Departamento de Qumica Facultad de Agronoma Universidad Agraria de la Habana

La interaccin Planta-Metal Pesado. Estudios en la familia Solanaceae

Autores: Ing. Liane Portuondo Faras Lic. Andrs Caldern Garca DrC. Fernando Guridi Izquierdo

La Habana, 2008

ndice 1. Introduccin..... 2. Efecto y acumulacin de metales pesados en plantas.... 3. Mecanismos de adaptacin..... 3.1 Inmovilizacin. 3.2 Exclusin.. 3.3 Quelacin. 4. Compuestos involucrados en los mecanismos de defensa... 4.1 Metalotioneinas (Metallothioneins-MTs).. 4.2 Fitoquelatinas (Phytochelatins-PCs)... 5. Estudios relacionados con adicin de metales pesados a medios de cultivo ....... 5.1 Perspectivas y aplicaciones de los mtodos de propagacin in vitro..

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1. Introduccin Los avances en la ciencia y la tecnologa desde la revolucin industrial, han aumentado la capacidad del ser humano para explotar los recursos naturales. Sin embargo, esto ha generado perturbaciones en los ciclos biogeoqumicos elementales (Liu y Suflita, 1993). La introduccin repentina de compuestos qumicos xenobiticos o la reubicacin masiva de estos materiales en diferentes compartimientos ambientales, con frecuencia provoca la acumulacin de contaminantes a niveles perjudiciales para todos los organismos vivos (CaizaresVillanueva, 2000). La contaminacin del ambiente con metales txicos y radioncleos surge como resultado de las actividades humanas, principalmente industriales que junto a otras fuentes como la agricultura y la eliminacin de residuos, contribuyen a agravar esta problemtica a nivel mundial (Atkinson y Kassan, 1998). Estos contaminantes son descargados en la atmsfera y en los ambientes acuticos y terrestres, principalmente como solutos o partculas que pueden alcanzar concentraciones elevadas, especialmente cerca del sitio de descarga (Brierley, 1990). Entre los mecanismos moleculares que determinan la toxicidad de los metales pesados se encuentran: el desplazamiento de iones metlicos esenciales de biomolculas y bloqueo de sus grupos funcionales; modificacin de la conformacin activa de biomolculas, especialmente enzimas y polinucletidos; ruptura de la integridad de biomolculas y la modificacin de otros agentes biolgicamente activos (Ochiai, 1987). Un aumento en las concentraciones de metales como Ni, Cu, Cd, Pb y Zn pueden producir cambios fisiolgicos y bioqumicos en las plantas, tales como daos a la membrana celular, modificacin o inactivacin de la actividad de las enzimas e inhibicin del crecimiento de las races, que influyen en su posterior desarrollo (Barcelo et al., 1997). La acumulacin de metales en la plantas depende de procesos de movilizacin y captacin del suelo, compartimentacin y secuestro desde la raz y la eficacia del xilema como tejido de transporte hacia las partes areas para su almacenamiento

a nivel de las hojas. Para que estos procesos sean eficaces, se hace necesaria la presencia en la planta de ligandos que posean alta afinidad con los cationes de los metales pesados, para la posterior formacin de complejos ligando-metal. Los ligandos potenciales incluyen aminocidos, cidos orgnicos y pptidos como las fitoquelatinas y las metalotioneinas, principales encargadas de inmovilizar y atrapar metales pesados para su posterior almacenamiento dentro de la vacuola; siendo este un mecanismo de defensa ante elevados niveles de toxicidad (Lobo, 2000). Una de las principales familias botnicas estudiadas mundialmente es la Solanaceae, dentro de la cual se incluyen importantes especies con fines alimentarios como es el caso del tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) y la papa (Solanum tuberosum L.). Adems se encuentran otras con fines comerciales como el tabaco (Nicotiana tabacum L.), la cual constituye una fuente importante de ingresos al pas, que se utiliza como base para el estudio de la estructura y funciones del genoma, debido a la buena caracterizacin gentica que existe de esta especie. Tambin es un cultivo que permite estudios in vitro aplicados a la micropropagacin y a la ingeniera gentica que pueden ser extrapolados a otras especies vegetales (Grimmer et al., 2000). La caracterizacin gentica de especies como el tabaco, permiten el empleo de tcnicas de ingeniera gentica para estudios ms profundos acerca de los mecanismos de adaptacin de las plantas ante metales pesados. Dado que muchas de las especies consideradas como acumuladoras se encuentran en la familia Solanaceae, es por lo que este trabajo se propone como objetivo presentar a esta familia botnica como modelo en la interpretacin de los efectos relacionados con metales txicos en las plantas, as como la utilizacin de la micropropagacin para futuras investigaciones en este sentido. Para ello, se presentan en este material las principales investigaciones realizadas en este tema en los ltimos diez aos. Relacionados principalmente con especies pertenecientes a las solanaceas y la interaccin de estas plantas con los metales pesados, sus mecanismos de defensa ante este estrs y la utilizacin prctica de las tcnicas de micropropagacin para estos fines.

2. Efecto y acumulacin de metales pesados en plantas En los ecosistemas agrcolas la mayora de los metales pesados se encuentran incluidos en un ciclo biogeoqumico en el cual los dos componentes fundamentales son el suelo y la planta. Estos elementos pueden llegar al suelo de forma area o terrestre, principalmente por la accin del hombre y son absorbidos por las plantas, por lixiviacin o erosin. A su vez, existe un equilibrio entre las fracciones disponibles y no disponibles de estos elementos en el suelo, capaces de modificar su ciclo, que dan lugar a que se encuentren en proporciones deficientes o txicas (Ghosh y Singh, 2005; Llugany et al., 2007). La capacidad de las plantas para acumular metales o presentar signos de fitotoxicidad ante stos u otros posibles contaminantes, vara segn la especie vegetal y la naturaleza del contaminante. Estas diferencias en la absorcin de metales pueden ser atribuidas a la capacidad de retencin del metal por el suelo y a la interaccin del complejo planta-raz-metal. Los efectos negativos o daos en la fisiologa de las plantas han sido motivo de innumerables investigaciones en los ltimos aos (Harter y Naidu, 1995). Se plantea que una toxicidad por metales pesados, pueden causar anomalas

citogenticas en las plantas como el decrecimiento o la inhibicin de la divisin por mitosis y anomalas en los cromosomas (nceer et al., 2000). Adems de la reduccin del crecimiento radicular y la frecuencia de clulas mitticas, incrementando la frecuencia de clulas aberrantes en especies del gnero Allysum (Lerda, 1992). Sin embargo, a pesar de ser considerada como acumuladora, la familia Solanaceae no se encuentra exenta de este comportamiento y en condiciones altamente txicas se ha comprobado que elementos como el Cd, Fe, Pb, Zn, Cu y Hg, pueden inhibir la germinacin del polen, el crecimiento del tubo polnico y la germinacin de semillas en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.). Esto afect negativamente el crecimiento de la plmula, la radcula y provoc cambios morfogenticos. Esa informacin se obtuvo a partir de la adicin de disoluciones de Ni Cl2, Fe Cl2, Cu SO4 y CO Cl2 y Pb NO3 a medios de germinacin donde las

plntulas se encontraban bajo condiciones controladas de temperatura, humedad, fotoperodo y asepsia total (Tuna et al., 2001). Adems, se han reportado estudios donde en condiciones controladas se logr demostrar anomalas citogenticas en plantas de la familia Solanaceae, tales

como el decrecimiento o la inhibicin de la divisin por mitosis, encontrando al catin Pb2+ como el principal causante de la reduccin del crecimiento y la frecuencia de mutaciones (Lupino et al., 2005). Iguales resultados se han encontrado en especies de la misma familia pero en condiciones de campo, donde concentraciones elevadas de Cd fueron responsables de daos en la estructura del ADN extrado de las hojas y races de Nicotiana tabacum L var. Nicotiana xanthi, las que provocaron cambios morfogenticos y recombinaciones en la estructura de los cidos nucleicos, (Gichner et al., 2004) as como el incremento en la frecuencia de mutaciones somticas en plantas de Solanum tuberosum L. que no slo retardaron el crecimiento de stas, sino que repercutieron en una reduccin del rea foliar (Gichner et al., 2007). Estudios equivalentes a estos en condiciones naturales tienen una mayor complejidad ya que deben considerarse otros factores actuantes. En el suelo se establece adems una interaccin entre la planta, el suelo y los microorganismos, que de alguna manera puede modificar los procesos encontrados en condiciones de laboratorio. Las investigaciones que recoge la literatura consultada, a pesar de desarrollarse en diferentes condiciones, demostraron una conclusin coincidente y es que los denominados metales pesados, cuando se encuentran en elevadas

concentraciones, provocan efectos negativos en las plantas que obstaculizan el buen funcionamiento de todos los procesos necesarios para un adecuado desarrollo. La accin directa de los metales pesados sobre los seres vivos ocurre a travs del bloqueo de las actividades biolgicas, es decir, la inactivacin enzimtica por la formacin de enlaces entre el metal y los grupos sulfhidrilos (SH) de las protenas, causando daos irreversibles en los diferentes organismos (Hernndez, 2002).

Cuando los metales pesados penetran en una clula vegetal, son inmovilizados o atrapados por pptidos, especficamente fitoquelatinas, pasndolos al interior de la vacuola. De este modo la clula posee dos mecanismos de proteccin: la unin del metal con la fitoquelatina y su deposicin en la vacuola. Algunas plantas

pueden tener una capacidad masiva para acumular niveles elevados de materiales txicos siempre que se mantengan almacenados en la vacuola ya que de esta manera las clulas no sufren los efectos txicos de los mismos. Ciertas plantas denominadas hiperacumuladoras muestran resistencia a los metales pesados y son capaces de acumular y extraer grandes volmenes de estas sustancias en suelos con una alta contaminacin. Las plantas

hiperacumuladoras son aquellas que acumulan, altas concentraciones de metales en sus tejidos y poseen dos caractersticas principales (Bruneton, 2001): La habilidad de crecer y desarrollarse en suelos con niveles de metales, txicos para casi todas las especies de plantas. Son especies que contienen en sus tejidos una concentracin mayor al 0.1% de Ni, Pb, Cu, Co. En los ltimos aos se logr identificar, en estado natural, plantas que tienen la capacidad potencial de acumular metales pesados (Ghosh y Singh, 2005),

pertenecientes por lo menos a 45 familias: entre ellas Solanaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Euphorbiaceae, Asteraceae, Lamiaceae, y Scrophulariaceae como especies hiperacumuladoras. De estas ltimas, las especies ms conocidas son Thlaspi caerulescens L., que sin mostrar lesiones ha logrado acumular hasta 26,000 mg kg-1 de Zinc y Brassica juncea L., que posee la habilidad de transportar metales desde las races a los retoos y algunos clculos indican que ha sido capaz de extraer 1,1550 mg kg-1de Pb por hectrea. En el tabaco, Nicotiana tabacum L., se ha encontrado que tiende a acumular elevados niveles de metales como Cd y Pb, reportndose concentraciones en tejidos foliares de este ltimo de ms de 500 mg kg-1 en condiciones de campo (Rodrguez et al., 2006) (Tabla 1).

Tabla 1 (Resultados recientes de las principales especies acumuladoras de la familia Solanaceae) Metal que acumula Cd, Fe, Pb, Zn, Cu, Hg Contenido (mg kg-1)

Especies Nicotiana tabacum L.

Efectos que ocasiona

Referencias

Inhibicin de la germinacin del Tuna et al., 2001 polen, crecimiento del tubo

polnico y germinacin de las semillas. Afectaciones del crecimiento de la plmula y radcula. Cambios morfogenticos. Nicotiana tabacum L. Pb Inhibicin mitosis. Anomalas en los cromosomas. Nicotiana tabacum L. Cd Pb 500.0 Cambios morfogenticos. Gichner et al., 2004 de la divisin por nceer et al., 2000

Recombinaciones en la estructura Rodrguez et al., 2006 de los cidos nucleicos.

Nicotiana tabacum L. Solanum tuberosum L.

Cd

Reduccin del rea foliar.

Gichner et al., 2007

Especies

Metal que acumula

Contenido (mg kg-1)

Efectos que ocasiona Sin mostrar lesiones.

Referencias Golia et al., 2007

Nicotiana tabacum L. var. - Burley Zn Cu Cd Pb - Virginia Zn Cu Cd Pb - Oriental Zn Cu Cd Pb 161.0 54.5 3.7 9.1 135.6 42.8 3.0 10.2 114.4 37.8 2.6 14.4

3. Mecanismos de adaptacin

Las plantas han desarrollado mecanismos altamente especficos para absorber, traslocar y acumular nutrientes incluyendo metales txicos, lo que constituye generalmente el primer eslabn de entrada de stos en la cadena alimentaria. La absorcin y posterior acumulacin dependen, en primera instancia, del movimiento de los metales desde la disolucin del suelo hacia las races de la planta; el paso por las membranas de las clulas corticales de la raz; el transporte desde las clulas corticales hasta el xilema donde la disolucin con los metales se transporta de la raz hacia el tallo y la posible movilizacin a travs del floema de las hojas hacia tejidos de almacenamiento utilizados por el hombre como alimento. Otro mecanismo de ingreso puede ser a partir de la absorcin foliar, debido a fuentes areas de contaminacin que provoquen la acumulacin de elementos trazas en la superficie o haz de las hojas. Otra va puede ser la aplicacin continua de fertilizantes qumicos que activan una fase de penetracin cuticular. Se ha considerado la existencia de un mecanismo de carcter metablico que justifique la acumulacin de los elementos contra un gradiente de concentracin, cuando la deposicin se realice en tejidos que ya almacenan una determinada cantidad del elemento txico (Harter y Naidu, 1995). Algunas especies de plantas pueden acumular metales pesados dentro o fuera de sus tejidos, otras pueden ser receptoras pasivas y unas pocas pueden controlar la traslocacin de elementos txicos debido a reacciones fisiolgicas y bioqumicas especficas. Las plantas pueden presentar distintos mecanismos de tolerancia o respuesta al exceso de metales pesados que incluyen la exclusin, la formacin de pptidos ricos en grupos tilicos, la quelacin por cidos orgnicos y aminocidos, la compartimentacin del metal en estructuras subcelulares y la reduccin del transporte a travs de la membrana (Hall y Williams, 2003). Los componentes de la clula que en forma selectiva se pueden convertir en blanco de metales txicos son la membrana plasmtica y el citoesqueleto. Es por esta razn que la clula, para un correcto funcionamiento, debe tener en buen estado los siguientes caminos metablicos: la produccin de ATP mitocondrial, el

metabolismo del calcio, la sntesis de protenas, la regulacin del ADN, la gliclisis y el ciclo del cido ctrico o ciclo de Krebs. Los dos ltimos proporcionan los precursores para la sntesis de aminocidos y los equivalentes reducidos, cuya oxidacin genera la mayora del ATP requerido. Los daos a la membrana plasmtica, a la produccin de ATP mitocondrial y al control de los niveles de calcio intracelular, son las causas para la destruccin final de la clula (Pea et al., 2004). La membrana plasmtica es uno de los componentes que primero responde al dao y sobre ella se producen efectos especficos segn el metal. Sin embargo tambin puede estar involucrada en la tolerancia a metales, reduciendo la captacin o estimulando las bombas de flujo de metales que promueven la entrada al citosol. Se sabe que las plantas tolerantes protegen la membrana mediante mecanismos de reparacin que mantienen su integridad, mecanismos de proteccin (como protenas de choque trmico y metalotioneinas), mejorando los mecanismos de homeostasis de metal, promoviendo un influjo reducido a travs de la membrana plasmtica o un eflujo selectivo (Montes, 2001). 3.1 Inmovilizacin La primera barrera contra la entrada de metales pesados se expresa principalmente a nivel radicular. La inmovilizacin de stos desde la pared celular por carbohidratos extracelulares, identificados como sustancias mucilaginosas, evitan la presencia de iones libres de elementos txicos y su posterior traslocacin hacia la parte area, reduciendo al mximo la fitotoxicidad (Zhao et al., 2001). La raz constituye el tejido de entrada principal de metales txicos en la planta. Estos pudieran llegar fundamentalmente por un proceso de difusin en el medio mediante un flujo masivo e intercambio catinico. En el caso de la inmovilizacin, los metales quedan retenidos en las paredes celulares debido a la celulosa, hemicelulosa, lignina y carbohidratos extracelulares, que no permiten el paso de estos elementos txicos hacia la parte area de las plantas (Junk y George, 2002).

3.2 Exclusin Prevenir la entrada de metales pesados al citosol a travs de la exudacin de compuestos, puede representar otra estrategia de defensa. Algunas plantas conocidas como excluyentes poseen mecanismos especializados para la reduccin de la entrada de metales txicos a las races, que toleran su presencia, pero no los absorben en grandes cantidades (Peris, 2006). El malato, el citrato y el oxalato han sido identificados como importantes quelantes secretados por las races, que brindan resistencia a las plantas frente a metales txicos y su actuacin, en dependencia de las caractersticas del suelo, puede lograr una mayor disponibilidad de ellos para su posterior extraccin (Dobermann y Fairhurst, 2000). 3.3 Quelacin Uno de los aspectos ms importantes de la acumulacin de metales es el que se refiere al proceso de formacin de complejos metlicos. Un complejo o compuesto de coordinacin es el resultado de la interaccin de un tomo central; esto es, un ion metlico con orbitales de valencia vacos, que puede actuar como cido de Lewis (aceptor de electrones) y una o varias bases de Lewis (dador de electrones) con pares de electrones libres. Estas bases se conocen como agentes acomplejantes o ligandos (Rieuwerts et al., 1998). El metal se rodea de los ligandos formando un complejo. Los ligandos simples, como el agua, slo forman un enlace con el tomo central y se llaman monodentados o monocoordinados. Algunos ligandos son capaces de formar mltiples enlaces de coordinacin, lo cual va incrementando la estabilidad de los complejos. La planta utiliza este mecanismo de formacin de complejos en el interior de la clula para detoxificar o amortiguar la presencia de metales txicos. De esta manera, el metal queda inmerso en una interaccin qumica que le mantiene en equilibrio electrnico o acomplejado, pero que no lo deja fuera del metabolismo; o

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sea, no se ha eliminado del citoplasma de la clula y por ello, sigue siendo potencialmente txico. Ciertos agentes quelatantes sintticos, facilitan la disponibilidad de iones metlicos en disolucin, disminuyendo procesos de insolubilizacin o de oxidacin reduccin, por lo cual se han utilizado en disoluciones nutritivas para las plantas. En la Figura 1 se muestra al cido etilendiamintetractico (EDTA), uno de los ligandos ms utilizados, formador de quelatos estables y solubles en agua al interactuar con un gran nmero de cationes metlicos de diversas cargas.

Figura

(A)

(Frmula

desarrollada

de

la

molcula

de

cido

etilendiamintetractico) (EDTA). (B) (Representacin tridimensional segn Williams y Xing, 2006)

Los quelatantes tienen la capacidad de formar complejos con los metales pesados que se encuentran en la disolucin del suelo y hacerlos biodisponibles a las plantas que poseen mecanismos de defensa contra estos elementos txicos. Los principales agentes quelatantes que se utilizan en la agricultura pertenecen a los siguientes grupos qumicos (Tabla 2).

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Tabla 2 (Nombres qumicos y frmulas de los principales agentes quelatantes). (Modificado de Evangelou et al., 2007)

Los quelatos formados para estos fines deben tener una estabilidad suficiente para impedir la formacin de sales insolubles del in metal, pero han de ser suficientemente inestables para liberar lentamente los metales y que las plantas puedan asimilarlos. Slo unos pocos agentes quelatantes tienen suficiente afinidad con metales para formar complejos solubles estables. La estabilidad de los quelatos est indicada por su constante de estabilidad. Mientras ms alto es el valor de esta constante ms elevada es la estabilidad del complejo (Tabla 3).

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Tabla 3 (Constantes de estabilidad (Kest) de los distintos quelatos). (Modificado de Evangelou et al., 2007)

Agente quelatante EDTA EDDHA HEEDTA Citrato Gluconato (GL) Fe3+ 25.0 33.9 19.6 11.2 37.2 Fe2+ 14.27 14.3 12.2 4.8 1.0

Log Kest Zn2+ 14.87 16.8 14.5 4.86 1.70 Cu2+ 18.70 23.94 17.4 5.90 36.6 Mn2+ 13.81 ___ 10.7 3.70 ___ Ca2+ 11.0 7.20 8.0 4.68 1.21

4. Compuestos involucrados en los mecanismos de defensa Los efectos txicos por metales pesados en las plantas pueden causar daos oxidativos de forma directa, por la produccin de especies reactivas de oxgeno (ERO) o indirectamente, inactivando los sistemas antioxidantes de la clula. No obstante, las plantas pueden presentar diferentes mecanismos de tolerancia que incluyen compartimentacin del metal en estructuras subcelulares y la formacin de pptidos ricos en cistena como metalotioneinas y fitoquelatinas. Otra alternativa es la produccin de un sistema antioxidante de defensa que incluye sistemas enzimticos y no enzimticos (Soares, 2005). 4.1 Metalotioneinas (Metallothioneins-MTs) Las MTs estn presentes en todos los organismos, incluyendo microorganismos procariotas y eucariotas, algas, plantas superiores, invertebrados, peces y

mamferos (Roesijadi, 1996). El trmino fue introducido para designar protenas ricas en azufre que contenan Cd, Zn, Cu, y provenan del crtex renal del caballo. Estas protenas fueron caracterizadas por poseer bajo peso molecular (6 - 12 KD), alto contenido metlico, composicin caracterstica de aminocidos con una elevada proporcin de cistena y ausencia de histidina y de aminocidos aromticos. Se encontr una

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secuencia nica de aminocidos, con una distribucin caracterstica de los residuos de cistena en la forma Cys - X - Cys; y caractersticas espectroscpicas propias de uniones mercarptilo (azufre - metal) (Pavlkov et al., 2004). Existen cuatro isoformas diferentes; las MTs-I y MTs-II se expresan prcticamente en todos los tejidos de los organismos vivos y son inducibles por metales pesados, agentes oxidantes, hormonas, inflamacin y el estrs. Por el contrario, la MTs-III y la MTs-IV tienen una distribucin mucho ms restringida, localizndose fundamentalmente en el sistema nervioso central (SNC) y el epitelio escamoso estratificado del cuerpo humano. No se conocen con certeza las funciones de las MTs, aunque se supone que intervienen en la homeostasis del Zn y del Cu y en la detoxificacin de los mismos cuando alcanzan concentraciones elevadas (Trancoso, 2000). Las MTs actan en las plantas como protenas transportadoras de metales y juegan un papel importante en su detoxificacin. Adems del zinc, su expresin y biosntesis parece estar regulada por otros metales, como el Cd y el Cu, as como por factores endgenos, tales como citoquininas y hormonas esteroideas (Tohyama et al., 2000). 4.2 Fitoquelatinas (Phytochelatins-PCs) Las PCs son ligandos de alta afinidad que acomplejan metales pesados. Se identificaron despus que las metalotioneinas y se piensa que pueden desempear en las plantas el papel equivalente al que stas ltimas desempean en bacterias y mamferos. Consisten en pequeos pptidos ricos en azufre a partir de unidades repetitivas de glutamilcistena (entre 2 y 8 unidades) con una glicina terminal y son sintetizadas por degradacin de glutatin mediada por una carboxipeptidasa. Son capaces de enlazarse con cationes de metales pesados va coordinacin de tiol y en consecuencia provocar detoxificacin (Goldsbrough, 2000). En la Figura 2 se muestra la sntesis de este pptido.

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Figura 2 (Esquema donde se demuestra la sntesis de PCs producida por la unin de Glutatin sintasa (GSH), con residuos de Glutamato (Glu) y Cistena (Cys) ligados a travs de repeticiones de (-Glu-Cys)n-Gly donde n= 25..11. segn Cobbett, 2000) Las PCs se inducen rpidamente en las plantas por tratamiento con metales txicos. Su disminucin provoca una mayor sensibilidad a los metales pesados y por tanto, su papel en la tolerancia y acumulacin de stos es crtico. Su sntesis en las races es ms efectiva cuando es estimulada por Cd, en menor proporcin por Zn y Cu y prcticamente no existe en presencia de Ni (Howden et al., 1995). Se sintetizan en el citosol, donde se unen a compuestos metlicos formando complejos. Sin embargo, tcnicas de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (High performance liquid chromatography-HPLC) y rayos X detectan mayores concentraciones de metal y PCs en el interior de la vacuola, por lo que se deduce que el transporte y acumulacin en su interior estn implicados en tolerancia y detoxificacin (Rea et al., 1998). Adems del bien documentado proceso de acumulacin de los complejos PCs-Cd en vacuola, hay evidencias de acumulacin de otros metales, involucrando diferentes sistemas de transporte desde el tonoplasto con metales como el Zn y el Ni, entre otros. (Figura 3).

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Figura 3 (Algunos mecanismos que actan en la acumulacin de metales pesados en plantas segn Clemens et al., 2002) A pesar de esos resultados an quedan muchas interrogantes que no logran discernir los verdaderos mecanismos que intervienen en el proceso descrito anteriormente. Es por esto que todava se realizan investigaciones que buscan dilucidar a ciencia cierta cules son en su totalidad las interacciones que tienen lugar en estos sistemas.

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5. Estudios relacionados con adicin de metales pesados a medios de cultivo En la actualidad aun son escasos los trabajos relacionados con adicin de metales txicos a medios de cultivo, para conocer con claridad los mecanismos fisiolgicos que se desarrollan en plantas resistentes a concentraciones elevadas de estos metales. Sin lugar a dudas, el medio de cultivo ms ampliamente difundido, dada su facilidad de preparacin, as como sus excelentes resultados y fcil adaptacin a cualquier fase de micropropagacin, es el propuesto por Murashige & Skoog desde 1962. Este es un medio al cual se le pueden adicionar cationes de metales pesados en concentraciones elevadas, para estudios de comportamientos fisiolgicos en plantas estresadas con esas condiciones. Para el empleo de esta tcnica se precisa suplementar el medio de cultivo con hormonas reguladoras del crecimiento vegetal, como 6-bencilaminopurina (6-BAP) o giberelinas (GA3), lo que propicia que los explantes se encuentren ante un medio favorablemente balanceado en hormonas, aumentando la induccin de tejidos, fundamentalmente de nuevos brotes, formacin de races y multiplicacin celular acelerada (Gmez et al., 2006). El xito del cultivo de tejidos est muy influenciado por la composicin qumica del medio basal; este contiene macronutrientes (sales de nitrgeno, potasio, calcio, fsforo, azufre y magnesio); micronutrientes (manganeso, boro, hierro, nquel, cobalto y otros); carbohidratos (usualmente sacarosa), destinados a reemplazar el carbono que la planta normalmente fija de la atmsfera por medio de la fotosntesis; vitaminas (las cuales son necesarias para llevar a cabo una serie de reacciones catalticas en el metabolismo y son requeridas en pequeas cantidades) y por ltimo el agua, Acevedo, 1999). La ausencia de alguno de estos componentes, normalmente conlleva a que no se produzca crecimiento y desarrollo y el tejido u rgano aislado muera. De aqu la importancia de una preparacin adecuada del mismo, ya que un explante no representando alrededor del 95% (Lpez-

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podra sobrevivir en un medio desbalanceado y adems, con la adicin de otra sustancia ajena, como podra ser, un metal txico para las plantas. La presencia de metales en los medios de cultivos se puede realizar mediante la preparacin de diluciones partiendo de una solucin ms concentrada, que se adiciona al medio mediante alcuotas en concentraciones que se encuentren totalmente biodisponibles para las futuras semillas o plntulas (Portuondo et al., 2008). En la actualidad se han desarrollado trabajos donde ha sido posible la preparacin de medios de cultivo suplementados con CdCl2, para la determinacin del estrs en el crecimiento de races de Turfgass (Jen-Kuo et al., 2005). Tambin se ha estudiado, mediante tcnicas de cultivo de tejido, la tolerancia ante

concentraciones de los metales pesados Zn, Cu y Mn en la especie Ailanthus altissima Swingle, suplementando los medios de cultivos con sales de estos metales (Predieri y Gatti, 2003). De igual forma, en investigaciones para determinar el contenido de metales pesados en los tejidos de las plantas de Typha latifolia, stas se pusieron directamente en contacto con disoluciones acuosas de una sal de plomo (Carranza et al, 2004). Muchos son los estudios en la determinacin de las modificaciones moleculares de las plantas cuando son sometidas a estrs por metales pesados. La generalidad de estos estudios se concentra, en la evaluacin de la expresin de alguna sustancia o grupos de compuestos, relacionados con el efecto producido por la exposicin al metal. Un ejemplo de ello resulta la determinacin de niveles de fitoquelatinas, que en la familia Solanaceae se ha relacionado con el metal Cd. Sin embargo, los efectos morfolgicos externos de las plantas, modificados cuando son sometidas a elevadas dosis de otros cationes de metales pesados, especialmente Pb2+, an no han sido suficientemente estudiados, a pesar de que se reporta que la familia es acumuladora de ese catin. Un acercamiento a estos estudios sobre los efectos fisiolgicos se pueden encontrar en trabajos realizados por Portuondo et al., (2008) en plantas de dos variedades de tabaco San Luis 21(SL.21) y Burley Habana 13 (BH.13), obtenidas a partir de callos sin diferenciar, donde fueron adicionados al medio de cultivo

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concentraciones de 100, 500 y 1000 mg kg-1 respectivamente de una sal de plomo. Las diferentes concentraciones del metal utilizadas afectaron los indicadores morfolgicos evaluados (altura de las plntulas, nmero de hojas totales y nmero de hojas verdes), teniendo una repercusin directa sobre la formacin de nuevos brotes en los explantes (Figura 4). Esto se atribuy a un efecto de genotoxicidad, presumiblemente por una interaccin del catin plomo con el ADN, formando enlaces con bases nitrogenadas como la Adenina, Guanina y Timina, adems de una disminucin considerable en la clula de grupos tilicos antioxidantes, lo que traera consigo un aumento de especies reactivas de oxgeno. Esto ltimo finalmente causara un estrs oxidativo a nivel celular que repercutira en infuncionalidad de los lpidos, protenas y el ADN en s mismo. la

Figura 4 (Medias del nmero de brotes para el factor concentracin) (anlisis bifactorial)

Una ltima evidencia de este efecto negativo sobre la fisiologa de las plantas se evidenci en la escasa formacin de hojas a partir de los brotes (Figura 5); lo cual resulta lgico si se tiene en cuenta que sus clulas son las encargadas de la formacin de tejidos foliares, divisin y especializacin celular, sugirindose que estos daos tan marcados estn dados fundamentalmente por la accin del Pb2+ sobre las bases nitrogenadas en los cidos nucleicos, lo que indudablemente trae

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consecuencias en la variabilidad y formacin de nuevos tejidos, as como en los niveles de especializacin celular.

Figura 5 (Cantidad de hojas totales por explante en el tiempo)

En todos los indicadores, los mayores efectos se ejercieron en los tratamientos ms concentrados de 500 y 1000 mg kg-1. La posibilidad de contar con un rango de concentraciones de Pb2+ que estimule efectos visibles en las plantas de tabaco, tiene como principal ventaja, la de contar con una planta que acte como indicadora de concentraciones biodisponibles de estos metales. Esto se debe a que en los indicadores evaluados, los efectos ms importantes y visibles estuvieron en concentraciones superiores a 100 mg kg-1, indicando que cuando la planta se somete a tales niveles, se desatan una serie de trastornos morfolgicos visibles y medibles.

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5.1 Perspectivas y aplicaciones de los mtodos de propagacin in vitro La utilizacin de los mtodos de propagacin in vitro es numerosa, dependiendo del objetivo que se persiga. Se puede destacar la micropropagacin acelerada de material vegetal seleccionado o transformado; el mantenimiento de bancos de germoplasma; la evaluacin de plantas resistentes o tolerantes a estrs abitico como alta salinidad, estrs hdrico, bajas temperaturas, etc.; la resistencia a herbicidas, plagas; la produccin de metabolitos secundarios y la germinacin in vitro. Las aplicaciones ms importantes de los mtodos de cultivo de tejidos in vitro en la agricultura se orientan a la propagacin, al saneamiento y a la mejora gentica. La propagacin vegetativa in vitro o clonacin puede ser una alternativa econmicamente rentable, frente a los mtodos de multiplicacin clsicos; el sexual (germinacin de semillas) y el vegetativo o asexual (esqueje, injerto,

acodo, entre otros). La micropropagacin masiva de clones puede obtenerse va organognesis directa; es decir, a partir de un meristemo o yema (apical y/o axilar) aislada de un vstago. Esta va aporta estabilidad gentica o ausencia de mutaciones y tambin plantas libres de virus, bacterias u hongos, mediante el cultivo de pices meristemticos de vstagos (Mederos-Molina, 2007). El enorme potencial que posee esta tcnica ha propiciado que en los ltimos aos se haya producido un incremento en el nmero de laboratorios de cultivos de tejidos, lo que ha motivado que algunos especialistas la utilicen como una alternativa viable en sus programas de produccin. De igual manera en estudios recientes a nivel mundial, la micropropagacin ha servido de pauta para las

investigaciones a nivel molecular de efectos y mecanismos que desatan las plantas resistentes a metales pesados, as como la creacin de hbridos o clones resistentes a estos metales txicos con el fin de ser utilizados como plantas saneadoras de terrenos contaminados.

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