UNIVERSIDADE SO JUDAS TADEU CURSO DE PS-GRADUAO

BIOLOGIA MOLECULAR DATA: Junho/2006

Profs. Adriana Bortolai / Alexandre T. Dias

AULA PRTICA

FISH (Fluorescence ' in situ' Hybridisation) =>

HIBRIDAO 'in situ' por FLUORESCNCIA
A HIBRIDAO 'in situ' por FLUORESCNCIA (FISH : Fluorescence ' in situ' Hybridisation) permite que seqncias de DNA sejam detectadas por fluorescncia em cromossomos metafsicos, em ncleos interfsicos, em cortes de tecidos ou em blastmeros (material em suspenso ou lminas com cortes parafinados). Essa tcnica utiliza sondas de DNA que se hibridam a cromossomos inteiros, centrmeros, telmeros ou cpia de genes de seqncia nica, e serve como uma poderosa ferramenta auxiliar citogentica clssica. Esse mtodo tornou-se uma ferramenta til no campo mdico e em pesquisa bsica, oferecendo novas possibilidades em diagnsticos rpidos e preliminares. Pode ser usado para marcar regies especficas (genes de seqncia nica,
'conjunto' de genes em microdelees - 'Sndrome de genes contguos'), para deteco e anlise

de aneuploidias cromossmicas, anlise de aberraes cromossmicas estruturais e mapeamento cromossmico. Apresenta muitas vantagens sobre os mtodos de hibridao 'in situ', como alta sensibilidade e especificidade, obteno de resultados rpidos, estabilidade da sonda e mapeamento direto. A Hibridao abre perspectivas interessantes no estudo da organizao e estrutura cromossmica.

PROTOCOLO DE HIBRIDAO 'in situ' PARA SONDAS LQUIDAS (X e Y)

AMOSTRA : CULTURA DE LINFCITOS OBS. : - A M QUALIDADE DA AMOSTRA (como por exemplo : poucas metfases, qualidade ruim dos cromossomos e presena de citoplasma, que interfere na entrada da sonda no ncleo) o maior motivo porque o FISH pode falhar, e no se observar o sinal. - Observar sob fase com aumento de 100x se a concentrao a ideal, de 20 a 30 ncleos (no caso de culturas, pelo menos 5 metfases) por campo. Se necessrio acertar a concentrao, 'lavando' novamente o material em Fixador CARNOY (adicionando ou

diminuindo a quantidade de fixador suspenso).

- Para FISH usar sempre lmina recm preparada, nunca envelhec-la em estufa ou
'flambada'.

A.) DESIDRATAO =>

1. Lavar a lmina com a amostra em 2xSSC por 2 minutos temperatura ambiente; 2. Desidratar em lcool 70%, 85% e absoluto (100%) por 2 minutos em cada, temperatura ambiente; 3. Deixar secar rapidamente e colocar a lmina com a amostra a 37oC por pelo menos 2 minutos; 4. Pr-aquecer uma lamnula (24x24mm) e uma alquota de 10l da sonda selecionada, por pelo menos 5 minutos a 37oC; 5. Adicionar os 10l da sonda na rea previamente marcada na lmina, onde se encontra um nmero ideal de clulas com boa qualidade de espalhamento e qualidade dos cromossomos; 6. Colocar a lamnula limpa e previamente aquecida sobre a lmina preparada ; 7. Deixar a soluo se espalhar sob a lamnula, pressionando levemente, para no formar 'bolhas'; 8. Selar as bordas da lamnula aplicando a soluo de borracha para assegurar o completo selamento para que a soluo no evapore (este passo importante no caso de sondas
com hibridao 'overnight');

9. Assegurar-se que a borracha selante esteja completamente seca, colocando-a 37oC por pelo menos 5 minutos antes de proceder o passo seguinte. B.) DENATURAO => 1. Checar se a temperatura da placa aquecedora est a 75oC usando o termmetro de superfcie e checar se no h soluo de borracha ou outro material sob a lmina que possa causar problemas com a transferncia de temperatura; 2. Denaturar a sonda e o DNA alvo colocando as lminas preparadas na placa aquecedora, com a superfcie de temperatura 75oC (+/- 1C), por 2 minutos (dependendo do tipo de sonda,
por ex. de 'pintura cromossmica', o tempo de aquecimento para denaturar pode chegar a 5 minutos).

C.) HIBRIDAO => Hibridar as lminas em uma cmara mida escura a 37oC (+/- 1C) , no mnimo 1 hora
(dependendo do tipo de sonda, por ex. de 'pintura cromossmica', e do material biolgico,o tempo de hibridao pode chegar a 18 horas).

D.) LAVAGEM PS-HIBRIDAO => H dois tipos de Lavagens rigorosas, com e sem formamida :

A lavagem com o protocolo de formamida conduz a timos resultados; O protocolo sem formamida delineado para resultados rpidos, e o mais utilizado nos protocolos de diversas sondas por no utilizar a Formamida, considerada uma droga mutagnica e carcinognica.

Sistema sem Formamida : 1. Preparar um boru contendo 0,4xSSC.

Colocar em banho-maria e deixar a soluo dentro do boru chegar 72 oC e ajustar o pH para 7,0.

2. Preparar um boru contendo 2xSSC a 0,05% TWEEN 20. Deixar a temperatura ambiente. Passos das lavagens: Sistema de lavagem sem formamida 1. Remover a lamnula cuidadosamente com uma pina e coloc-la em um boru contendo 0,4x SSC a 72oC por 2 minutos. Escorrer rapidamente; 2. Colocar a lmina em outro boru a temperatura ambiente contendo a soluo de 2xSSC a 0,05% de TWEEN 20, por 30 segundos; 3. Escorrer o excesso do lquido em um papel de filtro, sem deixar secar totalmente. E.) COLORAO => 1. Adicionar 10l DAPI ou PI-antifade na regio marcada na lmina; 2. Colocar uma lamnula limpa sobre a soluo de contra-corante na lmina; 3. Deixe a colorao se desenvolver no escuro e na geladeira por no mnimo 10 minutos antes de observar; 4. Observar sob microscpio de luz epifluorescente, com lmpada e filtros corretos para os fluorocromos que foram utilizados. CUIDADOS E DICAS PARA OBTER MELHORES RESULTADOS => As sondas so sensveis a luz e perdem fluorescncia . Os resultados no sero bons quando as sondas so expostas mnima quantidade de luz durante estes procedimentos, contudo, no necessrio trabalhar no escuro. MICROSCOPIA => 1. A luz deve ser 100 watts, e o microscpio deve estar com a luz bem centralizado. 2. As objetivas devem ser de 40x ou 60x de imerso. 3. Os principais filtros usados para visualizao so : DAPI (azul), FITC (verde) e TRITC (vermelho) , que podem ser filtros simples (uma s cor), duplos ou triplos.

BOM FISH !!! ***