3.

AS CLASSIFICAES DA CROMATOGRAFIA

So vrios os critrios usados para a classificao das diferentes modalidades de cromatogr afia, sendo os mais comuns relacionados tcnica empregada, ao mecanismo de separao envolvido e aos diferentes tipos de fases utilizadas. A forma fsica do sistema de cromatografia define a tcnica geral: a fase estacionria pode ser colocada em um tubo cilndrico ou disposta sobre uma superfcie planar. Baseando-se nesta, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Na primeira, de acordo com o tamanho do dimetro interno do tubo, temos as colunas preparativas (6-50 mm), analticas (26 mm) e com microdimetro (<2 mm). As colunas preparativas e analticas sempre apresentam a fase estacionria na forma de partculas e a fase ativa na forma de um slido ou de um lquido que tanto pode recobrir a superfcie do slido como estar quimicamente ligado a ele. As colunas com microdimetro tambm podem ser recheadas com a fase estacionria ou podem possuir a fase estacionria sob a forma de um filme ou de partculas aderidas nas paredes do tubo. Considerando o estado fsico da fase mvel, distingue-se a cromatografia gasosa, onde a fase mvel um gs, a cromatografia lquida, onde a fase mvel um lquido, e a cromatografia supercrtica, onde se usa como fase mvel um vapor pressurizado, em temperatura acima de sua temperatura crtica, com as vantagens de ter viscosidade menor do lquido, mas mantendo as propriedades de interao com os solutos.

15

A cromatografia lquida cm coluna tambm sc divide cm dois grupos- a cromalografi* q ca, feita cm colunas dc vidro, sob presso atmosfrica, com o fluxo da fase mvel devi o ora gra a e (por isto, s vezes esta tcnica chamada "cromatografia lquida por fora da gravi e ), e a croma ogr 1 lquida de aJta eficincia (CLAE), que usa colunas metlicas e presses de fase mve e eva cora auxlio de uma bomba de alta presso (e, por isto, , s vezes, chamada cromatogra ia qui presso") que pode empurrar a fase mvel com vazo mais rpida (resultando em outro nome. cromatografia liquida de alta velocidade"). Sugere-se, como nome preferido desta tcnica, cromatogr lquida de alta eficincia, devido a sua caracterstica mais importante, que a elevada eficincia atingida na separao. O estado fsico da fase estacionria pode ser lquido ou slido. O lquido pode estar simplesmente espalhado sobre um suporte slido ou imobilizado sobre este. A imobilizao pode envolver ligaes qumicas entre o lquido e o suporte ou somente entre as cadeias do prprio lquido. Devido as vantagens de volatilidade e solubilidade reduzidas atribudas s fases estacionrias contendo a parte ativa na separao quimicamente imobilizada sobre o suporte, comum considerar-se esta uma categoria distinta, ou seja, a cromatografia com fase ligada. Justifica-se esta distino pelo fato de que seu mecanismo de separao freqentemente difere dos mecanismos atribudos s fases estacionrias lquidas ou slidas. A Figura f~] mostra as classificaes da cromatografia, segundo as formas fsicas mais encontradas.

CRITRIO OE CLASSIFICAO

CROMATOGRAFIA

TtCNI C A EU COLUNA FASE MVEL LQUIDO LIQUIDO SUOO FASE LfOUlOO

GiS

^SE

SUOO

F*St

J,

F L Ui 00 SUFEU CUI T ICO .n ' LIGADA

LIQUIDO LIQUIDO SLIDO

F AS E

ESTACIONOU
TIPO CE CROMATOGRAFIA

I utAO
CC CCD

I
C6L

CCS

/;,
COFl

**
ess

w*

L IGA 0 A

CSFl

CLL

CLS

CE CLFL

FIGURA 1-1 Classificao dc cromatografia pelas formas fsicas.

C8

Uma outra classificao baseia-se na polaridade relativa das fases. Em cromatografia gasosa, a fase mvel inerte e a separao ocorre devido as interaes das molculas da amostra com a fase estacionria, enquanto que, na cromatografia lquida, a polaridade de ambas as fases importante. Chama-se cromatografia lquida com fase normal quando a fase estacionria mais polar do que a fase mvel, e cromatografia com fase reversa quando se tem o inverso, ou seja, a fase mvel mais polar e a fase estacionria mais apoiar. O mtodo de introduo da amostra e seu subseqente desenvolvimento constitui um outro tipo de classificao (Figura 1-2). A introduo da amostra em uma nica aplicao e seu desenvolvimento mm

FASE ESTACIONA RIA (COM ELUENTE)

DESENVOLVIMENTO

ELUENTE
m
^ir

DESLOCADOR
X\\\S Wv: D C+D ---- C aMr o
aO

AMOSTR

A+d+

W/, W

---- C T t n*r o+ c A+E

SXNSX

AtB A

---- A + U .A

' / // /,

RESPOSTA DO DETECTOR

ELUIO

AN FR

FIGURA 1-2 Mtodos de desenvolvimento em cromatografia.

17

E^uemadot
meC,nm cromatogrfico

de a: adsoro; b:

FIGURA 1-3

, 6. partio; c; troca inica; d: bioafinidd

o* Q

i
1

b
*> o' \

>! i

FIGURA I 3 Etqueou da meanumo* cromatogrfficot de : dtorfto; b: pertiio, c: troe inic; d e e: Quando a fane ctadonria 6 um lquido, espalhado na superfcie de um suporte rUdo do i uho cromatogrfieo, o processo 6 intrafacial; ocorrendo por a rao, ou p ao, que wt

soltibilidadcs dos componentes da amostra na fase estacio ria dos componente* A fane mvel depende de sua volatilidade (fase mvel gasosa) ou e sua sou . sr (lasi mov( | l(|uidn). Encontra-se este mecanismo na cromatografia em papel (CP), na cro

inicialmente desenvolvidas para a cromatografia gasosa (CGFL), o seu uso nesta modalidad colunas dc dimenses capilares, onde a fase estacionria est freqentemente imobilizada ou parede do tubo. Fases quimicamente ligadas esto sendo usadas com mais freqncia na cr delgada (CCD), especialmente na tcnica chamada cromatografia em camada delgada de alta efi

Para o processo qumico de troca inica, a fase estacionria constituda de uma matr

grupos funcionais ionizveis. Assim so obtidos os trocadores aninicos que tm s

positivamente, retendo nions, e os trocadores catinicos, que tm stios carregados negativame

A fase mvel , geralmente, uma soluo inica com propriedades tamponantes, esc

compatvel com o tipo de trocador usado. Desta maneira, se a fase estacionria retm ctions, a cromatografia por troca inica (CTI) (ver captulo V). Outro processo qumico encontrado na cromatografia utiliza grupos com especificidade

ctions capazes de substitu-los preferencialmente. A Figura I-3c indica uma representa

ligado s matrizes. Estes grupos, que podem ser, por exemplo, antgenos, enzimas ov lecitinas

somente os componentes complementares, os anticorpos, protenas o\ acares, respectivamente

as outras espcies da amostra, como indica a Figura I-3c Na cromatografia por hioafinida

componentes retidos pode ocorrer com a mudan das propriedades da fase mvel, por exem grupo fortemente atrac! (ver captulo VII).

modifica as propriedades ou do grup ligado ou do seu complementar, ou por mtodos de des

A cromatografia por excluso (CE) baseia-se em um processo puramente mecnico. A fa e

dc composio inerte, com partculas de forma, tamanho e porosidade unifonni As molculas d

porque as menores so capazes de penetrar facilmente em tod os poros da fase estacionria, equ

mvel intrasticial e intersticial, enquanto maiores so excludas dc todos os poros, passa acompanhando a fase m intersticial, isto , a fase mvel que fica fora dos poros (Figura /-3e). As

efet intermedirio migram com velocidades variveis entre estes dois extremos, sendo que possu

poros*, entrando cm alguns, mas no em todos, e saindo da coluna em ordem relacionada c se captulo VI).

cromatografia planar a fa<* m/w 1 partida da amostra e arrastaProvemente de um reserv atravs dospontos de Pr dr a distncia perc0JTjc^COnif>0nenes ^^^te o processo de desenvolvimento. Defiu (Figura 1-4). ^ 05 Proponentes e por dm a distncia percorrida pela fase m

Na

FGURA M
Cromatograma pico desenvolvido por cromatografia planar.

Os mesmos termos se aplicam a um processo cromatogrfico realizado em coluna componentes permaneam no tubo cromatogrfico sem serem eludos. Contudo, norm cromatografia em coluna procede com fluxo contnuo da fase mvel, at que todos os c sado da coluna e as suas presenas sejam detectadas pelo detector e indicadas graficam

Akeruinrale. tolo pod. colcttdo (raes de lume. ideco5i SUK

da. unidade de distncia ^mddo,colide,Mdo0nmero do ,uboded,fr.i

20

FIGURA 1-5

Cromatograma tpico obtido por cromatografia cm coluna.

Para a cromatografia em coluna mais comum utilizar ou tempo ou volume, em vez da esta ltima medida no papel, enquanto o tempo ou o volume podem ser diretamente processo ocorrendo na coluna cromatogrfica.

Por isto, o tempo de reteno, o tempo gasto desde o ato de injeo at a sada do compo

, a varivel impressa pelos dispositivos eletrnicos, freqentemente acoplados a sistema

cromatografia. Faltando este dispositivo, o tR calculado a partir das medidas feitas no cromat tR = dR / f, onde f a velocidade do papel no registrador grfico, em unidades de cm/min ou mm/s,

O tempo de reteno engloba todo o tempo que o componente em questo fica no si quer na fase mvel, quer na estacionria, Quando as molculas do soluto ficam na fas movimentar-se com a mesma velocidade que as molculas da prpria fase mvel. Ento que as molculas do soluto esto na fase mvel igual ao tempo gasto para as mo percorrerem a coluna, tm :
tM = dM /f. Sendo .im a parle do tempo em que as molculas do soluto ficam r<** calculada pela diferena:

{ vc f M

21

faceestacionria someiuc

coluna recheada, ou nos espaos vazios em colunas contenao a paTCd

de separao, na
rctido

Para evitar possveis confuses resultantes dos diferentes mecanismos^

cha

por excluso o volume da fase mvel necessrio para eluir um

tQ t
do

este volume representa a parte intersticial da fase mvel nesta m

fora dos poros, enquanto o volume total da fase mvel na coluna, t e o volume intrasticial, Vi:
Vt

volume in

= Vo + Vi.

r^T PTrJuso Vc . inclui tambm volume total contido na coluna em cromatografia por ex matriz inerte; Vg:
Vc = Vo + Vi + V g .

Nas outras modalidades de cromatografia, o volume total dentro da coluna C.

Vc = VM + VS, onde Vs o volume da fase estacionria. Estas medidas de distncia, tempo e volume so usadas diretamente para fins qual identificao das substncias contidas nas amostras, por comparao dos tempos ou ajustados. Estas medidas so tambm usadas para calcular os vrios valores relacion eficincia das separaes cromatogrficas. O fator de reteno para cromatografia planar definido:
Rf = dr / dm .

Comparaes do valor de Rf da amostra com o de um padro 6 o mtodo qualitativa cromatografia planar.

N. cronmografia cohu. . na.ofc <fc omponeme dMenniMda pd rMik) dos lem >.ol&utoiBem dd,(*. a**,*ou
^ ^ _ Dm. w ^ ve^ [itot Ele rrUrirtado ao coeficiente dc distribuio, Kf> , pelo* volumes d fase* mvel, respectivamente, da fesc mvel, VM , pelo volume da fase estacionria, Vs . Na mxaacografia por cxcJuso, o fator de capacidade, k\ t definido
3 rio ao

Ko = Cs / Cm - Dm VM / Vs - Dm0 . ocvic Cs ' Ca representam as concentraes do soluto nas f

*1: v . Vo

/ crc-^ entre Dm e kJ relaciona-se ao fato que, na cromatografia por excluso, o volume passagem de uma substncia no retida VQ f o volume da fase mvel i o vx>iume tocai desta f**r O toer>osnte de distribuio de cromatografia por excluso, Ko , tambm utiliza os relacionados a esta modalidade:

A reteno relanva usada para identificao de substncias e pode ser calculada para cromai ograma. Iivrc da restrio de serem adjacentes. usada em crocnaografia em coluna e calculada a partir da dUrnrl* que separa as divididos pela mdia das larguras de suas respectivas bases, wb (Figura 1-6): 2 (dR2 - dRi ) Rs
=

Uma outra medida quantitativa de separao de dois componentes consecutivos

^ AdR Wb2

Wbl + Wb2

Para a Largura de base sempre tomada a distncia entre as tangentes traada

Quando 06 picos so bem adjacentes, a mdia das suas larguras pode ser substituda pel pico.

A resouo em cromatografia planar determinada pela separao entre as manch

Rs (planar) = 2 (dRi - dR2 )/(wsi + ws2 ) onde Ws a lanzur

mancha, enquanto o fator de separao representado pela raz< entre os fatores de reten a = Rf, /Rf2 = dri /dr2

A cfidnda representada por um cromatograma medida em termos de nmero de pr

ou e/etivos. Um prato terico pode ser considerado equivalente a uma etapa de equilbrio e

anlogo aos pratos tericos da teoria de destilao. Quanto maior o nmero de pratos, m eq maior ser a eficincia e, portanto, melhor a separao.

23

estacionria, e no com o tempo total requisitado pela corrida, o nmero de pratos efet calculado usando o tempo de reteno ajustado: N = 16 t*R2 / wb2 = 5,545 (t*R /wh )2

Lembre-se que a medida da largura da base, neste caso, deve tambm ser em unidad que o nmero de pratos um nmero puro, sem unidades.

o nmero de pratos obtidos pode ser afetado por vrios fatores, incluindo as condi * tp dc solu, e* P^cipalmente, o comprimento da coluna, fato q . uma comparao do nmero de pratos entre diferentes colunas Pnr P,a -

# entre colunas feita usando a medida da altura equivalente a um , COrrCSp ndc razo cntrc comprimento da coluna, I, e o nmero de pratos. ^ ^

FIGURA 1-6

Medidas relacionadas determinao de resoluo.

FIGURA 1-7 Cromatogramas ilustrando a relao entre resoluo, seletividade e eficincia, a por eficincia e m seletividade; b: boa resoluo devido a boa seletividade, po c: boa rcsolu com boa eficincia e boa seletividade.

requeridos para uma determinada separao. a

req = 16RS

Dm2 + 1 Dm2

a-1

separao.

Nos Apndices 1 a 3 so sumarizados estes e outros termos bsicos cromatografia com definies.

5. REFERNCIAS

5.1. Gerais

- BRAITHWAITE, A. e SM1TH, FJ. ChromatographicMethods, 4* edio, Chapman and captulos 1 e 2.

mr I ins CH.; DE AQUINO NETO. FJl. e DA SILVA. J.R.P. Qutm.Nova,11,443 (198 GROB, R-L., ed Modem Practice of Gas Chromatography, 2* edio, John Wiley & S captulos 1 e 2.

JOHNSON, El. e STEVENSON, R. Basic Liquid Chromatography, 2* edio, Var Alto, 1978, captulos 1 e 2.

McNAIR, H.M. e BONELLI, EJ. Basic Gas Chromatography, 5* edio, Varian A 1969, captulos 1 e 2.
KIRKLANDJJ

Wiley & Sons, New York, 1979, captulos lei

to Modem Liquid Chromatograp

2. Hiitricai

ABE^E.W.;P0LI^

PierinaSueli Bonato Faculdadede CinciasFarmacuticas de Rib

Universidadede So Paulo

Pierina Sueli Bonato Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto Universidade de So Paulo

A amostra, atravs de um sistema de mieco a .

(Sa)'

o uso de temperaturas connieM d a ' " > > l ' m a C . , e n d o 1 f a S e e s substncias que, de acordo com suas pronriiT a ' P "aponzao determinados e chegam sada da coiuna em tem dtf ' ^ ^ ^ estacionria> ^o retidas po detector ad torna possvel a deteco e quantifica^e^^-
gasosa

Algumas tcnicas semelhantes a-omatocn-afi desenvolvimento s foi acelerado apareceram desde 1930, no entanto, seu

nmnampnfK p> m~ gasosa com que houvesse um grande desenvolvimento de ^mpamentc* tomou-se uma tcnica comum, presente na maioria dos laboratrios que rtnh7.am a an

e MARTIN. O interesse pela olo^a ^ T*

A cromatografia gasosa uma tcnica com um poder de resoluo excelente, tornando p

a anlise de dezenas de substncias de uma mesma amostra. Um dos principais motivos que to

gasosa de uso bastante acentuado a sua sensibilidade. Dependendo do tipo de substncia a

empregado, consegue-se detectar cerca de 10~12g. Essa sensibilidade faz com que haja ne

pequenas quantidades de amostra, o que em certos casos, um fator crtico e limira a utiliza obeno de resultados quantitativos em concentraes que variam de picogramas a miligramas.

importante salientar ainda que a cromatografia gasosa excelente como tcnica quantitat

Se de um lado a cromatografia gasosa apreseata todas estas vaalageas, p algum

aj termicamente, inconvenientes.E*.tcmcapod^ser emp^g na analise de substncias ^^^^que t

caso contrno, h necessidade de se fo viveL A anlise cromatogrfica i^oladam-n

^ ^

em

^ ^ ^es que ela possa ser

maioria das vezes h necessidade de etapas e n,am;na^0 da coluna cromatogrfica. s vezes, para que no haja interferncias duranu a an mujto o tempo e o cust disso, a etapa de preparao longa e complexa, a cromatografia gasosa no uma ttouca
eficiente, necessitando,

mu

os,,,. Outro fa

143

144

de gs, cia arrastada atravs da ao detector, que gera um sinal para

dor (Flgura VIII-1).

LRA V7IM Cromatograma fornecido pelo registrador.

sobreposio parcial devido a uma' ^ p'W)S_af>resentam'se separados e simtricos; na prtica po separao deficiente na coluna, ou a presena de picos com a

144

^ j=^r^*-=^5sr

< T
L

P
O H L O O O < hC/ )

2 </
>
L

c r

inje o

144

145

C,tadas a ama. 3 baia uma maior simetria nos picos e um a excessivamente longos sob condies , / ^abidade * amostra composta de substncias com ^ A Prgramao deT m uma grande difV temperatura

reteno de

su

,emperatura f

^ le bastante
ebulio.

De acordo com o tipo dc fase estadon*

Da

em

seus

P>os

de

om***. gs-aslido
Na cromatografia gs-slido, a fase est separao baseia-se em mecanismos de adsor^T ' ,T a usada principalmente na anlise de gases permanemieT** Na cromatografia gs-lquido a fase estad sdo ou as paredes de colunas capilares. A sepa^blT
UqUd mPstos

^
s6Ud S6U<J-A craografia

^ Kr c|mlfa

uma grande

gs-slido

apoiares

de baixa massa

^ *** brindo um suporte entre a fase hquida e a fase ga cromatografia gs-lquido

daJom- r meca^^ d* partio das substncias do total de aplicaes.

corresponde a ce

3. EFICINCIA

As medidas de separao das substndas da amostra em cromatografia em co.una j f definidas no Capitulo I. Aqui ser vuto um pouco mais sobre efidnda em cromatografia ga

A efidnda de uma coluna medida em termos de nmero de pratos tericos. Um pra

corresponde a uma etapa de equilbrio da substnda entre a fase estadonria e a fase mvel

quanto maior o numero de pratos tericos maior ser a efidnda (picos mais estreitos). O nmero d tericos definido por: n = 16 (d R / w b )2 onde D = nmero de pratos tericos dR = distncia de reteno Wb = largura do pico na linha da base

Muitos fatores afetam a eficincia de uma coluna, tais como o comprimento, dim

temperatura, vazo da fase mvel, volume da amostra, tcnica de injeo, caractersticas das

C. A comparao entre colunas de comprimentos diferentes pode ser feita utilizan equivalente 311131 prato terico (h), determinado pela equao:

h = L/n
0Dde

L o comprimento da coluna cromatogrfca.

146

VAN DEEMTER desenvo/veu un

aj--<

vdoddade linear do gs de arraie e fatores que prov cromatografia gs-lquido decido a sua maior u 3

CU PtMotempe

ue

as molcula

= L/W.

etM

O termo A refe^se a ^
molculas da amostra. Em

, . ltnear do gs de arraste onde a velocidade +B/u + Cu, b na fase T **+ etM^o o A n6cessrio usar colunas com uma 0termo At ^

= A

ntodop,co

tamanbopeQ

da outra, provocando ^t^eadas e P^ ^ fase m6vel, que proporao dimetros intemos pequeno molecular do ^ ^ ^ no g O termo B est relaaonado ^ , capaacUd ^ a)luna. o aumento da densidade d difusibilidade do soluto ma perda na efi ^ ^ presso> provoca uma dmnnui maior o alargamento do p. , ^ na sua massa mo fase q qu ^gruo como devido gs de arraste, quer seja po possvel, ousod de voca ^

na

largura dos pi* pois, ueste caso, - f

recobrindo

as partculas do su

quanto Quando a fase estacionria lquida, tem- ^ ^ ^ ^ a efldncia da coluna, j que tenno

maior for a espessura deste fdme, maior se r ^ ^ ^ molculas do ^luto da fase estacionria para a

est relacionado com a facilidade de -^dade (difusibilidade elevada) produz colun mvel. Um filme fino de fase lqui com necessidade ainda de se utilizar vaze eficientes. Para minimizar a contribmo do termo C, h necess. C - Anal fase mvel. A equao anterior melhor escrita da seguinte maneira:

2yDM 2 Dm d? h 2 u3 (1 + Dm)

Ds

dp

onde* h X dp Y

* altura equivalente a um prato terico = fator relacionado com irregularidades no recheio = dimetro mdio das partculas do suporte

= fator relacionado com as tortuosidades dos canais entre as partculas do = velocidade linear do gs de arraste = L / tM

Dm = coeficiente de difuso do soluto no gs de arraste

u
df
Ds

Dm = razo de distribuio das massas = - espessura do filme lquido

t*R / tM

147

148

temperatura da coluna melhora a sua eficincia entretanto, a dificuldade no enchimento H

CStaS Clunas

" mCnrCS temPeraturas; geralmente, a dim

menores

dimetrosinternossoma ^ta a sua utilizao.

velocidade linear do gs de arraste.

FIGURA VlH-2 Variao de h com a vtioci

Outros fatores, alm destes teladoeados com a ' s |ig chamados fatores extra-eoluua como. |W ^

luna podem causar o alargamento d

coluna-detector. Dcve-se, portanto, evitar

aseparao.

149

dap*"*

l, ,no tl.0MoP ^^or(

.riaioeoh

A CTOfflat^ rnearidade^^^no sujeitos a uma de de alteraes catalti pode-se destacar anao^ tempos ^tar ainda, a P'^ superfidal destes adsorventes p-*- /m nreseoa dos _^meote longos, p ^ *3 n.a.0. 'ad, do, adsoneoKa a a,o,K

- relao a cr

P <- T dfis e"pre8a< . loia d. coluna (olatilizao constao

no existe o problema relacionado com a sangr

estacionria). .natoerafia gs-slido so relacionados na Tabe Os prindpais adsorventes ^os^e ^ Century Series so os materiais mais utili

polinjerizao da ,=. pre^ea de trn, reagent

de entrecruzamento das cadeias. As caractersticas do material obtido dependem da nat

monmero, reagente de entrecruzamento e solvente. O Porapak (Millipore-Waters) e

polmero do eslireno ou etilvinilbenzeno, entrecruzado com divinilbenzeno, forman

uniforme, com poros de tamanho especfico. Este material pode ser modificado por cop

vrios outros monmeros polares, para produzir adsorventes de polaridades diferentes. Os sido usados para a separao de compostos apoiares e polares de baixa massa molecular e Uma propriedade importante deste tipo de material a eluirr. polares como picos, cuja assimetria quase desprezvel. e

da Chromosorb Century Series (Johns Manville) possuem caractersticas equivalentes. E

gua e

^smeros estruturais e geomtricos

Polmeros porosos
pafiliiuzido Slica
QrvSo

Gases permanente , _ -----------------------------------------A. compostos apoiares ou polares d

AJumina

Hidrocartionet C l'*(*rOCar*>onelos baixo ponto dc ebul