Revista Ciencias Xxxiii 2012

ISSN 0034-9313
Revista Ecuatoriana de
MEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS

VOLUMEN XXXIII NMEROS 1 y 2 OCTUBRE / 2012
Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas Volumen XXXIII Nmeros 1 y 2 - Octubre 2012 ISSN 0034-9313 Impresin: Centro de Publicaciones Pontificia Universidad Catlica del Ecuador Av. 12 de Octubre 1076 y Roca, Quito, Ecuador Imprenta: PPL Impresiones, Quito Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamn Carrin Seccin de Ciencias Naturales, Biolgicas y Ciencias Exactas Direccin de Publicaciones, Av. Seis de Diciembre N16-224 y Patria, Quito, Ecuador Diagramacin: Csar E. Salazar O. Diseo portada: scar Champutiz
REVISTA ECUATORIANA DE MEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamn Carrin Presidente: Sr. Ral Prez Torres Sociedad Ecuatoriana de Ciencias Biolgicas, Ncleo de Pichincha Presidente: Dr. Jaime Costales Cordero Pontificia Universidad Catlica del Ecuador Rector: Dr. Manuel Corrales Pascual, S.J. EDITORES: Dr. Carlos A. Soria Proao1 (Ciencias Naturales) 1 Pontificia Universidad Catlica del Ecuador Dr. Sergio Barba 1,2,3 (Medicina) 1 Sociedad Ecuatoriana de Alergologa, Inmunologa y Ciencias Afines; 2Universidad Central del Ecuador; 3Centro mdico AXXIS, Quito
NDICE Editorial TRABAJOS CIENTFICOS La placa del techo del gastrocele de Epipedobates tricolor (Anura: Dendrobatidae) 11 Natalia Senz Ponce, Michelle Arias Contreras y Eugenia M. del Pino Crecimiento de oocitos biderianos en machos adultos de Rhinella marina (Linnaeus, 1758) mediante el uso de hormonas y disruptores endcrinos Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez Cariologa beta de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica Ana Beatriz Mafla M 20 9
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Deteccin de genes codificantes de enzimas modificadoras de aminoglucsidos 46 (EMAs) en aislados clnicos de Pseudomonas aeruginosa Pedro Barba, David Ortega-Paredes, Mara Fernanda Yauri, Mercedes Rodrguez-Riglos, Jeannete Zurita e Iliana Alcocer Bsqueda de bacterias con actividad EC 3.2.1.4 (endo-1,4- beta-glucanasa) en Eisenia foetida (Oligochaeta, Lumbricidae) Carmen Amelia Salvador, Maira Rojas, Gabriela Jaramillo-Kouperman, Luca Ypez, Juan Pablo Surez, Leyanis Mesa y Csar Paz-y-Mio Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador Andrea Rodrguez-Guerra, Charles W. Barnes, Mara Eugenia Ordez, Andrs Salazar y Carlos A. Soria Preferencia de oviposicin en tres especies de polilla de la papa (Lepidoptera: Gelechiidae) Mario Andrs Herrera y Olivier Dangles REVISIN DE TRABAJOS CIENTFICOS Composicin, estructura, densidad y aspectos socio-ecolgicos de bandadas 88 mixtas de aves de sotobosque y dosel en una parcela de 100 ha, Parque Nacional Yasun, Amazonia Ecuatoriana Tjitte de Vries, Galo Buitrn, Marcelo Tobar, Paolo Piedrahita, Andrs Iglesias, Andrs Serrano, Mara Jos Erazo, Isabel Ojeda, Luis Baquero y Pablo Snchez 57
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NOTAS CIENTFICAS Descripcin de una nueva especie del gnero Drosophila (Diptera: Drosophilidae) miembro del grupo de Drosophila tripunctata Diego Cspedes y Violeta Rafael Cromosomas politnicos de Drosophila sp. nov. Especie primitiva del grupo de Drosophila repleta? Karina Betancourt Lista anotada de la avifauna en una parcela de 100 ha y en los alrededores de la Estacin Cientfica Yasun, Parque Nacional Yasun, Ecuador Paolo Piedrahita, Andrs Iglesias, Marcelo Tobar, Galo Buitrn, Andrs Serrano, Luis Baquero, Mara Jos Erazo, Isabel Ojeda, Pablo Snchez y Tjitte de Vries HOJAS DE VIDA El Dr. Plutarco Naranjo Vargas en la Alergologa e Inmunologa Sergio F Barba A Breve perfil cientfico del Dr. Plutarco Naranjo Vargas Oswaldo Bez Tobar 158 159 124
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Instructivo para autores 160
La Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas (REMCB) (ISSN 0034-9313) es un rgano de difusin cientfica auspiciada por la Sociedad Ecuatoriana Biologa ncleo de Pichincha, la Casa de la Cultura Ecuatoriana y la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador. La REMCB se encuentra incluida en el Citation Index Expanded, se publica anualmente y est dirigida a cientficos nacionales e internacionales as como a estudiantes de las ciencias de la vida. Para solicitud de sobretiros o cualquier correspondencia relacionada con la revista, favor dirigirse a: Dr. Carlos A. Soria, Quito-Ecuador. E-mail: revecuatorianamedycb@gmail.com o en la seccin de contacto en la pgina web www.puce.edu.ec/revistaciencia. Las opiniones expresadas en los artculos cientficos y en las publicaciones que aparecen en la revista son responsabilidad exclusiva de sus autores y no representan necesariamente el sentir de los editores de la REMCB, quienes no se responsabilizan por errores o por las consecuencias surgidas del uso del material que aparece publicado en la misma.
EDITORIAL
n marzo de 1963, hace casi 50 aos, se publica el primer volumen de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas, impulsada por visionarios como el Dr. Plutarco Naranjo, educador, gestor cientfico y mdico a quien rindo un homenaje pstumo y sentido. El objetivo de la revista fue incorporar la creacin cientfica ecuatoriana a los avances mundiales que entonces llegaban al pas con dificultad y en otros idiomas. Preparar una revista cientfica de publicacin regular y presentar a los lectores lo ms calificado de nuestras investigaciones era y es una ardua tarea. Dentro de estos parmetros, la revista se ha mantenido como un referente en la produccin cientfica ecuatoriana en el marco de las polticas de estado, de la comunidad y de respeto a la naturaleza. Se ha integrado la qumica verde o la qumica orgnica de maestros ahora ausentes como Ricardo Muoz, que en su legado acadmico nos dejaron varias generaciones de cientficos e ingenieros moleculares. Creemos que el contenido de la revista debe motivarnos a formular nuestras propias conclusiones. Que se entienda, por ejemplo, que nuestra diversidad biolgica est todava por descubrirse, que la kintica enzimtica, la PCR o reaccin en cadena de la polimerasa para reproducir secuencias genticas o para incorporar genomas en la bsqueda de macromolculas o nuevas identidades biolgicas, son tecnologas que estn llamando a nuestras puertas. El tema cientfico de los transgnicos debe ser conocido y estudiado en conjunto con otros aspectos como la existencia de monopolios, los capitales en juego o los efectos a largo o corto plazo en la salud. Nos interesa que se discuta abiertamente las ventajas y desventajas de cada tecnologa. Podemos hablar de los beneficios de la insulina o de los cultivos de maz o soya transgnicos de la misma manera que podramos analizar problemas como la competencia gentica que estos cultivos modificados implican en la vida autctona y en el banco de genes. Al conocer tecnologas nuevas, debemos tomar conciencia de nuestros derechos y responsabilidades adems de reconocer las implicaciones que se imponen a la sociedad. ltimamente los medios han subrayado el hecho de que el pas cuenta con pocas patentes pero deberamos analizar que quizs esta escasez no se deba a la falta de capacidad creativa, innovadora o a la falta de aplicacin industrial. Los problemas radican en los aspectos prcticos de cmo apoyar, promover, presentar, calificar y capitalizar una solicitud patentable. El premio Nobel ha reconocido este ao los avances de la Biologa del Desarrollo. Se ha destacado la importancia de la investigacin que reprograma clulas diferenciadas en clulas madre pluripotentes a travs de trasplantes nucleares, creando as nuevos conceptos histocompatibles de terapia gentico-molecular. En este nuevo volumen de la revista se reportan algunas investigaciones en Biologa del Desarrollo: el crecimiento de oocitos biderianos estimulados por hormonas y disruptores endcrinos y la caracterizacin de la placa del techo del gastrocele embrionario en anuros. En este punto, expreso mi reconocimiento a la Dra. Eugenia del Pino, profesora, investigadora y pionera de la Biologa del Desarrollo en el pas, actual Premio Eugenio Espejo a la investigacin cientfica ecuatoriana. Tambin se reporta la deteccin de genes de resistencia que codifican enzimas modificadoras de aminoglucsidos, la bsqueda de bacterias con actividad para beta-glucanos y hongos genticamente identificados poseedores de importante actividad celulsica. Se incluyen estudios cromosmicos para describir nuevas especies de insectos o se analiza la ovoposicin de polillas agrcolas; tambin se destacan dos contribuciones que describen la riqueza avifaunstica del bosque protector amaznico Yasun.
Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas - Vol. XXXIII Nmeros 1 y 2, octubre 2012 www.puce.edu.ec/revistaciencia
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Natalia Senz Ponce, Michelle Arias Contreras y Eugenia M. del Pino
Agradezco a cada uno de los articulistas por enviarnos sus trabajos para que, tras ser evaluados, se considere su inclusin en la revista. Reconozco la colaboracin desinteresada y annima de los colegas nacionales e internacionales que revisaron rigurosamente el contenido de los artculos. De igual forma va mi agradecimiento para los coordinadores auxiliares de edicin Lcds. David Tern y Andrea Rodrguez, quienes me ayudaron a mantener la comunicacin con los articulistas, los revisores y auspiciantes a fin de lograr este nuevo volumen que intenta cumplir estndares de calidad cada vez ms exigentes. A la Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamn Carrin por la diagramacin, a miembros de la Sociedad Ecuatoriana de Biologa por su colaboracin como revisores cientficos y a la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador por su ayuda incondicional con la impresin de este nuevo volumen. Dr. Carlos A. Soria, PhD Editor Cientfico REMCB
TRABAJOS CIENTFICOS
La placa del techo del gastrocele de Epipedobates tricolor (Anura: Dendrobatidae)
Natalia Senz Ponce, Michelle Arias Contreras y Eugenia M. del Pino1
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Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Escuela de Ciencias Biolgicas, Laboratorio de Biologa del Desarrollo, Quito, Ecuador. edelpino@puce.edu.ec Recibido: 04, 05, 2012; aceptado: 09, 10, 2012
RESUMEN.- En la mayora de los vertebrados usados como modelo del desarrollo, la determinacin de la asimetra izquierda-derecha de la localizacin de rganos tales como el corazn se determina en la neurula y obedece a un flujo de fluido hacia el lado izquierdo. El flujo de fluido est guiado por el movimiento sincronizado de cilios en el techo del gastrocele, que corresponde a la cara interna del techo de la neurula de los anuros. Se estudi la morfologa de la neurula y la placa del techo del gastrocele del anuro ecuatoriano, Epipedobates tricolor (Dendrobatidae). La placa del techo del gastrocele de la neurula de E. tricolor reviste dorsalmente a la cavidad del gastrocele y consiste de un epitelio monociliado, como en Xenopus laevis y otras ranas. La longitud de los cilios de E. tricolor fue de 8 m en promedio. La placa del techo del gastrocele de E. tricolor comparte las caractersticas morfolgicas observadas en la rana dendrobtida, Epipedobates machalilla y otras ranas con diversos modos reproductivos. La comparacin sugiere que E. tricolor mantiene el mecanismo de flujo de fluido guiado por cilios para la determinacin de la asimetra izquierda-derecha, como en otros anuros. PALABRAS CLAVE: Asimetra izquierda-derecha, cilios, nodo, placa del techo del gastrocele, vescula de Kupffer. ABSTRACT.- In most model vertebrates, the left-right asymmetry in the location of organs, such as the heart, is determined in the neurula, and derives from fluid flow towards the left side. The fluid flow results from synchronized movement of cilia in the gastrocoel roof plate, which is the inner side of the dorsal roof of the anuran neurula. The morphology of the neurula and of the gastrocoel roof plate was analyzed in the Ecuadorian anuran, Epipedobates tricolor (Dendrobatidae). The gastrocoel roof plate coats the gastrocoel cavity in the dorsal side in the E. tricolor neurula, and consists of a mono-ciliated epithelium, as in Xenopus laevis and other frogs. The cilia of the E. tricolor gastrocoel roof plate had a mean length of 8 m. The gastrocoel roof plate of E. tricolor shares similar morphological characteristics with the dendrobatid frog Epipedobates machalilla and with other frogs that display various modes of reproduction. The comparison suggests that fluid flow guided by cilia of the gastrocoel roof plate likely determines the left-right asymmetry in E. tricolor as in other anurans. KEYWORDS: Cilia, gastrocoel roof plate, Kupffers vesicle, left-right asymmetry, node.
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INTRODUCCIN Existen importantes asimetras del eje izquierdo-derecho en el cuerpo humano como son la localizacin asimtrica del corazn, del lbulo principal del hgado, del bazo y la vescula biliar. Mutaciones en el ratn han demostrado que hay dos niveles de regulacin del eje izquierdo-derecho: un nivel general y otro para cada uno de los rganos. Las mutaciones del gen situs inversus viscerum (iv) resulta en la determinacin aleatoria e independiente del eje izquierdo-derecho para cada rgano. La falta de coordinacin resultante produce trastornos, que pueden ser fatales, debido a que existen errores en la conexin de los principales vasos sanguneos. Por el contrario, los ratones son normales cuando se da la inversin de todos los rganos como imagen en el espejo. La inversin de rganos tambin ha sido detectada en los humanos. La asimetra izquierda-derecha de los rganos del cuerpo tiene como base la expresin asimtrica de genes durante el desarrollo embrionario. El punto determinante de la cascada de expresin gnica, que genera la asimetra izquierda-derecha tanto en los mamferos como en otros vertebrados, es la expresin de las protenas Nodal en el lado izquierdo de la placa lateral del mesodermo (revisado por Vandenberg y Levin, 2012; Gilbert, 2010; Blum et al., 2009; Tian y Meng, 2006). Todas las clulas tienen una asimtrica disposicin de las organelas (Hausen y Riebesell, 1991). Dicha asimetra en el huevo fecundado se considera la base de la asimetra izquierda-derecha de los vertebrados (Schweickert et al., 2012; Vandenberg y Levin, 2012). Por otro lado, se ha encontrado una estructura de la neurula que influye directamente en la asimetra izquierda-derecha. Esta estructura se deriva del mesodermo presuntivo superficial de la gstrula temprana, y en la neurula reviste la cara interna del notocordio posterior. En los mamferos esta estructura se conoce como el nodo o notocordio posterior, en los peces se denomina como la vescula de Kupffer, en tanto que en el anuro Xenopus laevis esta estructura
es la placa del techo del gastrocele. (Blum et al., 2009; 2007; Shook et al., 2004). La coordinacin entre los eventos tempranos de la determinacin de la asimetra izquierda-derecha con los eventos tardos, que ocurren despus de la gastrulacin, es desconocida (Schweickert et al., 2012; Vandenberg y Levin, 2012). El nodo, la vescula de Kupffer y la placa del techo del gastrocele son estructuras homlogas y transitorias que estn caracterizadas por derivarse del mesodermo y estar recubiertas de un epitelio mono-ciliado (Blum et al., 2009). Cada clula epitelial expresa polaridad planar manifestada por la presencia de un nico cilio localizado en la regin apical posterior (Antic et al., 2010; Blum et al., 2009). Los cilios tienen una longitud aproximada de 5 m en el pez cebra, el ratn y la rana X. laevis, y la rotacin coordinada de los cilios en el sentido de las agujas del reloj genera un flujo de fluido hacia el lado izquierdo (Blum et al., 2009). El flujo de fluido gatilla la expresin diferencial de genes en los lados izquierdo y derecho, lo que gatilla la formacin asimtrica de rganos y tejidos (Tian y Meng, 2006). En X. laevis se ha investigado la regulacin gnica de la asimetra izquierda-derecha. El movimiento coordinado de los cilios de la placa del techo del gastrocele produce un flujo de fluido hacia el lado izquierdo, el mismo que gatilla la expresin asimtrica del gen Nodal en el lado izquierdo de la neurula de la siguiente manera: El inhibidor de Nodal denominado Coco originalmente se expresa a ambos lados de la placa del techo del gastrocele. Como resultado del flujo de fluido, la expresin de Coco se reprime en el lado izquierdo permitiendo de esta manera la expresin de Nodal exclusivamente en ese lado. En cambio, en el lado derecho la continuada expresin de Coco reprime la expresin de Nodal y de esta manera se regula la expresin de Nodal de modo exclusivo en el lado izquierdo de la placa lateral del mesodermo. El inhibidor Coco es un miembro de la familia Cerberus-Dan de protenas secretadas inhibidoras y es homlogo al
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gen del ratn cerberus-like-2 (Schweickert et al., 2010). La cascada que gatilla la expresin de Nodal y la asimetra izquierda-derecha se alteran al interferir en el desarrollo de los cilios o al inhibir el flujo de fluido (Hatayama et al., 2011; Schweickert et al., 2010; Vick et al., 2009). La generacin de la asimetra izquierda-derecha del pollo difiere de la de otros vertebrados por cuanto sus embriones carecen de mesodermo presuntivo superficial y de clulas mono-ciliadas en el epitelio que reviste el techo de su arquentern (Blum et al., 2009; Schlueter y Brand, 2007; Shook et al., 2004). Se denomina gastrocele a la cavidad formada durante la gastrulacin que no est plenamente revestida de endodermo y que tiene mesodermo expuesto en la superficie de su techo. El arquentern es la cavidad formada durante la gastrulacin que se encuentra completamente revestida de endodermo (Shook et al., 2004). En las neurulas de las ranas Ceratophrys stolzmanni, Engystomops randi, Epipedobates machalilla y Gastrotheca riobambae se determin que la placa del techo del gastrocele consiste de epitelio mono-ciliado, evidencia que sugiere un patrn conservado que debe incluir flujo de fluido gatillado por el movimiento de los cilios para el establecimiento de la asimetra izquierda-derecha en estas ranas (Senz-Ponce et al., 2012). Las ranas analizadas difieren en su velocidad del desarrollo y modos de gastrulacin (Senz-Ponce et al., 2012). Como complemento a los estudios previos (Senz-Ponce et al., 2012), se procedi a analizar la presencia de clulas monociliadas en la placa del techo del gastrocele de la neurula de Epipedobates tricolor Boulenger, 1899 (Dendrobatidae). Esta especie est distribuida en la Provincia de Bolvar, Ecuador a una elevacin entre los 1.000 a 1.769 m (AmphibiaWeb, 2012). La gstrula de E. tricolor est caracterizada por la formacin de un prominente collar circumblastoporal y retardo en el alargamiento del gastrocele, un patrn similar al encontrado en Epipedobates machalilla y otros dendrobtidos (del Pino et al., 2007).
MATERIALES Y MTODOS Las neurulas de Epipedobates tricolor utilizadas en este estudio se obtuvieron de la donacin de posturas por parte de la Divisin de Anfibios del Museo de Zoologa de la PUCE y su programa de mantenimento en cautiverio de ranas, Balsa de los sapos. La localidad de coleccin de las ranas es Moraspungo, Provincia de Bolvar, Ecuador. Los embriones fueron mantenidos en cmaras hmedas a temperatura ambiente del laboratorio que fluctu entre 18 a 21 C. La determinacin de los estadios del desarrollo as como el cultivo y procesamiento de los embriones fue de acuerdo a lo descrito para E. machalilla (del Pino et al., 2004). Para analizar la morfologa externa de la neurula, los embriones fueron fijados en el fijativo de Smith (Moya et al., 2007). Se analiz tanto la morfologa externa de la neurula as como las caractersticas del techo del gastrocele para cada embrin. El lado dorsal de los embriones de estadios 13 a 16 fue bisectado para el anlisis del techo del gastrocele. Los cilios del techo del gastrocele fueron detectados mediante inmuno-localizacin en montaje entero. Los embriones fueron fijados en el fijativo de memfa por tres horas (Harland, 1991). Los embriones se incubaron en una dilucin 1:700 con un anticuerpo monoclonal producido en ratn contra la tubulina acetilada. El anticuerpo secundario fue anti-ratn, producido en conejo, conjugado-Cy3 (los dos anticuerpos se adquirieron de la compana Sigma, St. Louis, Mo, Estados Unidos). La dilucin utilizada fue de 1:250 (Vick et al., 2009). Para la deteccin de cilios se mont el techo del gastrocele en placas portaobjeto con glicerina y fueron cubiertas con laminillas cubreobjeto. Se analizaron los embriones con un microscopio de diseccin Stemi SV6 de Carl Zeiss. Las imgenes de fluorescencia de los cilios fueron obtenidas con un microscopio invertido AxioObserver.Z1 de Carl Zeiss. Ambos microscopios estn acoplados al programa Axiovision (Carl Zeiss, Overkochen, Alemania) que permiti la digitalizacin y microfotografa de las imgenes.
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RESULTADOS La neurula y la placa del techo del gastrocele de Epipedobates tricolor.- Se analiz la morfologa externa de la neurula de E. tricolor de aquellos embriones que luego fueron disectados para el estudio de la placa del techo del gastrocele. Las caractersticas del desarrollo de E. machalilla (del Pino et al., 2004) brindaron los parmetros de comparacin. Los huevos de E. tricolor son de tamao superior a los de E. machalilla (Tabla 1) y se caracterizan por mayor pigmentacin oscura en el hemisferio animal (del Pino et al., 2007). El pigmento oscuro permiti la clara deteccin de la placa neural en embriones de estadio 13 de E. tricolor (Fig. 1A). En el estadio 14 se observ que los pliegues neurales se encontraban elevados (Fig. 1B). En embriones ms avanzados, del estadio 15 se observ que los pliegues neurales estaban en contacto en la parte caudal del embrin, en tanto que en la parte rostral, los pliegues neurales an se mantenan separados (Fig. 1C). Estas caractersticas morfolgicas de la neurula de E. tricolor son similares a las caractersticas de la neurula de E. machalilla (del Pino et al., 2004). Se procedi a bisectar la regin de la placa neural de embriones de estadio 13 (Fig. 1A) y la regin de los pliegues neurales de embriones de estadios 14, 15 y 16 (Fig. 1B, C) para analizar la morfologa de la placa del techo del gastrocele. Para el efecto, se montaron las bisecciones en una placa portaobjeto y se procedi a observar la cara interna, que revisti al gastrocele y que correspondi al techo del gastrocele (Fig. 2A). Se detect un rea pigmentada de forma triangular, rostral al blastoporo cerrado y al gran collar circumblastoporal. Esta regin se localiza en la cara interna del techo del gastrocele en embriones de estadios 14 al 17 (Fig. 2A). El rea pigmentada estuvo delimitada lateralmente, a ambos lados, por regiones libres de pigmento que se considera corresponden a las crestas endodermales laterales (Fig. 2A). La estruc-
tura pigmentada corresponde a la placa del techo del gastrocele y tiene una morfologa similar a la observada en E. machalilla y Ceratophrys stolzmanni (Santillana Ortiz y del Pino, 2009; Senz-Ponce et al., 2012). De modo similar, la disposicin de las crestas endodermales laterales que bordean a la placa del techo del gastrocele fue similar a lo observado en otras especies. En X. laevis se ha demostrado que con el avance del desarrollo embrionario, las crestas endodermales laterales se juntan en la lnea media dorsal. Finalmente recubren totalmente con endodermo a la cavidad, que pasa a denominarse arquentern (Blum et al., 2009). En los embriones de E. tricolor, no se realizaron secciones histolgicas de la placa del techo del gastrocele, pero se procedi a analizar la presencia de un epitelio mono-ciliado en esta estructura. En embriones de estadios 14 a 16, se detect que el epitelio que reviste el techo del gastrocele consiste de clulas monociliadas (Fig. 2B). Los cilios tuvieron una longitud promedio de 8 m (Fig. 2B). No se detectaron cilios en embriones del estadio 13. Estas observaciones estn acordes con las caractersticas de la placa del techo del gastrocele en E. machalilla (Senz-Ponce et al., 2012). El tamao de los cilios de la placa del techo del gastrocele vara entre especies. Los cilios de mayor tamao ocurrieron en las dos especies de dendrobtidos, E. machalilla y E. tricolor, en comparacin con otras especies analizadas (Tabla 1) (Senz-Ponce et al., 2012; Blum et al.; 2009). Cabe resaltarse que los cilios de la placa del techo del gastrocele de E. tricolor fueron los ms grandes (Tabla 1). No se encontr relacin entre el tamao del huevo, modo reproductivo y velocidad del desarrollo con el tamao de los cilios de la placa de techo del gastrocele (Tabla 1).
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Tabla 1. Comparacin del desarrollo embrionario de E. tricolor con otras ranas
Especie
Modo reproductivo
Longitud de del huevo del Referenciasc b los cilios (mm) desarrolloa (m) Dimetro Tiempo
Desarrollo rpido Xenopus laevis Ceratophrys stolzmanni Engystomops randi Acutico 1.2 Acutico 2.2 Nido de espuma 1.1 14 horas 10 horas 24 horas 5 7 4 1,2 1,3 1,3
Desarrollo lento 1.6 Epipedobates machalilla Nido terrestre Nido terrestre 2.0 Epipedobates tricolor 3.0 Gastrotheca riobambae Bolsa materna
a
4 das 4 das 14 das
6 8 4
1,3 1 1,3
Tiempo desde la fecundacin hasta el final de la gastrulacin de acuerdo a del Pino et al. (2007). Longitud de los cilios de la placa del techo del gastrocele. c Referencias: 1, del Pino et al., 2007; 2, Blum et al., 2009; 3, Senz-Ponce et al., 2012.
b
Figura 1. Vista externa de la neurula de E. tricolor. Los embriones estn orientados con la regin rostral hacia arriba. (A) Estadio avanzado de blastoporo en forma de hendidura, que muestra la formacin de la placa neural. (B) Neurula temprana. Se distinguen los pliegues neurales elevados. (C) Neurula media. Los pliegues neurales se encuentran paralelos en la regin media y caudal. Abreviaturas: b, blastoporo; est, estadio; pn, placa neural; pl, pliegue neurales. Los estadios del desarrollo en esta y las siguientes figuras fueron determinados de acuerdo a del Pino et al., 2004 y Nieuwkoop y Faber, 1994.
DISCUSIN Modos de gastrulacin y la placa del techo del gastrocele.- Existen importantes diferencias en el modo de gastrulacin de X. laevis (Pipidae) y Engystomops randi (Leiuperidae), especies con desarrollo rpido, en com-
paracin con las especies de desarrollo lento E. machalilla, E. tricolor (Dendrobatidae), y G. riobambae (Hemiphractidae) (del Pino, 2010; del Pino et al., 2007; Moya et al., 2007). En particular el alargamiento del notocordio ocurre despus del cerramiento del blastopo-
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Figura 2. La placa del techo del gastrocele en la neurula de E. tricolor. (A) Vista en montaje entero de la placa del techo del gastrocele. La vista externa de este embrin fue similar al embrin que se muestra en la Fig 1B. Con puntos oscuros se sealan los bordes de las crestas endodermales laterales. La placa del techo del gastrocele tiene pigmentacin oscura. El embrin est orientado con la regin dorsal hacia arriba. (B) Campo de cilios de la placa del techo del gastrocele detectados por inmuno-localizacin y fluorescencia indirecta en una neurula temprana, similar a la que se muestra en la Fig. 1B. Los cilios miden 8 m, en promedio. La barra corresponde a 100 m (A) y 20 m (B). Abreviaturas: b, blastoporo; est, estadio; ccb, collar circumblastoporal; ptg, placa del techo del gastrocele.
ro en las especies de desarrollo lento. Por tal motivo era de particular inters determinar el inicio de la formacin de la placa del techo del gastrocele y la presencia de cilios en esta estructura en especies con diversos modos reproductivos y velocidades del desarrollo (Senz-Ponce et al., 2012). El anlisis ha permitido sugerir que, como en X. laevis, las especies analizadas tienen mesodermo presuntivo superficial en la zona ecuatorial de la gstrula temprana de estadio 10.5 (Fig. 3), el mismo que es internalizado por los movimientos de la gastrulacin. En las ranas con desarrollo rpido, el mesodermo presuntivo dorsal reviste el techo del gastrocele durante la gastrulacin en tanto que en aqullas de desarrollo lento, el mesodermo presuntivo se almacena en la superficie del gran collar circumblastoporal que se forma durante la gastrulacin. Una vez que se inicia el alargamiento del notocordio y del embrin, debido a la convergencia y extensin dorsales (estadio 13), se alarga el gastrocele y
el mesodermo dorsal reviste el techo de esta cavidad (estadio 14), al igual que en las especies de desarrollo rpido (Fig. 3). Aun cuando no se ha realizado el mapeo del mesodermo, se propone que la placa del techo del gastrocele, con un origen en el mesodermo presuntivo superficial de la gstrula temprana, es un aspecto conservado del desarrollo de ranas que pertenecen a cuatro familias diferentes y que tienen diferentes modos de gastrulacin (Tabla 1). Comparacin de la placa del techo del gastrocele de E. tricolor con otras especies.La neurula de E. tricolor tiene un epitelio ciliado en el techo del gastrocele como en otras ranas (Senz-Ponce et al., 2012; Blum et al., 2009). Este estudio aade datos al anlisis de Senz-Ponce et al., 2012 y sealan que la presencia de epitelio mono-ciliado ocurre en un dendrobtido cuyos huevos son de mayor tamao que los de E. machalilla (Tabla 1). La presencia de un techo del gastrocele ciliado en
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Figura 3. Destino hipottico del mesodermo presuntivo superficial en ranas con desarrollo rpido (Ceratophrys stolzmanni, Engystomops randi y Xenopus laevis) y desarrollo lento (Epipedobates machalilla, Epipedobates tricolor y Gastrotheca riobambae) (Senz-Ponce et al., 2012; Shook et al., 2004). El mesodermo presuntivo est resaltado con un trazo grueso en color gris oscuro. El lado dorsal est orientado a la derecha. Se ha omitido el blastocele en todos los embriones, y solamente se muestra en embriones de estadio 10.5. Abreviaturas: b, blastoporo; ccb, collar circumblastoporal; g, gastrocele; ld, labio dorsal del blastoporo; lv, labio ventral del blastoporo. Este diagrama fue modificado de Senz-Ponce et al., 2012.
la neurula de ranas con diferentes velocidades del desarrollo y diferentes estrategias reproductivas (Tabla 1) indica que en estas ranas la asimetra izquierda-derecha posiblemente se deba a flujo de fluido en el techo del gastrocele como ha sido demostrado para X. laevis y otros vertebrados. Para complementar los estudios de la determinacin de la asimetra izquierda-derecha por flujo de fluido es de inters analizar la presencia del equivalente de la placa del techo del gastrocele tanto en reptiles como en aves. El estmulo que desencadena la asimetra izquierda-derecha es desconocido para los reptiles. En el caso del pollo, no se ha detectado mesodermo presuntivo superficial ni la
presencia de cilios en el techo de la cavidad de la neurula. Se considera que en el pollo, la asimetra izquierda-derecha no est gatillada por cilios, por tal motivo es de inters el anlisis comparativo con los embriones de otras aves (Blum et al., 2009). La significativa biodiversidad del Ecuador provee de modelos alternativos del desarrollo cuyo estudio es de inters tanto para documentar la biologa de organismos ecuatorianos como para la mejor comprensin de fenmenos del desarrollo. En este caso se recomienda la ampliacin de estudios de la determinacin de la asimetra izquierda-derecha en vertebrados tales como los reptiles y las aves.
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AGRADECIMIENTOS nal Journal of Developmental Biology, Se expresa agradecimiento a los colabo48: 663670. radores del Laboratorio de Biologa del De- del Pino EM, VenegasFerrn M, Romero sarrollo de la Pontificia Universidad Catlica Carvajal A, MontenegroLarrea P, Senz del Ecuador (PUCE) por su ayuda durante la Ponce N, Moya IM, Alarcn I, Sudou N, realizacin de este estudio. Se agradece a los Yamamoto S y Taira M. 2007. A compamiembros de la Divisin de Anfibios del Murative analysis of frog early development. seo de Zoologa de la PUCE y su programa Proceedings of the National Academy of Balsa de los sapos por la donacin de postuSciences USA, 104: 1188211888. ras de E. tricolor. Este trabajo recibi el apoyo del Pino EM. 2010. La gastrulacin en ranas de becas de investigacin de la PUCE. con diversos modos de reproduccin. Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas, 31: 94105. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Gilbert SF. 2010. Developmental Biology. 9th Amphibiaweb 2012. Information on amed. Sunderland, Massachussetts: Sinauer phibian biology and conservation. Associates, Inc. 711 pp. [web application]. Berkeley, Califor- Harland RM. 1991. In situ hybridization: an nia: AmphibiaWeb. Pgina de Internet: improved wholemount method for Xehttp://amphibiaweb.org/. Consultada nopus embryos. Methods in Cell Biology, 25-abril-2012. 36: 685695. Antic D, Stubbs JL, Suyama K, Kintner C, Hatayama M, Mikoshiba K y Aruga J. 2011. Scott MP y Axelrod JD. 2010. Planar cell IP(3) signaling is required for cilia forpolarity enables posterior localization of mation and leftright body axis determinodal cilia and leftright axis determinanation in Xenopus embryos. Biochemical tion during mouse and Xenopus embryoand Biophysical Research Communicagenesis. PloS One, 5(2): e8999. tions, 410: 520524. Blum M, Andre P, Muders K, Schweickert A, Hausen P y Riebesell M. 1991. The early deFischer A, Bitzer E, Bogusch S, Beyer T, velopment of Xenopus laevis. Springer Van Straaten HWM y Viebahn C. 2007. Verlag. Berlin, Heidelberg, New York. Ciliation and gene expression distinguish 142 pp. between node and posterior notochord in Moya IM, Alarcn I y del Pino EM. 2007. the mammalian embryo. Differentiation, Gastrulation of Gastrotheca riobambae 75: 133146. in comparison with other frogs. DeveloBlum M, Beyer T, Weber T, Vick P, Andre pmental Biology, 304: 467478. P, Bitzer E y Schweickert A. 2009. Xe- Nieuwkoop PD y Faber J. 1994. Normal table nopus, an ideal model system to study of Xenopus laevis (Daudin). Garland Puvertebrate leftright asymmetry. Develoblishing. New York, USA. 282pp. pmental Dynamics, 238: 12151225. SenzPonce N, SantillanaOrtiz JD y del Blum M, Weber T, Beyer T y Vick P. 2009. Pino EM. 2012. The gastrocoel roof plate Evolution of leftward flow. Seminars in in embryos of different frogs. DifferentiaCell and Developmental Biology, 20: tion, 83: S62S66. 464471. Santillana Ortiz JD y del Pino EM. 2009. Cadel Pino EM, vila ME, Prez OD, Bentez ractersticas morfolgicas de la gstrula MS, Alarcn I, Noboa V y Moya IM. en Ceratophrys stolzmanni (Anura: Cera2004. Development of the dendrobatid tophryidae). Revista Ecuatoriana de Mefrog Colostethus machalilla. Internatiodicina y Ciencias Biolgicas, 30: 5056.
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Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez
Crecimiento de oocitos biderianos en machos adultos de Rhinella marina (Linnaeus, 1758) mediante el uso de hormonas y disruptores endcrinos
Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez1
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Laboratorio de Biologa del Desarrollo y Biologa Molecular, Escuela de Ciencias Biolgicas, PUCE, Quito, Ecuador. odeperez@puce.edu.ec Recibido: 13, 03, 2012; aceptado: 11, 10, 2012
RESUMEN.- En la regin anterior de los testculos de los machos de ciertos taxa de la familia Bufonidae se localiza el rgano de Bidder (OB), un ovario rudimentario no funcional que crece y se desarrolla parcialmente si los testculos son removidos. En esta investigacin se analiz el efecto de hormonas y disruptores endcrinos sobre el crecimiento de los oocitos del OB de machos adultos orquidectomizados de la especie Rhinella marina. Machos adultos fueron orquidectomizados y sometidos a dosis diarias de una solucin salina, atrazina y progesterona durante un periodo de dos meses y el efecto de dichas substancias fue analizado mediante observaciones en la morfologa interna y externa y mediciones del dimetro mximo de los oocitos biderianos de los machos oquidectomizados. Todos los tratamientos exhibieron un incremento en el dimetro mximo de los oocitos biderianos. Los tratamientos que presentaron oocitos de mayor tamao y con caractersticas correspondientes a estadios de la oognesis posteriores, fueron el tratamiento con progesterona seguido por el tratamiento con atrazina + progesterona; sin embargo, se obtuvo una baja cantidad de oocitos crecidos. Los resultados sugieren que la hormona progesterona fue la que promovi un mayor crecimiento de los oocitos biderianos de machos orquidectomizados de la especie Rhinella marina. PALABRAS CLAVE: Atrazina, rgano de Bidder, orquidectomizacin, progesterona, vitelognesis. ABSTRACT.- The Bidders organ is located anterior to the testis of some taxa of bufonid toads ; it is a rudimentary non-functional ovary, which grows and partially develops if the testes are removed. In this research, we analyzed the growing effect of hormones and endocrine disruptors on Bidders organ (BO) oocytes of orchidectomized adult males of Rhinella marina. Adult males were orchidectomized and subjected to daily doses of saline, atrazine and progesterone solutions for a two months period. The effects of these compounds were tested by observations in the internal and external morphology and measurements of the maximum diameter of the Bidderian follicles. All treatments showed an increase in the maximum diameter of bidderian oocytes after two months of treatment. Progesterone produced more advanced oogenesis stages than the ones with atrazine + progesterone. However, the number of grown oocytes in both cases was quite low. These results suggest that progesterone is the most suitable for inducing growth in the Bidderian oocytes of orchidectomized Rhinella marina male toads. KEYWORDS: Atrazine, Bidders organ, orquidectomy, progesterone, vitellogenesis.
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INTRODUCCIN El rgano de Bidder (OB) es un ovario vestigial presente en la mayora de especies de la familia Bufonidae siendo una sinapomorfa de los clados ms derivados (Pramuk et al., 2008; Frost et al., 2006; Pramuk, 2006; Duellman y Tueb, 1986). Se desarrolla a partir del primordio gonadal en la etapa larval de los embriones de esta familia. Inicialmente, el primordio gonadal posee caractersticas de ovario, las cuales se mantendrn en las hembras hasta el final de su desarrollo. Sin embargo, en los machos, la regin posterior del primordio se diferencia en testculo al final de la metamorfosis, mientras que la regin anterior mantiene las caractersticas de ovario formando el rgano de Bidder (Norris y Lopez, 2011; Falconi et al., 2007; Falconi et al., 2004; Brown et al., 2002). En los machos de las especies de la familia Bufonidae que poseen OB; como es el caso de las especies del gnero Bufo, Pedostibes, Nectophrynoides, entre otros (Davis, 1936), la extirpacin quirrgica de uno o de ambos testculos u orquidectoma causar un incremento en el tamao de dicho rgano (Farias et al., 2002; Pancak-Roessler y Norris, 1991). De igual manera, los oocitos dentro de este rgano crecern e iniciarn el proceso vitelognico alcanzando estadios de la oognesis posteriores (Brown et al., 2002; Cannatella et al., 2001; Pancak-Roessler y Norris, 1991). La ausencia de hormonas masculinas producidas por los testculos, promueve el incremento de tamao del OB como la iniciacin del proceso vitelognico de sus oocitos; estas hormonas, cuando estn presentes, poseen un efecto inhibitorio en el crecimiento de dicho rgano (Brown et al., 2002; Pancak-Roessler y Norris, 1991; Ghosh et al., 1990). El tiempo de crecimiento de los oocitos despus de la orquidectoma es bastante lento, alcanzando los estadios II, III y IV de la oognesis hasta tres meses despus de la orquidectomizacin (Wolpert et al., 2007; Brown et al., 2002; Pancak-Roessler y Norris, 1991).
Durante la oognesis en anfibios (proceso de formacin, crecimiento y maduracin de los gametos femeninos) las clulas germinales femeninas (oogonias) sufren meiosis, la cual est acompaada por pausas o arrestos que se producen en determinados momentos de este proceso (Norris y Lopez, 2011; Gilbert, 2010; Wolpert et al., 2007; Bill, 2002). Un evento importante de la oognesis es la vitelognesis (periodo de crecimiento nuclear y citoplasmtico que se da despus del primer arresto meitico en diplotene de profase I) en el cual la protena vitelogenina es sintetizada en el hgado y transportada por el sistema sanguneo al ovario. Dentro del oocito, esta protena es convertida en lipoviteina y fosvitina, protenas que forman parte de las plaquetas de yema, compuesto necesario para la posterior nutricin del embrin (Hausen y Riebesell, 1991; Wallace y Selman, 1990; Wallace y Bergink, 1974). El sistema endcrino cumple un papel muy importante en la modulacin y regulacin de la oognesis. Las hormonas, especialmente las hormonas gonadales, estn involucradas en el crecimiento de los oocitos (a travs de la estimulacin de la vitelognesis), en la reiniciacin del proceso meitico y en los cambios estructurales del citoplasma y del crtex celular despus de la ruptura de la vescula germinal (Norris y Lopez, 2011; Schuetz, 1974). La hormona folculo estimulante (FSH), por ejemplo, es trascendental dentro del proceso vitelognico ya que estimula la produccin de 17-estradiol, el cual a su vez estimula al hgado para que produzca vitelogenina. De igual manera, la hormona luteinizante (LH) estimula produccin de progesterona, hormona involucrada en el proceso de maduracin nuclear en oocitos completamente desarrollados, oocitos de estadio VI (Norris y Lopez, 2011; Gilbert, 2010). Un aspecto interesante sobre el proceso de crecimiento y maduracin de los oocitos (de ovario y rgano de Bidder) es que puede ser gatillado experimentalmente. Diferentes
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hormonas, gonadotropina corinica humana (hCG), progesterona y testosterona, y los extractos de pituitaria, han sido utilizadas para inducir crecimiento, maduracin y ovulacin en varias especies de anfibios (Bravo et al., 1978). En el rgano de Bidder el uso de hormonas ha promovido diversos cambios dependiendo de la hormona que se ha utilizado, la especie que ha sido inducida y la etapa del desarrollo en la que esta se encuentra. En machos adultos de Bufo woodhousii, por ejemplo, las hormonas gonadotropina corinica humana y gonadotropina de suero de yegua preada provocaron un incremento en el tamao de dicho rgano, as como tambin un incremento en el tamao de los oocitos preexistentes (Pancak-Roessler y Norris, 1991). De igual manera, la exposicin a hormonas tanto masculinas como femeninas en larvas de la especie Bufo vulgaris promovi un retraso en el desarrollo del OB en los individuos que fueron inducidos con testosterona y extractos de testculo y, dependiendo de la dosis, se observ un incremento de tamao en el OB en las larvas expuestas a estradiol y extractos de pituitaria (Takahashi, 1956). Otros compuestos qumicos tambin pueden provocar crecimiento e incluso completa feminizacin en machos de distintas especies de anfibios, ya que actan como disruptores endcrinos modificando la seal hormonal del individuo y alterando el sistema masculino reproductivo (Diamanti-Kandarakis et al., 2009). En los machos la feminizacin (induccin o desarrollo anormal de caracteres femeninos) generalmente se produce debido a desrdenes genticos o adquiridos del sistema endcrino (Norris y Lopez, 2011; Blood et al., 2007). La exposicin a disruptores endcrinos altera el sealamiento hormonal normal durante el desarrollo embrinico, cambiando permanentemente la morfologa y funcin del sistema reproductivo en el adulto y su comportamiento reproductivo (McCoy et al., 2008). Varios pesticidas utilizados en la industria agrcola son disruptores endcrinos y cau-
san anormalidades reproductivas en los individuos expuestos a ellos. La atrazina, uno de los pesticidas ms usados en la industria agrcola alrededor del mundo, es conocida por ser un potente disruptor endcrino a bajas concentraciones. En anfibios, este compuesto suele ser ms potente debido a que su actividad dentro de estos organismos se produce a niveles mucho ms bajos en comparacin con otros taxa (Hayes et al., 2002). Por ejemplo, Hayes et al., 2010, muestra las consecuencias reproductivas de la exposicin de larvas de Xenopus laevis a la atrazina; ya que los machos adultos que fueron expuestos a la atrazina, desde la etapa larval hasta la metamorfosis, mostraron una desmasculinizacin (castracin qumica) y completa feminizacin; es decir que el hermafroditismo observado en la metamorfosis result, en la mayora de los casos, en una feminizacin completa y persistente ya que a pesar de ser genotpicamente machos los individuos de esta especie presentaban caractersticas fenotpicas femeninas, as como tambin eran reproductivamente funcionales y capaces de producir huevos viables. Basados en estos conceptos, el presente estudio explora la induccin del crecimiento de los oocitos biderianos en bufnidos machos de la especie Rhinella marina, mediante la aplicacin de distintos tratamientos hormonales y qumicos con el fin de obtener oocitos de estadios oognicos posteriores; por lo que el objetivo de este estudio fue acelerar el proceso de crecimiento en los oocitos del rgano de Bidder en machos adultos orquidectomizados de la especie Rhinella marina mediante el uso de hormonas y disruptores endcrinos. MATERIALES Y MTODOS Recoleccin y aclimatacin.- Veinte y dos machos adultos de la especie Rhinella marina fueron colectados en las localidades de Jama, Manab y Santo Domingo, Santo Domingo de los Tschilas a lo largo del ao 2010. En el Laboratorio de Biologa del Desarrollo y Biologa Molecular (PUCE) estos
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animales fueron pesados, medidos (longitud boca-ano), fotografiados (no se muestran fotografas), identificados y distribuidos en cuatro terrarios (correspondientes al grupo control y a los tres tratamientos), en grupos de seis animales por cada terrario para, posteriormente, ser sometidos a un proceso de aclimatacin a las condiciones estndares del laboratorio durante un perodo de dos meses. Orquidectoma.- Finalizada la aclimatacin, se removieron ambos testculos (oquidectoma bilateral) en los 22 machos adultos colectados. Los animales fueron anestesiados sumergindolos parcialmente en el anestsico MS-222 SIGMA-ALDRICH (Cat. No. E10521) por 20 minutos aproximadamente; a continuacin, con tijeras de punta fina (MEDITEC cc), se realiz una incisin (de 15 mm de longitud aproximadamente) a 1cm de la lnea media del animal y a 30mm de la base del abdomen y se removieron los testculos. En algunos casos la remocin fue parcial debido a que el rgano de Bidder (OB) rodeaba la punta del testculo; no obstante, se extrajo la mayor cantidad posible de testculo, evitando daar el OB. Durante la operacin se tomaron fotos y medidas de ambos OB en cada individuo. De igual manera, se tomaron fotos y medidas de los dos testculos removidos. Finalmente, las incisiones fueron suturadas con hilo quirrgico reabsorberte Vicryl Plus antibacterial # 3 ETHICON. Posterior a la operacin, los animales fueron trasladados a un terrario individual, durante una semana, para permitir su recuperacin.
toma y progesterona los animales recibieron una inyeccin intraperitoneal de solucin de progesterona (SIGMA-ALDRICH, Cat. No.P8783) 7 g/ml en solucin Ringer. En el tratamiento orquidectoma y atrazina los animales fueron expuestos a una solucin de atrazina (Gesaprim 9WG ECUAQUIMICA) 0.1 ppb en agua reposada, la cual se coloc en la base del terrario para que est en contacto permanente con la superficie ventral del animal; para ello se realiz una previa aclimatacin en la cual los animales fueron colocados individualmente en terrarios con 100 ml de agua reposada (sin disruptor endcrino) durante un periodo de dos semanas. Finalmente, para el cuarto tratamiento, orquidectoma y atrazina + progesterona, los animales fueron sometidos tanto a las inyecciones de progesterona como a la exposicin ventral de la solucin de atrazina.
Cortes y anlisis morfolgico del OB.Finalizados los dos meses, los individuos de los cuatro tratamientos fueron sacrificados para extraer los rganos de Bidder izquierdo y derecho. De igual manera, se extrajo una porcin de ovario de una hembra de la misma especie para comparar la morfologa de ambas estructuras (OB y ovario). La morfologa externa y el tamao de los oocitos de dichos rganos fueron registrados por medio de micrografas utilizando un estereoscopio Stemi SV11 ZEISS y una cmara digital Canon PowerShot G9. A continuacin, se fij ambos rganos en Smiths durante 24 horas a temperatura ambiente. Despus de Tratamientos (grupos experimenta- este periodo, los rganos fueron sometidos a les).- Los sapos orquidectomizados fueron lavados seriales con agua destilada y fueron sometidos a cuatro tratamientos distintos du- almacenados a temperatura ambiente en una rante un periodo de dos meses. Tanto las in- solucin de formaldehdo 1.5 % para su posyecciones, colocadas en la regin intraperito- terior anlisis morfolgico mediante cortes neal (Browne et al., 2006), como la solucin histolgicos. que contena el disruptor endocrino fueron adPara los cortes histolgicos se modifiministradas diariamente. c el protocolo descrito por Liu, 2006, para En el tratamiento control: orquidecto- la tincin histoqumica de oocitos ya que se ma se inyect 100 l de Solucin de Ringer aument el tiempo de deshidratacin y el para anfibios. Para el tratamiento orquidecRevista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas - Vol. XXXIII Nmeros 1 y 2, octubre 2012 www.puce.edu.ec/revistaciencia
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de infiltracincon paraplast (Histosec Pastillas-MERCK). Utilizando un micrtomo (820 Reichet HistoSTAT Rotary microtome) se cort el tejido en secciones de 25 m de espesor, las cuales fueron colocadas en placas Superfrost Plus FISHER SCIENTIFIC (Cat. No. 12-550-14). Para la tincin de las placas se sigui el protocolo de tincin con eosina y hematoxilina de Mayer (Lee, 1960) con algunas modificaciones en el tiempo de exposicin a las soluciones.
Para establecer el estadio de la oognesis tanto de las micrografas como de los cortes del OB de los machos orquidectomizados sometidos a los tratamientos, se midi el dimetro de los oocitos ms grandes de cada rgano de Bidder y se lo compar con la tabla de oognesis descrita por Brown et al., 2002, para la especie Rhinella marina (Anexo 1). Anlisis estadstico.- Para observar el efecto de los tratamientos sobre el crecimiento de los oocitos del OB de los machos orquidec-
Anexo 1. Tabla de la oognesis de Rhinella marina. La oognesis de R. marina fue clasificada en seis estadios definidos de acuerdo a la tabla de oognesis de Dumont (1972) para Xenopus laevis (Brown et al., 2002).
Estadios de la oognesis en Bufo marinus* Estadio Dimetro del oocito (m) 1 50-300 2 300-450 3 450-600 4 600-1000 5 1000-1200 6 1200-1400 Citoplasma translcido sin plaquetas de yema. Vs con nuclolos y localizada centralmente. Citoplasma blanco-translcido, debido a la formacin de plaquetas de yema. En la Vs se observan cromosomas plumosos y varios nuclolos localizados principalmente en la periferia. Oocito opaco y ligeramente pigmentado. Plaquetas de yema de mayor longitud. El centralmente localizado ncleo contiene nuclolos localizados principalmente en la periferia. Se observa vascularizacin alrededor de los oocitos. Pigmentacin oscura presente en todo el oocito, con una mayor concentracin en el polo animal. Plaquetas de yem mucho ms largas y abundantes. Vs ligeramente desplazad hacia el polo animal. Numerosos nuclolos localizados en la periferia del ncleo. Visible vascularizacin alrededor de los oocitos. Polos animal y vegetal claramente visibles en el oocito con una mayor concentracin de pigmento en el polo animal. Plaquetas de yema mucho ms largas y abundantes. La Vs es desplazada hacia la regin animal. Numerosos nuclolos localizados en la periferia del ncleo. No se observa RVs. vascularizacin alrededor de los oocitos. Polos animal y vegetal claramente visibles en el oocito, con una mayor concentracin en el polo animal. No se distingue la lnea ecuatorial de pigmento en el ligeramente pigmentado polo vegetal. Se observa vascularizacin alrededor de los oocitos. En los oocitos de este estadio no se analiz la RVs y la histologa. Caractersticas citolgicas
* Los estadios de la oognesis fueron definidos de acuerdo a Xenopus laevis (Dumont 1972). Vs, vescula germinal; RVs, ruptura de la vescula germinal
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tomizados se realiz un Anlisis de Varianza (ANOVA) factorial (4 x 2), utilizando como variable el dimetro mximo de los oocitos del OB derecho e izquierdo de los animales de cada tratamiento. Tambin se realizaron comparaciones ortogonales para determinar la combinacin de los tratamientos frente al control o entre tratamientos del rgano de Bidder de cada lado en el programa estadstico SPSS 17.0. Dichas interacciones fueron graficadas mediante diagramas de caja (box plots) utilizando el programa Golden Grapher 7.0.
opaco y transparente), dimetros y diferentes caractersticas morfolgicas y citolgicas. Los oocitos de todos los estadios se encontraban rodeados por una capa de clulas foliculares.
Descripcin de la gnada masculina de los machos de Rhinella marina.- La gnada de los machos, durante la orquidectomizacin, present las dos estructuras que forman parte de la gnada masculina en bufnidos; el rgano de Bidder (OB) y el testculo. Ambas estructuras presentaron diferencias en su morfologa, claramente observables en la zona de transicin entre el testculo y el OB (Figura RESULTADOS Descripcin morfolgica del ovario de 1A-B). Rhinella marina.- La porcin de ovario extrado a la hembra de R. marina contena ooci-
Figura 1. Zona de transicin testculo-rgano de Bidder. (A) Corte histolgico del rgano de Bidder izquierdo, animal # 12 del tratamiento orquidectoma y progesterona. (B) Micrografa del rgano de Bidder izquierdo, animal # 10 previo al tratamiento orquidectoma y progesterona. Las flechas indican la zona de transicin. La barra representa 500 m (A) y 2 mm (B). t, testculo; OB, rgano de Bidder.
tos en diferentes estadios de la oognesis. Los oocitos ms grandes (1 200 m de dimetro) presentaron una clara diferenciacin entre el polo animal y vegetal con una mayor concentracin de pigmento (de color caf oscuro) en el polo animal; la vescula germinal se encontraba desplazada hacia este polo. Tambin se encontraron oocitos de menor tamao que presentaban coloraciones (caf claro, blanco
Los testculos removidos, observados in vivo, eran de color amarillo plido, forma ovalada alargada, con alta vascularizacin y un ensanchamiento en la regin de unin al OB. En los cortes histolgicos se observaron tbulos seminferos con espermatogonias, espermatocitos y agrupaciones de espermatozoides. Los testculos izquierdo y derecho de los 22 animales midieron en promedio 21.3 mm de largo y 4 mm de ancho y pesaron 106 mg.
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Durante las operaciones, se encontr al OB adherido al extremo anterior de cada testculo y unido a un cuerpo graso. Estructuralmente, present una coloracin rosada-plida y un tamao y forma variables. En algunos animales se observaron manchas de color negro (clulas con melanina) alrededor de todo el OB o en determinadas regiones. Las mediciones del dimetro de los oocitos biderianos de mayor tamao de los OB de los veinte y dos machos arrojaron un dimetro promedio de 189 m. La mayora de estos oocitos, segn la tabla de oognesis para R. marina (Brown et al., 2002), se encontraban en el estadio I de la oognesis mientras que nicamente tres de los veinticuatro animales presentaron oocitos de estadio II. Morfolgicamente, los oocitos biderianos eran ligeramente transparentes con una gran vescula germinal fcilmente visible in vivo. Efecto de la orquidectoma y la administracin de progesterona y atrazina sobre el OB.- Despus de los dos meses de tratamiento se observ una mayor vascularizacin en el rgano de Bidder y los oocitos de todos los tratamientos y un considerable aumento de tamao de dichos oocitos, alcanzado un dimetro promedio general de 346 m (Tabla 1 aqu). En los cortes histolgicos tambin se pudieron observar algunas zonas con oocitos atrsicos y ciertas zonas con manchas de color caf o negro, correspondientes a clulas con melanina. Al comparar todos los tratamientos, mediante ANOVA factorial (4 x 2) de los datos transformados (Coeficiente Variacin datos no transformados = 58.6 %) se encontr diferencias altamente significativas entre los tratamientos (F = 4.3; p = 0.009) pero no entre rgano de Bidder izquierdo y derecho (F = 1.4; p > 0.05). En las comparaciones ortogonales, se encontr un media mayor, numricamente, en el tratamiento control: orquidectoma del OB izquierdo comparado con los otros tratamien-
tos; sin embargo, no se encontraron diferencias estadsticas (p = 0.09). De igual manera, se observ una diferencia numrica mayor entre el tratamiento progesterona frente al control pero tampoco se encontraron diferencias significativas (p = 0.07). Entre los dems tratamientos no se observaron diferencias significativas. En cuanto al OB derecho, se realiz una nueva comparacin ortogonal con los datos transformados (Coeficiente Variacin datos no transformados = 63,6 %), la cual arroj diferencias significativas entre todos los tratamientos (p = 0.04), entre el control y los tratamientos (p = 0.02), entre el tratamiento progesterona frente a los dems tratamientos y el control (p = 0.016) y entre el tratamiento progesterona frente al tratamiento atrazina (p = 0.05), y diferencias altamente significativas entre el tratamiento progesterona frente al control (p = 0.007). En los diagramas de caja se observ que existan datos atpicos de oocitos que se encontraban muy por encima o debajo de la mediana, tambin se pudo comprobar la variabilidad de medianas entre los tratamientos de los rganos de Bidder izquierdo y derecho (Figura 2A-B). En el OB derecho, tanto el tratamiento progesterona como el de atrazina con progesterona presentaron datos atpicos muy por encima de su mediana. Orquidectoma y administracin de solucin salina.- En los animales pertenecientes al tratamiento control: orquidectoma, se observ un ligero incremento en el dimetro de los oocitos, as como tambin en su nmero. En los cortes histolgicos, las micrografas y el dimetro mximo de los oocitos se encontr un gran nmero de los oocitos en estadio I de la oognesis (Figura 3A-B). Para el OB derecho, el promedio del dimetro mximo de los oocitos fue de 207 m y del rgano izquierdo fue de 229 m. Dentro de este tratamiento, el animal # 1, present una morfologa distinta en su rgano de Bidder; antes de la operacin
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A)
550 500
RGANO DE BIDDER IZQUIERDO
IMETRO MXIMO OOCTOS
450 400 350 300 250 200 150 100 ControlP rogesterona AtrazinaA trazina+Progesterona
B) RGANO DE BIDDER DERECHO

1400 700
DIMETRO MXIMO OOCTOSD
650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 ControlP rogesterona AtrazinaA trazina+Progesterona
Figura 2. Diagramas de caja del dimetro mximo de los oocitos de los rganos derecho e izquierdo de los machos orquidectomizados.
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se pudo observar que tanto el rgano izquierdo como el derecho posean una coloracin caf oscura (atpica) alrededor de todo el OB y que dichos rganos eran bastante pequeos.
Orquidectoma y administracin de progesterona.- En el tratamiento orquidectoma y progesterona se encontraron oocitos de estadio I, II y III (Figura 4A- B- C- D). De los cuales su gran mayora pertenecan al estadio II de la oognesis. El promedio del dimetro mximo de los oocitos del OB derecho fue de 546 m y del rgano izquierdo fue de 352 m. Dentro de este tratamiento, tres animales presentaron oocitos pigmentados pertenecientes al estadio III o IV de la oognesis. En el animal # 12 se encontr el oocito de mayor tamao registrado en todos los tratamientos (1 400 m), en el cual se observ la morfologa caracterstica de un oocito perteneciente al estadio VI de la oognesis (Figura 5A- B). Orquidectoma y administracin de atrazina.- En el tratamiento orquidectoma y atrazina se encontraron oocitos pertenecientes a los estadios I, II y III de la oognesis. En las mediciones del dimetro mximo de los oocitos tambin se observaron dimetros pertenecientes a estos tres estadios arrojando un dimetro promedio para el rgano de Bidder derecho de 323 m y para el izquierdo de 322 m.
Figura 3. Oocitos tratamiento control: orquidectoma. (A) oocitos macho control # 6, rgano de Bidder derecho. Las flechas sealan oocitos en estadio I de la oognesis; transparentes, vescula germinal visible. (B) oocitos macho control # 2, rgano de Bidder derecho. La flecha indica un oocito estadio I, ncleo con numerosos nuclolos distribuidos aleatoriamente. La barra representa 250 m (A) y 60 m (B).
Posterior al tratamiento, se observ un notable crecimiento en ambos rganos y una mayor proliferacin de oocitos.
Orquidectoma y administracin de atrazina + progesterona.- En el tratamiento orquidectoma y atrazina + progesterona las micrografas y los cortes histolgicos muestran oocitos de estadios I, II, III y IV de la oognesis; la mayora de los cuales pertenecan al estadio II de la oognesis. El dimetro promedio del OB derecho fue de 405 m y el izquierdo fue de 310 m.
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Figura 4. Oocitos tratamiento orquidectoma y progesterona. (A) oocitos del rgano de Bidder izquierdo del macho # 9. (B) oocitos del rgano de Bidder derecho del macho # 10. Las flechas sealan oocitos estadio II altamente vascularizados. (C) oocitos rgano de Bidder izquierdo macho # 7. La flecha indica un oocito de estadio II con la vescula germinal con numerosos ncleos ubicados en la periferia. (D) oocitos rgano de Bidder derecho individuo # 10. Flecha superior seala cromosomas dentro del ncleo, flecha inferior, pared de clulas foliculares. Los nmeros romanos indican el estadio de la oognesis de los oocitos. La barra representa 200 m (A); 700 m (B); 90 m (D y C).
DISCUSIN rgano de Bidder, ovario y testculos de Rhinella marina.- Similar al ovario de Xenopus laevis, el ovario de una hembra adulta de Rhinella marina posee oocitos mononucleados de diferentes estadios vitelognicos rodeados de clulas foliculares. Estos oocitos, en cada estadio, presentan caractersticas citolgicas y morfolgicas nicas y distinguibles entre s (Brown et al., 2002; Dumont, 1978). Brown et al., 2002, describe dichas caractersticas en la tabla de oognesis para R. marina, la cual fue utilizada para determinar el estadio de la oognesis en la que se encontraban los
oocitos biderianos de cada tratamiento, que tambin fueron comparados con los oocitos de la seccin de ovario extrado de la hembra. De igual manera, mediante los cortes de los testculos removidos, se pudo establecer que los machos orquidectomizados estaban sexualmente maduros ya que presentaron densas concentraciones de espermatozoides y espermtidas dentro de los tbulos seminferos (Zug y Zug, 1979) La similaridad morfolgica de los oocitos biderianos, estructuralmente equivalentes a los oocitos previtelognicos del ovario (Farias et al., 2002), con los oocitos del ovario
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algunos individuos en cada tratamiento, es una caracterstica comn dentro de este rgano ya que ha sido encontrada en algunos estudios del OB (Farias et al., 2002; Pancak-Roessler y Norris, 1991). En los machos orquidectomizados de todos los tratamientos, excepto el control, tambin se pudieron encontrar pequeos grnulos de color caf (clulas con melanina) localizados en la periferia del ooplasma de los oocitos biderianos, equivalente a lo hallado por Pancak-Roessler y Norris, 1991. Efecto de la orquidectoma y la administracin de progesterona y atrazina sobre el OB.- La aplicacin de progesterona y atrazina exgenas Figura 5. Oocitos estadio II, III y VI rgano de Bidder derecho animal # 12 en los machos ortratamiento orquidectoma y administracin de progesterona. (A) Micrografa. quidectomizados de (B) Corte histolgico. Los nmeros romanos corresponden al estadio de la oognesis en el que se encuentran los oocitos. t, testculo; Vs, vescula germinal. La barra repre- Rhinella marina provoc el crecimiento de senta 1 mm (A y B). los oocitos del rgano de Bidder, claramente de la hembra permiti la determinacin del estadio de la oognesis de los oocitos bide- observable en el promedio de los oocitos birianos en los machos orquidectomizados de derianos de mayor tamao de todos los trataeste estudio. La presencia de oocitos atrsi- mientos durante la operacin y posterior a los cos, observada en ciertas regiones del OB de tratamientos (de 189 a 346 m).
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Figura 6. Cortes histolgicos del testculo de Rhinella marina, testculo derecho animal # 1 tratamiento control: orquidectoma. (A) Testculo rodeado de oocitos pertenecientes al rgano de Bidder. Las flechas sealan un tbulo seminfero; Ts. (B) Tbulo seminfero; Ts. (C) espermatozoides de R. marina. Flecha izquierda, espermatocito; flecha derecha, espermatozoides. La barra representa 200 m (A); 100 m (B); 50 m (C).
De igual manera, las diferencias significativas en el ANOVA factorial y las comparaciones ortogonales indican que la tasa de crecimiento fue distinta en cada tratamiento aplicado; ya que se encontraron diferencias al realizar la comparacin entre los rganos de Bidder de ambos lados de los individuos control: orquidectoma frente a los individuos de los dems tratamientos. Sin embargo, en el lado izquierdo el ANOVA arroj diferencias numricamente mayores y no estadsticamente significativas mientras que para el lado derecho estas diferencias s fueron estadsticamente significativas; esto pudo deberse a que en el lado derecho se registraron los oocitos de mayor dimetro en los tratamientos orquidectoma y progesterona y orquidectoma y atrazina + progesterona.
Las diferencias tambin se observaron al analizar las medias de cada tratamiento; la media ms alta perteneci al tratamiento orquidectoma y progesterona (483 m), seguida por el tratamiento orquidectoma y atrazina + progesterona (358 m), el tratamiento orquidectoma y atrazina (322 m) y finalmente el tratamiento orquidectoma: control, con una media de 218 m; lo que indica que cada compuesto acta de forma distinta en el proceso de crecimiento de los oocitos biderianos y que la hormona progesterona fue ms exitosa que el disruptor endcrino atrazina en la induccin de crecimiento; esto tambin pudo comprobarse en las comparaciones ortogonales en las que se registraron diferencias significativas entre el tratamiento orquidectoma y progesterona frente al tratamiento orquidectoma y atrazina.
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Figura 7. rganos de Bidder con zonas de oocitos atrsicos y zonas manchadas. (A) Micrografa rgano de Bidder derecho animal # 3 tratamiento orquidectoma y atrazina. Se observan manchas alrededor de toda la estructura. (B) Corte histolgico rgano de Bidder derecho animal #3, con grades zonas de oocitos atrsicos. (C) Micrografa rgano de Bidder izquierdo animal # 8 despus del tratamiento orquidectoma y administracin de progesterona. (C) Manchas encontradas previo y despus del tratamiento. (D) Corte histolgico rgano de Bidder izquierdo animal # 8. Las flechas sealan las manchas halladas. t, testculo. OB, rgano de Bidder. Las barras representan 1 mm (A); 900 m (B); 3 mm (C); 800 m (D); 700 m (C).
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La remocin de los testculos sin la administracin de hormonas y disruptores endcrinos (tratamiento control: orquidectoma) provoca el alargamiento del OB y el incremento en el tamao de los oocitos biderianos (Brown et al., 2002; Pancak-Roessler y Norris, 1991). Al extraer los testculos, el OB crece y sus oocitos alcanzan estadios de la oognesis superiores, ya que se elimina el efecto inhibitorio de los testculos sobre el crecimiento de este rgano (Falconi et al., 2007). Este efecto, se cree que es producido por ciertas hormonas masculinas secretadas por los testculos (Zaccanti y Tognato, 1976). Todos los oocitos de los animales del tratamiento control: orquidectoma, aumentaron de tamao (218 m dimetro mximo promedio) y todos ellos pertenecan al estadio I de la oognesis despus de los dos meses de administracin de la solucin salina (Brown et al., 2002) (Figura 3). Pancak-Roessler y Norris, 1991, en su estudio sobre el efecto de las hormonas gonadotropinas en el OB, obtuvieron resultados similares despus de tratar a machos orquidectomizados con una solucin salina durante un mes. La similaridad de resultados a diferentes tiempos puede ser explicada con el estudio de Brown et al., 2002, el cual
concluye que la mayor parte del incremento en el dimetro de los oocitos se produce despus del primer mes de realizada la orquidectoma. Se conoce que los esteroides son las principales hormonas que estn involucradas en la induccin de la diferenciacin sexual. Varios estudios sobre la aplicacin de estas hormonas en embriones y larvas de anfibios han demostrado que existe una gran variedad de esteroides que causan reversin sexual en anfibios (Norris y Lopez, 2011; Hayes, 1998). En este estudio, se utiliz progesterona para promover el crecimiento de los oocitos del rgano de Bidder ya que a pesar de que fue utilizada en machos adultos su accin dentro del organismo fue dirigida al OB, el cual posee oocitos previtelognicos (Falconi et al., 2007; Brown et al., 2002; Farias et al., 2002). El mecanismo de accin observado de la progesterona est relacionado con el proceso de oognesis. Los oocitos del OB en los machos adultos de R. marina se encuentran en estadios previtelognicos de la oognesis (estadios I y II); es decir que posiblemente han alcanzado el arresto en profase I pero que no han empezado a acumular plaquetas de yema (Gilbert, 2010; Falconi et al., 2007; Farias et al., 2002).
Tabla 1. Medidas promedio de los oocitos del rgano de Bidder de los machos orquidectomizados despus de los dos meses de tratamiento. Entre parntesis estadio de la oognesis de los oocitos de mximo dimetro (I= izquierdo; D= derecho).
TRATAMIENTO DIAMETRO MXIMO OOCITOS (m) Control Progesterona Atrazina Progesterona y Atrazina PROMEDIO DE CADA LADO I 228 (1) 352 (2) 322 (2) 437 (2) 310 D 207 (1) 532 (3) 324 (2) 406 (2) 382 346
PROMEDIO TOTAL
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La vitelognesis, se produce despus de que los oocitos han alcanzado el estadio III de la oognesis (400 m de dimetro aproximadamente). Los oocitos del OB, por ende, lograrn estadios de la oognesis mayores una vez que inicien el proceso de vitelognesis (Gilbert, 2010; Schuetz, 1974). En este estudio, tanto la hormona progesterona como el disruptor endcrino atrazina fueron utilizados para inducir la iniciacin de la vitelognesis. El anlisis estadstico en este estudio confirm que la hormona progesterona particip dentro del proceso de crecimiento, ya que el tratamiento progesterona result en oocitos con un dimetro mximo por encima de la media grupal y del propio tratamiento (oocitos de estadios IV y VI) (Figura 4). Las comparaciones ortogonales afirman lo dicho anteriormente ya que se encontr en los rganos de Bidder de los machos del tratamiento orquidectoma y administracin de progesterona frente a los machos control: orquidectoma diferencias mayores en el lado izquierdo (p = 0.07) y diferencias altamente significativas en el lado derecho (p = 0.007). Sin embargo, los datos atpicos, encontrados por encima y debajo de la mediana en el diagrama de caja del tratamiento progesterona, nos indican que este tratamiento fue parcialmente exitoso ya que la cantidad obtenida de oocitos crecidos fue muy baja (solo un oocito estadio VI y pocos estadio IV) (Figura 2A- B). Esto puede deberse a que las hormonas esteroides actan de manera distinta en cada especie e incluso en cada individuo (Norris y Lopez, 2011). Estudios con varios tipos de esteroides en diferentes especies de anfibios demuestran que existe una gran variabilidad de resultados (Wallace et al., 1999; Hayes, 1998), sugiriendo que el efecto hormonal puede variar entre especies e incluso de entre organismos. Dependiendo de la especie, esteroides exgenos pueden ser metabolizados a compuestos inactivos o compuestos ms potentes. Los factores que producen dicha variabilidad pueden ser ambientales
(temperatura, alimentacin, tiempo y duracin del tratamiento; entre otros) o intrnsecos del propio organismo (metabolismo) (Norris y Lopez, 2011). En animales jvenes de Xenopus laevis, por ejemplo, se requiere un periodo de 1 a 1.5 aos para producir oocitos completamente desarrollados, mientras que en hembras estimuladas con gonadotropinas solo se requieren dos meses (Hausen y Riebesell, 1991). Tambin se ha determinado que la sntesis y fosforilacin de nuevas cadenas de vitelogenina son eventos altamente relacionados y que se requiere aproximadamente dos horas (dependiendo del metabolismo del organismo) para la sntesis de una nueva molcula de vitelogenina. Esto sugiere que, dentro de este estudio, posiblemente los factores tiempo, alimentacin o concentracin hormonal estuvieron involucrados en la produccin del bajo nmero de oocitos crecidos. No obstante, los resultados presentados aqu son significativos al ser comparados con otros estudios en los que se obtuvieron oocitos vitelognicos que alcanzaron estadios III y IV en el proceso de oognesis (Brown, 2002; Pancak-Roessler y Norris, 1991) (Figura 5). Numerosos qumicos fabricados por el hombre actan dentro del metabolismo de los organismos imitando y alternado proceso fisiolgicos estrgeno-dependientes. Estas sustancias qumicas, llamadas disruptores endcrinos, producen alteraciones significativas e irreversibles en los procesos de reproduccin y desarrollo a concentraciones extremadamente bajas. En este estudio se utiliz atrazina (un tipo de disruptor endcrino) para provocar una alteracin irreversible en el ciclo hormonal de la especie Rhinella marina y obtener oocitos biderianos de estadios oognicos superiores. Entre otros efectos, la atrazina altera tejidos reproductivos masculinos en los organismos que han sido expuestos al qumico durante el desarrollo, causando demasculinizacin y feminizacin en las gnadas de machos vertebrados (Hayes et al., 2011). En el tratamiento orquidectoma y atrazina, la atrazina provoc el crecimiento de los oocitos biderianos de los
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machos orquidectmizados alcanzado hasta estadios II y III de la oognesis. En el diagrama de caja, a pesar de que existen datos alejados de la mediana no se observan datos atpicos (Figura 2A-B). Igualmente, al comparar la media de este tratamiento (323 m), con el promedio del tratamiento progesterona (484 m), especialmente en el rgano de Bidder derecho, se encontraron diferencias significativas (p = 0.05), lo que indica que este tratamiento fue menos exitoso que el tratamiento orquidectoma y progesterona en el crecimiento de los oocitos biderianos. Se cree que el mecanismo de accin de la atrazina dentro del organismo est relacionado con un incremento en la produccin de la enzima aromatasa P450; la cual es responsable de convertir andrgenos en estrgenos (testosterona a estradiol). Como consecuencia de su incremento, se produce un aumento en los niveles de estrgeno en los machos de varias especies de anfibios y peces (grupos en los que este efecto ha sido ampliamente estudiado) lo que finalmente provoca la feminizacin de los individuos. Sin embargo, este mecanismo de accin no es concluyente en los anfibios ya que se ha observado que la aromatasa P450 puede ser activada mediante dos vas distintas en peces y mamferos (Norris y Lopez, 2011). En este estudio se observaron los efectos feminizadores que provoca la conversin de andrgenos en estrgenos, ya que se observ un incremento de tamao en los oocitos del OB de los machos; sin embargo, dichos efectos no fueron pronunciados ya que no se encontraron oocitos biderianos de estadios vitelognicos tardos. La ausencia de oocitos biderianos de estadios vitelognicos tardos pudo deberse a que posiblemente la concentracin de atrazina dentro del tratamiento no fue la adecuada (Hayes et al., 2003). De igual manera, el uso de la atrazina como disruptor endcrino nunca haba sido probado en especies terrestres adultas, por lo que se tuvo que idear un mecanismo mediante el cual los individuos estuvieran en
contacto permanente con el qumico. Adems del efecto feminizador en las gnadas masculinas, se conoce que la atrazina deteriora el sistema inmune aumentando la sensibilidad de los anfibios a infecciones (Norris y Lopez, 2011). La inmunodepresin, por tanto, pudo ser otro factor que influy en la obtencin de oocitos de estadios vitelognicos tempranos, a pesar de que ninguno de los animales dentro de este tratamiento present enfermedades o infecciones. Al observar, de manera individual, los resultados del tratamiento orquidectoma progesterona, orquidectoma: control y orquidectoma y atrazina. Se puede inferir que los resultados obtenidos dentro del tratamiento orquidectoma y atrazina + progesterona se deben en gran parte a la accin de la progesterona ms que a la accin de la atrazina y que adems ambos compuestos no presentan una accin sinrgica. Las comparaciones ortogonales dentro del tratamiento orquidectoma y atrazina + progesterona, a diferencia del tratamiento orquidectoma y progesterona, no arrojaron diferencias significativas al ser comparado con los dems tratamientos; similar a lo que ocurri en el tratamiento atrazina. Sin embargo, se pueden encontrar un mayor nmero oocitos de estadio mayores de oognesis (III y IV), lo que indica que posiblemente la hormona progesterona es la que indujo el crecimiento en los oocitos mencionados. De igual manera, al comparar el dimetro mximo promedio de los oocitos del tratamiento orquidectoma y progesterona (358 m) con los dimetros mximos promedios de los otros tratamientos se puede observar que se produjo un crecimiento en los oocitos del OB de los machos pertenecientes a este tratamiento, pero que dicho crecimiento no se compara con lo obtenido en el tratamiento progesterona. Dichas aseveraciones no se pueden corroborar debido a que estos dos compuestos nunca han sido probados de manera conjunta en estudios anteriores.
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Ana Beatriz Mafla M.
Cariologa beta de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica

Laboratorio de Gentica Evolutiva, Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador. Apartado 17-01-2184. Quito-Ecuador. amafla@puce.edu.ec Recibido: 04, 04, 2012; aceptado: 01, 10, 2012
RESUMEN. - Se presentan los cariotipos metafsicos de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica, dos especies ecuatorianas nuevas para la ciencia: Drosophila chorlavi Cspedes & Rafael, 2012; Drosophila rucux Cspedes & Rafael, 2012 y la tercera D. mesophragmatica Duda, 1927 que corresponde a una poblacin de los Andes Ecuatorianos. El nmero 2n = 10 es compartido por las tres especies; en los cariotipos son claramente identificables los autosomas 4 y 5 as como el cromosoma sexual Y; en tanto que los autosomas 2 y 3 al igual que el cromosoma sexual X son prcticamente indistinguibles entre ellos. Las tres especies difieren ligeramente en el contenido de heterocromatina y marcadamente en la morfologa del autosoma 5. PALABRAS CLAVE: Cromosomas mitticos, dpteros andinos, heterocromatina, nuevas especies. ABSTRACT. - We present the metaphase karyotypes of three species belonging to the species group Drosophila mesophragmatica, two Ecuadorian species new to science: Drosophila chorlavi Cspedes & Rafael, 2012, Drosophila rucux Rafael & Cspedes, 2012 and the third D. mesophragmatica Duda, 1927 corresponds to a population of the Ecuadorian Andes. The number 2n = 10 is shared by the three species; in the karyotypes are clearly identifiable autosomes 4 and 5 and the Y sex chromosome, while the autosomes 2 and 3 as well as the sex chromosome X are virtually indistinguishable from them. The three species differ slightly in heterochromatin content and markedly in autosomal morphology 5. KEYWORDS: Andean Diptera, heterochromatin, mitotic chromosomes, new species. INTRODUCCIN La cariologa beta segn White, 1978, corresponde a un segundo nivel de anlisis cromosmico por el cual se consigue determinar no solo el nmero de cromosomas de una especie sino definir su tamao, la posicin de los centrmeros e identificar a los cromosomas sexuales; en tanto que la cariologa zeta corresponde a una descripcin ms detallada de las bandas y otras marcas en los cromosomas politnicos (puffs, ectopic pairing, weak spots). Estos dos niveles de anlisis citolgico proporcionan datos complementarios para dilucidar el grado de parentesco entre dos o ms especies relacionadas; ms an, en los casos en que los cromosomas politnicos resultan homosecuenciales en dos especies, la simple comparacin de los bloques heterocromticos en los cromosomas mitticos, permite asumir qu especie es derivada de cul otra, considerndose que la tendencia a ganar material es el carcter apomrfico (Ward y Heed, 1970).
Cariologa beta de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica 39
El grupo de especies de D. mesophragmatica fue establecido por Brncic & Koref-Santibaez, 1957 para reunir a las especies andinas: D. mesophragmatica Duda, 1927; D. gaucha Jaeger y Salzano, 1953; D. pavani Brncic, 1957; D. altiplanica Brncic & Koref- Santibaez, 1957; D. orkui Brncic & Koref-Santibaez, 1957 y D. viracochi Brncic & Koref-Santibaez, 1957. Posteriormente, Brncic et al., 1971, proponen las relaciones citotaxonmicas entre seis especies del grupo D. mesophragmatica, y establecen tres unidades filticas al interior del grupo; en su trabajo consideran de importancia dos tipos de cambios cromosmicos: las alteraciones en la cantidad de heterocromatina observada en las placas metafsicas y las inversiones paracntricas detectadas en los cromosomas politnicos. Los autores asumen que ambos tipos de cambio ocurren al azar y se constituyen como eventos nicos en la historia evolutiva de los diferentes grupos dentro del gnero Drosophila, por lo que las especies que compartan estructuras cromosmicas nicas pueden ser agrupadas en unidades filticas discretas; consecuentemente proponen que dentro del grupo mesophragmatica hay tres de estas unidades: una conformada por D. mesophragmatica, D. brncici Hunter & Hunter, 1964 y D. gasici Brncic, 1957; otra por D. pavani y D. gaucha y una tercera slo con D. viracochi. Plantean que la filogenia cromosmica propuesta requiere partir desde una secuencia de bandas en los cromosomas politnicos semejante a la de D. mesophragmatica y portadora del cromosoma puntiforme en el cariotipo metafsico, tal estado sera el de una Hipottica primitiva para el grupo; sugieren que esta condicin podra encontrarse en alguna poblacin local o especie an no descubiertaen alguna regin del sistema montaoso de los Andes, propensa a mantener poblaciones aisladas y/o endmicas. Vela y Rafael, 2004, describen tres nuevas especies del grupo D. mesophragmatica, recolectadas en el Bosque Protector del Pa-
sochoa: D. ruminahui Vela & Rafael, 2004; D. amaguana Vela & Rafael, 2004; D. shyri Vela & Rafael, 2004; en su trabajo, las autoras argumentan que la direccin de las cerdas escutelares basales es un carcter taxonmico importante, por lo cual reconocen los dos subgrupos ya propuestos por Nacrur, 1958 y proponen renombrarlos como subgrupo D. viracochi a las especies con cerdas escutelares anteriores convergentes y subgrupo D. mesophragmatica a las especies con cerdas escutelares anteriores divergentes. Mota et al., 2008, presentan una filogenia molecular del grupo D. mesophragmatica como un ejemplo de evolucin andina; dan la referencia de que otros autores ya han hecho inferencias de las relaciones dentro del grupo, basados en anlisis morfolgicos, citolgicos, y de isoenzimas, que a nivel molecular se ha confirmado la monofilia del grupo pero que las relaciones internas no son claras, por ello argumentan que el uso de marcadores nucleares y mitocondriales podra arrojar datos esclarecedores; comparan seis de las trece especies del grupo mesophragmatica; y reportan sus resultados apoyando la subagrupacin hecha por Brncic et al., 1971; reconocen tres subgrupos y entonces proponen renominarlos como subgrupos D. mesophragmatica, D. gaucha y D. viracochi; aclaran que tal subagrupacin no est en discordancia con la de Vela y Rafael, 2004, pero que prefieren la de tres subgrupos pues esa topologa refleja mejor sus resultados de ramificacin. Recientemente, el grupo de especies D. mesophragmatica se ha ampliado a 17 miembros con el descubrimiento de otras especies ecuatorianas: D. cashapamba Cspedes & Rafael, 2012; D. chorlavi Cspedes & Rafael, 2012; D. rucux Cspedes & Rafael, 2012; y D. yanayuyu Cspedes & Rafael, 2012. En esta publicacin se posiciona a D. chorlavi como un miembro del grupo mesophragmatica mientras que a D. rucux se la categoriza como un miembro aberrante del grupo mesophragmatica. De forma que, las especies
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nuevas de este grupo de moscas andinas se constituyen en un objeto interesante para analizarlas citolgicamente y complementar las propuestas mencionadas anteriormente respecto a las relaciones entre especies y entre subgrupos. En este trabajo se reporta los resultados del anlisis de los cromosomas metafsicos de Drosophila chorlavi Cspedes & Rafael, 2012; D. rucux Cspedes & Rafael, 2012, especies nuevas descubiertas en el Ecuador y que han sido propuestas como miembros del grupo mesophragmatica por Cspedes y Rafael, 2012; y se las compara con los cromosomas metafsicos de D. mesophragmatica Duda, 1927, especie de amplia distribucin, desde el sur de Per y Bolivia hasta Colombia (Koref-Santibaez, 1963). Considerando que la comparacin de bloques heterocromticos en cromosomas mitticos es un carcter del endofenotipo con valor citotaxonmico, creemos que la informacin que proporcione la cariologa
MATERIALES Y MTODOS Las muestras examinadas corresponden a 55 larvas de Drosophila mesophragmatica, 47 de D. rucux y 31 de D. chorlavi, provenientes de las colecciones que se muestran en la tabla 1. Para obtener cromosomas bien extendidos y diferenciados en porciones eucromticas y heterocromticas se utiliz la tcnica de suspensin celular y la tincin con Giemsa descrita en Mafla, 2008. Se disectaron larvas de tercer estadio para extraer los ganglios cerebrales; se colectaron de 10 a 18 ganglios cerebrales en un portaobjeto excavado con solucin de Ringer-Drosophila; se transfirieron a otro portaobjeto excavado conteniendo una solucin de Ringer: colchicina 0,01M en proporcin 2:1 por 30 minutos; se retir esta solucin y se reemplaz por KCl 0.075M durante 20 minutos. Despus del tratamiento hipotnico se fij el tejido en metanol: cido actico (3:1) durante un mnimo de 30 minutos, despus de lo cual se retir el fijador y se dispers el tejido en cido
Tabla 1. Datos de coleccin de las especies analizadas
Especie Colector Localidad
Determinado Cdigo del por holotipo
Chimborazo: Riobamba, D. mesophragmatica R. Len 014100S, V. Rafael 783800W, 2 754m D. chorlavi M. L. Figuero Ibarra: Chorlav, 02130S, V. Rafael 781042W, 2 200 m QCAZI 2316 QCAZI 2305
Quito: Cruz Loma, D. rucux D. 0119S, D. Cspedes Cspedes 783125.1W, 3 325 m
beta de las tres especies ecuatorianas mencionadas, aportaran pistas para esclarecer las relaciones tanto entre especies como entre subgrupos.
actico 60 %, se aadi dos gotas de fijador y la suspensin se gote en portaobjetos que se conservados en etanol y en refrigeracin; las placas con la suspensin se dejaron secar en una plancheta a 65 C (el shock trmico
permite una mejor dispersin de los cromosomas). Luego fueron teidas con Giemsa diludo en agua desionizada en proporcin 1:20 durante 30 minutos. Para el registro fotogrfico de las placas se us un microscopio Zeiss con cmara digital Olympus DP72; se seleccionaron los mejores ncleos para fotografiarlos con el objetivo de inmersin APO 40X y el factor 2 del Optovar obtenindose una amplificacin total de 80X. La medicin de los cromosomas se hizo con el Software DP2BSW sobre las imgenes capturadas y archivadas. En lugar de realizar cariotipos convencionales se opt por medir los cromosomas y los datos se organizaron en orden descendente. Para la identificacin de la forma cromosmica se sigue las recomendaciones de Levan et al., 1964; nominando a los cromosomas m, sm, st o T de acuerdo a la posicin del centrmero en la regin medial, submedial, subterminal o en el punto terminal, respectivamente. Esta nomenclatura tiene la siguiente equivalencia con la nomenclatura clsica de cromosomas de Drosophila: la forma metacntrica equivale a V; los submetacntricos y subtelocntricos a J o barras y los telocntricos a puntiformes. Los idiogramas se construyeron normalizando los valores de 20 cariotipos (14, 6 ) de D. chorlavi; 20 (12 , 8 ) de D. rucux y 20 (15 , 5 ) de D. mesophragmatica. En la descripcin se utiliza la Longitud Relativa (LR) definida como el valor porcentual que cada cromosoma tiene en la dotacin haploide; por tanto corresponde a la relacin entre la longitud de cada cromosoma frente a la suma de longitudes del complemento total.
Figura 1. Placas metafsicas de neuroblastos de Drosophila mesophragmatica a-b; D. chorlavi c-d; D. rucux e-f. La flecha slida indica el cromosoma Y, la flecha clara al microcromosoma.
RESULTADOS D. mesophragmatica tiene cinco pares cromosmicos: 2n = 10 (Figura 1a, b); las especies nuevas: D. chorlavi y D. rucux, coinciden con el cariotipo bsico del grupo D. mesophragmatica ya que en los contajes cromosmicos de las placas mitticas se obtuvo un nmero modal de 10, (87/93 en D. chorlavi, 40/49 en D. rucux) por lo tanto se establece que estas dos especies ecuatorianas tienen 2n = 10 (Figura. 1. c, d, e, f). El tamao de los cromosomas en D. mesophragmatica flucta entre 3.92 y 0.65 m; en D. chorlavi entre 4.74 y 0.50 m y en D. rucux entre 3.43 y 0.81 m. En este complemento de cinco pares se identifican claramente los autosomas 4, 5 y el cromosoma sexual Y. El autosoma 4 es el par ms grande, de longitud relativa (LR) 15.60 en D. mesophragmatica, 16.98 en D. chorlavi
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y 15.81 en D. rucux; tiene el centrmero en la regin medial por lo que se le puede identificar como metacntrico en las tres especies. El ms pequeo del complemento es el autosoma 5, claramente heterocromtico; en D. chorlavi es puntiforme o telocntrico de LR 2.85; en tanto que en D. mesophragmatica y D rucux es submetacntrico de LR 6.36 y 6.66, respectivamente. El cromosoma Y tambin se distingue con claridad por su magnitud y heteropicnosis, en orden descendente ocupa el segundo lugar en longitud; en D. chorlav es subtelocntrico y con un satlite conspicuo en el brazo largo, LR 13.15; al contrario que el de D. rucux, cuyo aspecto es semejante al de D. mesophragmatica, submetacntrico y sin satlite visible, LR
11.16 en la primera especie y 12.21 en la segunda especie Figura 2 d. El cromosoma X as como los pares autosmicos 2 y 3 son indistinguibles entre ellos, tanto en tamao como en morfologa; los tres aparecen como submetacntricos, los brazos cortos son totalmente heterocromticos y de LR: 10.31, 8.96, 8.06 en D. mesophragmatica; 11.07, 9.77, 8.84 en D. chorlavi y 10.12, 9.09, 8.24 en D. rucux. En placas excepcionales se pudo reconocer el par heteromrfico, y definir que el cromosoma X ocupa el tercer lugar en orden descendente de longitud (Figura 2 a, b, c, d). Por lo tanto el par XY es heteromrfico: sm-st el Y de mayor longitud.
LONGITUD RELATIVA (LR) 4 Y X 2 3 5 a) 15.60 12.21 10.31 8.96 8.06 6.36 b) 16.98 13.15 11.07 9.77 8.84 2.85 c) 15.81 11.16 10.12 9.09 8.24 6.66
d
Figura 2. Idiogramas de las tres especies: a) Drosophila mesophragmatica; b) D. chorlavi; c) d. rucux y d) Valores de Longitud Relativa (LR) usados en los idiogramas.
La distribucin de heterocromatina es semejante en las tres especies: el autosoma 4 ms grande tiene un contenido de 2 % de heterocromatina en la regin pericentromrica, los brazos cortos del cromosoma sexual X, as como los de los autosomas 2 y 3, fluctan entre 2.41 y 3.96 %, en tanto que la totalidad del cromosoma sexual Y as como del pequeo autosoma 5 son completamente heterocromticos. En los idiogramas de las tres especies (Figura 2) se aprecia claramente las porciones eucromticas y heterocromticas; en total, cada una de las tres especies tienen alrededor de un tercio del genoma haploide estructurado en heterocromatina (Tabla 2, Figura 2).
En suma, los cariotipos mitticos de D. rucux y D. mesophragmatica son muy parecidos entre s y diferentes al de D. chorlavi (Figura 2 a, b, c). DISCUSIN La apariencia de las placas metafsicas en las tres especies es semejante a lo reportado por Brncic y Koref-Santibaez, 1957 como caracterstico del grupo D. mesophragmatica, es decir comprende 1 par en V, 3 pares de barras y 1 par puntiforme. La forma de pequea barra del par 5, igualmente ha sido reportada en algunos miembros del grupo como D. mesophragmatica, D. altiplnica y D. orkui por
Tabla 2. Distribucin de la heterocromatina en valores porcentuales
Cromosoma Heterocromatina Drosophila mesophragmatica chorlav 4 pericentromrica X brazo corto 2 brazo corto 3 brazo corto 5 todo Y todo Total: 2.00 2.98 2.79 2.62 6.36 12.21 28.96 2.00 3.96 3.31 3.09 2.83 13.15 28.24
rucux 2.00 2.78 2.83 2.41 6.66 11.16 27.84
Las diferencias ms notables entre las nuevas especies ecuatorianas: D. chorlavi y D. rucux son dos: 1) el tamao y morfologa del autosoma 5, en la primera es telocntrico y pequeo de LR 2.85 % mientras que en la segunda es submetacntrico y ms grande de LR 6.66 %. 2) La morfologa del cromosoma Y, en la primera es subtelocntrico y con una constriccin secundaria bien definida en el brazo largo; en tanto que en D. rucux es submetacntrico (el ndice centromrico de 25.5 corresponde a la cifra lmite usada para definir la morfologa como submetacntrico o subtelocntrico) y no se visualiza ninguna constriccin secundaria.
Brncic et al., 1971, de modo que al compartir el carcter 2n = 10 las especies ecuatorianas D. chorlavi y D. rucux estn relacionadas con los otros miembros del grupo, por lo tanto acertadamente incluidas en el grupo D. mesophragmatica (Cspedes y Rafael, 2012). Respecto a la morfologa y tamao del cromosoma 5 diferente en D. chorlavi y D. rucux, se ve la misma relacin registrada por Brncic et al., 1971 entre las especies del subgrupo D. mesophragmatica y las del subgrupo D. pavani; diferencia que les llev a proponer la reunin de las especies que tienen el cromosoma 5 alargado y que son: D. mesophragmatica, D. gasici, D. brncici en una unidad filtica; separadas de otra unidad portadora del 5 puntiforme
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y que corresponde a las especies: D. gaucha, D. pavani y D. viracochi. En esta lnea deductiva: D. chorlavi podra ubicarse como un miembro ms tanto del subgrupo gaucha como del subgrupo viracochi (segn Mota, 2008) y D. rucux dentro del subgrupo mesophragmatica. Como se ha sealado antes, la cariologa beta ha de ser complementada con la cariologa zeta para obtener evidencias que establezcan los nexos de parentesco, en el caso de las nuevas especies falta este complemento aun cuando se cuenta con datos preliminares: el cariotipo de D. chorlavi fue reportado (Romero, 2010) como estructuralmente similar a los de las especies del grupo D. mesophragmatica, es decir que posee 5 filamentos largos: X, II, III, IV-R, IV-L, con telmeros bien definidos y extremos basales que coalescen en un cromocentro heteropicntico que incluye al pequeo V; as mismo registr lazos de inversin en los cromosomas X, II, IV-R, IV-L, y adems un segmento duplicado, que comprende las secciones 60 a la 75 del cromosoma IV R; sin embargo tales reestructuras cromosmicas no se han observado en las preparaciones de Salas, 2011 quien construy el mapa de los cromosomas politnicos de D. chorlavi en la que se muestra una secuencia de bandas similar a la de D. pavani; con lo dicho, se podra asumir que esta especie puede ser ubicada en el subgrupo D. gaucha. No obstante a Cspedes y Rafael, 2012 les llama la atencin el aspecto atigrado de D. chorlavi que la acerca a las especies del grupo repleta, as como la convergencia de las cerdas escutelares, carcter considerado plesiomrfico; en consecuencia parecera apropiada la integracin que Cspedes y Rafael hacen de D. chorlavi dentro del subgrupo viracochi. Es claro que la subagrupacin ha de continuar siendo preliminar hasta contar con la informacin que proporcionen los estudios comparativos de cromosomas politnicos de D. viracochi y de D. shyri. Con respecto a la posicin de D. rucux, con el sustento de que la convergencia citolgica es extremadamente improbable en dos
linajes, parece apropiado considerarla en el subgrupo mesophragmatica, junto a las especies que poseen el cromosoma 5 alargado. La subagrupacin realizada por Brncic et al., 1971 as como la de Mota et al., 2008 coinciden y refuerzan la idea de usar la comparacin de cantidad de heterocromatina en la distincin de linajes. La importancia de la cantidad de heterocromatina parece ser su relacin con el ADN satlite, as como con los elementos transponibles y el papel que juega en la especiacin; as lo establece la hiptesis de Korochkiri, 1983 quien supone que las diferencias en DNA satlite dependen de la afinidad del genoma con los genes saltarines y que estos genes pueden determinar la redistribucin de heterocromatina provocando cambios en los procesos moleculares y morfogenticos durante el desarrollo, por lo tanto: la afinidad del genoma por genes saltarines especficos puede cambiar por una simple mutacin la cual correspondera a una gran mutacin, que podra determinar el origen de una nueva especie por un salto y no por la acumulacin de pequeos cambios, como lo propuso Goldschmidt (citado por Gould, 1980). Esta hiptesis se complementa con el trabajo de Pimpinelli et al., 1993 y muchos otros en la misma lnea, que muestran a los elementos transponibles como componentes estructurales de la heterocromatina. CONCLUSIONES Las especies ecuatorianas D. chorlavi y D. rucux comparten el nmero cromosmico 2n = 10 con las especies que conforman el grupo de especies D. mesophragmatica. D. chorlavi y D. rucux difieren entre ellas en el tamao y morfologa del cromosoma 5; esta caracterstica se considera como indicio para posicionar a D. chorlavi en uno de los subgrupos que tienen el autosoma 5 puntiforme (D. gaucha o D. viracochi) y a D. rucux en el subgrupo D. mesophragmatica.
AGRADECIMIENTOS Levan A, Fredga K y Sandberg AA. 1964. NoA la Pontificia Universidad Catlica del menclature for centromeric position on Ecuador por financiar los proyectos: Cariolochromosomes. Hereditas, 52(2). ga Z de nuevas especies del subgrupo inca E Mafla AB. 2008. Cariotipos metafsicos de 29179 y Cariologa Z de nuevas especies de Drosophila inca y D. yangana, subgrupo Drosophila G19115. A la Dra. Violeta Rafael inca, grupo repleta. Revista Ecuatoriapor la provisin de las muestras de estas espena de Medicina y Ciencias Biolgicas, cies as como por sus entusiastas comentarios XIX(1 y 2). y por fomentar la interdisciplinariedad. Al Dr. Mota NR, Robe LJ, Vera LS, Budnik VM y Clifford Keil por sus valiosas acotaciones al Loreto E. 2008. Phylogeny of the Drosomanuscrito. A la Dra. Laura Arcos ex Decana phila mesophragmatica group (Diptera, de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Drosophilidae): An Example of Andean por su permanente apoyo a la investigacin. Evolution. Zoological Science, 25: 526 532. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Pimpinelli S, Berloco M, Fanti L, Dimitri P, Brncic D y Koref-Santibaez S. 1957. The Bonaccorsi S, Marchetti E, Caizzi R, CaMesophragmatica Group of Species of ggese C y Gatti M. 1993. Transposable Drosophila. Evolution, 11:300310. elements are stable structural compoBrncic D, Nair PS y Wheeler MR. 1971. nents of Drosophila melanogaster heteCytotaxonomic Relationships Within the rochromatin. Proceedings of the National mesophragmatica Species Group of DroAcademy of Sciences, 92:38043808. sophila. STUDIES IN GENETICS VI. Romero G. 2010. Informe de avance del ProUniversity of Texas Publications, 7103. yecto Cariologa Z de nuevas especies Cspedes D y Rafael V. 2012. Cuatro especies del subgrupo inca E 29179. nuevas del grupo de especies Drosophila Salas ISA. 2011. Caracterizacin de los cromesophragmatica (Diptera, Drosophilimosomas politnicos de una nueva espedae) en los Andes ecuatorianos. Iherincie de Drosophila perteneciente al grupo gia, Srie. Zoologia, 102(1). mesophragmatica. Tesis de Licenciatura, Gould SJ. 1983. El regreso del monstruo espePontificia Universidad Catlica del Ecuaranzado. En GOULD, S. J. El Pulgar del dor. Quito, Ecuador. Panda: 197205. Hermann Blume Edi- Vela D y Rafael V. 2004. Three new Andean ciones. Primera edicin espaola Fuenlaspecies of Drosophila (Diptera, Drosobrada, Madrid. philidae) of the mesophragmatica group. Koref-Santibaez S. 1963. Courtship and SeIheringia Srie Zoologia, 94(3):295299. xual Isolation in Five Species of the Me- White MJD. 1978. Modes of Speciation. W.H. sophragmatica Group of the Genus DroFreeman and Company, San Francisco. sophila. Evolution, 17(1): 99106. Ward BL y Heed WB. 1970. Chromosome Korochkiri LI. 1983. Institute of DevelopmenPhylogeny of Drosophila pachea and tal Biology, Moscow, USSR. The hypoRelated Species. Journal of Heredity, thesis about the role of heterochromatin 61(6): 248258. in the evolution of Drosophila of the virilis group.DIS, 59:70.
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Pedro Barba, David Ortega-Paredes, Mara Fernanda Yauri, Mercedes Rodrguez-Riglos, Jeannete Zurita e Iliana Alcocer
Deteccin de genes codificantes de enzimas modificadoras de aminoglucsidos (EMAs) en aislados clnicos de Pseudomonas aeruginosa
Pedro Barba1, David Ortega-Paredes1, Mara Fernanda Yauri1, Mercedes Rodrguez-Riglos1, Jeannete Zurita2 e Iliana Alcocer1
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Laboratorio de Microbiologa, Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito, Ecuador, pmbarba@gmail.com 2 Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito, Ecuador. Recibido: 04, 05, 2012; aceptado: 02, 10, 2012
RESUMEN.- La resistencia bacteriana a antibiticos representa un grave problema de salud pblica. Pseudomonas aeruginosa tiene gran relevancia debido a su alta incidencia en infecciones asociadas al cuidado de la salud. La patogenicidad de P. aeruginosa se intensifica debido a: su resistencia intrnseca o adquirida a varios agentes antimicrobianos, y al encontrarse asociada a plataformas gnicas mviles como plsmidos o transposones; lo cual deriva en el surgimiento de cepas multirresistentes. Los aminoglucsidos representan un grupo de antimicrobianos fundamental en la terapia de infecciones cuyo agente etiolgico es P. aeruginosa. El objetivo de este estudio fue detectar la presencia de genes que codifican enzimas modificadoras de aminoglucsidos (EMAs) en aislados clnicos de Pseudomonas aeruginosa. Se analizaron 78 aislados resistentes a aminoglucsidos provenientes de varios hospitales en Quito, Ecuador. La confirmacin de la especie se realiz mediante la amplificacin del gen oprL. Los genes codificantes de EMAs reportados con mayor frecuencia en Pseudomonas aeruginosa son: aac(3)-IIa, aac(6)-Ib, ant(2)-Ia, aph(3)-VIa. Estos genes fueron detectados mediante PCR empleando iniciadores especficos. El 64,10 % de aislados de la poblacin de estudio presentaron genes EMAs. Los genes con mayor prevalencia fueron aac(3)-IIa, aac(6)-Ib y ant(2)-Ia. Los perfiles de genes EMAs ms prevalentes fueron las combinaciones aac(3)-IIa y aac(6)-Ib / ant(2)-Ia, lo cual concuerda con sus perfiles fenotpicos de resistencia. Este estudio nos permite reconocer la relacin entre la resistencia a los aminoglucsidos y los mecanismos de resistencia relacionados con genes productores de enzimas modificadoras de aminoglucsidos (EMAs). PALABRAS CLAVE: Aminoglucsidos, EMAs, infeccin, Pseudomonas aeruginosa, resistencia. ABSTRACT.- Bacterial resistance to antibiotics represents a major public health issue. Pseudomonas aeruginosa constitutes a leading cause of nosocomial infections. The pathogenicity of P. aeruginosa is intensified by its intrinsic and acquired resistance to wide variety antibacterial agents. Acquired resistance spreads through genetic mobile elements such plasmids and transposons, leading to the emergence of multiresistant strains. Aminoglycosides represents a key family of antibacterials used to treat infections caused by P. aeruginosa. The aim of this study was to detect the presence of aminoglycoside-resistance genes in 78 resistant clinical isolates of P. aeruginosa from several hospitals in Quito-Ecuador. The specie confirmation was performed by amplifying the oprL gen. The most frequently reported AMEs genes in
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Pseudomonas aeruginosa: aac (3)-IIa, aac (6 )-Ib, ant (2)-Ia, aph (3)-VIa were detected by PCR using specific primers. AMEs genes were found in 64.10% of isolates. The most prevalent genes were aac (3)-IIa, aac (6)-Ib and ant (2)-Ia. The most common profiles of AMEs genes were aac (3)-IIa, and aac (6 )-Ib / ant (2)-Ia, consistent with phenotypic resistance profiles. This study allows us to gain better understanding of the resistance mechanisms related with genes that produce aminoglycoside modifying enzymes. KEYWORDS: AMEs, aminoglycosides, infection, Pseudomonas aeruginosa, resistance. INTRODUCCIN La resistencia bacteriana a los antibiticos es un grave problema de salud pblica que reduce de manera significativa la capacidad de los centros hospitalarios para restaurar la salud de los pacientes (Lepape y Monnet, 2009). El uso inadecuado de los agentes antimicrobianos en coordinacin con la plasticidad gentica bacteriana, han permitido el desarrollo de mltiples mecanismos de resistencia a cada antibitico introducido en la prctica clnica (Davis y Davis, 2010). Los mecanismos de resistencia a antibacterianos son, con frecuencia, complejos, incluyendo la produccin de enzimas que catalizan la inactivacin del antibitico, impermeabilidad de la membrana externa, sobreexpresin de bombas de eflujo y mutaciones puntuales (Tenover, 2006). En la prctica diaria, el personal mdico se ve forzado a escoger una terapia antimicrobiana en base a los sntomas de la infeccin. Este tipo de tratamiento se conoce como terapia emprica. La aplicacin de una terapia emprica efectiva requiere, adems de las consideraciones mdicas para cada paciente, del conocimiento de los patrones y mecanismos de resistencia del patgeno involucrado en la infeccin (Pterson, 2008). Existe una alta variacin en dichos patrones y mecanismos de resistencia, la cual se encuentra influenciada por factores relacionados al lugar geogrfico donde ocurre la infeccin. Se requiere de datos locales con el fin de aumentar la probabilidade de definir la terapia antibacteriana inicial (Livermore y Pearson, 2007) y reducir los ndices de morbilidad y mortalidad; as como, el valor asociado al tratamiento antimicrobiano (Ramn y Fernndez-Cruz, 2008; Isturiz y Carbon, 2000). Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) es un importante patgeno oportunista. Se encuentra ampliamente distribuido, y en la actualidad es responsable de un gran nmero de infecciones, principalmente en ambientes hospitalarios (Pterson, 2008). Las infecciones producidas por P. aeruginosa se desarrollan en pacientes que tienen el sistema inmune comprometido o cuando se alteran las barreras normales de la piel y mucosas, generalmente, iniciadas por heridas, quemaduras, cateterizaciones, traqueotomas, punciones lumbares o transfusiones intravenosas (Livermore y Pearson, 2007; Isturiz y Carbon, 2000). P. aeruginosa presenta resistencia natural a muchos antimicrobianos, como a la mayora de las penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda y tercera generacin, cefamicinas, entre otros, debido a caractersticas relacionadas con baja permeabilidad en la membrana, produccin de -lactamasas cromosmicas de tipo AmpC, reduccin de porinas y sobreexpresin de bombas de expulsin activa (Ramn y Fernndez-Cruz, 2008). Adems, puede desarrollar mutaciones cromosmicas y adquirir nuevos elementos genticos que incrementan su resistencia, convirtindose en un patgeno multirresistente a una amplia gama de antimicrobianos disponibles para su control (Madigan et al., 2003; Cantn et al., 2002). Los aminoglucsidos representan un componente fundamental en la terapia de infecciones causadas por P. aeruginosa, debido a su actividad contra bacterias Gram negati-
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vas y por exhibir sinergia con otros antibacterianos, principalmente -lactmicos (Onguru et al., 2008). Sin embargo, su efectividad en la terapia se ha visto disminuida por la presencia de enzimas modificadoras de aminoglucsidos (EMAs), las cuales actan principalmente sobre kanamicina, neomicina, gentamicina, amikacina y tobramicina (Martnez, 2007). Las EMAs modifican covalentemente los grupos amino e hidroxilo de los aminoglucsidos, disminuyendo la especificidad de su unin al sitio blanco en el rRNA 16S, inactivando de esta forma al antimicrobiano (Stain y Raoult, 2002). El conocimiento detallado de la prevalencia de estos determinantes de resistencia en nuestro medio, nos permitir el adecuado uso de dichos agentes en la terapia contra infecciones cuyo agente etiolgico es P. aeruginosa, elevando de esta manera, la capacidad de los centros hospitales para restablecer la salud en sus pacientes. Por esta razn el objetivo de este estudio fue detectar la presencia de genes productores de EMAs en aislados hospitalarios de P. aeruginosa resistentes a aminoglucsidos. MATERIALES Y MTODOS Poblacin de estudio.- Se analizaron 78 aislados de P. aeruginosa resistentes a aminoglucsidos donados por el Departamento de Microbiologa de Zurita&Zurita Laboratorios (Quito, Ecuador). Estos aislados provienen de varios centros hospitalarios de la ciudad de Quito y se muestrearon en pacientes que presentaron casos documentados de infeccin microbiana durante enero de 2005 y octubre de 2008. El perfil fenotpico de resistencia a amikacina, gentamicina y tobramicina, fue realizado mediante MicroScan (Dade Behring), siguiendo los criterios de sensibilidad y lineamientos establecidos por el Clinical and Laboratory Standards Institute, 2009. Los aislados se mantienen en la Coleccin Bacteriana Quito Catlica del Laboratorio de Microbiologa de la Escuela de Ciencias Biolgicas, de la Pontificia Universidad Catlica
del Ecuador. Extraccin de ADN.- Para la extraccin del ADN total, empleado como molde para las pruebas moleculares, se utiliz el reactivo de aislamiento para ADN genmico DNAzol Reagent (Invitrogen), siguiendo las especificaciones del fabricante. Identificacin molecular de Pseudomonas aeruginosa.- La identificacin genotpica de Pseudomonas aeruginosa, se realiz a travs de la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), mediante amplificacin del gen oprL codificante de una protena de membrana externa, nico para esta especie. Los iniciadores usados (Tabla 1), as como las condiciones de amplificacin, con modificaciones, fueron los descritos por Xu et al., 2004. La reaccin de PCR fue estandarizada en un volumen de 25 l, conteniendo: 25 ng de ADN, 800 M de deoxinucletidos fosfato (dNTPmix) (Promega), 0,1 M de cada iniciador (Integrated DNA Tecnologies), 1.25 U de GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega), 10 mM de Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM de KCl, 2.5 mM de MgCl2 (Promega). Como control positivo de la reaccin se emple ADN de la cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 y como control negativo se utiliz agua de graduacin molecular. El programa de amplificacin se realiz en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PerkinElmer). El programa consisti en una denaturacin inicial a 94 C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos, los cuales consistieron en un paso de denaturacin a 96 C por 1 minuto, seguido de un paso de hibridacin a 57 C por 40 segundos y un paso de extensin a 72 C por 1 minuto; y, una extensin final a 72 C por 10 minutos. Deteccin de genes productores de enzimas modificadoras de aminoglucsidos (EMAs).- La deteccin de genes EMAs se realiz mediante PCR, amplificando genes especficos, los cuales han sido identificados como productores de enzimas que modifican
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Tabla 1. Iniciadores utilizados para la deteccin de genes codificantes para el gen oprLy EMAs.
Gen Iniciador Secuencia nucleotdica 5 - 3 pb oprL oprLF ATGGAAATGCTGAAATTCGGC 504 oprLR CTTCTTCAGCTCGACGCGACG aac(3)-IIa aac(3)-IIa-F CGCTAAACTCCGTTACC 196 aac(3)-IIa-R TAGCACTGAGCAAAGCC aac(6)-Ib aac(6)-Ib-F TATGAGTGGCTAAATCGAT 395 aac(6)-Ib-R CCCGCTTTCTCGTAGCA ant(2)-Ia ant(2)-Ia-F CGTCATGGAGGAGTTGGACT 304 ant(2)-Ia-R CGCAAGACCTCAACCTTTTC aph(3)-VIa aph(3)-VIa-F ATACAGAGACCACCATACAGT 234 aph(3)-VIa-R GGACAATCAATAATAGCAAT

Referencia Xu et al., 2004 Xu et al., 2004 Daz et al., 2004 Daz et al., 2004 Daz et al., 2004 Daz et al., 2004 Daz et al., 2004 Daz et al., 2004 Vila et al., 1999 Vila et al., 1999
pb, pares de bases; A, adenina; C, citosina; G, guanina; T, timina; oprL, gen de protena de membrana externa nico de Pseudomonas aeruginosa; EMAs genes productores de enzimas modificadoras de aminoglucsidos.
antibiticos pertenecientes al grupo de los aminoglucsidos, descritos por Shaw et al., 1993. Los iniciadores utilizados en esta seccin se encuentran detallados en la Tabla 1 (Daz et al., 2004; Vila et al., 1999). Las condiciones de amplificacin fueron las descritas por Daz et al., 2004, con modificaciones. La reaccin de PCR se la estandariz en un volumen de 25 l incluyendo: 25 ng de ADN; GoTaq Green Master Mix (Promega), el cual contiene 1.5 mM de MgCl2, 800 M de dNTPs, 1 U de GoTaq DNA Polymerase y 1 X Green GoTaq Reaction Buffer (pH 8.5); 25 pM de cada iniciador (Integrated DNA Tecnologies); se adicion MgCl2 para llegar a la concentracin final de 3 mM; y agua grado molecular hasta alcanzar el volumen final de reaccin. Como controles positivos se utilizaron las cepas 57 KPN-BLEE para el gen aac(3)-IIa, la cepa 68 KPN-BLEE para el gen aac(6)-Ia, la cepa 58 KPN-BLEE para el gen ant(2)-Ia (Ortega 2010) y la cepa 333 Ps aer, para el gen aph(3)-VIa. Como control negativo se utiliz agua de grado molecular. El proceso de amplificacin del ADN se realiz en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PerkinElmer). El programa
consisti en una denaturacin inicial a 96 C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos con denaturacin a 96 C durante 30 segundos, hibridacin a 55 C durante 1 minuto y extensin a 72 C durante 3 minutos; seguido de una extensin final a 72 C durante 8 minutos. Anlisis de los productos de amplificacin.- Los productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1 % en tampn TBE 1X. El programa de electroforesis consisti en la aplicacin de 8V/cm durante 50 minutos en tampn TBE 0.5X. La tincin del gel se realiz empleando SybrGold (Invitrogen). Los resultados fueron fotodocumentados en un sistema de captura de imagen MiniBIS Pro. La longitud de los fragmentos fue calculada empleando el programa informtico GelAnalyzer versin 2010a freeware. RESULTADOS Los 78 aislados analizados fueron confirmados como Pseudomonas aeruginosa mediante la amplificacin de un fragmento de 500 pb, correspondiente al gen oprL (Figura 1).
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Figura 1. Gel representativo del producto de aplificacin del gen de protena de membrana externa oprL (504 pb). M, marcador de peso molecular (100 pb). Las canaletas 1 a la 12 pertenecientes a diferentes aislados de P. aeruginosa y presentan bandas con un peso molecular aproximado de 500 pb correspondientes al gen oprL, nico de P. aeruginosa; comprobando as, la especie de estudio. 1, 13 Ps aer; 2, 16 Ps aer; 3, 17 Ps aer; 4, 21 Ps aer; 5, 23 Ps aer; 6, 28 Ps aer; 7, 29 Ps aer; 8, 31 Ps aer; 9, 38 Ps aer; 10, 44 Ps aer; 11, 45 Ps aer; 12, 48 Ps aer; La canaleta 13 presenta la banda del amplicn de PCR de la cepa ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa utilizada como control positivo; C-, control negativo.
De los 78 aislados resistentes a aminoglucsidos 16 aislados (20.51 %) presentaron resistencia nicamente a gentamicina, 1 aislado (1.28 %) present resistencia slo a amikacina y no se encontr aislados resistentes nicamente a tobramicina (0.00 %). Por otra parte 20 aislados (25.64 %) mostraron resistencia conjunta a gentamicina y tobramicina, 5 aislados (6.41 %) mostraron resistencia a amikacina y gentamicina, no se encontraron aislados con el perfil de resistencia amikacina y tobramicina (0.00 %). treinta y seis aislados (46.15 %) mostraron resistencia a los tres antibiticos (Figura 2). El resultado del anlisis mediante el programa informtico GelAnalizer, document pesos moleculares de 196 pb para el gen aac(3)-IIa, 390 pb para el gen aac(6)-Ib, 300 pb para el gen ant(2)-Ia y 230 pb para el gen aph(3)-VIa; confirmando la presencia de los genes estudiados (Figura 3).
De los 78 aislados analizados, 50 (64.10%) presentaron al menos uno de los cuatro genes EMAs referentes en este estudio, mientras que los 28 aislados restantes (35.90 %) no evidenciaron la presencia de genes. Diecinueve aislados (24.40 %) presentaron nicamente el gen aac(3)-IIa, 11 (14.10 %) aislados presentaron slo el gen aac(6)-Ib, 4 (5.13 %) presentaron slo el gen ant(2)-Ia y ningn aislado fue identificado nicamente con el gen aph(3)-VIa. En los aislados restantes, se logr identificar diferentes perfiles de presencia para genes EMAs; as, el perfil aac(6)-Ib / ant(2)-Ia se identific en 6 aislados (7.69 %), el perfil aac(3)-IIa / aph(3)-VIa se identific en 4 aislados (5.13 %), el perfil aac(3)-IIa / aac(6)-Ib se identific en 3 aislados (3.85 %), el perfil ant(2)-Ia / aph(3)-VIa se identific en 2 aislados (2.56 %) y el perfil aac(3)-IIa / aac(6)-Ib / ant(2)-Ia se identific slo en un aislado (1.28 %); ningn aislado present los cuatro genes (Figura 4).
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Figura 2. Porcentaje de los diferentes Perfiles de resistencia a aminoglucsidos encontrados en los aislados hospitalarios de Pseudomonas aeruginosa. El total de la poblacin resistente a aminoglucsidos fue de 78 aislados.
Figura 3. Gel representativo de los productos de amplificacin de genes EMAs en Pseudomonas aeruginosa. M, marcador de peso molecular (100 pb). 1 y 2, bandas de peso molecular aproximado a 200 pb correspondiente al gen aac(3)-IIa; 1, 377 Ps aer; 2, cepa control 57 KPN-BLEE. 3 y 4, bandas de peso molecular aproximado a 400 pb correspondiente al gen aac(6)-Ib; 3, 373 Ps aer; 4, cepa control 68 KPN-BLEE. 5 y 6, bandas de peso molecular aproximado a 300 pb correspondiente al gen ant(2)-Ia; 5, 318 Ps aer; 6, cepa control 58 KPN-BLEE. 7 y 8, bandas con peso molecular aproximado a 250 pb pertenecientes al gen aph(3)-VIa; 7, 263 Ps aer; 8, aislado control 333 Ps aer; C-, control negativo.
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Figura 4. Porcentaje de los perfiles genotpicos encontrados para genes EMAs en aislados de Pseudomonas aeruginosa resistentes a aminoglucsidos.La poblacin resistente a aminoglucsidos fue de 78 aislados.
DISCUSIN La resistencia bacteriana a aminoglucsidos en infecciones ocasionadas por Pseudomonas aeruginosa ha sido reportada en varios pases alrededor del mundo, con especial nfasis, en Latinoamrica y Europa (Poole, 2005; Andrade et al., 2003; Vakulenko y Mobashery, 2003; Gales et al., 2001). Los altos porcentajes de resistencia a los aminoglucsidos analizados en este estudio, concuerdan con lo reportado por la Red Nacional de Vigilancia de Resistencia Bacteriana-Ecuador, REDNARBEC, 2008 y con porcentajes reportados en otros estudios (Shahid y Malik, 2005; Vakulenko y Mobashery, 2003). Diversos estudios han registrado porcentajes altos de resistencia a gentamicina en aislados de P. aeruginosa de origen nosocomial (Shahid y Malik, 2005; Stratchounskil et al., 1998). En el presente estudio se registr un alto porcentaje de aislados resistentes a gentamicina (60.46 %); fenmeno posiblemente relacionado a los patrones de prescripcin regio-
nales: su generalizado uso emprico (Garca y Yturralde, 2005; Mella et al., 2004), esto a pesar de poseer una toxicidad importante (Mella et al., 2004; Mingeot-Leclercq y Tulkens, 1999). Adicionalmente, se ha registrado una prevalencia alta de genes que codifican para enzimas modificadoras de aminoglucsidos, que confieren resistencia a esta droga (Shaw et al., 1993). En concordancia, en este trabajo se observaron patrones similares de prevalencia, en donde, los genes EMAs relacionados con la resistencia a gentamicina, alcanzaron niveles cercanos al 50.00 %. Antibiticos tales como tobramicina, amikacina (analizados en este estudio), neomicina y netilmicina; se encuentran sujetos a iguales fenmenos de surgimiento de resistencia y diseminacin de la misma (Guerrero et al., 2003). Sin embargo, restricciones en su uso, como dosificacin y uso tpico, han limitado la presin selectiva, la cual ayuda a mantener niveles altos de sensibilidad (Poole, 2005; Schmitz et al., 1999). No obstante, el
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presente estudio registr resistencia a estos antibiticos en tasas relativamente altas, al igual que los determinantes genticos involucrados e incluidos en el estudio (Shaw et al., 1993). A pesar de la presencia de cepas de P. aeruginosa resistentes a aminoglucsidos en el medio hospitalario, estos compuestos mantienen su vigencia en la terapia de infecciones ocasionadas por este patgeno (Poole, 2005; Mella et al., 2004; Vakulenko y Mobashery, 2003), debido, especialmente, a su frecuente uso en sinergia con antibiticos de otras familias (en su mayora -lactmicos con actividad contra P. aeruginosa), principalmente en casos de neumona bacteriana (Poole, 2005; Valls y Mariscal, 2005; Organizacin Panamericana de Salud, 2004). Dicha caracterstica es de gran utilidad en el tratamiento de infecciones graves causadas por P. aeruginosa, la cual puede reducir el uso de agentes antibacterianos de ltima generacin, como carbapenemes (Valls y Mariscal, 2005), aportando tanto a la vigencia de estos compuestos, como a conservar lneas de defensa para casos de infeccin con cepas resistentes a aminoglucsidos (Poole, 2005); adems de reducir el costo del tratamiento (Mingeot-Leclercq y Tulkens, 1999). La tasa de resistencia bacteriana a los aminoglucsidos, al igual que a otros antimicrobianos, experimenta importantes variaciones, probablemente ocasionadas por diferencias en los patrones de prescripcin y dosificacin de los antibiticos, observado entre pases y regiones. Adicionalmente, la calidad en las prcticas y programas de control y vigilancia de infecciones nosocomiales aportan al surgimiento de perfiles localizados de resistencia (Poole, 2005; Vakulenko y Mobashery, 2003). La mayor resistencia observada a gentamicina en este estudio, puede ser el resultado de dichas diferencias en las polticas del uso de antimicrobianos. La prescripcin preferencial de dicho antibitico, en la terapia de infecciones ocasionadas por P. aeruginosa, sugiere una correlacin con la resistencia presentada por los aislados estudiados (Alio et al., 2007; Organizacin Pana-
mericana de la Salud, 2004). De igual forma, propone una sincrona con la prevalencia del gen aac(3)-IIa observada en mayor porcentaje en el anlisis molecular. Este gen confiere resistencia a gentamicina, tobramicina, dibekacina y sisomicina, ms no a amikacina; siendo el principal componente gentico de resistencia a aminoglucsidos. Anteriormente se ha reportado a los productos de genes pertenecientes al grupo aac(3)-II como el principal mecanismo de resistencia a aminoglucsidos en Pseudomonas aeruginosa (Zurita, 2005). En consecuencia, la alta resistencia hacia tobramicina, puede deberse a la relacin gentica que comparte con la resistencia a gentamicina (Vakulenko y Mobashery, 2003; Shaw et al., 1993). Caso similar es descrito en Estados Unidos, en donde la predominancia encontrada del gen ant(2)-I, responsable de la resistencia a gentamicina, es ocasionada por la propensin hacia el uso de este antimicrobiano en la terapia de infecciones ocasionadas por P. aeruginosa (Vakulenko y Mobashery, 2003). El gen ant(2)-Ia arroj un porcentaje moderadamente alto en este estudio. De igual manera, el alto porcentaje en el que se registraron los perfiles de resistencia gentamicina y gentamicina/tobramicina, dentro de este trabajo, puede ser el resultado de la prevalencia de los perfiles genotpicos aac(3)-IIa y aac(6)-Ib / ant(2)-Ia; este ltimo perfil gentico confiere, adems, resistencia a amikacina. El nivel alto de resistencia a amikacina se ve reflejado, por el alto ndice de ocurrencia del gen aac(6)-Ib (Poole, 2005; Shaw et al., 1993). La capacidad de los aislados para producir enzimas modificadoras de aminoglucsidos (EMAs) se estableci determinando la presencia o ausencia de los elementos genticos que los codifican. Los genes analizados fueron aquellos reportados con mayor frecuencia en aislados clnicos de Pseudomonas aeruginosa. Shaw et al., 1993, realiz un estudio que incluy 728 aislados de P. aeruginosa, en el cual, los genes con mayor incidencia encontrados fueron aac(3)-IIa,
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aac(6)-Ib, ant(2)-Ia y aph(3)-VIa. Similares resultados, fueron los arrojados por Daz et al., 2004 y Vakulenko y Mobashery, 2003. La inactivacin mediada por enzimas modificadoras de aminoglucsidos es el principal mecanismo de resistencia bacteriana a esta familia de antimicrobianos (Poole, 2005; Mella et al., 2004; Shaw et al., 1993). Sin embargo, la existencia de mecanismos alternos de resistencia descritos para aminoglucsidos, tales como: impermeabilidad de la membrana externa, ocasionada por mutaciones en porinas; eflujo del antimicrobiano, mediado por sobreexpresin de sistemas de expulsin activa; y mutaciones en el sitio blanco 16s rRNA (Poole, 2005; Mella et al., 2004; Shaw et al., 1993), juegan un papel importante en los porcentajes de resistencia a estos antimicrobianos, aumentando la complejidad de su epidemiologa (Vakulenko y Mobashery, 2003). En el presente trabajo, el 33.90 % de aislados de la poblacin de estudio no present genes EMAs. Consecuentemente, en los aislados que no presentaron genes EMAs, la resistencia observada a aminoglucsidos podra ser esperada por la existencia de uno o varios de los mecanismos de resistencia mencionados. La impermeabilidad de membrana externa, el eflujo del antimicrobiano y mutaciones en el sitio blanco, no fueron incluidos en este estudio. Al igual que otros mecanismos de resistencia, los genes productores de EMAs se encuentran localizados frecuentemente en plataformas genticas mviles, tales como plsmidos y transposones (Mella et al., 2004; Vakulenko y Mobashery, 2003; Mengeot-Leclercq y Tulkens, 1999). Sin embargo, varios estudios han localizado ciertos genes EMAs, (ant(2)-I y aac(6)-I, por ejemplo), dentro de integrones, con mayor frecuencia que otros determinantes genticos de resistencia, lo cual puede explicar, en parte, la ubicuidad de dichos genes y el aparecimiento de cepas multiresistentes (Xu et al., 2004; Reyes et al., 2003).
CONCLUSIONES Los resultados del presente estudio representan el primer reporte de la presencia de aislados clnicos de Pseudomonas aeruginosa con resistencia a aminoglucsidos mediada por la accin de enzimas modificadoras de aminoglucsidos (EMAs) en Ecuador. Existe un alto porcentaje de aislados clnicos de P. aeruginosa resistentes a aminoglucsidos que presentan enzimas modificadoras de aminoglucsidos como mecanismo de resistencia, lo cual, nos indica que al momento de hacer uso esta familia de antimicrobianos se debe tener conciencia de este fenmeno para evitar fracaso teraputico, diseminacin de cepas resistentes, aparecimiento de multirresistencia y la transmisin de estos genes a otros agentes etiolgicos. AGRADECIMIENTOS Los autores desean agradecer al grupo de trabajo del laboratorio de Microbiologa de la Escuela de Ciencias Biolgicas, PUCE, Quito, a todo el personal de Zurita&Zurita Laboratorios. Adems, a la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador y a la donacin voluntaria del Impuesta a la Renta 2009 por el apoyo econmico que hizo posible la realizacin de este estudio a travs del proyecto Determinacin de genes que codifican la resistencia a carbapenemes y aminoglucsidos en Pseudomonas aeruginosa. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Alio M, Esquirol J, Navarro R y Duperval P. 2007. Aminoglucsidos: mirada actual desde su historia. Revista Cubana de Pediatra, 79(2). Andrade SS, Jones RN, Gales AC y Sader HS. 2003. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among Pseudomonas aeruginosa isolates in Latin American medical centers: 5 year report of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (19972001). Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 52: 140141.
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Bsqueda de bacterias con actividad EC 3.2.1.4 (endo-1,4- beta-glucanasa) en Eisenia foetida (Oligochaeta, Lumbricidae)
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Centro Universitario de Investigacin Cientfica y Tecnolgica. Universidad Tcnica del Norte (UTN). Ibarra, Ecuador. pochasalvador@yahoo.com. 2Instituto de Investigaciones Biomdicas, Universidad de las Amricas (UDLA). Quito, Ecuador. 3Centros de Investigacin, Transferencia de Tecnologa, Extensin y Servicios. Universidad Particular de Loja (UTPL). Loja, Ecuador. 4Centro de Anlisis de Procesos, Universidad Central Marta Abreu de Las Villas. Cuba.
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Carmen Amelia Salvador1, 2, Maira Rojas2, Gabriela Jaramillo-Kouperman2, Luca Ypez1, Juan Pablo Surez3, Leyanis Mesa4 y Csar Paz-y-Mio2
Recibido: 16, 03, 2012; aceptado: 05, 10, 2012
RESUMEN.- La lombriz de tierra, Eisenia foetida, es hospedero de numerosos microorganismos simbiontes, muchos de los cuales han sido identificados recientemente, as como se ha descrito su actividad enzimtica. Estos microorganismos suelen presentar actividad enzimtica de diferente tipo. Algunos podran presentar inters industrial por sus potenciales aplicaciones. En el presente trabajo, se eligi identificar aquellos microorganismos que tienen actividad endo--1,4-glucanasa, y evaluar dicha actividad por el mtodo de los azcares reductores de Nelson-Somogyi. Dichos azcares reductores fueron liberados despus de la incubacin de las bacterias con la solucin de carboximetilcelulosa (CMC). Las colonias aisladas de inters fueron cultivadas en Plate Count Agar, PCA (Difco), y su identificacin se llev a cabo mediante el anlisis de la regin 16SDNAr. Comparando los resultados con la base de datos NCBI, se encontr que las especies productoras de la actividad endo--1,4-glucanasa fueron: Burkholderia fhytofirmans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, y Acidovorax delafieldii. Los aislamientos produjeron un porcentaje de degradacin interesante en relacin al control positivo empleado. Se presentan comparaciones de la degradacin causada por las diferentes colonias aisladas. PALABRAS CLAVE: Endo--1,4-glucanasa, enzimas, lombriz de tierra, microbiota, 16SDNAr. ABSTRACT.- The earth worm, Eisenia foetida, is host for numerous symbiotic microorganisms, many of which have been recently identified, as well as the description of their enzymatic activity. These microorganisms usually present enzymatic activity of different type, and some may present industrial interest due to their potential applications. In the present research, it was decided to identify those microorganisms that present endo--1,4-glucanasa activity, and to evaluate this activity by the Nelson-Somogyi method of reducing sugars. Reducing sugars were released after the incubation of the bacteria colonies with carboxymethyl cellulose (CMC) solution. The isolated colonies of interest were cultured in laboratory and their identification was made through analysis of the 16S DNAr region. By comparing the results with the NCBI database, it was found that the endo--1,4- glucanase activity producing species were: Burkholderia fhytofirmans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, and Acidovorax delafieldii. The isolations produced an interesting degradation percentage in relation to the positive control utilized. Comparisons of the degradation caused by the different isolated colonies are presented. KEYWORDS: endo--1,4-glucanase, earth worm, enzymes, microbiota, 16SDNAr.
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Carmen Amelia Salvador, Maira Rojas, Gabriela Jaramillo-Kouperman, Luca Ypez, Juan Pablo Surez, Leyanis Mesa y Csar Paz-y-Mio
INTRODUCCIN La mayor fraccin de materia orgnica en los ecosistemas terrestres est constituida por celulosa. Los microorganismos del suelo son los principales responsables de transferir el carbono de la celulosa y otros compuestos a la atmsfera, pero su contribucin no es exactamente conocida (Haichar, 2007); algunos de estos microorganismos viven en simbiosis en la lombriz de tierra, que tambin est ligada a la materia en descomposicin (Edwards y Bohlen, 1996). Los microorganismos que habitan en el suelo ingresan al tubo digestivo de la lombriz de tierra para servir de alimento, brindar un componente energtico a la dieta de la lombriz y para activar o desactivar una produccin enzimtica (Zirbes, 2007). La poblacin microbiana ingerida tiene entre sus funciones la de ayudar a digerir la materia orgnica del suelo (Brown y Lavelle, 2000) y desencadenar una actividad enzimtica (Aira et al., 2006), estas comunidades microbianas muestran una asociacin oportunista (Curry y Schmidt, 2006). En Eisenia foetida tambin se han descrito mecanismos de activacin de la produccin de actividades enzimticas, encontrndose las actividades, celobiasa y endoglucanasa, relacionadas con las actividades celulolticas (Prabha, 2007). Las celulasas descomponen los restos vegetales de los que se alimenta la lombriz de tierra, pueden participar en la descomposicin de lignina y en el proceso de humificacin (Brown y Lavelle, 2000). La actividad celuloltica puede ser propia de la especie o estar relacionada con la flora microbiana ingerida a partir del suelo, para permitir la hidrlisis de sustratos como la celulosa y el manano (Lattaud et al., 1997). Estas enzimas facilitan el reciclaje de los elementos nutritivos a partir de materia orgnica y su conversin en formas fcilmente absorbibles por las plantas (Edwards y Bohlen, 1996). Para la hidrlisis y el metabolismo de la celulosa los microorganismos producen celulasas extracelulares libres o
asociadas a la clula. Las endoglucanasas EC 3.2.1.4 actan en las porciones amorfas de las fibras de celulosa (Ramirez y Coha, 2003). La actividad celuloltica ha sido encontrada en algunos microorganismos pertenecientes a los Phylum Firmicutes, Actinobacteria, Fibrobacteres, Bacteroidetes, as como Proteobacteria. Entre las bacterias celulolticas ms abundantes se puede citar Cellulomonas sp, Microbisporabispora sp, Thermomonospora sp, Cytophaga sp, Corynebacterium sp, Vibrio sp, Bacillus sp, Pseudomonas sp y Thermobfida sp (Gaitan y Prez, 2007). De estas algunas especies como Clostridium thermocellum cumplen con el proceso de hidrlisis de la celulosa de manera eficiente pues poseen un complejo enzimtico que favorece la celulolisis, constituido de endo 1-4 glucanasa , exo 1-4 glucanasa y - glucosidasa, este complejo puede ubicarse en una estructura denominada celulosoma (Mitsuhiro, 2010). Algunas colonias aisladas de Burkholderia fhytofirmans y Bacillus sp., producen celulasas poco comunes (Sessitsch, 2005), que tienen alta actividad y termoestabilidad a un alto rango de pH (Miranda, 2009). Los organismos ms comunes de esta lombriz son los bacilos Gram positivos (Vinceslas-Akpa y Loquet, 1995) del gnero Bacillus. Sin embargo, tambin se han encontrado microorganismos Gram negativos a nivel de los rganos excretores de la lombriz llamados nefridios. Anlisis de las bacterias ligadas a los nefridios han mostrado que cada especie de lombriz alberga una especie bacteriana distinta y que las especies de bacterias forman un haz monofiltico en el gnero Acidovorax, pareciendo ser que hay una asociacin especfica, resultado de un ancestro bacteriano comn (Davidson y Stahl, 2006). En el presente estudio se desea hallar en los intestinos de la lombriz bacterias productoras de actividades endo-1,4-beta-glucanasa y comprender si entre las especies encontradas existen diferencias en la degradacin de la celulosa.
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MATERIALES Y MTODOS Recoleccin de lombrices.- Los individuos provinieron del Vivero del Programa Quito-Verde del Municipio de Quito, estos fueron mantenidos en el laboratorio del Instituto de Investigaciones Biomdicas, IIB de la Universidad de las Amricas. Las lombrices fueron colocadas en una caja rectangular de plstico con una capacidad de 10 l en un suelo orgnico hmedo con una temperatura entre 15 C y 25 C. El sustrato en el que fueron conservadas se compone de tierra de superficie y desechos vegetales en proporciones de 2:1, respectivamente. Diseccin de lombrices de tierra y recoleccin del tubo digestivo.- Las lombrices de tierra fueron lavadas con agua destilada, sumergidas en etanol al 45 % durante 5 s, colocadas en un congelador durante 3 min para que el agua del tejido epidrmico de la lombriz se encuentre cristalizado y se pueda proceder fcilmente con la diseccin. Se extrajo el tubo digestivo de la lombriz y se lo coloc en 1 ml de agua destilada estril. La mezcla que contiene extractos de tubo digestivo no filtrados, se coloc en el vortex (Genius) durante 15 s, a velocidad mediana. Esta mezcla se coloc en tres diluciones sucesivas de 1ml de agua destilada, con el objetivo de obtener concentraciones en diluciones de base diez. Deteccin de la actividad enzimtica en los extractos filtrados y no filtrados.- Despus de la diseccin se tom el tubo digestivo. ste fue colocado en 1 ml de agua destilada, para ser homogeneizado con ayuda del vortex (Genius); esta mezcla corresponde a los extractos no filtrados, y se refiere a los diferentes tejidos del tubo digestivo que contienen microorganismos y estructuras como el celulosoma. En cambio los extractos filtrados son obtenidos mediante la filtracin en una membrana Millipore 0.45 m (Merck) de la mezcla del tubo digestivo en agua destilada; este filtrado corresponde al segundo extracto y
contiene en su gran mayora molculas como enzimas. Ambos extractos sirven de gua para determinar el origen, ya sea microbiano o propio de la lombriz, de la actividad EC 3.2.1.4 endo-1,4- beta-glucanasa. El origen de la actividad se determina colocando los extractos anteriores, en tubos de vidrio de 20 ml, que contienen 10 ml de agua destilada, 0.9 g de gelatina y 0.2 g de carboximetilcelulosa. Para verificar que no existe presencia de azcares reductores en la gelatina natural, se emple el mtodo de licor de Fehling Causse-Bonnans (Isla, 2011) pues estos pueden registrar resultados falsos el test enzimtico de Nelson-Somogyi. No se encontraron azcares reductores. Este sustrato de CMC y gelatina fue previamente autoclavado a 120 C para posteriormente inocular los extractos filtrados y no filtrados. Despus de 15 horas de la inoculacin de ambos extractos se procedi al empleo del protocolo de Nelson-Somogy (Nelson, 1944) para el anlisis de la glucosa obtenida producto de la degradacin de la celulosa y para verificacin de la presencia de las enzimas en alguno de los extractos. Se coloc un control positivo con una enzima comercial celulasa de Aspergillus niger C1184-5KU Sigma-Aldrich; para la preparacin de la enzima se coloc 0.1 g de la enzima comercial en 10 ml de agua destilada. El control negativo contena agua destilada estril en lugar de la solucin bacteriana o enzimtica. Este ensayo es realizado para asegurarnos de la presencia de microbiota simbionte productora de la actividad enzimtica en los extractos del tubo digestivo, previo al ensayo de aislamiento. Aislamiento, purificacin, seleccin y preparacin de las colonias.- Se sembr 40 l del extracto no filtrado en medio Plate Count Agar, PCA (Difco), para realizar el contaje de las colonias. Las colonias que crecieron fueron aisladas, purificadas, sembradas nuevamente en caldo nutritivo (Difco) a 37
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C 1 por 24 horas. Luego de la incubacin se aislaron colonias en medio PCA, para confirmar la pureza. Los aislamientos madre fueron conservados en criotubos (Fisher) con esferas de plstico a - 80 C. Deteccin de la actividad celuloltica EC 3.2.1.4 (endo-1,4- beta-glucanasa) por el mtodo de azcares reductores de Nelson-Somogy.- Esta prueba se realiz con las bacterias aisladas de los extractos no filtrados, sin presencia de gelatina como soporte, siguiendo el mtodo de azcares reductores, que consisti en preparar el sustrato diluido de carboximetilcelulosa (CMC) al 2 %. De esta preparacin se tom 1 g de este sustrato en 50 ml de tampn fosfato de sodio (pH 5.8). Esta mezcla se homogeneiz rpidamente durante 5 min con la ayuda de un agitador magntico para evitar cualquier tipo de agregaciones, para luego enfriar a temperatura ambiente. Se emplearon los mismos controles para la deteccin de la actividad enzimtica en los extractos filtrados y no filtrados. Preparacin y lectura de las muestras.Se coloc 0.5 ml de bacterias previamente preparadas en agua destilada estril a escala Mc. Farland 2 en un tubo que contena 1 ml de sustrato diluido del medio CMC. Se dej a bao Mara durante 15 min, se procedi segn el protocolo de Nelson-Somogy (Nelson, 1944). Anlisis por espectrofotometra.- Se sacaron los tubos del bao Mara y se colocan 3ml de solucin Acido dinitrosaliclico (DNS) en cada tubo. Se colocan todos los tubos en un bao Mara a 100 C durante 5 min. Luego se enfriaron los tubos y se midi la cantidad de glucosa producida por la degradacin de la celulosa en el UVmini-1240-Shimadzu Spectrophotometer a 550 nm. Para interpretar los resultados de la degradacin producida por las colonias bacterianas, se aplic la prueba de Kruskal-Wallis (Chan y Walmsley, 1997), para esto se uso el programa Minitab 15(Win2000/XP/2003/Vista). Se planteo la hiptesis nula (H0) en la que
no existe diferencia estadstica en la degradacin de la celulosa generada por las bacterias y la hiptesis alternativa (H1) en la que existe diferencia estadstica en la degradacin de la celulosa generada por las bacterias. Secuenciamiento e Identificacin molecular.- El ADN fue extrado de aproximadamente 2 x 10 9 bacterias (en 1 ml de agua destilada) que se encontraban en caldo nutritivo (Difco) empleando un kit de purificacin PureLink Genomic DNA (Invitrogen). Un volumen final de 50 l por reaccin fue amplificado en un termociclador Thermal cycler Multigene Gradient (Labnet International, Inc.). Por reaccin se tuvo 10 l de DNA a una concentracin de 5 ng/l, 1 M de cada primer, 0.20 mM de dNTPs, de 1.5 mM de MgCl2 y 1.25 U Taq Polimerasa (Invitrogen). Los primers empleados para la secuenciacin de la regin 16SDNAr son 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Universal Turner (Turner, 1999) y 1492R (s) GGTTACCTTGTTACGACTT Universal Lane (Lane, 1991). Los fragmentos de amplificacin fueron verificados por electroforesis en geles de agarosa al 1 %. Se purific la PCR con el PureLink PCR Purification Kit (Invitrogen). Las secuencias Forward y Reverse fueron alineadas usando el programa Bioedit (Harrison y Langdale, 2006). Las secuencias presentes en los organismos fueron alineadas a organismos presentes en el Database GenBank database (Septiembre 2011), usando el Basic Local Alignment Search Tool(Blast) del National Center for Biotechnlogy Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome. RESULTADOS En el tubo digestivo de los siete individuos de Eisenia foetida se encontr una media aritmtica de 2.07 x 105 CFU/ g de bacterias totales. De esta microbiota se seleccionaron cinco aislamientos, que produjeron despus
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Especies: Aspergillus niger C1184-5KU-Control + (1), Bacillus amyloliquefasciens (2), Acidovorax delafieldii (3), Burkholderia phytofirmans (4), Bacillus amyloliquefasciens (5), Bacillus licheniformis (6), Control - (7) Figura 1. Porcentaje de glucosa despus de la degradacin de la carboximetilcelulosa.
del tiempo de incubacin, una absorbancia de ms de uno, esta medida fue tomada debido a que la Absorbancia, Ab que present la enzima comercial superaba este valor en cada una de las mediciones realizadas. Despus de la alineacin de las secuencias en el Blast, las cinco especies tienen secuencias similares en un 99% a Burkholderia fhytofirmans (CL1), Bacillus amyloliquefaciens (CL5) (CL9), Bacillus licheniformis (CL16), y a Acidovorax delafieldii (CL8). En relacin a la presencia de glucosa promovida por la degradacin bacteriana de la celulosa en presencia de la actividad EC 3.2.1.4 (endo-1,4-beta-glucanasa, sta fue transformada en porcentaje como se observa en la Figura 1. Solo se encontraron actividades enzimticas celulolticas de origen posiblemente microbiano en los extractos no filtrados, sin embargo en otros estudios (Edwards y Bohlen,
1996), se han encontrado en los extractos no filtrados, enzimas celulolticas secretadas por la propia lombriz de tierra y no por la microbiota simbionte. A nivel cualitativo se presenci un cambio en la constitucin de la mezcla pues se form un halo vidrioso-lquido que nos indicaba la degradacin de la actividad endo-1,4- beta-glucanasa. Del extracto digestivo no filtrado se seleccionaron las cinco bacterias para la determinacin cuantitativa de la actividad endo-1.4-beta-glucanasa. Estas bacterias, bajo las condiciones descritas, degradaron de manera similar los sustratos de CMC, pues la prueba de Kruskal-Wallis proyect el valor de diez y ocho para los datos de absorbancia medidos; para esto previamente se encontr que el valor de ji-cuadrada para 4 grados de libertad es 9.48 para un nivel de confianza del 95%, en la prueba ANOVA el valor es de 1.64 y la probabilidad es del 0.82 .Tabla 1.
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Tabla 1. Anlisis estadstico empleado para medir la degradacin de la carboximetilcelulosa.
Prueba de Kruskal-Wallis Grupo N
Mediana del promedio Z -0.02 0.72 0.62 -0.29 -1.03
Cl1 7 1.055 17.9 Cl5 7 2.45 20.5 Cl8 7 2.2 20.1 Cl9 7 1.87 17 Cl16 7 1.54 14.4 General 35 18 H=1.64 G=4 P=0.802 H=1.64 G=4 P=0.801 Parece ser que esta actividad celuloltica puede originarse de los microorganismos ingeridos en la dieta nutricional de la lombriz o en algunos casos estar fijada a partculas del sistema digestivo de Eisenia foetida, como el celulosoma. DISCUSIN El nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) que se encontr con esta especie coincide con otros estudios realizados (Vinceslas-Akpa y Loquet, 1995), se esperaba encontrar una abundancia bacteriana ms alta en los intestinos de Eisenia foetida, pues la microbiota investigada proviene del suelo y de materiales orgnicos del componente edfico ecuatoriano que es considerado megadiverso (Estrella, 2005). Tambin otros estudios han mostrado que la diversidad microbiana total de la especie podra ser independiente del sitio en el que se colect la lombriz (Salvador et al., 2011), porque posiblemente Eisenia foetida posee un mecanismo de seleccin de las especies microbianas que ingiere (Zirbes, 2007). Con el valor de la probabilidad de 0.82 en la prueba de Kruskal-Wallis (Chan y Walmsley, 1997) se concluye que no hay variacin entre las colonias aisladas cuando se trata de degradar la carboximetilcelulosa. Al respecto se conoce que los gneros Acidovorax, Burkhol-
deria y Bacillus, posiblemente requieren de mecanismos que estimulen la actividad enzimtica como la respuesta fisiolgica fsico-qumica de la lombriz de tierra como hospedero (Brown y Lavelle, 2000). Se conoce adems que los gneros Burkholderia, Bacillus y Acidovorax comprenden algunas especies que son transitorias, que se encuentran comnmente en el suelo y que posiblemente son estimuladas por condiciones ambientales del componente edfico. De los gneros encontrados, Acidovorax ha sido ampliamente estudiado porque puede ser heredado (Davidson y Stahl, 2006); la transmisin de bacterias simbiontes en las cpsulas de los huevos ha sido recientemente demostrada en Eisenia foetida, el gnero incluye especies que han sido aisladas del suelo y del fango (Heylen et al., 2008); sobre el origen de las bacterias se ha sugerido que el morfotipo de bacterias filamentosas, debe ser interpretada como una microfauna autctona del tubo digestivo (Nelson, 1944), sin embargo, el origen de la microbiota sigue siendo controversial (Curry y Schmidt, 2006). AGRADECIMIENTOS A Jos Ignacio Laquidin por el trabajo de traduccin en ingls, la revisin del texto en espaol y las sugerencias brindadas. A Marthe Vinceslas-Akpa y Ricardo Oliva por los artculos cientficos facilitados.
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Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador
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Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito; Centro de Investigacin de la Biodiversidad y Cambio Climtico, Universidad Tecnolgica Indoamrica, Quito. casoria@puce.edu.ec
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RESUMEN.- Muestras de hongos fueron recolectadas en las estribaciones occidentales y orientales de Ecuador en las provincias de Pichincha, Sucumbos, Orellana y Santo Domingo de los Tschilas. Los hongos fueron aspticamente aislados y multiplicados en Agar Papa Dextrosa (PDA) o Agar Malta (MA). Se observ su crecimiento y luego fueron identificados molecularmente en base a la secuencia de la regin ITS1 e ITS2 del ADN ribosomal. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con otras similares en Genbank para su anlisis filogentico e identificacin. Las cepas aisladas e identificadas fueron sembradas en Carboximetilcelulosa (CMC) para evaluar sus capacidades enzimticas de degradacin celulsica. Dimetros (en mm) de los halos de hidrlisis fueron continuamente monitoreados durante 7 y 14 das de crecimiento, observndose halos ms grandes en las cepas H23.2 y H24 del gnero Pestalotiopsis y la de L4 del gnero Neonothopanus con medias significativas. Mayor actividad extracelulsica se registr en los sobrenadantes extrados de los gneros Neonothopanus, Pestalotiopsis y Gymnopilus a los 14 das de cultivo en el intervalo de 24 h. Esta actividad enzimtica en algunos casos no guard una relacin proporcional con la concentracin proteica en g/ml de los sobrenadantes extrados de los diferentes cultivos. PALABRAS CLAVES: Celulasas, celulosa, hongos, identificacin, protenas. ABSTRACT.- Fungal samples were collected in the Western and Eastern Andean foothills of Ecuador in the provinces of Pichincha, Sucumbos, Orellana and Santo Domingo de los Tschilas. The fungi were aseptically isolated and increased on Potato Dextrose Agar (PDA) or Malt Agar (MA). Their growth characteristics were recorded, and molecularly identified on the basis of ribosomal RNA internal transcribed spacer (ITS) region. The sequences were compared with other similar sequences on GenBank for phylogenetic analysis and identification. The isolated and identified strains were plated on Carboxymethylcellulose (CMC) to evaluate their enzymatic capabilities to degrade cellulose. Diameters (in mm) of the halos of hydrolysis were continuously monitored during 7-14 days of growth. The halos in strains H23.2 and H24 of the genus Pestalotiopsis and of L4 of the genus Neonothopanus had halo diameters significantly bigger than most of the other fungal samples tested. Increased extracellulolytic activity was recorded in the supernatants extracted from the genera Pestalotiopsis, Neonothopanus, and Gymnopilus after 14 days of culture in the 24-hour interval. This enzyme activity, in some cases, was not proportional to the protein concentration in g/ml of the supernatants extracted from the different cultures. KEYWORDS: Cellulases, cellulose, fungi, identification, proteins.
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Andrea Rodrguez-Guerra, Charles W. Barnes, Mara Eugenia Ordez, Andrs Salazar y Carlos A. Soria
INTRODUCCIN La celulosa es un componente importante de las paredes celulares y probablemente uno de los ms abundantes recursos renovables de la naturaleza (Fan et al., 2012). La degradacin de la celulosa tiene gran importancia en el ciclo del carbono y son los microorganismos del suelo, hongos y bacterias los que descomponen por hidrlisis esta macromolcula formando varios azcares (Gefen et al., 2012; Coradetti et al., 2012). Existen variedades de hongos cuyas enzimas degradan los complejos cristales de celulosa en oligosacridos, celobiosa o unidades de glucosa (Coradetti et al., 2012; Gaitn y Prez, 2007). Celulosas y celulasas son utilizadas, por ejemplo, por la industria, en la manufactura de papel, cartn, telas, pelculas fotogrficas, celofanes, diluyentes, jabones, aromas y alimentos (Ponce y Prez, 2002; Azzaz et al., 2012). Se han reportado tres tipos de celulasas: la endo B-1,4 glucanasa o carboximetilcelulasa, la exo B-1,4 celobiohidrolasa y la B-1,4 glucosidasa. El nivel de la actividad celulsica y su aplicacin depende de cada enzima, de la composicin del medio y del proceso de control (Azzaz et al., 2012; Brs et al., 2011). En la actualidad, la utilizacin de microorganismos con actividad celulsica representa una solucin viable para el problema de la acumulacin de residuos celulsicos como resultado de las actividades agrcolas, el desbroce de bosques y la industria en general. El concepto celulsico podra ser una inversin a bajo costo para obtener como resultado una bioremediacin aplicable, un sustrato de carbono aprovechable inclusive como biocombustible o la obtencin de otros compuestos como algunos productos farmacuticos, cidos orgnicos o edulcorantes (Fan et al., 2012; Valencia, 2009; Garca et al., 2000). Se han realizado investigaciones sobre el aislamiento, caracterizacin y produccin de variadas enzimas utilizando hongos de los gneros Penicillium, Gymnopilus, Pestalotiopsis
o Fusarium (Hongguang et al., 2011; Russell et al., 2011; Qu, 2008; Valentin-Carrera et al., 2008; Jiao, 2006). No existen estudios acerca de la diversidad de hongos con actividad celulsica en un pas mega-diverso como es el caso de Ecuador. El presente trabajo tiene como objetivo principal iniciar estudios moleculares de identificacin, evaluacin y cuantificacin de la capacidad celulsica en medios de cultivo con carboximetilcelulosa utilizando cepas de hongos aislados localmente. MATERIALES Y MTODOS Aislamiento.- Muestras de hongos fueron recolectados al azar de materia orgnica en descomposicin en las provincias de Pichincha, Sucumbos, Orellana y Santo Domingo de los Tschilas, en Ecuador. Se tomaron muestras de menos de 1cm2 del estpite del cuerpo fructfero de los hongos recolectados y se sembraron en el campo en medios de Agar Papa Dextrosa (PDA) o Agar Malta (MA) conteniendo estreptomicina al 0.1 % como antibacteriano, 0.2 % de levadura como compuesto de enriquecimiento y 0.01 % de benomil al 50 % como inhibidor de ascomicetos. Estos aislados fueron incubados durante 7 das a 30 C, al trmino de los cuales se observ basidiomicetos y un ligero crecimiento de 3 nuevos hongos del grupo de los ascomicetos. De este crecimiento primario, se sembraron todos los aislamientos obtenidos en medios PDA y MA utilizando una cmara de flujo laminar ESCO Optimair . Junto con estos nuevos aislados se realizaron las pruebas preliminares de actividad celulsica cuya metodologa se describir ms adelante. Identificacin molecular.- Los cultivos puros obtenidos se multiplicaron y preservaron en PDA sin aditivos. Para la identificacin molecular se extrajo ADN del micelio siguiendo un protocolo de extraccin con Tiocianato de Guanidina. Se coloc el micelio en tampn de lisis con proteinasa K (20 mg/ml) a 55 C
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por 3 horas. Las protenas se precipitaron con una solucin 4M de Tiocionato de Guanidina, seguido por la precipitacin de ADN con isopropanol. El ADN fue purificado con acetato de sodio 3M y precipitado nuevamente con etanol al 70 %. El ADN concentrado fue almacenado en Tris EDTA pH 8, mientras que las diluciones de ADN usadas para la amplificacin se ajustaron a 25 ng/l en agua destilada estril. Se amplific la regin ITS1, 5.8S e ITS2 del ADN ribosomal, mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores ITS1 e ITS4 (White et al., 1990; Russell et al., 2011). Dos l de los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 1 % y los 20 l restantes fueron enviados a la compaa Macrogen (Macrogen Inc., Seoul, Korea) para su secuenciacin. Las secuencias obtenidas fueron alineadas con los mejores emparejamientos para cada cepa encontradas con la bsqueda Blastn en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank). Se realiz un anlisis filogentico de las muestras encontradas y las cepas obtenidas con un mtodo de mxima verosimilitud (PHYML), con 1000 rplicas de bootstrap, utilizando el programa Geneious Pro 5.4.6 (Drummond, 2011). Descripcin morfolgica.- La descripcin morfolgica macroscpica de los cultivos puros de las cepas se efectu despus de cinco das de incubacin en MA o PDA. Se levant una base de datos con fotografas y descripciones de la coloracin que presentaba el micelio de cada cepa en ambos medios. Se utiliz la identificacin de colores RAL de Pantone (http://www.logorapid.com/tabla_de_colores_ral), tomando en cuenta los colores del centro de la colonia hacia afuera (Logorapid, 2012). Caracterizacin del crecimiento y de su actividad celulsica.- Cada cepa de hongo fue sembrada en el centro de cada una de 3 cajas Petri conteniendo 20 ml de Agar Carboxi-
metilcelulosa (CMC) al 1 %. Las cajas fueron incubadas a 30 C en un incubador Incucell de MMM Group durante 2, 4 y 7 das. Al trmino del tiempo de incubacin se procedi a teir homogneamente cada cultivo con 5 ml de Rojo Congo al 1 % durante 15 min descartando el tinte sobrante. Se procedi a diluir y lavar el remanente con 5 ml de una solucin de NaCl 0.1 M durante 15 min eliminndose luego la mayor cantidad del tinte diluido (Gaitn y Prez, 2007). Se realizaron 2 mediciones del halo de crecimiento del hongo en cada una de las 3 cajas sembradas utilizando el calibrador digital Tresna (0-200 mm): una medicin desde el centro de la colonia hacia el borde exterior del halo, y otra desde el borde interno del halo hacia el exterior del mismo. Posteriormente, se realiz la descripcin detallada del tipo de halo observado. Los datos del tamao del halo fueron analizados siguiendo un diseo completamente aleatorizado de un factor DCA o Anova 1, con igual tamao de muestra en el programa SPSS ver. 18, para establecer comparaciones entre la accin enzimtica de cada cepa durante los 2, 4 y 7 das estudiados (Snchez-Otero, 2011). Actividad celulsica exoenzimtica.Las cepas en estudio fueron cultivadas durante 7 y 14 das a 30 C en tubos con 5 ml de una suspensin de CMC al 0.5 % esterilizados a 120 C por 15 min a 1 atm. Los tubos con el cultivo fueron centrifugados durante 20 min a 2500 rpm (250 g) en una centrfuga Conical Centrifuge Aloe Scientific y se procedi a recuperar el sobrenadante que se guard a 4 C en varios tubos de 1.5 ml. Sesenta ul de este sobrenadante fueron incorporados en forma asptica en un orificio central de 7 mm de dimetro por 4 mm de profundidad que se cre con un sacabocados en el Agar CMC al 1 %, en cada una de 3 cajas Petri pequeas (5 cm de dimetro, 6 ml de agar) por cepa estudiada. Los halos de actividad que se formaron a 18 C fueron analizados, fotografiados y cuan-
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tificados a las 2, 4, 6, 8 y 24 h despus de la inoculacin y despus de haber sido coloreados con una solucin de Rojo Congo similar al procedimiento que se utiliz para visualizar crecimiento y halos de actividad enzimtica. Se realiz un Anova multifactorial con diseo aleatorio para las 3 lecturas de cada uno de los 5 intervalos de tiempo (2, 4, 6, 8, 24 h) en cada una de las 10 cepas incubadas a los 7 y 14 das. Cuantificacin proteica total extracelular por espectrofotometra.- Se analiz la concentracin proteica en los sobrenadantes de los cultivos arriba mencionados utilizando el kit de cuantificacin de protenas totales QuantiProTM BCA de Sigma con modificaciones implementadas en el laboratorio (Astudillo y Soria, 2011). Los reactivos se prepararon mezclando 500 l de la muestra sobrenadante a analizar con 500 l del reactivo de cuantificacin en una proporcin 1:1, utilizando tubos de 1.5 ml. Los tubos fueron incubados a 60 C por aproximadamente 15 min; seguidamente se procedi a medir la absorbancia de la protena extracelular fngica a 562 nm usando el espectrofotmetro Thermo Scientific y a compararla con la absorbancia de las concentraciones estndar de albmina bovina (BSA) que contenan entre 0 y 500 g de protena por ml. Se realiz un Anova factorial con diseo aleatorio para las 2 lecturas de cada una de las absorbancias en las 10 cepas incubadas a los 7 y 14 das. Adicionalmente, se realiz una prueba de Tukey para determinar los subconjuntos homogneos de los valores de absorbancia en ambos periodos de incubacin. Se realiz adems una correlacin bivariada de la actividad exoenzimtica y de la absorbancia de los extractos de las 10 cepas cultivadas por 7 y 14 das.
tudiados incluyendo su gnero y/o especie resultante de su identificacin molecular en base a secuencias de la regin ITS. Los datos de porcentaje de cobertura, mxima identidad y valores de bootstrap para cada cepa se muestran en la Tabla 1. En el caso de las cepas L7 (Psilocybe cubensis), L9 (Agaricus bisporus) y L10 (Agaricus bisporus) donde el porcentaje de cobertura fue igual o mayor a 99 y la identidad mxima fue 100. No se realiz anlisis filogentico, por lo que la Tabla 1 no muestra valores de bootstrap para esas cepas. La cepa L4 (Neothopanus nambi) y la cepa L5 (Gymnopilus junonius) se agruparon con muestras europeas en el anlisis filogentico. La cepa L22 fue identificada por su anamorfo, Penicillium pinophilus. En el caso de la cepa L8, la Figura 1 muestra la relacin filogentica entre especies de Chloridium segn los resultados del Blastn para las secuencias del ITS. La cepa L8 y otra muestreada en la Florida, EEUU, se agrupan como Chloridium virescens aunque difieren notoriamente de otras C. virescens igualmente colectadas en ese pas. La Figura 2 muestra la relacin filogentica entre especies de Pestalotiopsis segn secuencias del ITS con los resultados de Blastn. No se pudo asignar especies para las cepas H23.1, H23.2 y H24 del gnero Pestalotiopsis ya que no hubo un buen emparejamiento con las secuencias descritas para ese gnero, inclusive la cepa H24 result diferente a la H23.1 y H23.2.
Caractersticas del crecimiento.- La Figura 3 muestra el crecimiento comparativo de cada cepa en PDA y MA; la Tabla 2 describe la coloracin del micelio de las mismas. La mayora de las cepas estudiadas presentan distintos tonos en la coloracin segn el medio en el que fueron cultivadas pero las caractersticas del crecimiento fueron relativamente similares tanto en PDA como en MA para las RESULTADOS cepas L4 (N. nambi) y H23.2 (Pestalotiopsis Identificacin molecular y descripcin sp.), aunque en algunos casos el PDA favode los hongos estudiados.- La Tabla 1 descri- reci crecimientos ms rpidos para L5 (G. be los datos de coleccin de los 10 hongos es- junonius), L8 (C. virescens), L9 (A. bisporus)
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Tabla 1. Datos de coleccin e identificacin molecular de los hongos estudiados.
Cdigo Especie ms Localidad Localidad cepa cercanamente del Blastn Provincia relacionadaa
Nmero de asccesin id/boot.b
% cobertura/ Max. 86/98/97 100/100/100 99/100 99/100/100 100/100 100/100 >99/100
L4 Neonothopanus nambi Austria Cuyabeno, Sucumbos JX684002 L5 Gymnopilus junonius Francia Amaguaa, Pinchincha JX684001 L7 Psilocybe cubensis Varios Amaguaa, Pichincha JX684006 c L8 Chloridium virescens EEUU Nanegal, Pichincha JX684009 L9 Agaricus bisporus Varios Quito, Pichincha JX684007 L10 Agaricus bisporus Varios Quito, Pichincha JX684008 L22 Talaromyces Varios El Coca, Orellana JX684010 pinophilus (anamorfo: Penicillium pinophilus) H23.1 Pestalotiopsis sp. d Varios Otonga, Sto JX684004 DomTschilas H23.2 Pestalotiopsis sp. d Varios Otonga, Sto JX684005 DomTschilas H24 Pestalotiopsis sp. d Varios Otonga, Sto JX684003 DomTschilas
>99/100/43 >99/100/43 >99/100/68
a. En base a los resultados de Blastn, y del anlisis filogentico con especies cercanamente relacionadas. b. Resultados de Blastn para porcentaje de cobertura e identidad mxima, y valor de bootstrap del ltimo grupo filogentico de la cepa. Se utiliz anlisis filogentico cuando los resultados de Blastn no eran obvios. c. Existen 2 grupos claramente diferentes para Chloridium virescens (ver Figura 2). L8 tiene una secuencia similar solo a una muestra de la Florida, EEUU. d. El anlisis filogentico no mostr buena agrupacin con nombres de especies, pero H24 es diferente a H23.1 y H23.2 (ver Figura 1).
y L10 (A. bisporus); mientras que L7 (P. cubensis), L22 (P. pinophilus) y L24 (Pestalotiopsis sp.) crecieron mejor y ms rpidamente en MA. Diferencias y caracterizacin de la actividad celulsica durante el crecimiento.La cepa que mostr el mayor halo de hidrlisis del CMC a los 7 das de crecida fue H23.2 Pestalotiopsis sp. (media = 14.63 mm), seguida de H24 (Pestalotiopsis sp.), L4 (N. nambi) y de L9 (A. bisporus) con medias estadsticamente similares de 10.21 mm, 9.65 mm y 8.54 mm, respectivamente. La prueba de Tukey al 0.05 permiti comparar y confirmar resultados obtenidos de las cepas en estudio. Del anlisis de varianza (ANOVA) se obtuvo un coeficiente de varian-
za del 14.48 % indicando que no hubo variabilidad aceptable entre los datos experimentales dentro de cada grupo. Existieron diferencias altamente significativas entre los valores de las medias obtenidas para las 10 cepas (p= 0.000). Considerando la desviacin tpica, se encontr que no existen variaciones considerables entre las medias de los halos de hidrlisis de las cepas L8 C. virescens (7.37 mm), L9 A. bisporus, (8.54 mm), L10 A. bisporus (7.04 mm) y probablemente H23.1 Pestalotiopsis sp. (6.71 mm). Medias estadsticamente parecidas son las que se observaron en L5 G. junonius (5.37 mm), L10 A. bisporus (7.04 mm), L22 P. pinophilus (5.69 mm) y H23.1 Pestalotiopsis sp. (6.71 mm). Se reporta otras similitudes estadsticas para L5 G. junonius (5.37 mm), L7 P. cubensis (4.42 mm), L10 A.
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Figura 1. Relacin filogentica de las especies de Chloridium segn las secuencias de la regin ITS del ADNr utilizando PHYLM en Genious. Los nmeros sobre las ramas corresponden a valores de bootstrap >50 %. Se utiliz Thielaviopsis basicola como grupo externo. La muestra en negrilla es la que se utiliz en este estudio. Los nombres de las muestras empiezan con gnero (C= Chloridium), cdigo de identificacin de la muestra, Estado de los EEUU, y/o cdigo de 3 letras del pas.
bisporus (7.04 mm) y L22 P. pinophilus (5.69 (p = 0.000). Las muestras obtenidas de las cemm), segn los datos presentados en la Tabla pas L4 (N. nambi) y L9 (A. bisporus) cultivadas 3 y en la Figura 4. por 7 das no presentaron actividad durante las 24 h que se estudi la reaccin, sin embargo, Actividad celulsica exoenzimtica.- La la actividad enzimtica representada por halos mayora de las cepas presentaron halos de hi- con reas cada vez ms grandes a medida que drlisis del CMC cada vez ms grandes a me- aumentaba el tiempo de reaccin hasta las 24 h dida que se llegaba al penltimo (8 h) y ltimo fue evidente en los sobrenadantes colectados a intervalo (24 h) del tiempo que dur la prueba
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Figura 2. Relacin filogentica de las especies de Pestalotiopsis segn las secuencias de la regin ITS del ADNr utilizando PHYLM en Genious. Los nmeros sobre las ramas corresponden a valores de bootstrap >50 %. Se utiliz a Seiridium cardinale y S. ceratosporum como grupos externos. Las muestras que terminan en ECU fueron colectadas en el Ecuador, las muestras en negrillas se utilizaron en este estudio. Los nombres de las muestras empiezan por gnero (P= Pestalotiopsis), cdigo de identificacin de la muestra, y cdigo de 3 letras del pas.
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Figura 3. Crecimiento de las cepas en PDA (1) y MA (2): A. Gymnopilus junonius (L5); B. Neonothopanus nambi (L4); C. Pestalotiopsis sp. (H24); D. Psilocybe cubensis (L7); E. Agaricus bisporus (L9); F. Pestalotiopsis sp. (H23.1); G. Pestalotiopsis sp. (H23.2); H. Chloridium virescens (L8); I. Agaricus bisporus (L10); J. Penicillium pinophilus (L22).
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Crecimiento Especie Cdigo cepa En Agar Malta Neonothopanus L4 RAL 1015, RAL 9001, RAL nambi 9002 Gymnopilus L5 RAL 9001, RAL 9002, RAL junonius 9001 Psilocybe cubensis L7 Chloridium L8 virescens Agaricus bisporus L9 RAL 9002, RAL 9001 RAL 9003, RAL 6028, RAL 9001, RAL 6028, RAL 1015 RAL 1023
Tabla 2. Crecimiento de las colonias en MA y PDA: descripcin de la coloracin.
En Agar PDA RAL 8012, RAL 9001 RAL 7047, RAL 9003, RAL 7047, RAL 9003 RAL 9001 RAL 6028, RAL 9001, RAL 7044 RAL 9010, RAL 9001 RAL 8012, RAL 1011, RAL 9001 RAL 9001, RAL 6025 RAL 9003, RAL 9001 RAL 9001 RAL 9001, RAL 9003, RAL 8024, RAL 9001, RAL 8023
Agaricus bisporus L10 RAL 9001, RAL 1017 Penicillium L22 RAL 9001, RAL 6025 , RAL pinophilus 1017 Pestalotiopsis sp. H23.1 RAL 9001 Pestalotiopsis sp. H23.2 Pestalotiopsis sp. H24 RAL 1023, RAL 9000 RAL 9001, RAL 9003, RAL 8024, RAL 9001, RAL 8023
los 14 das de cultivo, inclusive mayor a lo detectado en las otras cepas. El comportamiento de C. virescens L8 es diferente porque a las 24 h de los 7 das de cultivo disminuye su actividad exoenzimtica a casi cero. Se realiz el anlisis de varianza de los extractos obtenidos a los 7 y 14 das de cultivo con tres lecturas para cada cepa en cada intervalo de tiempo (2, 4, 6, 8 y 24 horas) respectivamente. Los resultados permitieron determinar que los extractos de cultivos obtenidos a los 14 das tuvieron mayor actividad enzimtica que los recogidos a los 7 das (p = 0.000). La cepa con mayor actividad enzimtica a los 7 das fue la H23.1 (Pestalotiopsis sp.), seguida de H23.2 (Pestalotiopsis sp.) y de H24 (Pestalotiopsis sp.) con medias de 3.78, 3.38 y 3.30 mm respectivamente, registradas en el intervalo de 24 horas. Con los extractos recogidos en el da 14 del cultivo de las varias cepas, se obtuvieron resultados similares, pero la cepa con mejor actividad celulsica fue la L4 (N. nambi), seguida
de la H23.1 (Pestalotiopsis sp.), y L5 (G. junonius) con medias de 3.98, 3.59 y 3.58 mm respectivamente (Figura 5). El anlisis de varianza dio un coeficiente de variacin del 28.32 %, indicando una ligera variabilidad en los datos del experimento, sin embargo, los resultados presentados se consideran estadsticamente significativos. La prueba de Tukey al 0.05 permiti comparar y separar en rangos de significacin las medias obtenidas para cada cepa durante los dos periodos del experimento, 7 y 14 das en conjunto (Tabla 4). Cuantificacin proteica total extracelular.- Se determinaron mayores absorbancias, por ende, mayores concentraciones proteicas en las muestras de sobrenadantes colectados a los 14 das de cultivo en comparacin con aquellas reportadas a los 7 das. Las medidas de absorbancia obtenidas fueron comparadas y extrapoladas con las absorbancias obtenidas a 562 nm para protenas estndar de albmina bovina (BSA) conteniendo entre 0 y 500 g/ml.
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Tabla 3. Valores de las medias en orden descendente, rangos de significacin (en superndices) y desviacin tpica (en mm) de los halos formados despus de 7 das de cultivo.
Cepa Especie Media (mm)
Desviacin tpica (mm)
H23.2 Pestalotiopsis sp. 14.63 a 0.18 H24 Pestalotiopsis sp. 10.21 b 1.14 L4 Neonothopanus nambi 9.65 b, c 1.02 L9 Agaricus bisporus 8.54 b, c, d 1.19 L8 Chloridium virescens 7.37 b, c, d, e 0.83 L10 Agaricus bisporus 7.04 b, c, d, e 2.01 H23.1 Pestalotiopsis sp. 6.71 c, d, e 1.09 L22 Penicillium pinophilus 5.69 d, e 0.92 L5 Gymnopilus junonius 5.37 d, e 1.20 L7 Psilocybe cubensis 4.42 e 1.15
La muestra extrada a los 7 das de cultivo que present la mayor concentracin de protenas totales fue la L10 (A. bisporus) con una absorbancia de 2.31 (500 g/ml), seguida de la L9 (A. bisporus) con 2.19 (450 g/ml) y L4 (N. nambi) con 2.16 (445 g/ml). Las muestras extradas a los 14 das que presentaron la mayor cantidad de protenas totales fueron H23.2 (Pestalotiopsis sp.) con 2.84 de absorbancia (670 g/ml), seguida de L5 (G. junonius) y L9 (A. bisporus) con 2.73 (660 g/ml) y otras bastante similares como L7 (P. cubensis) con 550 g/ml y Pestalotiopsis sp. (H24) con 530 g/ml (Tabla 5). Las cepas cultivadas durante 14 das presentaron mayores concentraciones (430 a 660 g/ml) de protenas totales que las cultivadas a los 7 das (70 a 500 g/ml) (p = 0.000). El Anova factorial realizado para las cepas en ambos periodos de tiempo present resultados altamente significativos. Las muestras extradas a los 14 das de cultivo dieron concentraciones de protenas totales ms altas que las encontradas a los 7 das de incubacin. Se compar los valores de absorbancia obtenidos para los dos periodos de cultivo en conjunto a travs de Anova y Tukey al 0.05. Estas pruebas permitieron agrupar los valo-
res en subconjuntos (rangos significativos) y se determin que C. virescens (L8) present la absorbancia ms baja (1.60) seguida de las cepas N. nambi (L4) y Pestalotiopsis sp. (H24) con absorbancias entre 2.11 y 2.12 pero similares para ambos cultivos por lo que sus concentraciones se podran considerar iguales. Las cepas Pestalotiopsis sp. (H23.2) y (H23.1) desplegaron absorbancias un poco ms altas (2.33 y 2.35) pero similares entre ellas, razn por la cual las concentraciones proteicas seran consideradas iguales. Las cepas de G. junonius (L5) y A. bisporus (L9) dieron absorbancias an mayores (2.42 y 2.46) y bastante similares entre s. Pero la cepa con mayor absorbancia, por ende, con mayor concentracin proteica, fue la L10 (A.bisporus) con un valor promedio de 2.54 (Tabla 6). La correlacin entre la actividad exoenzimtica y la absorbancia de los extractos de 7 das no fue significativa (p > 0.05). Por lo tanto no se encuentra relacin lineal en los datos mencionados. Sin embargo, la correlacin entre la actividad enzimtica y concentracin proteica de los extractos de 14 das fue significativa, (p < 0.05). El grfico de los datos mostr relacin o tendencia inversa, es decir, que a mayor tamao de halo de acti-
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Figura 4. Halos de hidrlisis de celulosa: imgenes normales y de acercamiento para cada cepa cultivada durante 7 das. A. Gymnopilus junonius (L5); B. Neonothopanus nambi (L4); C. Pestalotiopsis sp. (H24); D. Psilocybe cubensis (L7); E. Agaricus bisporus (L9); F. Pestalotiopsis sp. (H23.1); G. Pestalotiopsis sp. (H23.2); H. Chloridium virescens (L8); I. Agaricus bisporus (L10); J. Penicillium pinophilus (L22).
vidad exoenzimtica se puede observar en general que las absorbancias registradas son menores lo que indica una menor concentracin proteica.
haber ocurrido debido a procesos selectivos y de resistencia al fungicida. En general el crecimiento fue relativamente similar en ambos medios, PDA y MA; sin embargo, se observ que PDA permiti un mejor crecimiento en DISCUSIN determinadas cepas. Se estudiaron 10 hongos colectados en las Mediante el anlisis de la secuencia de la estribaciones de la cordillera ecuatoriana. Los regin ITS1, 5.8S e ITS2 del ADNr, fue posihongos fueron aislados, purificados y multipli- ble identificar a todas las cepas estudiadas a cados en medios de cultivo MA y PDA, notn- nivel de gnero y a 7 cepas a nivel de especie, dose diferencias en cuanto a crecimiento y a obtenindose valores altos de porcentaje de coloracin en cada medio. El crecimiento tar- cobertura, mxima identidad y bootstrap. Fue do de los ascomicetos Chloridium y Pestalo- posible determinar que la cepa de C. virescens tiopsis en medios conteniendo Benomil, pudo tiene una relacin ms cercana con una muesRevista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas - Vol. XXXIII Nmeros 1 y 2, octubre 2012 www.puce.edu.ec/revistaciencia
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Figura 5. Curvas de actividad enzimtica de muestras extradas a los 7 ( ____ ) y 14 das ( .. ) de cultivo de las 10 cepas; eje de las ys corresponde a los valores de los halos en mm y el eje de las xs a los intervalos de tiempo de actividad enzimtica, 2, 4, 6, 8 y 24 horas: A. Gymnopilus junonius (L5); B. Neonothopanus nambi (L4); C. Pestalotiopsis sp. (H24); D. Psilocybe cubensis (L7); E. Agaricus bisporus (L9); F. Pestalotiopsis sp. (H23.1); G. Pestalotiopsis sp. (H23.2); H. Chloridium virescens (L8); I. Agaricus bisporus (L10); J. Penicillium pinophilus (L22).
tra recolectada en la Florida, EEUU que con otras muestras de la misma especie provenientes de otros lugares de ese pas. Probablemente estas dos muestras estn ms cercanamente relacionadas entre s por provenir de ambientes tropicales. Para las cepas del gnero Pestalotiopsis no fue posible designar la especie ya que el anlisis filogentico no mostr una clara agrupacin
con los nombres de las especies publicadas en GenBank. La designacin de especies en este grupo en general no es clara si se basa solo en las secuencias de ITS (Hu et al., 2007), por lo que amerita estudios adicionales para identificar estas cepas hasta un nivel especfico. La Figura 3 registra el crecimiento de los hongos en MA o PDA y la Tabla 2 describe la coloracin de dicho crecimiento para cada
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Tabla 4. Valores en orden descendente de las medias y rangos de significacin (en superndices) de los halos formados durante ambos periodos de incubacin (7 y 14 das).
Cepa
Especie
Media halos (mm)
L7 Psilocybe cubensis 1.72a H23.1 Pestalotiopsis sp. 1.68a L8 Chloridium virescens 1.52a,b H24 Pestalotiopsis sp. 1.52a,b L22 Penicillium pinophilus 1.48a,b L5 Gymnopilus junonius 1.46a,b L10 Agaricus bisporus 1.44a,b H23.2 Pestalotiopsis sp. 1.22c L4 Neonothopanus 1.07c nambi L9 Agaricus bisporus 0.60d cepa en ambos medios utilizando el identificador de colores RAL de Pantone (http://www. logorapid.com/tabla_de_colores_ral, Logorapid, 2012). Los resultados indican que hay diferencias notorias entre los crecimientos. Por ejemplo, en A. bisporus (L9) el crecimiento en MA fue lento mientras que en PDA fue ms rpido y los bordes del micelio maduro adquieren una consistencia algodonosa de color blanco en PDA y no en MA. Resaltamos tambin el caso de C. virescens (L8), que al crecer en MA adquiere una coloracin blanquecina hacia los bordes del micelio, a diferencia de su crecimiento en PDA que es de color plomizo. Se encontraron entonces diferencias en la rapidez y en la cantidad de crecimiento, incluso en la coloracin que adopta cada hongo en determinado medio. Estas diferencias, en algunos casos muy notorios, podran hacernos pensar que se trata de cultivos de hongos diferentes, cuando en realidad son morfologas relativamente distintas del mismo individuo y que no pueden ser utilizados como criterios para una identificacin final. La actividad celulsica de estos cultivos fue visualizada y cuantificada en agar CMC teido con Rojo Congo al trmino del perodo indicado de incubacin (la concentracin del CMC fue seleccionada cuidadosamente para favorecer la reaccin). El Rojo Congo es una molcula lineal constituida por varios benzenos con radicales azo y aminos que forman puentes de hidrgeno con los hidroxilos de macromolculas. Estas reacciones permitieron evidenciar o no la hidrlisis de celulosa que se tie de rojo cuando reacciona no-covalentemente con el colorante, hecho que no ocurre con las oligocelulosas o unidades de glucosa resultantes de la degradacin enzimtica. Esta propiedad qumica facilita la diferenciacin entre zonas hidrolizadas o entre organismos celulsicos y no celulsicos (Gaitn y Prez, 2007). Sera interesante estudiar el comportamiento enzimtico o de cultivo en medios como el CMC a diferentes pHs, conociendo que muchos hongos crecen mejor y que ciertas enzimas son ms activas en condiciones relativamente cidas. La endo b-1,4-glucanasa acta al azar sobre los enlaces b-1,4 glucosdicos internos, primero en las regiones amorfas, luego de la parte cristalina de la fibra celulsica, seccionndola en varios conjuntos de b oligosacridos, lo que crea nuevos extremos no reductores que le sirven a otras enzimas como la exo b-1,4-celobiohidrolasa para remover unidades de celobiosa y a la b-1,4 glucosidasa para generar glucosa.
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Tabla 5. Absorbancias (562 nm) y concentracin de protenas totales (g/ml) promedio de 3 muestras extradas de cada cepa de hongos cultivados durante 7 y 14 das. Especie Siete das de cultivo Catorce das de cultivo Absorbancia Concentracin Absorbancia Concentracin 562 nm g/ml 562 nm g/ml
Neonothapanus nambi (L4) Gymnopilus junonius (L5) Psilocybe cubensis (L7) Chloridium virescens (L8) Agaricus bisporus (L9) Agaricus bisporus (L10) Penicillium pinophilus (L22) Pestalotiopsis sp. (H23.1) Pestalotiopsis sp. (H23.2) Pestalotiopsis sp. (H24)
2.16 2.11 1.97 0.59 2.19 2.31 1.87 2.04 1.82 1.75
445 440 390 70 450 500 385 420 380 350
2.05 2.73 2.56 2.61 2.73 2.76 2.51 2.67 2.84 2.48
430 660 550 560 660 655 535 570 670 530
El acumulamiento tanto de la celobiosa como de la glucosa puede dar lugar a una disminucin de la eficiencia enzimtica hidroltica en el cultivo (Ovando-Chacn, 2005; Ryu y Mandels, 1980). El tamao del halo de la actividad celulsica permiti comparar estadsticamente la accin enzimtica de cada cepa. Segn los resultados obtenidos a los 7 das de cultivo se evidenci que los valores promedio de los halos de hidrlisis no presentaron variaciones considerables entre algunas cepas (L8, L10 y H23.1) y (L4, L9 y H24) que se agrupan dentro del mismo rango de variacin. Otras cepas como L5, L10, L22 y L23.1 o las cepas L5, L7 y L22 pueden hacer otros grupos, igualmente de acuerdo con sus medias y su rango de variacin. Pero la cepa H23.2 es un cultivo que presenta halos bastante grandes y se aleja considerablemente de los dems. Las cepas con halos grandes (H23.2, H24 y L4) curiosamente tuvieron menor crecimiento del micelio comparado con el resto de cepas que registraron halos ms pequeos (entre 4.4 y 8.5 mm) y crecimientos similares moderados. Estos resultados nos haran sospechar la presencia de diferencias en la cantidad de exoenzimas producidas por unidad celular, diferencias en la actividad o sinergia
por unidad enzimtica producida, incluso inhibiciones o estmulos puntuales en la actividad enzimtica, dependientes de la acumulacin de productos de reaccin o metabolitos presentes o ausentes en el medio de cada uno de los cultivos analizados (Gaitn y Prez, 2007). La actividad celulsica exoenzimtica de los sobrenadantes estudiados fue progresiva en la mayora de las cepas, observndose un aumento en la generacin de exoenzimas durante el periodo de experimentacin que fue de 7 o de 14 das de cultivo. El Rojo Congo utilizado para la evaluacin de la hidrlisis enzimtica, permiti visualizar y cuantificar la capacidad enzimtica de degradacin del medio de cultivo carboximetilcelulosa. Durante las 24 h que fueron incubados los extractos exoenzimticos, las 8 y 24 h fueron los tiempos que presentaban mayor actividad en ambos sobrenadantes colectados a los 7 y 14 das de cultivo de cada cepa, pero los halos ms grandes fueron los que se obtuvieron con muestras colectadas a los 14 das de incubacin. La variabilidad registrada en el coeficiente de variacin (CV = 28.32 %) durante el anlisis estadstico de la prueba de actividad celulsica pudo haber sido causado por factores que al momento se desconocen, sin embargo, los re-
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Tabla 6. Promedio de los valores de absorbancia de los sobrenadantes extrados a los 7 y 14 das de cultivo y rangos significativos (en superndices) obtenidos de la prueba de Tukey.
Media Cepa Especie (absorbancia a 562 nm) A. bisporus L10 2.54a A. bisporus L9 2.46b G. junonius L5 2.42b Pestalotiopsis sp. H23.1 2.35c Pestalotiopsis sp. H23.2 2.33c P. cubensis L7 2.27d P. pinophilus L22 2.19e Pestalotiopsis sp. H24 2.12e N. nambi L4 2.11e C. virescens L8 1.60f sultados obtenidos fueron considerados como estadsticamente significativos. Vale la pena tambin anotar que al comparar las reas de los halos obtenidos con los sobrenadantes versus los reportados para los cultivos, se encontr que estos ltimos fueron mucho ms grandes, como es el caso de Pestalotiopsis H23.2 (14.63 mm), Pestalotiopsis H24 (10.21 mm), N. nambi (9.65 mm) o A. bisporus L9 (8.54 mm), comparados con los halos mucho ms pequeos de los sobrenadantes (aunque fueron los ms grandes del grupo) como el caso de N. nambi (3.98 mm), Pestalotiopsis H23.1 (3.78 mm), G. junonius (3.58 mm) o Pestalotiopsis H24 (3.30 mm). Adems el halo no se repite con valores mximos similares para la misma cepa en ambos modelos. Las carboximetilcelulasas del cultivo son mucho ms activas que las aisladas del sobrenadante cuya actividad probablemente se ve disminuida por la acumulacin de glucosas o celobiosas que en el caso del cultivo son removidas por el crecimiento celular. Resaltamos tambin el caso de A. bisporus L9, en el que no se observa actividad exoenzimtica en el sobrenadante recogido a los 7 das de cultivo pero si a los 14. La explicacin para estos resultados se dara por el hecho de que esta cepa crece muy lentamente en ambos medios de cultivo (Figuras 3, 4 y 5), tambin porque A. bisporus L9 adems de tener poco crecimiento y poca actividad enzimtica, tiene una concentracin alta de protena en su sobrenadante de 7 das de cultivo (Tabla 4, Figuras 4 y 5), que por lo visto carece de actividad celulsica. No es el caso de A bisporus L10, que adems de tener un buen crecimiento y una alta concentracin proteica, presenta una actividad enzimtica progresiva (Tabla 4, Figuras 4 y 5). La deteccin y cuantificacin de protenas con el mtodo BCA se basa en la propiedad de reducir Cu+2 a Cu+1 en medio alcalino y de la habilidad del cido bicinconnico para quelar Cu+1 y formar complejos hidrosolubles de color que absorben luz a 562 nm, proporcionalmente a la concentracin de las protenas presentes en la muestra (Astudillo y Soria, 2011). Estas reacciones detectaron colorimtricamente y por espectrofotometra la presencia y la cantidad de protenas totales encontradas en las muestras extradas de los hongos en estudio. Los valores proteicos obtenidos son una estimacin de la real concentracin que depende mucho de la tcnica que se utiliza y
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de varios contaminantes orgnicos como carbohidratos, catecolaminas, cidos nucleicos, lpidos, triptfano, glicerol, cuya presencia afectara el color, pero la reaccin se vuelve confiable una vez estandarizado el pH de los reactantes, la temperatura y los tiempos de reaccin (Zhang et al., 2006). La concentracin proteica encontrada no necesariamente guarda relacin lineal con la actividad enzimtica de los extractos obtenidos a los 7 das pero la relacin es inversamente proporcional con los extrados a los 14 das; este comportamiento se cree es tpico de cada cepa. Es el caso de N. nambi, en el que se encontr mxima actividad exoenzimtica (3.98 mm) en una muy baja concentracin proteica (430 g/ml). Por el contrario, Pestalotiopsis sp. H23.1 y G. junonius L5 mostraron alta actividad enzimtica (3.59 y 3.58 mm) y concentraciones proteicas igualmente altas (570 y 660 g/ml). Las diferencias en crecimiento, actividad exoenzimtica y concentracin proteica extracelular son parmetros aparentemente nicos para cada cepa y quiz podran ser considerados como ayudas en el reconocimiento de gneros y especies que no puedan ser distinguidos con estudios genticos y de filogenia. Identificar el organismo con el que se trabaja resulta indispensable en estudios de degradacin o en aislamientos biomoleculares de inters. AGRADECIMIENTOS A la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, por la asignacin de fondos de investigacin PUCE 2011 y 2012. A la Universidad Tecnolgica Indoamrica, por la colaboracin en la investigacin. Al Ingeniero Julio Snchez-Otero, por el apoyo estadstico, al Lcdo. Bolvar Salas Mario, por la recoleccin de uno de los hongos utilizado en este estudio y a Jorge Flores, por la ayuda en el trabajo de campo y de laboratorio.
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Mario Andrs Herrera y Olivier Dangles
Preferencia de oviposicin en tres especies de polilla de la papa (Lepidoptera: Gelechiidae)

Laboratorio de Entomologa, Escuela de Ciencias Biolgicas Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito. marioandres45@hotmail.com 2 IRD, UR 072, Diversity, Ecology and Evolution of Tropical Insects Team, Evolution, Genomes and Speciation Laboratory, UPR 9034, CNRS, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France and University Paris-Sud 11, 91405 Orsay Cedex, France
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Mario Andrs Herrera1 y Olivier Dangles1,2
RESUMEN.- Los insectos plaga son una de las principales causas de prdidas en cultivos y en almacenes a nivel mundial. En los Andes tropicales, el complejo de polillas de la papa (CPP) (Lepidoptera: Gelechiidae) est conformado por tres especies principales (Tecia solanivora, Symmetrischema tangolias y Phthorimaea operculella) y constituye una de las principales amenazas de los cultivos y almacenes de papas en la regin. Se ha demostrado que las interacciones entre las larvas de las tres especies tienen un efecto significativo en la dinmica poblacional del CPP y en los daos causados a los cultivos. Sin embargo, los patrones de interaccin inter-especificas durante otras fases del ciclo de vida de estas especies son desconocidos. Este estudio analiz la preferencia de oviposicin de hembras del CPP mediante la realizacin de experimentos en los que hembras del CPP tuvieron que elegir el lugar de oviposicin. Hembras de las tres especies del CPP prefirieron ovipositar en tubrculos daados artificialmente ya que estos podran ofrecer mejores condiciones para el desarrollo de su descendencia. Cuando hembras del CPP tuvieron que elegir ovipositar entre tubrculos sanos y tubrculos previamente infestados mostraron diferentes comportamientos, encontramos que T. solanivora no tiene sitios de oviposicin preferidos mientras que S. tangolias y P. operculella tienen sitios de oviposicin preferidos. PALABRAS CLAVE: Complejo de polillas de la papa, Phthorimaea operculella, preferencia de oviposicin, Symmetrischema tangolias, Tecia solanivora. ABSTRACT.- Insect pests are a major cause of losses in crops and storage globally. In the Tropical Andes, the potato tuber moth (PTM) complex (Lepidoptera: Gelechiidae) is composed of three main species: Tecia solanivora, Symmetrischema tangolias and Pthhorimaea operculella. This complex is a major pest of potato crops and stores in several countries of the Andean region. It has been shown that interactions between larvae of the three species have a significant effect on the population dynamics of the PTM complex and damage to crops. However, patterns of inter-specific interactions during other phases of the life cycle of these species are unknown. This study analyzed the oviposition preference of females of the CPP by conducting two experiments in which females of the CPP had to choose the oviposition site. Females of three PTM complex species showed oviposition preference for artificially damaged tubers over the healthy ones because the damaged tubers may have better conditions for the development of the offspring. When females of the PTM complex had to choose laying eggs between healthy tubers and previously infested ones showed different behaviors, we found that T. solanivora have not preferred sites for oviposition while S. tangolias and P. operculella have preferred oviposition sites. KEYWORDS: Oviposition preference, Phthorimaea operculella, potato tuber moth complex, Symmetrischema tangolias, Tecia solanivora.
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INTRODUCCIN El complejo de polillas de la papa (CPP) (Lepidoptera: Gelechiidae), Phthorimaea operculella Zeller, Tecia solanivora Povolny, y Symmetrischema tangolias Gyen constituye una de las principales plagas de este cultivo en la regin Andina (Kroschel, 2002). El CPP ataca a los tubrculos en el campo y en el almacn causando grandes prdidas econmicas (Barragn, 2005; Palacios, 1997). Varios trabajos se han enfocado en el estudio del CPP sea en una sola especie o en combinaciones de dos o tres especies, dichos trabajos han descrito y detallado aspectos importantes tales como: identificacin, biologa y comportamiento, caractersticas ecolgicas, manejo integrado y diversidad gentica (Herrera, 2010). Sin embargo, an es necesario profundizar los conocimientos existentes en relacin a las interacciones intra e interespecficas que se producen entre las especies del CPP, interacciones entre las que se incluye la preferencia de oviposicin. La localizacin de hospedero y la oviposicin son etapas cruciales en el ciclo de vida de insectos invasivos y pueden jugar un papel muy importante en la competencia entre especies (Broad et al., 2008). Adicionalmente, el comportamiento de oviposicin de las hembras determina el ambiente en el cual huevos y posteriormente larvas de desarrollarn (Bonebrake et al., 2010). Finch y Collier, 2003 resumieron en tres pasos bsicos la localizacin de hospedero en insectos: la estimulacin qumica indica cuando empezar; la estimulacin visual indica donde empezar y el contacto con el hospedero indica si quedarse o trasladarse. Larvas de varias especies de insectos invasivos no son capaces de trasladarse de una planta a otra y por lo tanto son forzadas a completar su desarrollo en la planta seleccionada por su madre, se cree que las hembras ovipositan en plantas donde su descendencia se desempear de la manera ms favorable para la especie (Shiojiri et al., 2002). Estudios demuestran que algunas especies prefieren ovipositar en plantas infestadas por individuos de la misma especie y otras prefieren ovipositar en plantas no infestadas (Choh et al., 2008).
Ya que se ha demostrado que el dao producido a los tubrculos es mayor cuando est presente ms de una especie de polilla y que la diversidad tiene un efecto significativo en la dinmica poblacional del CPP (Dangles et al., 2009), este estudio tuvo como objetivo determinar s hembras adultas del CPP prefieren ovipositar en tubrculos que han sido daados por individuos de una misma especie, en tubrculos que han sido daados por individuos de otra especie o no discriminan entre tubrculos daados y tubrculos sanos. MATERIALES Y MTODOS En este estudio se analiz la preferencia de oviposicin de hembras del CPP mediante la realizacin de dos experimentos en los que hembras del CPP tuvieron que elegir el lugar de oviposicin. Con la primera parte de este estudio evaluamos si las hembras del CPP prefieren ovipositar en tubrculos sanos o tubrculos daados artificialmente. Para esto se coloc en un recipiente plstico (3 L) un tubrculo de papa Solanum tuberosum L. v. leona blanca sin infestar y un tubrculo daado artificialmente [12 orificios de 1 milmetro de grosor y aproximadamente 3 milmetros de profundidad realizados al azar alrededor del tubrculo para simular el dao provocado por las polillas (ver Dangles et al., 2009)]. Para estandarizar el experimento el peso de los tubrculos fue 40 5 g (Balanza TU-OI, FA-2104). Posteriormente se coloc en cada recipiente 5 pupas hembra y 5 pupas macho de cada especie del CPP, las pupas de cada especie fueron colocadas en distintos recipientes. En la segunda parte del estudio evaluamos si hembras del CPP prefieren ovipositar en tubrculos sanos o tubrculos previamente infestados. Se coloc cuatro tubrculos de papa Solanum tuberosum L. v. leona blanca en un recipiente plstico (3 L). Para estandarizar el experimento el peso de los tubrculos fue 40 5 g. El primer tubrculo estuvo previamente infestado con 12 larvas de T. solanivora, el segundo con 12 larvas de S. tangolias, el
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100 80
60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0
Tubrculo sano
Figura 1. Los grficos de barras muestran el nmero de huevos ovipositados (promedio) por hembra del CPP en tubrculos sanos y tubrculos daados artificialmente durante 21 das. a) T. solanivora Prueba T, t = -17.702, p < 0.01, b) S. tangolias Prueba T, t = -13.702, p < 0.01, c) P. operculella Prueba T, t = -10.684, p < 0.01. Las barras de error muestran el error estndar.
Tubrculo daado artificialmente
tercero con 12 larvas de P. operculella (la infestacin previa a la colocacin de los tubrculos fue de 30 das, la densidad de infestacin est de acuerdo a las observaciones realizadas en bodegas de almacenamiento de papas), y el cuarto, un tubrculo sin infestar. Posteriormente, se coloc en cada recipiente los 4 tubrculos descritos anteriormente, y se aadieron 5 pupas hembra y 5 pupas macho de una de las 3 especies; el mismo procedimiento fue utilizado con las otras 2 especies. Para los dos ensayos el sexo de las pupas fue determinado con la ayuda de un estereomicroscopio (ZEISS, Stemi DV4). Todos los recipientes fueron cerrados con una tapa plstica diseada para permitir la entrada de aire. Se realizaron 10 repeticiones por cada especie. Una vez que las polillas pasaron del estado de pupa al estado adulto se las dej en el respectivo recipiente durante 21 das tomando en cuenta la longevidad de los adultos de las polillas (ver Nio, 2004 y Vera Delgadillo et al., 2009). Durante los das que dur el experimento las polillas fueron alimentadas con agua azucarada (solucin de sacarosa 2M). Finalmente se realiz el contaje de los huevos (directamente en los recipientes), as como la determinacin del lugar en que fueron ovipositados. Para el primer ensayo los datos obtenidos fueron analizados mediante una prueba T para muestras independientes y grficos de barras para cada una de las especies del CPP; y para el segundo ensayo se realiz un ANOVA
# de huevos (promedio)ovipositados por hembra durante 21 das de observacin
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50 40
T. solanivora
a a
# de huevos (promedio)ovipositados por hembra durante 21 das de observacin
30 20 10 0 80 70 60 50 40 30 20 10 0 50 40 30 20 10 0
de una va, una prueba de Tukey para determinar los rangos de significacin entre los sitios de oviposicin y un grfico de barras para cada especie del CPP. Los anlisis fueron realizados con el paquete informtico PASW Statistics 18. RESULTADOS Preferencia de oviposicin en tres especies del CPP entre tubrculos sanos y tubrculos daados artificialmente.- Los resultados obtenidos en los grficos de barras (Figura 1) y confirmado mediante los respectivas Pruebas de T mostraron que las hembras de las tres especies del CPP prefieren ovipositar en tubrculos daados artificialmente que en tubrculos sanos. (T. solanivora Prueba T, t = -17.702, p < 0.01, S. tangolias Prueba T, t = -13.702, p < 0.01 y P. operculella Prueba T, t = -10.684, p < 0.01). Preferencia de oviposicin en tres especies del CPP entre tubrculos sanos y tubrculos previamente infestados.- En hembras de T. solanivora la diferencia entre los sitios de oviposicin no fue significativa (Figura 2, Prueba de Tukey, = 0.05, p = 0.27). En contraste, hembras de S. tangolias prefieren ovipositar en tubrculos infestados por individuos de la misma
S. tangolias
b b
a a
P. operculella
c
ab
Figura 2. Nmero de huevos ovipositados (promedio) por hembra del CPP en cuatro tubrculos durante 21 das. A. tubrculo previamente infestado por T. solanivora, B. tubrculo previamente infestado por S. tangolias, C. tubrculo previamente infestado por P. operculella, D. tubrculo sano. Letras distintas muestran que hay diferencias significativas entre los sitios de oviposicin (Prueba de Tukey, = 0.05, T. solanivora, p = 0.27, S. tangolias, p < 0.01, P. operculella, p < 0.01). Las barras de error muestran el error estndar.
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especie y tubrculos infestados por P. operculella que en tubrculos infestados por T. solanivora y tubrculos sanos (Figura 2, Prueba de Tukey, = 0.05, p < 0.01) y hembras de P. operculella prefieren ovipositar en tubrculos infestados por individuos de la misma especie que en tubrculos infestados por T. solanivora o infestados por S. tangolias y tubrculos sanos (Figura 2, Prueba de Tukey, = 0.05, p < 0.01). DISCUSIN La primera parte de este estudio muestra que hembras de las tres especies del CPP prefieren ovipositar en tubrculos daados artificialmente que en tubrculos sanos. Se conoce que las plantas producen compuestos voltiles para defenderse de insectos plaga y que la mezcla de estos compuestos depende del comportamiento alimenticio de los insectos pero tambin que adultos de insectos herbvoros son atrados hacia la planta hospedera por compuestos voltiles emanados por sta (Broad et al., 2008; Liu et al., 2005). Aunque en este estudio solo se trabaj con tubrculos, posiblemente estos produjeron compuestos voltiles que atraen a insectos en mayor cantidad que aquellos compuestos que los repelen. Debido a que no existe informacin del efecto de compuestos voltiles en el comportamiento de adultos del CPP una hiptesis es que las hembras del CPP prefirieron ovipositar en tubrculos daados artificialmente por que estos presentaban mejores condiciones para la supervivencia de la progenie, especficamente los orificios realizados alrededor de los tubrculos pudieron haber influido en la eleccin de las hembras mediante la facilitacin para la entrada de las larvas. La segunda parte del estudio muestra que la preferencia de oviposicin es distinta para las tres especies del CPP cuando tienen que elegir entre tubrculos infestados y tubrculos sanos. Aparentemente hembras de T. solanivora no discriminan sus sitios de oviposicin, hembras de S. tangolias prefieren ovipositar en tubrculos infestados por
individuos de su misma especie y en tubrculos infestados por P. operculella y hembras de P. operculella prefieren ovipositar en tubrculos infestados por individuos de su misma especie. Posiblemente la preferencia de oviposicin en hembras del CPP est relacionada con la hiptesis de preferencia-desempeo. Esta hiptesis establece que las hembras de insectos herbvoros deberan preferir ovipositar en plantas en las que las larvas aseguren su desempeo (desarrollo y supervivencia). Varios estudios se han enfocado en probar la hiptesis de preferencia-desempeo (Mphosi y Foster, 2010; Choh et al., 2008; Shiojiri et al., 2002; Harris et al., 2001). Es posible que la hiptesis de preferencia-desempeo se cumpla en dos de las tres especies del CPP, S. tangolias y P. operculella, ya que estas dos especies provocan menor dao a los tubrculos en comparacin a T. solanivora; por lo que evidentemente una vez que las larvas eclosionen tendran una mejor fuente de alimento y por lo tanto podran asegurar el xito de su ciclo vital. Adems, como muestran los resultados tanto S. tangolias como P. operculella tienen sus tasas de oviposicin ms bajas en los tuberculos infestados por T. solanivora, hecho que confirmara la hiptesis. En contraste, tambin hay estudios que muestran que en varias especies de insectos herbvoros la relacin entre preferencia de oviposicin y desempeo de larvas es muy baja (Mller y Arand, 2007; Scheirs y De Bruyn, 2002); esto podra explicar la preferencia de oviposicin en T. solanivora ya que como se muestra en el estudio hembras de esta especie no tienen un lugar de oviposicin preferido. Ya que en este estudio solo se evalu la preferencia de oviposicin, estudios complementarios deberan enfocarse en el desempeo larval, es decir, tomar en cuenta la tasa de supervivencia, la tasa de consumo y la fecundidad de las larvas que llegan a completar el ciclo de vida para de esta manera evaluar la hiptesis de preferencia-desempeo.
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AGRADECIMIENTOS Kroschel J. 2002. Desafos y oportunidades La realizacin de este trabajo fue posipara el manejo de plagas en papa en pable gracias a la colaboracin de la Pontificia ses en desarrollo. Boletn de la papa CIP. Universidad Catlica del Ecuador (PUCE), el Lima, Per. Instituto de Investigacin para el Desarrollo Liu SS, Li YH, Liu YQ y Zalucki MP. 2005. (IRD) y la Fundacin McKnight en el proyecto Experienceinduced preference for oviEnfoques Innovativos para el Manejo Integraposition repellents derived from a non do de Plagas en los Andes, Beca No. 09-022. host plant by a specialist herbivore. Ecology Letters, 8:722729. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Mphosi MS y Foster SP. 2010. Female preBarragn A. 2005. Identificacin, biologa y ference and larval performance of suncomportamiento de las polillas de la papa flower moth, Homoeosoma electellum, en el Ecuador, Boletn PROMSA, MAG on sunflower prebreeding lines. EntoPUCE, Quito, Ecuador. mologia Experimentalis et Applicata, Bonebrake TC, Boggs CL, McNally JM, Ran134: 182190. ganathan J y Ehrlich PR. 2010. Oviposi- Mller C y Arand K. 2007. Tradeoffs in ovition behavior and offspring performance position choice? Fooddependent perforin herbivorous insects: consequences of mance and defence against predators of a climatic and habitat heterogeneity. Oikos, herbivorous sawfly. Entomologia Experi119: 927934. mentalis et Applicata, 124: 153159. Broad ST, Schellhorn NA, Lissont SN y Mend- Nio L. 2004. Revisin sobre la Polilla de la ham NJ. 2008. Host location and oviposiPapa Tecia solanivora en Centro y Sution of lepidopteran herbivores in diversiramrica. Suplemento Revista Latinoafied broccoli cropping systems. Agricultural mericana de la Papa, 18 pp. and Forest Entomology, 10: 157165. Palacios M. 1997. Manual de Capacitacin Choh Y, Uefune M y Takabayashi J. 2008. Principales Plagas de la Papa: La Polilla Diamondback moth females oviposit de la Papa y La Mosca Minadora. Centro more on plants infested by non-parasitiInternacional de la papa (CIP) Fascculo sed than by parasitized conspecifics. Eco3.7. Lima, Per. logical Entomology, 33: 565568. Scheirs J y de Bruyn L. 2002. Integrating opDangles O, Mesas V, Crespo-Prez V y Siltimal foraging and optimal oviposition vain JL. 2009. Crop damage increases theory in plantinsect research. OIKOS, with pest species diversity: evidence from 1: 187191. potato tuber moths in the tropical Andes. Shiojiri K, Takabayashi J, Yano S y Takafuji Journal of Applied Ecology, 1: 17. A. 2002. Oviposition preferences of herFinch S y Collier RH. 2003. Insects can see bivores are affected by tritrophic interacclearly now the weeds have gone. Biolotion webs. Ecology Letters, 5: 186192. gist, 50: 132135. Vera Delgadillo V, Gonzales Aldana MA, Harris MO, Sandanayaka M y Griffin W. 2001. Chambilla Quisbert C y Garret K. 2009. Oviposition preferences of the Hessian fly Efecto de las variaciones climticas en el and their consequences for the survival comportamiento de dos polillas (Phthoriand reproductive potential of offspring. maea operculella y Symmetrischema tanEcological Entomology, 26: 473486. golias) en el cultivo de papa en comuniHerrera DMA. 2010. Interacciones intra e indades del Altiplano Central. Sustainable terespecficas entre polillas de la papa Agriculture and Natural Resource Mana(Lepidoptera: Gelechiidae). Tesis de Ligement Collaborative Research Support cenciatura, Pontificia Universidad CatProgram (SANREM CRSP). Working lica del Ecuador. Quito, Ecuador. Paper No. 0109.
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Tjitte de Vries, Galo Buitrn, Marcelo Tobar, Paolo Piedrahita, Andrs Iglesias, Andrs Serrano, Mara Jos Erazo, Isabel Ojeda, Luis Baquero y Pablo Snchez
Composicin, estructura, densidad y aspectos socio-ecolgicos de bandadas mixtas de aves de sotobosque y dosel en una parcela de 100 ha, Parque Nacional Yasun, Amazonia Ecuatoriana
Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito, Ecuador. Email: tdevries@puce.edu.ec Recibido:23, 05, 2012; aceptado: 18, 10, 2012
RESUMEN.- Durante los aos 2001-2011 en el Parque Nacional Yasun, en la Amazona Ecuatoriana, varios investigadores observaron las bandadas mixtas de aves del sotobosque y dosel en una parcela total de 100 ha dividida en cuadrantes de 100 m x 100 m, lo que permiti localizar y establecer la posicin de cada bandada. Cada investigador tuvo un plot de 25 ha de cuyo anlisis total de las 100 ha se encontraron 15 bandadas mixtas de aves de sotobosque con 143 especies y 4 bandadas mixtas de aves de dosel con 94 especies. Como lderes en las bandadas del sotobosque comandan Thamnomanes caesius (Batar Cinreo, Thamnophilidae) y T. ardesiacus, (Batar Golioscuro, Thamnophilidae), mientras Lanio fulvus (Tangara Fulva, Thraupidae) y Myiopagis caniceps (Elenita Gris, Tyrannidae) lo hacen en las bandadas del dosel. De toda esta investigacin se obtuvieron datos en los que se detalla la participacin de especies nucleares, frecuentes, ocasionales y accidentales de esas bandadas mixtas. Cinco familias de las aves participantes de bandadas mixtas de sotobosque son las ms importantes: Thamnophilidae con 26 especies, Furnariidae, Thraupidae, Tyrannidae, todas ellas con 11 especies cada uno; y Dendrocolaptidae con 10 especies. Entre las familias con mayor diversidad de especies de bandadas mixtas del dosel, se destacaron: Thraupidae con 23 especies, Tyrannidae con 18 especies; y, Picidae con 11 especies; ellas forman el 53 % de la diversidad de las especies que participaron en estas bandadas. PALABRAS CLAVE: Amazonia, Aves, Bandadas Mixtas, Cien Hectreas, Ecologa. ABSTRACT.- During a period of ten years (2001- 2011) in Yasuni National Park, in ecuadorian Amazon, several scientists observed flocks of mixed species of birds in understory and canopy a plot of 100 ha divided in quadrats of 100 x 100 m in order to locate and establish the position of each flock. Each scientist worked in a plot of 25 ha which resulted in the analysis of a total of 100 ha with 15 understorey flocks with 143 species and 4 canopy flocks with 94 species. Two species act as leaders, Thamnomanes caesius (Cinereous Antshrike, Thamnophilidae), as principal, and T. ardesiacus (Dusky-throated Antshrike, Thamnophilidae) as sub-lder in understorey flocks, whereas in canopy flocks Lanio fulvus (Fulvous Shrike-Tanager, Thraupidae) and Myiopagis caniceps (Gray Elaenia, Tyrannidae) lead the group. Details are presented on the occurrence as nuclear, frequent, occasional and accidental species. Five families of the birds participating in under-storey flocks are the most important: Thamnophilidae with 26 species, Furnariidae, Thraupidae, Tyrannidae, each with 11 species; and Dendrocolaptidae with 10 species. The families with the greatest diversity of species of canopy flocks are: Thraupidae
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with 23 species, Tyrannidae with 18 species; and, Picidae with 11 species; they form 53 % of the diversity of the species participating in these flocks.
KEYWORDS: Amazonia, Birds, Ecology, Hundred Hectares, Mixed Species Flocks. INTRODUCCIN Las bandadas mixtas de aves de la Amazonia permanecen juntas todo el ao y presentan una compleja estructura social (Munn, 1985; Powell, 1979). En el conjunto de la bandada, de acuerdo a Munn, 1985 se pueden distinguir cuatro tipos de especies participantes: nucleares, facultativas, seguidoras y ocasionales. En nuestra investigacin y, partiendo de esa clasificacin, utilizaremos los siguientes trminos: nucleares, frecuentes, ocasionales y accidentales. Los miembros nucleares de las bandadas de sotobosque permanecen generalmente toda su vida con la misma bandada mientras las especies facultativas y seguidoras participan solo temporalmente y pueden moverse frecuentemente fuera de la asociacin (Munn, 1985). En el Parque Nacional Man (Per), Munn y Terborgh, 1979 llevaron a cabo los primeros estudios sobre bandadas mixtas amaznicas; Terborgh et al., 1990 estudiaron un rea de 100 ha en la reserva y obtuvieron datos sobre la abundancia y composicin de la comunidad de la avifauna en un rea determinada del bosque tropical hmedo en la Amazonia. Para el Ecuador, los primeros estudios sobre bandadas mixtas fueron los de Wiley, 1980; y a continuacin, uno mucho ms extenso desarrollado por English, 1998 quien fue el primero en Ecuador en analizar un rea de 100 ha con un estudio entre 1994-1995 en el Parque Nacional Yasun (PNY). No obstante, comparaciones sobre la composicin de especies de aves capturadas en redes de neblina en diferentes localidades del PNY, demostraron una variacin notable entre diferentes hbitats: tierra firme, bosque temporalmente inundado, pantano y bosque de borde (Jaramillo y de Vries, 2002; de Vries, 2001).Por esta razn, se inici un proyecto de 10 aos (2001-2011) en una parcela de 100 ha ubicada en el km 9 cerca de la Estacin Cientfica Yasun (ECY) de la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador (PUCE), en la que participaron 11 tesistas de la carrera de Ciencias Biolgicas de la PUCE con la direccin del Dr. Tjitte de Vries, para obtener datos cuantitativos y cualitativos de la composicin de la avifauna y las especies que participan en bandadas mixtas. Datos preliminares del primer plot de 25 ha sobre bandadas de sotobosque fueron presentados ya por Tobar et al., 2003 y de bandadas de dosel por Piedrahita et al., 2003. El diseo original del rea de estudio de las 100 ha concebido en el 2001 sufri una variacin a raz de la creacin del asentamiento Waorani de Timpoka, en las inmediaciones del km 10 de la va NPF-Tivacuno en el 2003. Esto oblig a cambiar 50 ha -de las 100 ha programadas- desde el km 10 al km 8 hacia el oeste. En esta zona de 100 ha progresivamente se han hecho anlisis de la composicin de las especies, tomando en consideracin el tamao de los territorios, los diferentes hbitats del bosque, aspectos socio-ecolgicos de la avifauna y la funcin del canto del lder de la bandada (Baquero, 2003).Simultneamente, y distribuidos en la parcela de 100 ha, se iniciaron anlisis en cuatro plots de 25 ha cada una, en diferentes aos y con diferentes investigadores: Buitrn, 2005; Tobar, 2006; Erazo, 2010 y Ojeda, 2011. Tambin se investig, en la misma parcela de 100 ha, sobre la morfometra, la muda y los movimientos de las participantes de las bandadas mixtas (Serrano, 2006), bandadas mixtas del dosel (Iglesias, 2007; Piedrahita, 2007) y aspectos de depredacin (Snchez, 2008). Para obtener datos sobre la participacin de la avifauna en el dosel y la presencia de
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disponibilidad de frutas y semillas, se observaron dos especies de leguminosas, rboles del dosel, Cedrelinga cataeniformis y Parkia multijuga (Melo, 2000; Silva, 2000). Vale la pena mencionar que, simultneamente con el anlisis de la parcela de 100 ha se elabor una lista detallada y anotada de 420 especies de aves en los alrededores de la ECY, donde se incluyeron tambin las especies analizadas en el rea de estudio del presente trabajo (Piedrahita et al., 2012). En este trabajo se recurri al uso de una Torre de Observacin, la misma que puede presentar sesgos al momento de inferir aspectos sobre la ecologa general a un grupo de especies de aves, pero que adquiere un grado de importancia invaluable en el estudio de ciclos poblacionales y abundancia, al ser una herramienta para la conservacin de la avifauna de dosel. El presente trabajo pretende conglomerar los resultados parciales de cada uno de los plots de 25 ha investigados entre 2001 2011, para con esta informacin construir el patrn mosaico del bosque en donde participan las diferentes aves en sus respectivos territorios. MATERIALES Y MTODOS Este estudio fue realizado en los alrededores de la Estacin Cientfica Yasun (ECY) en el interior del Parque Nacional Yasun (PNY) entre 2001-2011. La ECY est localizada en la ribera sur del Ro Tiputini, cuyas coordenadas geogrficas referenciales son 75 55 O y 0040 S, a una altitud promedio de 230 msnm (Figura 1). Las observaciones del comportamiento y movimiento de las bandadas mixtas de aves de sotobosque y dosel fueron obtenidas en una parcela de 100 ha (1km2) localizada a 1.5 km de la ECY en el km 9 de la va NPF-Tivacuno. La parcela fue dividida en cuadrantes de 100 x 100 metros y con marcas cada 25 m, lo que permite localizar y establecer la posicin de cada bandada. El rea posee varios hbi-
tats: bosque de tierra firme con algunos claros naturales en regeneracin (lianeros), bosque temporalmente inundado, bosque de pantano y bosque secundario de borde de carretera. Lianeros corresponden a claros naturales en regeneracin con abundantes troncos cados, bejucos y lianas que obstaculizaron el paso. Parte de la metodologa de la investigacin se fundamenta en el anlisis comparativo de los resultados de las investigaciones que, durante los 10 aos de este proceso, han realizado los diferentes coautores en sus respectivos plots de 25 ha que conforman la parcela de 100 ha objeto de este estudio. En el presente estudio, por plot se entender la porcin de 25 ha de la parcela total de 100 ha. Cada investigador ha tenido su criterio para definir las diferentes categoras de participacin en la bandada, llegando a conclusiones similares con respecto a la participacin de las especies de aves que conforman el patrn mosaico del bosque. Por esta razn, a lo largo de los resultados de esta investigacin, se mencionan esas conclusiones y esos aportes. Diariamente y a lo largo de las estadas en el campo (que variaban entre 6 meses a 1 ao durante todo el perodo de la investigacin), en los diferentes senderos, se observaron los movimientos de varias bandadas mixtas, recopilando informacin que fue tabulada en los mapas correspondientes a los plots de 25 ha. Cabe mencionar que las observaciones de forrajeo relacionado con el rango vertical de la estructura del bosque, planteado por Buitrn, 2005, se realizaron observando la posicin de las aves en sus respectivos sitios de altura. Adems analiz las frecuencias de uso de estratos en gremios de aves insectvoras de 24 especies de bandadas mixtas de sotobosque. Observ tambin con detalle los diferentes insectos capturados por ciertas especies de aves. En el caso de Erazo, 2010, su mtodo de clasificacin est en 6 categoras en relacin con el tamao del territorio y de la densidad poblacional.
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Para Ojeda, 2011, el mtodo de clasificacin es de 4 categoras siguiendo la lgica propuesta por Moynihan, 1962; Munn y Terborgh, 1979; Greenberg, 2000, clasificacin en la que se hace referencia a los tiempos en los que las especies participan en las diferentes actividades de la bandada y analizando los diferentes tipos de canto de la especie sub-lder de la bandada, con grabaciones de los sonidos producidos. Serrano, 2006, por su parte entre agosto del 2001 y agosto del 2003, realiz salidas de campo de entre 15 a 30 das durante las cuales se capturaron aves con redes de neblina de diferentes tamaos (7 m a 20 m de largo), llegando a un total de 80 metros de red; que fueron situadas a ras del suelo en los senderos de la parcela por tres das, en siete puntos dentro de una seccin de 25 ha; realizndose los muestreos en los diferentes tipos de hbitat. Para el marcaje de las aves se utilizaron cuatro anillos de diferentes colores, dos en cada pata, a los que se los design un nmero que otorga un cdigo de identidad nico para cada individuo capturado. Para la recoleccin de informacin, Piedrahita, 2007, realiz observaciones de identificacin de aves del dosel, dentro de las 25 ha alrededor de la Torre de Observacin, ubicada cerca del km 8 de la carretera ECYTivacuno. Mientras tanto, Iglesias extendi el rea a 50 ha (sumando a sus 25 ha, el rea de estudio de Piedrahita) incluyendo observaciones desde los senderos hacia las copas de los rboles (dosel). RESULTADOS Bandadas mixtas del sotobosque.- De la observacin de las bandadas mixtas de sotobosque, se identificaron reas de reunin nicas donde al amanecer se congregaron los miembros y se escucharon vocalizaciones caractersticas de las especies de hormigueros, Thamnomanes caesius, la especie lder y el sublder T. ardesiacus (Ojeda, 2011; Erazo, 2010; Tobar, 2006; Buitrn, 2005; Baquero, 2003).
A continuacin, detallamos los resultados obtenidos por los diferentes investigadores en sus respectivos plots de 25 ha y los datos con los que aportaron a la composicin de las aves de bandadas mixtas dentro del patrn mosaico del bosque en la parcela total de 100 ha. Para esto, hemos dividido los temas en los autores que investigaron el sotobosque y el dosel, incluyendo casos de observacin de depredacin en el sotobosque, y bandadas mixtas adicionales del dosel. Buitrn, 2005 dentro de su plot de 25 ha, al interior de la parcela de 100 ha objeto de esta investigacin, agrupa 108 especies en cinco categoras por el nmero de participaciones y ocurrencia de las especies dentro de 8 bandadas (en 50 ha) con especies obligatorias (10), especies regulares (15; incluyendo 2 especies de dosel y 2 especies de lianero), especies frecuentes (12; incluyendo 3 especies de dosel y 6 de lianero), especies ocasionales (15; incluyendo 4 especies de dosel y 5 de lianero), especies accidentales (56; incluyendo 32 especies de dosel y 5 de lianero). De las 108 especies, 49 son tpicas del sotobosque, 18 del hbitat lianero y 41 del dosel que bajan y participan a veces en la bandada del sotobosque. Buitrn concluye tambin que 5 familias de aves participantes de bandadas mixtas de sotobosque (entre 22 familias) claramente son las ms importantes: Thamnophilidae con 26 especies, Furnariidae (11),Thraupidae (11), Tyrannidae (11) y Dendrocolaptidae (10). Tambin identifica los tamaos de los territorios en las ocho bandadas registradas, alcanzando un promedio de 6.5 ha (rango 5.2 8.5 ha). El promedio de las especies participantes en las ocho bandadas fue de 53.4 (rango 3573). No se encontr correlacin entre el nmero de especies promedio por bandada y el rea total del territorio el nmero total de especies registradas y el rea del territorio. La correlacin fue altamente significativa y negativa entre el total de especies y el porcentaje de bosque temporalmente inundado; y positiva y significativa entre el total de especies y el
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Tabla 1. Coeficientes de Similitud de Jaccard de composicin de todas las especies entre las bandadas de sotobosque en el km 9, PNY.
Zona formacin
A630 A900 E800 D600 D300 C100 B200 B400
No. Das (105) 25 9 15 18 11 8 10 10 Cdigo de Bandada A B C D E F A B C D E F G H G H
1 0.38 1 0.58 0.51 1 0.53 0.53 0.58 1 0.52 0.46 0.57 0.60 1 0.33 0.38 0.40 0.43 0.37 1 0.37 0.42 0.48 0.45 0.44 0.42 1 0.45 0.49 0.62 0.56 0.59 0.44 0.49 1 vaciones de forrajeo relacionado con la altura vertical en el sotobosque en un rango de 0.41 m (Henicorhina leucosticta) a 13.5 m (Capito auratus). El rango del promedio de altura vertical de las bandadas mixtas fue ms amplio al considerar tambin los promedios de las especies frecuentes, ocasionales y accidentales que se asociaron a las bandadas de sotobosque en menos ocasiones que las especies obligatorias y regulares. El rango estuvo entre 28.3 m (Celeus grammicus) a 0.22 m (Myrmoborus myiotherinus). El lder, Thamnomanes caesius forraje a una altura promedio de 7.44 m (SD+-3.85; n = 188), mientras el sub-lder T. ardesiacus forraje a 4.07 m (SD +-2.01; n = 201); (para datos estadsticos de las dems especies en Buitrn, 2005). Buitrn, 2005, analiz las frecuencias de uso de 6 estratos: suelo, arbustos, sotobosque bajo, sotobosque alto, estrato medio y dosel; en gremios de aves insectvoras de 24 especies de bandadas mixtas de sotobosque: especies de probadoras de corteza (5 especies), atrapadores desde percha (4), probadores de hojas secas (5), buscadores de follaje (7), buscadores en epfitas (1) y buscadores de hojarasca (2).
porcentaje de bosque colinado (tierra firme), pero no entre el total de especies y el porcentaje de lianero. En el estudio se concluye que las dos bandadas de estudio (E y F) que tuvieron los porcentajes ms altos de bosque temporalmente inundado fueron las que menos especies registraron a lo largo de todo el estudio, con 35 y 39 especies, respectivamente (Figura 2).Por lo tanto un menor nmero de especies participantes ocasionales o accidentales de bandadas mixtas mantienen territorios en reas de bosque temporalmente inundado. El nmero de especies en bandada no estuvo relacionado al tipo de hbitat ya que no existi correlacin entre el promedio de especies diario y el porcentaje de extensin de los tipos de bosque dentro de los territorios: colinado (r = -0.19; p = 0.65; n = 8), lianero (r = 0.70; p = 0.05; n = 8); y, pantano (r = 0.241; p = 0.566; n = 8). La Figura 2 demuestra tambin el tipo de hbitat (tierra firme, pantano y lianeros) y los lmites de los 8 territorios en un plot de 50 ha. La extensin de los hbitats en el rea fue de: 74 % (37 ha) bosque colinado de tierra firme, 9.5 % (4.8 ha) lianeros y 16.5 % (8.2 ha) de pantano. Buitrn presenta adems datos de 24 especies que obtuvieron ms de 35 obser-
93
Thamnomanes caesius est presente en todos los seis estratos (mayormente en arbustos y sotobosque bajo y alto (n = 194); mientras T. ardesiacus est el 50 % en arbustos (n = 46), ambas especies en el gremio atrapadores de percha. Mayormente captan Orthoptera para ambas especies (10 y 13, respectivamente (n = 19), el resto representan Odonata, Blattaria, Hemiptera, Lepidoptera, Hymenoptera y Coleoptera. Los coeficientes de Similitud de Jaccard de composicin de todas las especies entre 8 bandadas de sotobosque varan de 0.33 a 0.60, demostrando gran variedad, reflejando un patrn mosaico del bosque (Tabla 1). Erazo, 2010, en su plot de 25 ha con 4 bandadas mixtas de sotobosque registr 60, 42, 33 y 35 especies en los territorios, respectivamente, con un total de 73 especies de 18 familias. Ella hace una clasificacin de las especies participantes en seis categoras de acuerdo al tamao del territorio y la densidad poblacional. Las categoras son las siguientes: Categora I: Especies nucleares que mantienen el mismo tamao de territorio con respecto a la bandada (5 especies). Categora II: Especies seguidoras que mantienen territorios ms grandes que la bandada y con menor densidad poblacional que las especies de la categora I (13 especies). Categora III: Especies seguidoras de bandadas con densidad poblacional mayor a las especies de la categora I (14 especies). Categora IV: Especies de distribucin en parches, ejemplo: lianeros, claros de bosque o estacionarios (12 especies). Categora V: Especies que participan con bandadas de dosel y ocasionalmente alternan con bandadas de sotobosque (8 especies). Categora VI: Especies ocasionales u oportunistas (21 especies). Erazo demuestra que las rutas diarias en la poca seca (agosto 2007) son ms largas dentro de los territorios que las rutas en la poca lluviosa (marzo 2008), mientras los conflictos en la poca seca, que se dieron con
la bandada vecina en los lmites territoriales, eran ms frecuentes que en la poca lluviosa (en 12 das de observacin: 15 versus 4). Tres bandadas recorren en promedio 9 887 m en una maana en la poca seca y un promedio de 6 700 m en poca lluviosa. Se observ que las bandadas llegan a reclutar mayor nmero de participantes durante la poca seca (datos estadsticos en Erazo, 2010), cuando los recursos son ms escasos y las aves no estn anidando. El uso de territorio de la bandada tambin puede influir en ese reclutamiento, ya que mientras ms reas cubre la bandada en busca de recursos, ms especies tienen la oportunidad de interactuar con ella. Los datos del comportamiento reproductivo demuestran que en los perodos de enero a marzo las aves se estn reproduciendo porque se las ha observado en cortejo, construyendo nidos e incubando. Las observaciones entre julio y agosto indican que las aves ya estn con juveniles que se pueden mover con la bandada (datos de Thamnomanes caesius, T. ardesiacus, Henicorhina leucosticta, Myrmotherula axillaris, Myrmoborus myotherinus, Turdus ignobilis, Euphonia xanthogaster). Erazo, 2010, calcul tambin el tamao del territorio de siete especies (dentro del territorio de la bandada) observadas con detalles por medio de mapas basados en puntos precisos de avistamientos en un rea de 25 ha: Henicorhina leucosticta (1.02 ha, n = 10) Figura 3; Myrmotherula fjeldsaai (1.4 ha, n = 2, en lianero); Myrmoborus myotherinus (2.2 ha, n = 3, en bosque colinado de tierra firme); Microrhopias quixensis (0.9 ha, n=1, en cobertura vegetal densa); Hypocnemis cantator (1.4 ha, n = 2 en bordes de bosque); un lek de Lepidothrix coronata (1.8 ha, n = 2) y un lek de Pipra erythrocephala (0.9 ha, n = 2). (Ms informacin sobre las Figuras de los distintos territorios de las especies en Erazo, 2010). Ojeda, 2011, en su plot de 25 ha encontr en cuatro bandadas mixtas de sotobosque un total de 109 especies en 17 familias, y toma en cuenta las 4 categoras propuestas por
94
Moynihan, 1962), Munn y Terborgh, 1979, Greenberg, 2000. Esta categorizacin aporta a la investigacin con datos relacionados a las actividades que las diferentes especies realizan al interior de las bandadas mixtas, clasificndose de la siguiente manera: Categora Lder: 2 especies en las 4 bandadas del plot de 25 ha, encargadas de formar, dar las seales de alerta, movimiento y cohesin a las bandadas mixtas. Estn de 6h00 a 17h00; es decir ms de 10 horas continuas, dentro del territorio de la bandada. Categora Ncleo: 810 especies en las 4 bandadas del plot de 25 ha, que siempre estn forrajeando en las bandadas mixtas. Estn de 06h15 a 16h00, un estimado de 8 horas. Categora Seguidoras: 1936 especies en las 4 bandadas del plot de 25 ha. Son especies que pueden o no forrajear con las bandadas mixtas. Estn hasta 4 horas, pero no desde la formacin ni en la desintegracin de la bandada. Categora Ocasionales: 121 especies en las 4 bandadas del plot de 25 ha. Estas especies forrajean solas y se unen a bandadas mixtas cuando stas pasan por su territorio, en un perodo de hasta 20 min en las bandadas. El nmero de especies en las 4 bandadas presentes en el plot de 25 ha es de 62, 60, 33, y 52, respectivamente y se nota que en las categoras seguidoras y ocasionales hay las mayores diferencias en los nmeros Ojeda, 2011, analiza y enfatiza la importancia del comportamiento y canto del sub-lder Thamnomanes ardesiacus con la clasificacin del canto en cuatro tipos: (1) formacin y ensamblaje, (2) cohesin, (3) alarma y (4) forrajeo; reforzando la importancia de sta especie en la bandada. Ojeda, 2001, presenta los detalles de las 15 bandadas mixtas de sotobosque estudiadas por Tobar, 2006, Buitrn, 2005, Erazo, 2010 y Ojeda, 2011 en sus diferentes plots, en la parcela de 100 ha con el total de 143 especies en 21 familias (Tabla 2), con los lmites de los territorios A hasta L (Figura 4).
Serrano, 2006, hace observaciones de las aves del sotobosque capturados en redes de neblina, con la intencin de marcar individualmente las aves para obtener informacin sobre la muda y los movimientos de ciertas especies dentro del plot 25 ha alrededor de la Torre de Observacin. En esa rea de estudio captur un total de 868 individuos de 104 especies (en 24 familias) en 4364 horas red. Se marcaron 716 individuos y 163 (22.8 %) de ellos fueron recapturados. Las cuatro especies con mayor nmero de capturas y recapturas fueron: Glyphorynchus spirurus (118 capturas y 41 (34.7 %) recapturas; Lepidothrix coronata 74/26 (35.1 %); Pithys albifrons 53/17 (32.1) y, Dixiphia pipra 33/7 (21.2 %). De estas cuatro especies se analiz con ms detalles las pocas de muda y la presencia de parche de incubacin, obteniendo como resultado que la presencia del parche de incubacin se observ en los meses de diciembre a febrero, mientras la muda de ala, cola y cuerpo ocurri mayormente en agosto-septiembre. Glyphorynchus spirurus se desplaz dentro de un rea que cubri tres diferentes territorios de bandadas mixtas del sotobosque. Marcado en territorio F el 10 de enero de 2002 y recapturado en el mismo sitio 6 meses ms tarde (9 de agosto de 2002); cuatro meses despus en territorio G, a 360 m de distancia y dos meses despus en territorio H a 100 m del sitio anterior. El desplazamiento en lnea recta es de 460 m; el individuo tiene por lo menos 12 meses. Otro ejemplo de un movimiento a ms de un territorio de la bandada es de Xenops minutus, marcado en F el 2 de agosto de 2001 y despus de 5 semanas se lo encontr en el mismo punto y despus de 17 meses, el 22 de febrero de 2003, fue encontrado en territorio H, desplazndose alrededor de 583 m en lnea recta.
Tabla 2. Composicin de las bandadas mixtas de Sotobosque en 100 Ha. Taxonoma sigue la propuesta de Ridgely y Greenfield (2001).
Familia A B C D E F G H I J K L* M N O
Especies
I.
rea sombreada: presencia de las especies en las bandadas por Parcela Galo B. II. Marcelo T. III. ma. Jos E. IV. Ma. Isabel O. 15 Bandadasa mixtas de Sotobosque encontradas en 100ha L*
Cuculidae
Piaya melanogaster
Piaya cayana
Trogonidae
Trogon curucui **
Trogon viridis
Trogon violaceus
Trogon collaris
Trogon melanurus
Trogon rufus
Galbulidae
Galbula albirostris
10
Jacamerops aureus
11
Bucconidae
Monasa morphoeus
12
Monasa migrifrons
13
Monasa flavirostris **
14
Nonnula brunea
15
Chelidoptera tenebrosa
16
Malacoptila fusca **
17
Capitonidae
Capio auratus
18
Eubucco richardsonii
19
Ramphastidae
Pteroglossus azara
20
Picidae
Celeus elegans
95
Continuacin Tabla 2.
A B C D E F G H I J K L* M N O L*
96
21
Celeus grammicus
22
Celeus flavus
23
Picummus lafresnayi
24
Piculus flavigula
**
25
Piculus chrysochloros
26
Veniliornis affinis
27
Campephilus rubricollis
28
Furnariidae
Xenops minutus
29
Automolus achrolaemus
30
Automolus infuscatus
31
Automolus melanopezus
32
Automolus rubiginosos
33
Automolus rufipileatus
34
Ancistrops strigilatus
35
Hyloctistes subulatus
36
Cranioleuca gutturata
**
37
Philydor erythrocercus
38
Philydor erythropterus
39
Philydor pyrrhodes
40
Sclerurus caudactus
41
Dendrocolaptidae
Xyphorhynchus ocellatus
42
Xyphorhynchus guttatus
43
Xyphorhynchus chunchotambo
44
Campylorhamphus trochilirostris
45
Glyphorynchus spirurus
46
Dendrocincla fuliginosa
47
Sittasomus griseicapillus
48
Dendrexeatastes rufigula
49
Xiphocolaptes promeropirhynchus
50
Dendrocolaptes certhia
51
Dendrocolaptes picummus
52
Lepidocolaptes albolineatus
53
Nasica longirostris
54
Deconychura longicauda
55 56 57
Thamnophilidae
Thamnomanes caesius Thamnomanes ardesiacus Thamnophilus aethiops
58
59
Thamnophilus schistaceus Thamnophilus murinus
60
Myrmotherula longipennis
61
Myrmotherula menetriesii
62 63 64 65
Myrmotherula hauxwelli Myrmotherula axilliaris Myrmotherula erythrura Myrmotherula fjeldsaai
66 67
Myrmotherula brachyura Myrmotherula ignota Myrmotherula ornata Myrmotherula obscura Myrmotherula sunensis
68 69 70 71 72
Myrmotherula multostriata
Microrhopias quixensis
**
97
73
Terenura spodioptila
98
74
Terenura humeralis
77
Hylophylax poecilinota
76
Cercomacra cinerascens
77 78
Cercomacra serva Myrmoborus myotherinus
79
Taraba major
80
Cymbilaimus lineatus
81 82
Pithys albifrons Phlegopsis erythroptera
83
Phegosis nigromaculata
84 85 86 87 88
**
89 90 91 92 93 94 95 96 Conopophagidae 97 Tyrannidae 98 99 100 101
Hylophylax naevia Hylophylax ochraceiceps Myrmeciza fortis Hypocnemis cantator Hypocnemis hypoxantha Pygiptila stellaris Rhegmatorhina melanosticta Gymnopithys leucaspis Frederickena unduligera Sclateria naevia Herpsilochmus dugandi Megastictus margaritatus Conopophaga peruviana Attila spadiceus Terenotriccus erythrurus Tolmomyias assimilis Mionectes oleagineus Myopagis gaimardii
** **
102 103 104 105 106 107
Myiobius barbatus Platypsaris minor Rhytipterna simplex Cnipodectes subbrunneus Laphotriccus vitiosus Rhynchocyclus olivaceus
** **
Cotingidae Pipridae
Poecilotriccus capitalis Lipaugus vociferans Tyranneutes stolzmanni Lepidothrix coronata Pipra erythrocephala Dixiphia pipra Chloropipo holochlora Piprites chloris
Vireonidae Turdidae
108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123
Troglodytidae
Hylophilus ochraceiceps Turdus ignobilis Turdus albicollis Henicorhina leucosticta Thryothorus coraya Thryothorus leucotis Donacobius atricapilla Microcerculus mariginatus
124 Polioptilidae 125 126 Thraupidae
Rhamphocaenus melanurus Microbates cinereiventris Tangara schrankii
127
Tangara xanthogaster
128
Tangara gyrola
129
99
130
Tachyphonus surinamus Tachyphonus cristatus
131
Cyanerpes caeruleus
132
Habia rubica
133
Lanio fulvus
134
Hemithraupis flavicollis
135
Clorophanes spiza
** ** **
136
Euphonia xanthogaster
137
Euphonia laniirostris
138
Euphonia minuta
139
Euphonia rufiventris
** ** **
140 Cardinalidae
Cyanocompsa cyanoides
141
Saltator maximus
142
73 63 49 58 35 39 57 53
Saltator grossus 60 42 33 35 62 60 33 52
143 Icteridae
Cacicus cela
Total de especies presentes en cada bandada
Total de especies = 143; Total de familias = 21; Total de gros = 93
* Banda mixta de sotobosque analizada con el apoyo de Ma. Jos Erazo 2010 y censada hasta esta investigacin
100 Tjitte de Vries, Galo Buitrn, Marcelo Tobar, Paolo Piedrahita, Andrs Iglesias, Andrs Serrano,
Mara Jos Erazo, Isabel Ojeda, Luis Baquero y Pablo Snchez
** Especies no registradas en el trabajo d Ma. Jos Erazo, 2010, para la bandada L.
101
Vale la pena enfatizar que dos especies ncleos se mantuvieron en el mismo territorio de la bandada: Thamnomanes caesius macho fue capturado el 26 de febrero de 2003 y recapturado el 14 de agosto de 2003 en el mismo territorio (F), mientras Thamnomanes ardesiacus hembra fue capturada el 7 de agosto de 2001 y recapturada el 25 de diciembre de 2002, 17 meses despus, en el mismo territorio E. Estas dos especies claramente ocupan el territorio de su especie en la totalidad del territorio de la bandada mixta del sotobosque (Figura 2). Casos observados de depredacin dentro del sotobosque: 1. En agosto 14 del 2006 alrededor del medio da, la bandada 1 fue atacada por un ave rapaz blanca dentro del sotobosque, probablemente Leucopternis melanops o L. albicollis. Las aves se alertaron con los cantos de alarma de Thamnomanes caesius macho y hembra. Se escuch el fuerte aleteo del ave rapaz y cmo sus alas golpeaban contra la vegetacin aproximadamente a 6 m de altura. No se logr identificar el miembro de la bandada que fue la presa mientras el ave rapaz ascenda fuera del bosque. Las aves se mantuvieron en absoluto silencio y escondidas entre las hojas
por 20 minutos. Finalmente cuando T. caesius dio su canto de direccin las aves lo siguieron dejando el rea del incidente a los 30 minutos (Erazo, 2010). 2. La presencia de Leucopternis albicollis (junio 2007) y de Micrastur gilvicollis (enero 2008) alert a T. caesius y T. ardesiacus y se emitieron el canto de alarma y se not que la bandada se desplaz hacia la parte baja del sotobosque permaneciendo en silencio. No se presenci ningn ataque a la bandada (Ojeda, 2011). 3. Buitrn (2005) sobre ataques a las bandadas mixtas de sotobosque dice: El nico ataque observado de una rapaz a una bandada se efectu en una bandada de tangaras cuando el elanio Harpagus bidentatus atac a una Tangara velia mientras una tropa de Saguinus tripartitus era simultneamente atacada por un Leptodon cayannensis incubante (28 de julio de 2004). Aunque Harpagus bidentatus ha sido reportado atacando aves, las descripciones han sido atribuidas a confusin con los azores Accipiter bicolor y A. striatus. En mi observacin no hubo confusin en la identificacin y al parecer el mismo individuo, fue observado dos das despus al borde de la carretera en la misma
TABLA 3. (a) Nmero de especies compartidas entre las cuatro bandadas mixtas de dosel observadas. (b) ndice de Similitud de Jaccard entre las bandadas encontradas.
(a) Nmero de especies compartidas B1 B2 B3 B4 B1 - B2 81 - B3 63 62 - B4 54 56 60 (b) ndice de Jaccard B1 B2 B3 B4 B1 - B2 0.910 - B3 0.670 0.667 B4 0.581 0.629 0.833
rea con un Tejidae (Reptilia: Lepidosauria) como presa. Con respecto a ataques de Harpagus a aves se presentan detalles en de Vries, 2007. Dentro de la parcela, cerca de la Torre de observacin, anid Spizaetus ornatus (Snchez, 2008) que extendi su territorio fuera de la parcela en un rea de 34 km2. Nunca fue observado atacando a las bandadas mixtas. Bandadas mixtas de aves del dosel.- Piedrahita, 2007, haciendo observaciones desde una torre de 30 m de altura registr un total de 178 especies de aves, pertenecientes a 30 familias. Tambin observ que en slo 5 familias se concentra el 52.6 % de la diversidad de la avifauna observada desde la Torre; estas son: Accipitridae (15 especies), Psittacidae (14), Picidae (12), Tyrannidae (23) y Thraupidae (28). En cuanto a la estructura gremial de estos registros, los gremios con mayor diversidad de especies de aves en el dosel fueron: los frugvoros (30.9 %), los insectvoros (34.8 %), los omnvoros (17.4 %) y las aves rapaces (12.4 %). El 48 % (86 especies pertenecientes a 18 familias) de stas especies, fueron registradas como integrantes de dos bandadas mixtas del dosel. Entre las familias con mayor diversidad de especies que integraron los dos territorios de las bandadas mixtas del dosel, alrededor de la Torre, se destacaron las siguientes: Thraupidae con 22 especies de aves de las 28 especies registradas en el dosel, Tyrannidae con 13 de las 23 especies registradas en el dosel, y Picidae con 11 de las 12 registradas en el dosel. En estas 3 familias se conform aproximadamente el 53 % de la diversidad total de las especies que participaron en estas bandadas. Piedrahita, 2007, distingue tambin 14 especies ncleo que poseen mayor frecuencia de asociacin en bandadas mixtas de dosel, es decir, presencia en ms del 25 % de las observaciones dentro de los dos territorios de las bandadas mixtas alrededor
de la Torre. Sin embargo, 3 especies de esta categora no se las consider como especies ncleo por ser aves migratorias, ya que stas estn presentes slo en una poca del ao, dependiendo si son migratorias boreales o australes. De esta manera hay once especies nucleares: Familia Thamnophilidae, una especie: Thamnophilus cf. amazonicus.Familia Thraupidae, nueve especies: Euphonia xanthogaster (68.6 %, n = 35), Cyanerpes caeruleus, Hemithraupis flavicollis, Tangara schrankii, Tachyphonus cristatus, (las ltimas 4 con el 45.7 %), Dacnis cayana, Dacnis lineata, Chlorophanes spiza, Euphonia rufiventris, (las ltimas 4 entre 2535 %). Familia Tyrannidae, una especie: Myiopagis caniceps. En la categora de especies seguidoras frecuentes se registr a 26 especies con una presencia del 823 % de las observaciones de bandadas mixtas registradas, mientras 49 especies de aves estuvieron dentro de la categora especies seguidoras ocasionales con una participacin de 12 bandadas (3 6 %). Detalles de las especies en Piedrahita, 2007 y en el sitio web de la revista. La Figura 5 demuestra el rango de visin (1 ha) para las bandadas mixtas de dosel alrededor de la Torre y el rea para analizar la abundancia temporal de loros y guacamayos. Movimientos dentro de sus territorios indican la importancia de cresta de colina como lmites (Figura 6). Iglesias, 2007 observ cuatro bandadas mixtas del dosel (incluyendo las dos de Piedrahita, 2007, alrededor de la Torre de Observacin), en un rea de 50 ha y anot cuatro bandadas adicionales que solamente ocupan en parte el espacio en la parcela total de 100 ha (Figura 7). Las cuatro bandadas del dosel tienen 86, 84, 71 y 61 especies, respectivamente, de un total de 94 especies ubicadas en las 50 ha estudiadas. La Tabla 3 demuestra el nmero de especies compartidas y el ndice de Similitud
TABLA 4. Especies presentes en las bandadas mixtas de dosel encontradas, categorizadas de acuerdo a su jerarqua y su ndice de propensin y ocurrencia
(n = 4 bandadas) No. bpb Ind. Ocurr.c
Nmero de observaciones formando parte de Especie bandadas mixtas No. 1 2 3 4 participaciones nd. prop. a
Especies Lder 0/18 38/40 9/9 47 0.505 (0.959) 2 0.50 18/18 39/40 7/9 90 0.968 4 1.00 18/18 12/18 15/18 15/18 15/18 16/18 12/18 6/18 9/18 14/18 35/40 37/40 32/40 37/40 30/40 33/40 29/40 32/40 27/40 22/40 9/9 6/9 7/9 8/9 8/9 8/9 6/9 6/9 5/9 0/9 87 80 80 75 71 73 64 54 53 51 0.935 4 1.00 0.860 4 1.00 0.860 4 1.00 0.806 4 1.00 0.763 4 1.00 0.785 4 1.00 0.688 4 1.00 0.581 4 1.00 0.570 4 1.00 0.548 3 0.75 0.495 4 1.00 0.473 4 1.00 0.462 4 1.00
Lanio fulvus * 0/26 ** Myiopagis caniceps 26/26
Especies Ncleo (Participantes obligatorios)
Myrmotherula obscura 25/26 Euphonia xanthogaster 25/26 Saltator maximus 26/26 Hylophilus hypoxantus 13/26 Tachyphonus luctuosus 18/26 Tangara velia 16/26 Hemitraupis flavicollis 17/26 Myiopagis gaimardii 10/26 Capito auratus 12/26 Chlorophanes spiza 15/26
Especies Facultativas (Participantes regulares) 8/18 16/40 4/9 46 7/18 19/40 3/9 44 12/18 17/40 3/9 43
Euphonia rufiventris 18/26 Attila spadiceus 15/26 Tangara schrankii 11/26
103
No. nd. propa No. bpb participantes Ind. Ocurr.c
Especie 1 2 3 4
Especies Facultativas (Participantes regulares) 9/18 11/18 12/18 9/18 6/18 9/18 8/18 11/18 7/18 0/18 6/18 0/18 10/18 12/18 8/18 8/18 14/18 12/18 12/18 5/18 6/18 5/18 12/18 6/18 15/40 17/40 13/40 15/40 22/40 11/40 16/40 13/40 17/40 30/40 12/40 31/40 18/40 15/40 12/40 12/40 0/40 6/40 0/40 9/40 8/40 11/40 0/40 9/40 5/9 4 1.00 5/9 42 0.452 4 1.00 2/9 42 0.452 4 1.00 5/9 42 0.452 4 1.00 5/9 41 0.441 4 1.00 6/9 41 0.441 4 1.00 3/9 41 0.441 4 1.00 3/9 40 0.430 4 1.00 6/9 40 0.430 4 1.00 6/9 39 0.419 3 0.75 6/9 39 0.419 4 1.00 8/9 39 0.419 2 0.50 1/9 38 0.409 4 1.00 1/9 36 0.387 4 1.00 2/9 35 0.376 4 1.00 5/9 34 0.366 4 1.00 0/9 33 0.355 2 0.50 1/9 31 0.333 4 1.00 0/9 31 0.333 2 0.50 2/9 30 0.323 4 1.00 1/9 28 0.301 4 1.00 0/9 26 0.280 3 0.75 0/9 25 0.269 2 0.50 3/9 24 0.258 4 1.00
Eubucco richardsoni 14/26 Xenops minutus 9/26 Tangara chilensis 15/26 Myrmotherula brachyura 13/26 Celeus elegans 8/26 Dafnis cayana 15/26 Piaya cayana 14/26 Icterus chrysocephalus 13/26 Turdus lawrencii 10/26 Vireo olivaceus 3/26 Tachyphonus surinamus 15/26 Habia rubica 0/26 Trogon viridis 9/26 Tityra cayana 8/26 Pygiptila stellaris 13/26 Melanerpes cruentatus 9/26 Tachyphonus cristatus 19/26 Xiphorhynchus guttatus 12/26 Tangara nigrocincta 19/26 Dafnis lineata 14/26 Todirostrum chrysocrotaphum 13/26 Dendrexetastes rufigula 10/26 Tangara xanthogastra 13/26 Herpsilochmus dugandi 6/26
Especie 1 2 3 4
Especies Facultativas (Participantes regulares) 12/18 4/18 5/18 5/18 2/18 9/40 2/9 18 3/18 7/40 1/9 18 5/18 3/40 0/9 17 4/18 2/40 3/9 17 3/18 11/40 0/9 17 4/18 6/40 6/9 16 6/18 0/40 0/9 15 6/18 7/40 2/9 15 3/18 6/40 1/9 15 6/18 2/40 1/9 14 4/18 0/40 0/9 14 2/18 5/40 1/9 14 7/18 2/40 0/9 13 3/18 8/40 1/9 13 0/18 10/40 3/9 13 5/18 7/40 1/9 13 2/18 6/40 1/9 13 2/18 6/40 0/9 12 0/40 8/40 9/40 8/40 2/9 3/9 1/9 2/9 23 16 18 19 0.247 3 0.75 0.237 4 1.00 0.204 4 1.00 0.204 4 1.00 0.194 4 1.00 0.194 4 1.00 0.183 3 0.75 0.183 4 1.00 0.183 3 0.75 0.172 3 0.75 0.161 2 0.50 0.161 3 0.75 0.161 4 1.00 0.151 4 1.00 0.151 2 0.50 0.151 4 1.00 0.140 3 0.75 0.140 4 1.00 0.140 2 0.50 0.140 3 0.75 0.140 4 1.00 0.129 3 0.75
Ornithion inerme Trogon violaceus Piculus flavigula Euphonia laniirostris
9/26 7/26 3/26 4/26
Especies seguidoras (Participantes frecuentes)
Myrmotherula erythrura 5/26 Cyanocorax violaceus 7/26 Piaya melanogaster 9/26 Monasa morpheus 8/26 Nasica longirostris 3/26 Selenidera reinwartdii 0/26 Notharchus macrorhynchos 9/26 Pachyramphus marginatus 0/26 Querula purpurata 5/26 Tangara callophrys 5/26 Cotinga cayana 10/26 Piprites chloris 6/26 Monasa flavirostris 4/26 Celeus flavus 1/26 Xiphorhynchus ocellatus 0/26 Myiornis ecaudatus 0/26 Terenotriccus erythrurus 4/26 Pionites melanocephala 4/26
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No. Ind. a b nd. prop No. bp Ocurr.c Especie 1 2 3 4 participaciones Especies seguidoras (Participantes frecuentes) Galbula chalcothorax 3/26 5/18 3/40 1/9 12 0.129 4 1.00 Cacicus cela 4/26 4/18 3/40 1/9 12 0.129 4 1.00 Tyrannulus elatus 3/26 2/18 5/40 2/9 12 0.129 4 1.00 Piaya minuta 5/26 6/18 0/40 0/9 11 0.118 2 0.50 Philydor erythropterus 5/26 6/18 0/40 0/9 11 0.118 2 0.50 Euphonia minuta 7/26 4/18 0/40 0/9 11 0.118 2 0.50 Psarocolius angustifrons 5/26 5/18 0/40 0/9 10 0.108 2 0.50 Philydor erythrocercus 8/26 2/18 0/40 0/9 10 0.108 2 0.50 Tolmomyias assimilis 3/26 4/18 2/40 1/9 10 0.108 4 1.00 Tolmomyias viridiceps 5/26 5/18 0/40 0/9 10 0.108 2 0.50 Contopus cooperi 6/26 4/18 0/40 0/9 10 0.108 2 0.50 Myiarchus tubercullifer 4/26 2/18 3/40 1/9 10 0.108 4 1.00 Participantes ocasionales Trogon curucui 6/26 0/18 3/40 0/9 9 0.097 2 0.50 Lipaugus vociferans 4/26 0/18 5/40 0/9 9 0.097 2 0.50 Hemithraupis guira 5/26 4/18 0/40 0/9 9 0.097 2 0.50 Xenops tenurirostris 3/26 1/18 3/40 1/9 8 0.086 4 1.00 Cotinga mayana 1/26 2/18 4/40 1/9 8 0.086 4 1.00 Cyanerpes caeruleus 4/26 4/18 0/40 0/9 8 0.086 2 0.50 Tangara mexicana 2/26 3/18 2/40 1/9 8 0.086 4 1.00 Monasa nigrifrons 3/26 2/18 1/40 1/9 7 0.075 4 1.00 Vireo flavoviridis 3/26 4/18 0/40 0/9 7 0.075 2 0.50 Dryocopus lineatus 2/26 4/18 0/40 0/9 6 0.065 2 0.50 Mionectes oleagineus 2/26 2/18 2/40 0/9 6 0.065 3 0.75 Iodopleura isabellae 3/26 0/18 2/40 0/9 5 0.054 2 0.50 Euphonia chrisopasta 2/26 1/18 1/40 1/9 5 0.054 4 1.00
Especie 1 2 3 4
Especies accidentales 2/18 0/18 1/18 2/18 1/18 1/18 0/18 0/18
c. ndice de Ocurrencia de cada especie en las cuatro bandadas mixtas de dosel encontradas * Especie considerada lder para las bandadas mixtas 3 y 4
Myrmotherula axillaris Platypsaris minor Campephilus melanoleucos Contopus virens Jacamareops aureus Icterus croconotus Campephilus rubicollis Zimmerius gracilipes 0/40 2/40 0/40 0/40 0/40 0/40 0/40 1/40 0/9 2/9 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 4 4 3 3 2 2 1 1
2/26 0/26 2/26 1/26 1/26 1/26 1/26 0/26
0.043 2 0.50 0.043 2 0.50 0.032 2 0.50 0.032 2 0.50 0.022 2 0.50 0.022 2 0.50 0.011 1 0.25 0.011 1 0.25
** Nmero total de observaciones para cada Bandada ndice calculado tomando en cuanta slo a las bandadas 3 y 4
a. ndice de propensin a formar parte de las bandadas mixtas para cada especie b. Nmero de bandadas en las que cada especie fue observada
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de Jaccard. Las dos bandadas del bosque de borde (1 y 2 al lado de la carretera) son ms similares entre ellas. Igual lo son las bandadas del bosque del interior entre ellas (3 y 4). Los tamaos territoriales de cada bandada variaron entre 12.515.4 ha (Figura 7).Los territorios son irregulares, al parecer limitados mayormente por la presencia de reas extensas de pantano (Figura 8). Iglesias, 2007, reconoce 6 diferentes categoras de acuerdo a la jerarqua y ocurrencia de las especies: Especies Lder (2 especies: Lanio fulvus, Myiopagis caniceps); especies Ncleo (participantes obligatorios) (10 especies: Myrmotherula obscura, Euphonia xanthogaster, Saltator maximus, Hylophilus hypoxantus, Tachyphonus luctuosus, Tangara velia, Hemithraupis flavicollis, Myiopagis gaimardii, Capito auratus, Chlorophanes spiza); especies Facultativas (participantes regulares) (31 especies); especies seguidoras (participantes frecuentes) (30 especies); participantes ocasionales (13 especies) y participantes accidentales (8 especies). El detalle de esta clasificacin puede observarse en la Tabla 4. La familia mejor representada fue Thraupidae con 23 especies participantes, el gnero Tangara con 7 y Euphonia con 5 especies, seguida por la familia Tyrannidae con 18 especies. En los dos territorios de bosque de borde de la carretera, no se observ la especie lder Lanio fulvus; en su lugar, el sub-lder Myiopagis caniceps lider estos dos territorios. En estas dos bandadas las 4 especies ms audibles son Euphonia rufiventris, E. xanthogaster, Myiopagis caniceps y el ave migratoria Vireo olivaceus, de acuerdo a los espectrogramas analizados en Piedrahita, 2007.
a las bandadas de tangaras, ya que sus complicados movimientos durante el forrajeo y las altas velocidades de vuelo, dificultaron el muestreo. Aun as, se registr por 7 ocasiones bandadas de tangaras compuestas por las siguientes especies: Cyanerpes caeruleus, Dacnis cayana, D. lineata, Euphonia chrysopasta, E. rufiventris, E. xanthogaster, Hemithraupis flavicollis, Tachyphonus cristatus, T. luctuosus, T. surinamus, Tangara callophrys, T. nigrocincta, T. schrankii y T. velia. El nmero mximo de especies y de individuos presentes en una bandada de Thraupidae fue de 6 y 12, respectivamente. Desde la torre de observacin, se registraron tambin bandadas mixtas temporales de dos y tres especies de la familia Apodidae, con Streptoprocne zonaris, Chaetura brachyura, Ch. cinereiventris, Panyptila cayennensis y Tachornis squamata. Las asociaciones mixtas ms frecuentes de estas especies fueron entre Streptoprocne zonaris y Chaetura brachyura. Esta asociacin se debi a las nubes de termitas (Isoptera) que estuvieron en vuelo nupcial, las mismas que tambin fueron aprovechadas como alimento por otras especies de aves como las rapaces Ictinea plumbea y Harpagus bidentatus. Desde la misma torre, igualmente se registr un total de 15 especies de loros y guacamayos como bandadas mono-especficas de Psittacidae, de ellas 3 fueron las especies ms comunes con 0.77 a 0.55 individuos/hora:Brotogeris cyanoptera, Pionites melanocephala y Ara macao; las siguientes 3 especies fueron de mediana abundancia con 0.43 a 0.2 individuos/hora:Ara ararauna, Pionus menstruus y Pionopsitta barrabandi; y las especies con menos frecuencia dentro del rea de estudio fueron Amazona farinosa, A. ochrocephala, A. Otras bandadas mixtas del dosel.- Se han identificado tres bandadas mixtas adicio- amazonica, Orthopsittaca manilata, todas con nales relacionadas a tangaras, vencejos, loros menos de 0.1 individuos/hora. Otras especies como Ara severa, Pyrrura y guacamayos. De acuerdo a Piedrahita, 2007, la familia melanura, Forpus sclateri, Amazona festiva y Thraupidae present una diversidad de 28 es- Ara chloroptera fueron registradas rara vez, pecies en el sitio de la observacin de la Torre. particularmente las dos ltimas que fueron obDesde esta Torre, se registr ocasionalmente servadas espordicamente.
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Figura 1. rea de estudio de la parcela de avifauna de 100 ha en los alrededores de la Estacin Cientfica Yasun. (Fuente: ECY).
Ara macao present mayor abundancia de individuos en agosto-septiembre, con grupos de entre 512 individuos. Ara ararauna mostr una mayor abundancia en febrero-marzo, una disminucin en agosto-septiembre y un leve aumento en diciembre-enero, aunque estadsticamente no present preferencias por alguna poca. Ara severa solo se observ en febrero-marzo con bandadas hasta 10 individuos, mientras en las otras pocas desapareci completamente. El patrn general de la variacin en la abundancia de loros y guacamayos presenta explicaciones en la fenologa de algunos rboles de dosel importante para la alimentacin. El estudio de Melo, 2000 y Silva, 2000, sobre la avifauna asociada a especies de rboles de leguminosas reporta la depredacin de los
frutos de estos rboles de dosel por los loros y guacamayos. La fructificacin ocurre primordialmente en el inicio de diciembre hasta finales de febrero en Cedrelinga catenaeformis; y de noviembre hasta enero, para Parkia multijuga. En una sola estacin de fructificacin, Melo (2000), reporta que hasta un 19 % de los frutos de C. catenaeformis fueron aprovechados por las especies Amazona amazonica, A. ochrocephala, Pionites melanocephala, Pionopsitta barrabandi y Pionus menstruus. Segn estos parmetros, un aumento en la actividad de los loros o nmero de individuos por hora podra ser el resultado de los grupos familiares visitando los sitios de alimentacin.
Figura 2. Mapa de vegetacin, territorios de 8 bandadas mixtas y rutas de movimiento en dos diferentes das para una bandada mixta de sotobosque en la parcela de 50 ha, km 9 va NPF-Tivacuno, Parque Nacional Yasun.
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Figura 3. Sitios de ocurrencia de Henicorhina leucosticta, y una aproximacin del tamao de su territorio.
Figura 4. Mapa de distribucin y territorios de las 15 bandadas mixtas de sotobosque registradas en una parcela de 100 ha, ubicada en el km 9, va NPF-Tivacuno, Parque Nacional Yasun; elaborada con datos adicionales de tres reas de 25 ha, analizadas por Buitrn (2005), Tobar (2006), Erazo (2010).
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Figura 5. Diseo de la parcela de 150 ha del proyecto Aves de Bandadas Mixtas. La parte sombreada muestra la distancia mxima de observacin del dosel para la identificacin de aves como loros, guacamayos, guilas y carroeras; el crculo con cuadrcula es el rea para analizar la abundancia temporal de loros y guacamayos; el crculo en amarillo muestra el rango de visin para las bandadas mixtas de dosel. Cada cuadrcula corresponde a 1 ha (10000 m2).
Figura 6. Movimientos de dos bandadas mixtas de dosel dentro de sus territorios. Cada territorio tuvo aproximadamente 10 ha de superficie. Ntese el solapamiento de los dos territorios alrededor de la Torre
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Figura 7. Distribucin de los territorios para cada bandada, con sus respectivos sitios de formacin (Realizado sobre el mapa modificado de F. Koester).
Figura 8. Mapa de distribucin de los distintos tipos de hbitat considerados en y en los alrededores del rea de estudio (realizado sobre el mapa modificado, elaborado por F. Koester).
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DISCUSIN Los participantes de las diferentes especies de aves en bandadas mixtas del sotobosque varan en nmero y categora entre los 15 territorios encontrados en la parcela de 100 ha. Diferentes autores clasifican las aves en distintas categoras, sin embargo coincidimos con ellos en la categora de especies ncleo (core-species), de alrededor de 9-12 especies. Cinco de estas especies (Thamnomanes caesius, T. ardesiacus, Myrmotherula axillaris, M. menetriesii, M. longipennis), coinciden sus territorios con el de las bandadas mixtas de sotobosque analizadas por nosotros, y se las puede considerar como caractersticas e importantes para la composicin de aves de sotobosque. De igual manera las cuatro especies ncleo (Xyphorhynchus ocellatus, X. guttatus, Automolus infuscatus, Glyphorynchus spirurus), que ocupan de 23 territorios de las bandadas mixtas estudiadas, se las puede considerar como caractersticas e importantes para la composicin de aves de sotobosque. Una interesante comparacin se puede hacer con English, 1998, quien estudi las bandadas mixtas de sotobosque en una parcela de 100 ha en el km 37 en la va Pompeya NPF (una estacin petrolera), un sitio ubicado a menos de 10 km de nuestra parcela. En su parcela, English, 1998, identifica un total de 284 especies (en 43 familias) con un total de 2 159 individuos (2 115 residentes) y considera 98 especies (en 18 familias) como especies participantes de bandadas mixtas de sotobosque. l define una especie de la bandada mixta de aves de sotobosque como: (as having been seen following the flock for over 30 minutes and/or with the core of the flock for over 50 m and/or moving with the core of the flock on three separate occasions) aquella que ha sido observada siguiendo la bandada por un periodo de tiempo de ms de 30 minutos, acompaando al ncleo de la bandada por ms de 50 metros, y/o movindose con el ncleo de la bandada en ms de tres ocasiones.
Pese a que la metodologa de identificacin de las especies de aves en las bandadas mixtas difieren entre las propuestas por English, 1998, y nuestra investigacin (2001 2011), coincidimos en 8 especies ncleo de las 12 propuestas por English. Las 4 con las que diferimos son: Hyloctistes subulatus, Philydor erythrocercus, Rhamphocaenus melanurus y Hylophilus ochraceiceps, pues a ellas nosotros las ubicamos en otras categoras. English, 1998, otorga a Glyphorynchus spirurus la categora understory flock species found frequently (especie frecuente en sotobosque) y calcula a esta especie entre las ms abundantes con ms de 100 individuos (50 parejas) en su parcela de 100 ha. De esto podemos concluir que existen un estimado de 1 pareja por cada 2 ha. Nuestro estudio demuestra que G. spirurus es una especie que participa en 23 diferentes bandadas mixtas de sotobosque; es decir, tiene un desplazamiento en un rea de 1520 ha siendo esta la actividad de la especie. Para estimar la densidad de la especie, partiendo de la actividad descrita, se debe tomar en cuenta el territorio que ocupa dentro de un rea especfica que, en ambos estudios, es de 100 ha de sotobosque. Nosotros estimamos de 56 parejas dentro de una parcela de 100 ha dado su movimiento, en contraste con las 50 parejas propuestas por English, 1998, en una parcela de las mismas dimensiones. Erazo, 2010, registr 10 territorios de Henicorhina leucosticta en cuatro bandadas mixtas de sotobosque (en 25 ha), mientras English, 1998, estim 25 individuos en su rea de estudio de 100 ha. Una reflexin sobre el nmero de individuos de una especie merece ms atencin ya que los individuos capturados en redes no aclaran la densidad, ms bien indican la actividad. Probablemente el error est en lo mencionado por English al momento de referirse a la captura de Henicorhina leucosticta: Avoided mist nets, perhaps because of fine-grained knowledge of territory and slow movements through
the forest Henicorhina leucosticta: Evita su captura en redes, posiblemente por el conocimiento del territorio y su movimiento lento dentro del bosque. English, 1998, adems considera a Thamnomanes ardesiacus como:found with virtually every understory flockencontrado virtualmente en cada bandada de sotobosque y concluye que: called infrequently in a flock unless in an aggressive interaction with another flock. My impression was that T. ardesiacus had a limited role in flock structure, if any at all (Canta de manera poco frecuente dentro de una bandada a no ser que sea en una interaccin agresiva con otra bandada. Mi impresin fue que T. ardesiacus tena un papel limitado dentro de la estructura de la bandada, si acaso tena alguno). Esta opinin difiera claramente con la de Ojeda, 2011, pues en su investigacin no solo identifica a T. ardesiacus como sub-lder en las bandadas estudiadas, sino que concluye que con sus comportamientos y cantos, el T. ardesiacus aporta en la direccin, cohesin, alarma y forrajeo de la bandada mixta de sotobosque. A 20 km de distancia de nuestra parcela, Blake, 2007, investig en dos parcelas de 100 ha la riqueza de las especies y composicin de las aves de sotobosque observando y capturando las aves en redes de neblina (en las meses de febrero y abril durante 20022005) registrando un total de 285 y 281 especies, respectivamente en los dos plots: Harpa y Puma. Un resultado muy similar a lo que obtuvo English, 1998, en su parcela de 100 ha con un total de 284 especies registradas. En el estudio de Blake, 2007, no se considera un efecto de poca de reproduccin (febrero-abril), si existiese alguno, elemento que en nuestra investigacin fue considerado con especial inters pues permite muestrear en distintas pocas del ao y tener un mejor snapshot de la comunidad de aves en el sotobosque.
La metodologa de Blake, 2007, ha sido muy distinta a la empleada en nuestros estudios, en donde seguamos las distintas bandadas mixtas de sotobosque con las diferentes composiciones de sus participantes y mapeando los lmites de cada uno de los 15 territorios en 100 ha. Blake, 2007, no intenta presentar estimaciones de la densidad de las especies, tal y como lo menciona: rather, I present a snapshot (repeated across years) of the numbers of individuals detected, by sight or sound (mejor dicho, yo presento un snapshot (repetido a lo largo de los aos) de los nmeros de los individuos detectados, de vista o por sonido) y llega a un total de 15 943 y 15 857 registros (detections), nmeros que dicen algo sobre las diferencias de la presencia si se analizan a nivel de especie. Como aves caractersticas de sotobosque nuestro estudio toma en cuenta las especies lderes, Thamnomanes caesius y T. ardesiacus, en contraste con la apreciacin de Blake quien tiene estas dos especies en un ranking de 6 y 13,en el plot Harpa; y 2 y 21 en el plot Puma, respectivamente. Estas especies tampoco constan en la lista de 20 especies indicadoras de los plots Harpa y Puma, ms bien, ninguna de las especies ncleos determinadas en nuestro estudio es incluida en la lista de indicadores de Blake, 2007, y solamente consta Xyphorhynchus, siendo en nuestro estudio una especie obligatoria en la bandada. Blake y Loiselle, 2008, presentan datos sobre la supervivencia de aves de sotobosque con un promedio de 0.58. Nuestros datos de supervivencia son ms bien anecdticos ya que las recapturas fueron insuficientes para la mayora de las especies, descubriendo que algunas vivieron ms de 18 meses. El clculo de la variable de supervivencia efectivamente tiene relacin directa con las capturas y recapturas, en donde ciertas especies de la parte superior del sotobosque caen con menor frecuencia en las redes de neblina, en comparacin con las especies de la parte inferior del sotobosque. Entre las especies que
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se encuentran en el estrato alto del sotobosque est T. caesius, mientras que T. ardesiacus es ms frecuente de encontrar en el estrato bajo del sotobosque, tal y como se demuestra en nuestro estudio (Buitrn, 2005). Esto tambin se demuestra en los datos de Blake y Loiselle, 2008, donde la relacin entre capturas y recapturas de las dos especies es de T. caesius108/18 versus T. ardesiacus 129/57. Pese a esta coincidencia, nos parece que Blake y Loiselle deberan tomar en cuenta las diferencias de estratos en el momento de calcular la supervivencia de las aves de sotobosque, evitando el posible error del clculo de la variable de supervivencia como relacionado exclusivamente con las variables de captura y recaptura. Blake y Loiselle, 2009, capturaron 157 especies en 4 001 individuos, (en los dos plots de 100 ha sumados), durante los meses febrero y abril en 20022005, mientras en nuestro estudio se capturaron 104 especies (en 24 familias) de 868 individuos durante ocho salidas con una duracin de entre 1530 das de trabajo de campo, entre agosto del 2001 y agosto del 2003, en un rea de 25 ha. En estos estudios y en anteriores (de Vries, 2001; Jaramillo y de Vries, 2002) las especies Glyphorynchus spirurus, Pithys albifrons y Lepydothrix coronata son capturadas en mayor nmero, relacionado con la actividad, sin ser especies con la mayor densidad. Considerando la participacin en las 15 bandadas de sotobosque registramos seis especies presentes en todas las 15 bandadas: Thamnomanes caesius, T. ardesiacus, Myrmotherula longipennis, M. axillaris, (Thamnophilidae), Glyphorynchus spirurus (Dendrocolaptidae), Henicorhina leucosticta (Troglodytidae), mientras 12 especies fueron presentes en 1214 bandadas: Monasa morphoeus (Bucconidae), Capito auratus (Capitonidae), Xenops minutus, Automolus infuscatus (Furnariidae), Xyphorhynchus guttatus (Dendrocolaptidae), Thamnophilus schistaceus, T. murinus, Hylophylax ochraceiceps (Tham-
nophilidae), Mionectes oleagineus (Tyrannidae), Lepidothrix coronata (Pipridae), Euphonia xanthogaster (Thraupidae). Consideramos a estas 18 especies como las especies de aves caractersticas o indicadoras de bandadas mixtas de sotobosque. En las cuatro bandadas mixtas del dosel participaron un promedio de 21 especies, y en total se registraron 94 especies participantes en las bandadas del dosel pertenecientes a 18 familias. Para caracterizar la bandada del dosel existen dos especies como lderes: Lanio fulvus (Thraupidae) y Myiopagis caniceps (Tyrannidae) y diez especies ncleo o participantes obligatorios: Myrmotherula obscura, Euphonia xanthogaster, Saltator maximus, Hylophilus hypoxantus, Tachyphonus luctuosus, Tangara velia, Hemithraupis flavicollis, Myiopagis gaimardii, Capito auratus, Chlorophanes spiza; estas 12 especies las consideramos como especies caractersticas o indicadoras de aves de bandadas mixtas de dosel. CONCLUSIONES En la parcela de 100 ha en el km 9 de la va NPF-Tivacuno en el PNY hay 15 bandadas mixtas de aves de sotobosque con un total de 143 especies de aves; y, 4 bandadas mixtas de aves de dosel con un total de 94 especies. Varias especies de dosel bajan al sotobosque y participan as en ambas bandadas de los dos estratos. Las diferencias en la composicin de las especies y nmeros de aves de las bandadas mixtas de sotobosque en la parcela de 100 ha demuestran el patrn mosaico del bosque en la Amazonia. La riqueza de especies de aves en una parcela de 100 ha en el Parque Nacional Yasun, en la Amazonia ecuatoriana, despus de un estudio de 10 aos, alcanz un registro de 358 especies. La especie lder de la bandada mixta de aves de sotobosque es Thamnomanes caesius con varios cantos distintos como: canto de direccin de la bandada, canto
de preparacin, canto de alarma, canto de interrogacin, cantos de estrs, cantos de forrajeo. Thamnomanes ardesiacus es importante como sub-lder con cuatro diferentes cantos: formacin y ensamblaje, cohesin, alarma y forrajeo, asociados a sus comportamientos. La especie lder de la bandada mixta de aves del dosel es Lanio fulvus, en su ausencia funciona Myiopagis caniceps como lder. Por ende, estas cuatro especies merecen especial atencin en programas de conservacin. Concluimos tambin que 24 especies que obtuvieron ms de 35 observaciones de forrajeo relacionado con la altura vertical en el sotobosque, lo hicieron en un rango de 0.41 m (Henicorhina leucosticta) a 13.5 m (Capito auratus). El rango del promedio de altura vertical de las bandadas mixtas fue ms amplio al considerar tambin los promedios de las especies frecuentes, ocasionales y accidentales que se asociaron a las bandadas de sotobosque en menos ocasiones que las especies obligatorias y regulares. La extensin de los hbitats en el rea de 50 ha fue de: 74 % (37 ha) bosque colinado de tierra firme, 9.5 % (4.8 ha) lianeros y 16.5 % (8.2 ha) de pantano, demostrando el patrn mosaico del bosque. Los territorios de las bandadas mixtas del dosel son ms extensas que los de las bandadas mixtas de sotobosque: 12.5 a 15.4 versus 5.2 a 8.5 respectivamente, demostrando la estructura ms compleja de la vegetacin dentro del sotobosque. Analizamos las frecuencias de uso en 6 estratos: suelo, arbustos, sotobosque bajo, sotobosque alto, estrato medio y dosel; en gremios de aves insectvoras de 24 especies de bandadas mixtas de sotobosque: especies de probadoras de corteza (5 especies), atrapadores desde percha (4), probadores de hojas secas (5), buscadores de follaje (7), buscadores en epfitas (1) y buscadores de hojarasca (2);
obteniendo datos sobre la diversidad de la participacin de las aves en los estratos mencionados. Calculamos tambin que las rutas diarias de las bandadas mixtas de sotobosque en la poca seca (agosto 2007) son ms largas dentro de los territorios que las rutas en la poca lluviosa (marzo 2008). Se calcul el tamao del territorio de siete especies (dentro del territorio de la bandada) en un rea de 25 ha, donde merece mencionarse que la especie Henicorhina leucosticta registr 10 territorios con un promedio de 1.02 ha. Se demuestra la importancia del comportamiento y canto del sub-lderThamnomanes ardesiacus con la clasificacin del canto en cuatro tipos: (1) formacin y ensamblaje, (2) cohesin, (3) alarma y (4) forrajeo; reforzando la importancia de sta especie en la bandada. De entre las cuatro especies con mayor nmero de recapturas se analiz detalladamente las pocas de muda y la presencia de parche de incubacin, obteniendo como resultado que la presencia del parche de incubacin se observ en los meses de diciembre a febrero, mientras que la muda de ala, cola y cuerpo ocurri mayormente en agosto-septiembre. Esto es una clara indicacin de que la poca de anidacin est en los meses de diciembre-febrero. Glyphorynchus spirurus se desplaz dentro de un rea que cubri tres diferentes territorios de bandadas mixtas del sotobosque, indicando que una especie puede participar en varios territorios de bandadas mixtas del sotobosque. Las dos bandadas mixtas del bosque de borde del dosel al lado de la carretera, son ms similares entre ellas. De la misma manera las dos bandadas del bosque del interior; por lo tanto, hay diferencias notables de la influencia del ser humano en la ecologa de las aves, al construir una carretera dentro de un rea del bosque hmedo tropical.
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Es errneo pensar que al deforestar unas cuantas hectreas y quitar los territorios en los que las aves se encuentran, stas podrn buscar en el extenso bosque otro sitio para sobrevivir. Este extenso bosque est en armona con el entorno, adaptado a sus caractersticas, de tal manera que en las cien hectreas contiguas a las deforestadas existen ya otras 15 bandadas mixtas de sotobosque y otras 4 bandadas mixtas de dosel, adems de las diferentes especies que ocupen esas reas. Esto es un hecho que debe tomar en cuenta la Biologa de la Conservacin. AGRADECIMIENTOS A la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador (PUCE) por apoyar y financiar el proyecto de avifauna durante todos estos aos. Al Ministerio de Ambiente por permitirnos investigar en el Parque Nacional Yasun. A los Directores de la Estacin Cientfica Yasun (ECY), Dr. Friedemann Koester, M.Sc. Pablo Jarrn, M. Sc. David Lasso y su personal por toda la ayuda logstica y atencin necesaria. A los colaboradores de campo: Anelio Loor, Wilson Loor, Milton Zambrano, Gabriel Grefa, Pablo Alvia, quienes delinearon y abrieron los senderos de los cuadrantes de 100 x 100 m, en total 22 km; los asistentes Augusto Sola, Rubn Jarrn, Daniela Tobar, Sofa Ruiz, Miguel Galarza, Jos Hidalgo, Fabin Falcon, Juan Jos Bravo, Margarita Baquero, Johanna Rodrguez, Carolina Portero, Esteban Guevara, Juan Galarza, David Donoso, Jos Parra, Mara Jos Pozo, Carlos Rodrguez, Salime Jalil, Miguel Durango, Gabriela Irazbal, Alicia Franco, Noem Cevallos, Juan Carlos Crespo, Alejandro Saa, Hctor Cadena y los estudiantes de los mltiples cursos de Tcnicas de Biologa de Campo de la PUCE, a todos ellos por el trabajo de campo realizado. A Peter y Rosemary Grant quienes inspiraron a Tjitte de Vries, por el entusiasmo demostrado luego de su visita a Yasun quienes, tras observar la riqueza del bosque tropical de la Amazonia,
propusieron y alentaron la recopilacin de los resultados de las once tesis de licenciatura, dirigidas en la PUCE. A las observaciones annimas realizadas al documento borrador, pues sirvieron de base para mejorar la claridad del contenido del documento; y a Andrs Pazmio por sus aportes en mejorar la estructura del documento, poniendo con mayor claridad y orden las ideas de los coautores y los resultados de sus investigaciones. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Baquero LE. 2003. Estructura y funcin de algunas vocalizaciones de Thamnomanes caesius (Thamnophilidae), lder de bandadas mixtas de sotobosque del bosque tropical en el Parque Nacional Yasun. Tesis de Licenciatura, PUCE. 100 pp. Baquero LE, Piedrahita P, Tobar M, Snchez P, Serrano A, Buitrn G, Iglesias A & de Vries TJ. 2003. Cantos de movimiento, forrajeo, alarma y cortejo de Thamnomanes caesius en bandadas mixtas de sotobosque en el Parque Nacional Yasun. Pp. 127128. En: Memorias. XXVII Jornadas Ecuatorianas de Biologa Pedro Nez Lucio. Sociedad Ecuatoriana de Biologa, Universidad Central del Ecuador, Quito. Blake JG. 2007. Neotropical forest bird communities: a comparison of species richness and composition at local and region scales. Condor, 109: 237255. Blake JG y Loiselle BA. 2008. Estimates of apparent survival rates for forest birds in eastern Ecuador. Biotropica, 40(4): 485 493. Blake JG y Loiselle BA. 2009. Species composition of neotropical understory bird communities: local versus regional perspectives based on capture data. Biotropica, 41(1): 8594. Buitrn G. 2005. Competencia interespecfica en aves de bandadas mixtas de sotobosque en el Parque Nacional Yasun, Amazonia ecuatoriana. Tesis de Licenciatura, PUCE. 167pp.
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Diego Cspedes y Violeta Rafael
Descripcin de una nueva especie del grupo Drosophila tripunctata (Diptera: Drosophilidae) en Cruz Loma, Pichincha, Ecuador
Laboratorio de Gentica Evolutiva, Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Apartado: 17-01-2184, Quito, Ecuador. diego_cesp@hotmail.com; vrafael@puce.edu.ec Recibido: 02, 07, 2012; aceptado: 22, 10, 2012
RESUMEN.- Se realiz un muestreo a lo largo de la Quebrada de Cruz Loma, un remanente de Bosque Andino ecuatoriano, situada entre los 3100 y los 4000 m de altitud. Se capturaron 718 individuos del gnero Drosophila, entre ellos a una nueva especie miembro del grupo de especies de Drosophila tripunctata: Drosophila condorhuachana sp. nov. Con esta nueva especie el nmero de especies del grupo de D. tripunctata registradas en el Ecuador asciende a 22. PALABRAS CLAVE: Bosque andino ecuatoriano, diversidad, Drosophila, Quebrada de Cruz Loma, taxonoma. ABSTRACT.- A sampling was conducted along the Cruz Loma gorge, a remnant Ecuadorian Andean forest located between 3100 to 4000 m near the Pichincha Volcano. A total of 718 individuals were captured in the Cruz Loma gorge. A new species of Drosophila was found and herein described: Drosophila condorhuachana sp. nov. With this new species, the number of species of the D. tripunctata group registered in Ecuador increased to 22. KEYWORDS: Andean forest, Cruz Loma gorge, diversity, Drosophila, taxonomy. INTRODUCCIN El grupo de especies de Drosophila tripunctata se encuentra ampliamente distribuido en la regin neotropical (Throckmorton, 1975). Este grupo es el segundo con el mayor nmero de especies despus del grupo Drosophila repleta (Bchli, 2008). Las especies del grupo Drosophila tripunctata se caracterizan por presentar mesonoto sin diseo, carina sin surco, ausencia de cerdas preescutelares y placa anal separada del arco genital (Frota-Pessoa, 1954). Se han realizado varias clasificaciones de este grupo, la primera fue hecha por Frota-Pessoa, 1954, quien lo subdividi en 4 subgrupos. Posteriormente, Throckmorton, 1975, ubic al grupo D. tripunctata dentro de la radiacin tripunctata junto con los grupos D. calloptera, D. cardini, D. guarani, entre otros, concluyendo que no se trata de un grupo monofiltico sino que se encuentra estrechamente relacionado con los otros grupos miembros de la radiacin tripunctata (Frota-Pessoa, 1954); lo cual ha sido confirmado por estudios moleculares (Mendes Hatadani et al., 2009; Yotoko et al., 2003). En el Ecuador, se han registrado 21 especies del grupo D. tripunctata. Los registros se han realizado principalmente en la provincia de Pichincha (Vela y Rafael, 2005; Vela y Rafael, 2001; Rafael et al., 2000) e Imbabura (Rafael, 2007); as como en la provincia de
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Loja donde se encontr D. bandeirantorum Dobzhansky & Pavan, 1943 (Rafael y Vela, 2003). En las islas Galpagos tambin se ha reportado a D. metzii Sturtevant, 1921 (Carson et al., 1983) miembro del grupo.
taxonmica se realiz mediante el anlisis de la genitalia externa e interna. Para obtener las estructuras de la genitalia tanto del macho como de la hembra se separaron los dos ltimos segmentos abdominales y se hirvieron durante 10 minutos en una solucin de KOH al 10 %; luego se realiz la diseccin. El epanMATERIALES Y MTODOS El rea de estudio se encuentra en el Bos- drio, hipandrio y falo del macho fueron coloque Protector Pichincha situado en el flanco cados en glicerol y observados al microscopio. oriental de la cordillera occidental de Los Los holotipos y paratipos fueron depositados Andes ecuatorianos y corresponde a la que- en el Museo de Zoologa seccin Invertebrabrada y loma situadas al norte del Telefrico dos de la Pontificia Universidad Catlica del de Quito y al occidente de la ciudad de Qui- Ecuador, Quito (QCAZI). to denominada Cruz Loma (783117.2W 01122S). El rea de colecta se encuentra RESULTADOS En la quebrada de Cruz Loma se colecentre los 3 100 y los 4 000 m de altitud. El clima que predomina en el rea es el ecua- taron un total de 713 individuos del gnero torial mesotrmico semi-hmedo, en el que Drosophila. Entre ellos se encontr una nueva se registran dos estaciones lluviosas marcadas especie de Drosophila que pertenece al grupo que oscilan entre febrero-mayo y octubre-no- Drosophila tripunctata viembre. La pluviosidad anual vara entre 500 Drosophila (Drosophila) condorhuachana sp. nov. (Figura 15) y 2 000 mm, la temperatura media entre 10 y Material examinado: ECUADOR, Pi20 C y la humedad relativa entre 65 y 85 % chincha: Quito, (Cruz Loma, 783117.2W (Ulloa Ulloa y Moeller Jorgensen, 1993). La recoleccin de individuos se realiz 01122S; 3 325 m) 1 , holotipo (disectadurante los meses de abril, julio, octubre del do, genitalia en microtubo), D. Cspedes det. 2008 y enero del 2009. Para el muestreo se IV. 2008, D. Cspedes col. (QCAZI 2305). utiliz trampas hechas con una botella plstica ECUADOR, Pichincha: Quito, (Cruz Loma, de 500 ml con agujeros en la parte superior y 783117.2W 01122S; 3 325 m) 10 , con una cubierta plstica para protegerla de la paratipos (disectado, genitalia en microtubo), lluvia. Como cebo se utiliz pltano fermenta- D. Cspedes det. IV. 2008, D. Cspedes col. do con una solucin de levadura al 10 %. Se (QCAZI 2294, 230614). colocaron un total de 78 trampas a lo largo de Descripcin del macho, holotipo y pala ladera distribuidas cada 75 metros de rango altitudinal y la colecta se realiz luego de 14 ratipos.- (Especmenes muertos y secos). y 21 das de haber colocado las trampas en el Morfologa externa: Longitud total (cuerpo + campo. Los individuos vivos fueron captura- alas) 4.3 mm. Cuerpo amarillo. Cabeza: Primer y segundo segmento de dos con un aspirador entomolgico y colocalas antenas color marrn claro; arista plumosa dos en tubos con medio de cultivo; mientras que, los muertos fueron retirados de las tram- con cinco ramas dorsales y tres ventrales. La pas y guardados en tubos con etanol al 70 %. placa orbital ligeramente ms oscura; cerda orLos individuos capturados vivos fueron bital media ms cerca a la cerda orbital anterior. separados por sexo. Los machos fueron utili- Tringulo ocelar y tringulo frontal de color zados para la identificacin taxonmica mien- marrn oscuro. Frontal vitta ligeramente ms tras que con las hembras se fundaron isolineas claro. Una cerda oral larga. Carina prominenpara obtener descendencia. La identificacin te ligeramente surcada de color marrn claro. Ojos de color rojo vinoso. Palpos amarillentos.
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Figura 15. Drosophila condorhuachana sp. nov. Holotipo : 1. Epandrio, 2. Hipandrio, 3. Falo vista ventral, 4. Falo vista lateral, 5. Falo vista dorsal.
Trax: Amarillo, ligeramente ms oscuro en la parte central del trax. Con ocho hileras de cerdas acrosticales entre las dorsocentrales anteriores. Escutelo ligeramente ms oscuro que el resto del trax. Escutelares anteriores divergentes. Cerda esternopleural media ligeramente ms pequea que la ante-
rior. Patas de color amarillo, ms claras que el resto del cuerpo. Alas oscurecidas, especialmente a lo largo de la vena costal y la vena transversal posterior. Longitud del ala 4 mm. ndices alares: c = 5.25; ac = 1.6; hb = 0.31; 4c = 0.42; 4v = 1.26; 5x = 0.92; M = 0.31; Prox x = 0.23.
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Vela D y Rafael V. 2005. Catorce nuevas es- Yotoko KSC, Medeiros HF, Solferini VN y pecies del gnero Drosophila (Diptera, Klaczko LB. 2003. A molecular study Drosophilidae) en el Bosque hmedo of the systematics of the Drosophila trimontano del Volcn Pasochoa, Pichincha, punctata group and the tripunctata radiaEcuador. Revista Ecuatoriana de Medicition. Molecular Phylogenetics and Evona y Ciencias Biolgicas, 27: 2741. lution, 28: 614619.
Cromosomas politnicos de Drosophila sp. nov. Especie primitiva del grupo de Drosophila repleta?
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Karina Betancourt
Laboratorio de Gentica Evolutiva, Escuela de Ciencias Biolgicas Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito. karybetancourt@yahoo.com Recibido: 03, 04, 2012; aceptado: 22, 09, 2012
RESUMEN.- El presente trabajo es un reporte de lo hallado en el anlisis de los cromosomas politnicos de Drosophila sp. nov. Se realiz placas citolgicas de las glndulas salivales de 18 larvas de tercer estado y se construy su mapa citolgico. En la secuencia cromosmica de esta especie se encontraron las seis inversiones correspondientes a la Primitiva I: Xa, Xb, Xc, 2a, 2b y 3b, localizadas en los cromosomas X, 2 y 3 respectivamente. Los cromosomas 4, 5 y 6 muestran una secuencia conservada similar a la hipottica Primitiva I. No se detect la presencia de alguna inversin paracntrica, a parte de las de la Primitiva I, en el patrn de bandeo de los cromosomas politnicos de la nueva especie. Los resultados de esta investigacin sugieren que Drosophila sp. nov. podra ser una especie primitiva del grupo repleta y probablemente haya dado origen a otras especies miembros de los subgrupos del grupo repleta. PALABRAS CLAVE: Cromosomas politnicos, Drosophila sp. nov., grupo repleta, inversiones paracntricas, Primitiva I. ABSTRACT.- This research is the result of polytene chromosome analysis in Drosophila sp. nov. Cytological plaques and maps were made from salivary glands of 18 third-stage larvae. Six inversions corresponding with Primitive I were found in this species chromosomic sequence: Xa, Xb, Xc, 2a, 2b and 3b, localized in chromosomes X, 2 and 3. Chromosomes 4, 5 and 6 show a conserved sequence similar to the hypothetic Primitive I. Besides Primitive I, there was no evidence for paracentric inversion in the banding pattern of polytene chromosomes of this species. These results suggest that Drosophila sp. nov. is a primitive species of the repleta group and may have given origin to other species within this group. KEYWORDS: Drosophila sp. nov., paracentric inversions, polytene chromosomes, Primitive I, repleta group. INTRODUCCIN Una de las radiaciones de drosophilideos ms grandes ocurridas en el Nuevo Mundo es la radiacin virilis-repleta cuya historia evolutiva se inici en los trpicos del Viejo Mundo; posteriormente el linaje ancestral de la radiacin virilis-repleta arrib a los trpicos del Nuevo Mundo (Throckmorton, 1982; Throckmorton, 1975). El grupo repleta proviene de al menos un linaje de la radiacin inicial ocurrida en los trpicos del Viejo Mundo, es probable que en el neotrpico el origen del grupo haya sido en lo que hoy se conoce como Mxico (Throckmorton, 1975). La mayora de especies del grupo repleta son formas desrticas y los cactus se convirtieron en su fuente principal de alimentacin
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Karina Betancourt
y refugio para su reproduccin, esto podra indicar que la diversificacin de las especies del grupo ocurri ampliamente junto a la aparicin de los desiertos en Amrica (Morn y Fontdevila, 2005; Wasserman, 1992; Wasserman, 1982a y b; Throckmorton, 1975). Adems es considerado uno de los grupos ms grandes dentro del gnero Drosophila ya que rene a casi un centenar de especies que estn distribuidas en seis subgrupos: mulleri, hydei, mercatorum, repleta, fasciola e inca (Mafla, 2005a; Ranz et al., 1997). Los parientes ms cercanos al grupo repleta incluyen a los grupos: aureata, cannalinea, castanea y dreyfusi, son especies de bosque, probablemente miembros primitivos del grupo, y conforman la seccin repleta. La radiacin repleta contiene adems al grupo mesophragmatica, estos junto con las especies de los grupos: melanica, peruviana, virilis y robusta forman la rama de la radiacin virilis-repleta (Wasserman, 1992; Wasserman, 1982 a y b; Throckmorton, 1982). Las especies de los grupos que conforman la seccin repleta citolgicamente estn relacionadas con los miembros del grupo repleta, a travs de una secuencia conocida como Primitiva I (Wasserman, 1992). La primitiva I es una especie hipottica que rene una secuencia que surgi a partir de los estudios citolgicos realizados por Wasserman, 1960 en varias especies de drosophilideos pertenecientes al grupo repleta. Dicha secuencia incluye seis inversiones: tres localizadas en el cromosoma X (Xa, Xb y Xc); dos en el cromosoma 2 (2a, 2b); y una en el cromosoma 3 (3b). La importancia de la Primitiva I es que dicha secuencia es considerada central en la evolucin citolgica del grupo repleta pues a partir de esta evolucionaron tres grandes lneas filticas. La primera llev a la evolucin de los subgrupos repleta y mercatorum, la segunda hacia el subgrupo hydei y la tercera al subgrupo mulleri (Wasserman, 1992). Una cuarta lnea filtica fue propuesta en el ao 2008, debido a los resultados obtenidos en el estudio
de los cromosomas politnicos de Drosophila huanvavilcae Rafael & Arcos, 1989, que sugeriran una conexin directa del subgrupo inca con la Primitiva I (Romero, 2008; Romero y Mafla, 2008). El subgrupo inca, creado en 1989 por la Doctora Violeta Rafael, est conformado por tres especies: Drosophila inca Dobzhansky & Pavan 1943, Drosophila huancavilcae y Drosophila yangana Rafael & Vela, 2003, estas dos ltimas son especies endmicas del Ecuador (Rafael y Vela, 2003; Rafael y Arcos, 1989). En el mapa cromosmico de D. huancavilcae se identific la inversin 2y5 en la regin central del cromosoma 2, que no est presente en ningn miembro de otro subgrupo del grupo repleta. Se encontraron, adems, las seis inversiones de la Primitiva I (Xabc, 2ab y 3b) (Romero, 2008). En los cromosomas politnicos de D. yangana se reportaron: 1) Las seis inversiones correspondientes a la Primitiva I (Xabc, 2ab y 3b), 2) Dos nuevas inversiones nominadas: Xl y 3l localizadas en la regin distal y central de los cromosomas X y 3 respectivamente, y 3) No se encontr la inversin 2y5 hallada en D. huancavilcae (Betancourt, 2010). Indicando que D. huancavilcae y D. yangana son dos especies emparentadas a travs de la Primitiva I (Betancourt, 2010; Romero, 2008; Romero y Mafla, 2008). El mapa cromosmico de D. inca no ha sido construido hasta el momento. El subgrupo hydei est dividido a su vez en dos complejos: complejo hydei que incluye a las especies: Drosophila eohydei Wasserman, 1962, Drosophila neohydei Wasserman, 1962 y Drosophila hydei Sturtevant, 1921 que incluyen en el patrn de bandeo de sus cromosomas politnicos a ms de la Primitiva I a la inversin 2z, y complejo bifurca: Drosophila bifurca Patterson & Wheeler, 1942, Drosophila nigrohydei Patterson & Wheeler, 1942 que poseen como secuencia estndar a la Primitiva I Wasserman, 1982a y cuyas especies no presentaban diferenciacin cromosmica.
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Sin embargo, un estudio realizado en el ao 2001 en los cromosomas politnicos de Drosophila novemaristata Dobzhansky & Pavan, 1943 y de Drosophila guayllabambae Rafael y Arcos, 1988, especie ecuatoriana, miembros del complejo bifurca, report la presencia de dos nuevas inversiones, localizadas en la Regin Central del cromosoma 2 nominadas: 2b10 y 2c10 aumentando el nmero de inversiones paracntricas en el acervo del grupo repleta (Morn, 2001), donde hasta el momento se han registrado 301 inversiones (Betancourt, 2010). Por el contrario, los grupos miembros de la radiacin virilis (melanica, peruviana, virilis y robusta), no presentan a la Primitiva I como su secuencia central pero han incorporado en su secuencia a una inversin terminal nombrada como 4e que tambin est presente en los grupos aureata, dreyfusi, cannalinea y mesophragmatica de la radiacin repleta, y no ha sido encontrada ni en los grupos castanea ni en repleta (Wasserman, 1992). Es difcil decir con certeza que secuencia es ancestral y cul es derivada (Primitiva I o 4e) pues las inversiones no permiten determinar la direccin de la evolucin pero si son determinantes fiables de las relaciones de parentesco ya que constituyen eventos de origen nico. Es decir: si dos poblaciones (o especies) tienen la misma inversin, estn ms cercanamente emparentadas entre s, que con otras poblaciones (o especies) que no posean dicha inversin (Gonzlez, 2002; Morn, 2001; Wasserman, 1992). Las investigaciones de diversidad drosophilidea que se llevan a cabo en el Ecuador permitieron en el ao 2011 encontrar una nueva especie de drosfila en la Provincia de Manab: Drosophila sp. nov. (comunicacin oral, Acurio, 2011). Estudios citolgicos preliminares de los cromosomas metafsicos de Drosophila sp. nov. Indican la presencia de 12 cromosomas (5 pares de barras y 1 par puntiforme) similar al cariotipo ancestral encontrado en las espe-
cies del grupo repleta. Sin embargo los datos obtenidos hasta el momento no son todava concluyentes porque se ha encontrado un nmero importante de placas citolgicas en las cuales se ha observado 10 y 8 cromosomas en el cariotipo de esta nueva especie (comunicacin oral, Mafla, 2012). Por otro lado, los primeros anlisis morfolgicos externos e internos de esta especie la vincularon con las especies del subgrupo inca, pero un examen posterior de la morfologa interna de Drosophila sp. nov. la relacion con el grupo peruensis (comunicacin oral, Acurio y Rafael, 2011). La dificultad de ubicar a Drosophila sp. nov. dentro de un grupo determinado y entender sus relaciones de parentesco hacen importante el anlisis y construccin del mapa cromosmico de los cromosomas politnicos de esta nueva especie, y pretende brindar un aporte importante en la comprensin de la misma. MATERIALES Y MTODOS El anlisis citolgico de los cromosomas politnicos se realiz a partir de una muestra de Drosophila sp.nov. que se logr criar en el laboratorio de Gentica Evolutiva de la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador (PUCE). Se realizaron placas citolgicas de las glndulas salivales de 18 larvas de tercer estado y para la preparacin de los cromosomas se aplic el protocolo de preparacin de cromosomas politnicos por aplastado squash, (Morn, 2001). La edicin de las fotografas tomadas en los meses de febrero, marzo y abril del 2012 y la construccin del mapa cromosmico de Drosophila sp. nov. se realiz con el programa Adobe Photo Shop (V.8.0) (Romero, 2008) Para nominar la secuencia cromosmica de Drosophila sp.nov. se utiliz la nomenclatura empleada por Wharton, 1942 en la secuencia estndar de Drosophila repleta. Cada cromosoma fue dividido en tres regiones de izquierda a derecha 1) Regin Distal,
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2) Regin Central y 3) Regin Proximal. Las regiones a su vez se dividieron en secciones, nominadas con letras maysculas; las seccin contiene subsecciones, numeradas del 1 al 7, el tamao de la subseccin es variable; y finalmente las bandas de cada subseccin fueron denominadas con letras minsculas en orden sucesivo (a,b,cetc.) (Morn, 2001). La posicin de las inversiones paracntricas se especific segn los puntos de rotura que indicaron: a) la seccin en donde ocurri el rearreglo, definida con letras maysculas, b) las subsecciones donde inici y termin el segmento invertido, mostrado con nmeros y c) las bandas, en ambos extremos, donde se cort la inversin, nombrndolas con letras minsculas (Morn, 2001). RESULTADOS Y DISCUSIN Los cromosomas politnicos de Drosophila sp. nov. presentaron seis brazos cromosmicos (X, 2, 3, 4, 5 y 6) unidos a travs de sus regiones heterocromticas formando un cuerpo irregular conocido como cromocentro (Gardner, 1971), que en esta especie fue difuso (Figura 1 aqu). Los telmeros de cinco, de los seis, cromosomas (X, 2, 3, 4 y 5) presentaron formas peculiares que facilitaron su identificacin y mostraron semejanza con los telmeros de la Primitiva I. El cromosoma X fue el ms fcil de reconocer debido a la forma de su telmero semejante a un clavel. El telmero del cromosoma 2 de Drosophila sp. nov. present una forma particular similar a un baln, mientras que el del cromosoma 3 se pareca a una copa ensanchada. La forma de jarrn del telmero del cromosoma 4 lo hizo muy fcil de distinguir y el cromosoma 5 resalt en casi todas las placas cromosmicas debido a la forma de copa alargada de su telmero. El cromosoma seis fue el ms pequeo y present mayor dificultad para encontrarlo pues al parecer se hallaba inmerso en el cromocentro. Se lo encontr nicamente en dos placas citolgicas.
Debido a que est constituido en su mayora por heterocromatina no politeniza, tiene una tasa muy baja de recombinacin y no presenta variabilidad gentica (Riddle y Elgin, 2006). En cuanto al mapa cromosmico de Drosophila sp. nov. se construy usando como estndar a la secuencia Primitiva I que tambin se utiliz para comparar el patrn de bandeo de cada uno de los cromosomas, se obtuvo los siguientes resultados: El cromosoma X se dividi en 8 secciones y 30 subsecciones; se encontraron las tres inversiones correspondientes a la Primitiva I: Xa con puntos de quiebre en: D4a- C4g, Xb: F2k- F1a y Xc: G2a- F3a (Wasserman, 1992). El cromosoma 2 abarc 8 secciones y 38 subsecciones. Present las inversiones 2a: B4e- A3a, y 2b: D1g- C6a de la Primitiva I (Wasserman, 1992). El cromosoma 3 de la nueva especie incluy 8 secciones y 36 subsecciones, se encontr la inversin 3b correspondiente a la Primitiva I (Wasserman, 1992) con puntos de quiebre: E1a- D3a. La subseccin 1b, de la seccin E, de este cromosoma result difcil de encontrarla extendida en las preparaciones citolgicas y siempre se la encontr replegada sobre si mismo lo que hizo imposible utilizar un segmento apropiado para formar parte del mapa citolgico construido. Los cromosomas 4 y 5 de Drosophila sp. nov. presentaron una secuencia conservada similar a la hipottica Primitiva I (Wasserman, 1992). El cromosoma 4 comprendi 8 secciones y 31 subsecciones; el cromosoma 5: 8 secciones y 32 subsecciones. El cromosoma 6 se dividi en dos secciones y tres subsecciones y exhibi una secuencia similar a la Primitiva I (Wasserman, 1992) Los resultados obtenidos en esta investigacin nos sugieren que Drosophila sp. nov. podra ser una especie primitiva del grupo repleta y probablemente se encuentre relacionada con los subgrupos: inca y/o hydei.
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Figura 1. Se observa un ncleo politnico con cinco de los seis brazos cromosmicos unidos al Cromocentro difuso (Cr.) de Drosophila sp. nov. Se distinguen en la foto los cromosomas 2, 3 y 5.
El nmero de seis brazos cromosmicos encontrado en las preparaciones citolgicas de los cromosomas politnicos de la especie Drosophila sp. nov son consistentes con un cariotipo ancestral que ha sido encontrado en otras especies del grupo repleta como: Drosophila inca, Drosophila huancavilcae y Drosophila yangana del subgrupo inca (Mafla, 2005b; Mafla, 2008) y en los miembros del subgrupo hydei (Wasserman, 1992). Adems, la ausencia de inversiones paracntricas extras, a parte de las seis inversiones de la Primitiva I, en el patrn de bandeo de los cromosomas politnicos de esta nueva especie sugiere la probabilidad de que esta sea aquella especie que Wasserman consider como hipottica y poseedora de la secuencia ancestral
conocida como Primitiva I con sus seis inversiones caractersticas: Xabc, 2ab y 3b, a partir de la cual podran haberse originado las cuatro lneas filticas propuestas por Wasserman, 1992 y Romero y Mafla, 2008. La relacin ms cercana que tendra Drosophila sp. nov. podra ser con el subgrupo hydei o con el subgrupo inca pues considerando que la fijacin de cada una de las inversiones en un linaje determinado requiere un periodo de tiempo bastante extenso, una por milln de aos (Ranz, 1997), los miembros de ambos subgrupos registran la menor tasa de fijacin de inversiones paracntricas comparadas con otras especies del resto de los subgrupos del grupo repleta (Wasserman, 1982a).
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Figura 2. Mapa Cromosmico de Drosophila sp. nov. Se observan los seis cromosomas (X, 2, 3, 4, 5, 6) y las seis inversiones (Xa, Xb, Xc, 2a, 2b y 3b). (C) Cromocentro. La seccin en puntos que se observa en el cromosoma 3 corresponde a la subseccin 3b que no ha sido visible en ninguna placa cromosmica.
Es as que en el subgrupo repleta se encuentran las inversiones 2i5, 2j5 y 2k5 (Primitiva IV), los miembros del subgrupo mercatorum tienen a la Primitiva V como secuencia ancestral con las inversiones 2-3F, 2det y 3df, las especies del linaje mulleri-fasciola tienen a la Primitiva VII como secuencia primordial con las inversiones 2o2, 2e3 y 2l3 (Wasserman, 1982a). Mientras que en el subgrupo inca encontramos las inversiones: 2y5 en D. huancavilcae (Romero, 2008; Romero y Mafla, 2008) y Xl y 3l en D. yangana (Betancourt, 2010) y en el subgrupo hydei las inversiones: 2b10 y 2c10 en el complejo bifurca y 2z para el complejo hydei (Wasserman, 1982a). Es probable tambin que Drosophila sp. nov. sea la especie basal a partir de la cual se bifurcaron los subgrupos hydei e inca y de esta manera tenga una conexin directa con los dos subgrupos. En cuanto a la inclusin, de Drosophila sp. nov. en el grupo peruensis debido a simi-
litudes encontradas en la genitalia del macho con miembros de dicho grupo, se puede decir que discrepa con el anlisis de los cromosomas politnicos realizados en esta especie. La especie Drosophila atalaia Vilela & Sene, 1982 que pertenece al grupo peruensis presenta en su cariotipo metafsico tres pares de cromosomas metacntricos (Vilela y Sene, 1982) que no coinciden con el nmero de cromosomas encontrado en Drosophila sp. nov. (seis pares), lamentablemente no se han realizado estudios a nivel de cromosomas politnicos en ninguna de las especies del grupo peruensis. Muller, 1940 y Sturtevant y Novitski, 1941 llegaron a la conclusin de que el cariotipo ancestral del gnero Drosophila deba estar formado por cinco cromosomas en forma de barra y uno puntiforme ya que es ms difcil la formacin de dos cromosomas a partir de uno, con la aparicin de un nuevo centrmero, que la fusin de dos cromosomas (Ranz et al., 1997).
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De esta manera entonces podramos decir que D. atalaia necesariamente tendra que ser una especie derivada de Drosophila sp. nov. pues debi haber ocurrido fusin cromosmica para que en la actualidad el cariotipos metafsico del de D. atalaia conste de tres pares de cromosomas. Las discordancias presentadas entre los estudios taxonmicos y citolgicos no son una novedad pues en el gnero Drosophila la mayora de grupos de especies se han establecido mediante la comparacin de las similaridades y diferencias morfolgicas observados en cada especie, sin embargo, el estudio de los cromosomas politnicos de las glndulas salivares de los dpteros en muchos de los casos ha reforzado dicha clasificacin morfolgica pero en otros el anlisis de dichos cromosomas a revelado relaciones de parentesco insospechadas a nivel morfolgico, tal es el caso de las especies D. nannoptera Wheeler MR, 1949, D. acanthoptera Wheeler MR, 1949 y D. pachea Patterson JT & Wheeler MR, 1942 (Ward y Heed, 2006). D. nannoptera y D. acanthoptera taxonmicamente eran lo suficientemente distintas como para ser clasificadas en dos diferentes subgneros, Sophophora y Sordophita respectivamente, posteriormente basados en estudios de la morfologa interna realizados por Throckmorton D. nannoptera fue transferida al subgnero Drosophila (Ward y Heed, 2006). D. pachea fue asignada al subgnero Drosophila y se la relacion con las especies del grupo repleta, pero Throckmorton encontr mayor similaridad con D. nannoptera (Ward y Heed, 2006). Sin embargo, al analizar los cromosomas politnicos de las tres especies las similitudes en el nmero de brazos cromosmicos, patrn de bandeo y en la forma de sus telmeros fueron evidentes. Estas tres especies que originalmente fueron asignadas a tres subgneros distintos difieren nicamente por cuatro inversiones fijadas. De esta manera las relaciones
de parentesco de estas especies siguen siendo inciertas pues necesitan ser re-examinadas morfolgicamente (Ward y Heed, 2006). Este es solo un ejemplo de la disparidad que ocurre entre los anlisis morfolgicos y cromosmicos del gnero Drosophila. Por otro lado, estudios moleculares llevados a cabo en Drosophila sp. nov. en Espaa han descartado la posibilidad de que esta especie pertenezca al grupo peruensis y ha llegado a la conclusin de que es una especie basal de la radiacin virilis-repleta (comunicacin verbal, Acurio, 2012). Hay que aclarar que la construccin del mapa cromosmico de Drosophila sp. nov. se llev a cabo con una muestra reducida de la especie pues al momento de realizar las placas citolgicas y tomar las fotografas de los ncleos politnicos de la especie, las cepas de la misma no se haban asentado todava en el laboratorio y no se contaba con una poblacin estable y suficiente con la cual trabajar, por lo que no se asegura que el ordenamiento gnico: Xabc, 2ab y 3b reportado en esta investigacin se cumpla para toda la poblacin y ser necesario aumentar la muestra poblacional y hacer ms estudios cromosmicos, ecolgicos y morfolgicos para establecer con mayor exactitud la relacin de parentesco de esta especie con los miembros de la radiacin virilis- repleta y el grupo peruensis. Este estudio constituye un aporte al conocimiento de esta nueva especie encontrada en el Ecuador ya que a pesar de haber trabajado con una muestra pequea, se logr construir un mapa de los cromosomas politnicos de Drosophila sp. nov a la vez que se pudo analizar su patrn de bandeo en busca de nuevas inversiones paracntricas. AGRADECIMIENTOS A la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador por la asignacin de fondos a travs del Proyecto: Cariologa Z de nuevas especies de drosfilas del Ecuador.
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Paolo Piedrahita, Andrs Iglesias, Marcelo Tobar, Galo Buitrn, Andrs Serrano, Luis Baquero, Mara Jos Erazo, Isabel Ojeda, Pablo Snchez y Tjitte de Vries
Lista anotada de la avifauna en una parcela de 100 ha y en los alrededores de la Estacin Cientfica Yasun, Parque Nacional Yasun, Ecuador
Paolo Piedrahita, Andrs Iglesias, Marcelo Tobar, Galo Buitrn, Andrs Serrano, Luis Baquero, Mara Jos Erazo, Isabel Ojeda, Pablo Snchez y Tjitte de Vries.
Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito, Ecuador Email: tdevries@puce.edu.ec Recibido: 23, 05, 2012 aceptado: 18, 10, 2012
RESUMEN.- Se registraron, hasta el momento, 420 especies de aves en los alrededores de la Estacin Cientfica Yasun de la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador en el Parque Nacional Yasun, Amazonia ecuatoriana. El listado presenta detalles con respecto al hbitat, ocurrencia y estrato del bosque. Un total de 358 especies han sido registradas en la parcela de avifauna de 100 ha. PALABRAS CLAVES: Amazonia, avifauna, lista de especies, Yasun. ABSTRACT.- A total of 420 species of birds have been registered around the Research Station Yasun, administrated by the Catholic University of Quito, located in the Yasuni National Park in the Ecuadorian Amazon region. The annotated list gives details on the habitat, status and type of forest. Three hundred and fifty eight species of birds have been recorded within the studied 100 ha plot. KEYWORDS: Amazon, avifauna, list of bird species, Yasun. INTRODUCCIN Sudamrica contiene la mayor cantidad de especies de aves de los cinco continentes, registrando ms de 3 500 especies, incluyendo algunas familias y grupos exclusivos de esta regin (Ridgely y Tudor, 1994; 1989). El Ecuador debido a su ubicacin geogrfica es el cuarto pas ms rico en especies de aves del mundo, con la mayor concentracin de especies (ms de 500) en la Amazonia (Ridgely y Greenfield, 2001). En esta regin pueden encontrarse tambin asociaciones multi-especficas complejas de aves, las bandadas mixtas de sotobosque y dosel, que han impresionado al ser humano desde sus primeras incursiones cientficas en esta regin (Wallace, 1972; 1889). Las bandadas mixtas de aves son un grupo conformado por ms de una especie, que se mantienen unidas por un determinado tiempo y espacio, y cuya organizacin est basada en el entendimiento de las seales entre sus miembros. El anlisis de las bandadas mixtas en una parcela de 100 ha formar parte de otra publicacin. Es necesario que exista un listado de las aves que habitan un rea determinada con la indicacin de hbitat, estrato del bosque, abundancia, registro (visual o auditivo) y/o participacin en bandadas mixtas, porque esa informacin servir como referencia, tanto para conocer como para futuras investigaciones relacionadas con la composicin de la avifauna en un rea determinada.
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Figura 1. rea de estudio de aves en los alrededores de la Estacin Cientfica Yasun resaltando la parcela de 100 ha. (Fuente: ECY). MATERIALES Y MTODOS El rea de estudio se encuentra dentro del Parque Nacional Yasun, cerca de la Estacin Cientfica Yasun de la PUCE en una parcela de 100 ha (en el km 8-9 en la va NPF-Pozo Tivacuno) y los alrededores de la Estacin. Se realizaron observaciones directas con binoculares (Nikon 8 x 32, Leica 10 x 42), dentro de la parcela de 100 ha con senderos internos de 100m x 100m, desde la torre de observacin de 30 m de altura, as como en caminatas aleatorias. Se capturaron aves del sotobosque en redes de neblina en los alrededores de la torre de observacin; mientras que los datos de las aves acuticas y rapaces fueron obtenidos mediante registros visuales oportunistas. Las aves acuticas fueron observadas en recorridos en canoa a lo largo del ro Tiputini, desde la Estacin hasta la bocana del ro Tivacuno, y en las lagunas cercanas a la Estacin. Tambin se realizaron registros en el sistema de senderos en los alrededores de la Estacin (Figura 1, con la localizacin de la parcela de 100 ha). RESULTADOS Hasta el momento hemos registrado un total de 420 especies de aves en el rea de estudio, de las cuales 342 (el 81.6 %) corresponden a especies propias del interior o del borde del bosque.
LISTA DE AVIFAUNA
English Name Hbitat Estrato del bosque Abundancia Registro Bandadas Mixtas Sotobosque Dosel Spp. en 100 ha.
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Familia/Especie
TINAMIDAE Tinamus major Tinamus guttatus A,B A,B A,B A,B A,B A,B A,B E E E R V U C Vi Vi Vi T T T T T C C C U R Vi Au Au Au Au T T U U Vi,Au Au
Great Tinamou White-throated Tinamou
x x x x x x x
Cinereous Tinamou Little Tinamou Undulated Tinamou Variegated Tinamou Bartlett's Tinamou
Neotropical Cormorant
Anhinga
Muscovy Duck
Cocoi Heron Great Egret Little Blue Heron Striated Heron Capped Heron Cattled Heron Tiger Heron Zigzag Heron E,A E,F E,F E,F V V,D V,D V,D
E E E E D,E D,E,F B,C,E B,E
D,SD,ST,T D,SD,ST,T D,SD,ST,T D,SD,ST,T D,SD,ST,T D,SD,ST,T ST ST
U U R U U U U R U U C R
Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Au Vi Vi Vi Vi
Crypturellus cinereus Crypturellus soui Crypturellus undulatus Crypturellus variegatus Crypturellus bartletti PHALACROCORACIDAE Phalacocorax brasilianus ANHINGIDAE Anhinga anhinga ANATIDAE Cairina moschata ARDEIDAE Ardea cocoi Ardea alba Egretta caerulea Butorides striatus Pilherodius pileatus Bubulcus ibis Tigrisoma lineatum Zebrilus undulatus THRESKIORNITHIDAE Mesembrinibis cayennensis CATHARTIDAE Sarcoramphus papa Coragyps atratus Cathartes aura
Green Ibis
x x x x
King Vulture Black Vulture Turkey Vulture
Cathartes melambrotus Yellow-Headed A D C Vi
Greater Vulture E,F A E,F A,E,F
ACCIPITRIDAE Pandion haliaetus Leptodon cayanensis Elanoides forficatus Rosthramus hamatus Harpagus bidentatus Ictinea plumbea Ictinia mississippiensis Accipiter superciolosus Accipiter poliogaster Geranospiza caerulescens Leucopternis schistacea Leucopternis melanops Leucopternis albicollis Buteogallus urubitinga Buteo magnirostris Buteo swainsoni Harpya harpyja Spizastur melanoleucus A,F A A,E,F A A,E A,D E D,F A,F B A A,B,E,F A,B A,F A,F D,E,F A,B A,B E A A,E D D SD SD SD SD SD D,SD D D,SD U R C U U R R R U R Vi Vi Vi Vi Vi Au Vi Au Vi Vi D SD V D SD V D D,SD D,SD D,SD SD D,SD,ST D,SD,ST SD SD D D,SD D M,U U C U U C Va R R U U R R U C R R R Vi Vi Vi Au Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Spizaetus tyrannus Spizaetus ornatus FALCONIDAE Daptrius ater Ibycter americanus Milvago chimachima Micrastur ruficollis Micrastur gilvicollis Micrastur mirandollei
Osprey Gray-headed Kite Swallow-tailed Kite Slender-billed Kite Double-toothed Kite Plumbeous Kite Mississippi Kite Tiny Hawk Gray-Bellied Hawk Crane Hawk Slate-colored Hawk Black-faced Hawk White Hawk Great Black Hawk Roadside Hawk Swainson's Hawk Harpy Eagle Black-and-white HawkEagle Black Hawk-Eagle Ornate Hawk-Eagle
Black Caracara Red-throated Caracara Yellow-headed Caracara Barred Forest-Falcon Lined Forest-Falcon Slaty-backed Forest-Falcon
Micrastur semitorquatus Micrastur buckleyi
Collared Forest-Falcon Buckley's Forest-Falcon
141
142
Laughing Falcon Bat Falcon A,E,F A,E,F A,E,F A,B A,B A,B B,E E E A,B E E B F A,B A,B A,B,F A, B,F A A,B A D,SD D,SD D,SD,ST ST,T ST,T ST,T ST,T T T,ST, D ----M,R M,C R C C U U C U U U T R U U Vi Vi Vi,Au Vi Vi Vi Vi Vi,Au Vi,Au Vi,Au Vi Vi.Au Vi Vi x x x x T U Au T U Vi,Au D,SD,ST SD D SD,T ST,T C R U R R Vi Vi Vi Vi Vi x x x x x x
A,F A
D D
U U
Vi Vi
x x
Speckled Chachalaca Spix's Guan Common Piping-Guan Nocturnal Curassow Salvin's Curassow
Marble Wood-Quail
Gray-necked Wood-Rail
Sungrebe
Sunbittern
Gray-winged Trumpeter
Solitary Sandpiper Spotted Sandpiper
Semipalmated Plover Southern Lapwing
Herpetotheres cachinans Falco rufigularis CRACIDAE Ortalis gutatta Penelope jacquacu Pipile cumanenses Nothocrax urumutum Mitu salvini ODONTOPHORIDAE Odonthophorus gujanensis RALLIDAE Aramidae cajanea HELIORNITHIDAE Heliornis fulica EURYPYGIDAE Eurypygia helias PSOPHIDAE Psophia crepitans SCOPOLACIDAE Tringa solitaria Actitis macularia CHARADRIDAE Charadrius semipalmatus Vanellus chilensis COLUMBIDAE Columba cayennensis Columba subvinacea Columba plumbea Claravis pretiosa Leptotila rufaxilla Geotrygon montana Geotrygon aspirina PSITTACIDAE x x x x x x x
Pale-vented Pigeon Ruddy Pigeon Plumbeous Pigeon Blue Ground-Dove Gray-fronted Dove Ruddy Quail-Dove Sapphire Quail-Dove
Ara ararauna Ara macao Ara chloroptera Ara severa Orthopsittaca manilata Aratinga leucophtalmus Aratinga weddellii Pyrrhura melanura Forpus sclateri Brotogeris cyanoptera Pionites melanocephala Pionopsitta barrabandi Pionus menstruus Amazona festiva Amazona ochrocephala A,E A,E A E,F C,E A A A,F A A A A A A A A A,B A,B,E,F A,B,E,F A,B,E,F F E A T D,SD D,SD D,SD ST ST,T U R U C C R D D U U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi x x x x x D D D D,SD D D SD SD D D D D D V D U U R U U C C C U C C U C Va,U U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi
Blue-and-yellow Macaw Scarlet Macaw Red-and-green Macaw Chestnut-fronted Macaw Red-bellied Macaw White-eyed Parakeet Dusky-headed Parakeet Maroon-tailed Parakeet Dusky-billed Parrotlet Cobalt-winged Parakeet Black-headed Parrot Orange-cheecked Parrot Blue-headed Parrot Festive Amazon Yellow-crowned Amazon
x x x x x x x x x x x x x x x
Amazona amazonica Amazona farinosa CUCULIDAE Piaya cayana Piaya melanogaster Piaya minuta Crotophaga major Crotophaga ani Ground-
Orange-winged Amazon Mealy Amazon
Squirrel Cuckoo Black-bellied Cuckoo Little Cuckoo Greater Ani Smooth-billed Ani
Neomorphus geoffroyi
Rufous-vented Cuckoo E
Hoatzin
ST
Vi
OPISTHOCOMIDAE Opisthocomus hoazin STRIGIDAE Otus choliba Otus watsonii Lophostrix cristata Pulsatrix perspicillata E,F A,B,E,F A,B,E,F E,F
Tropical Screech-Owl Tawny-bellied Screech-Owl Crested Owl Spectacled Owl
ST SD,ST D,SD SD
U C U U
Vi,Au Vi,Au Au Au
x x
143
144
Ferruginous Pygmy-Owl Black-banded Owl Mottled Owl A A A,E,F D,E,F D,E,F A,B,E A,B,C,D,E,F A,B,C,D,E,F A,B,C,D,E,F A,B,C,D,E,F A,C A A A,B A, B A,B A,B A,B A A A,D A A A A D,SD ST ST D D ST ST ST ST ST ST ST ST SD U C C C U R U U U U U R R U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi V V V V V C C U U C Vi Vi Vi Vi Vi V T ST,T M,U C R Vi Vi Vi D D D,SD U R C Vi ,Au Au Vi ,Au x x
E,F A,F B
ST SD,ST ST
U U R
Au Au Au
x x
Great Potoo Long-tailed Potoo Common Potoo
Common Nighthawk Parauque Ocellated Poorwill
x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Glaucidium brasilianum Strix huhula Strix virgata NYCTIBIDAE Nyctibius grandis Nyctibius aethereus Nyctibius griseus CAPRIMULGIDAE Chordeiles minor Nyctidromus albicollis Nyctiphrynus ocellatus APODIDAE Streptoprocne zonaris Chaetura brachyura Chaetura cinereiventris Panyptila cayennensis Tachornis squamata TROCHILIDAE Glaucis hirsuta Threnetes leucurus Phaetornis malaris Phaetornis hispidus Phaetornis bourcieri Phaetornis ruber Phaethornis atrimentallis Eutoxeres condamini Campylopterus largipennis
White-collared Swift Short-tailed Swift Gray-rumped Swift Lesser Swallow-tailed Swift Neotropical Palm-Swift
Rufous-breasted Hermit Pale-tailed Barbthroat Great-bellied Hermit White-Bearded Hermit Straight-billed Hermit Reddish Hermit Black-throated Hermit Buff-tailed Sicklebill Gray-breasted Sabrewing
Florisuga mellivora Thalurania furcata
White-necked Jacobin Fork-tailed Woodnymph
Heliodoxa aurescens Topaza pyra Heliothryx aurita
Gould's Jewelfront Fiery Topaz Black-eared Fairy
Heliomaster longirostris Eupetomena cf. Macroura F A x A,B A,B,E,F A,B,E,F A,B,E,F A,B A,B,E,F A,B,E,F Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi C U C R U ST SD,ST ST U R U Vi Vi Vi, Au Vi Vi Vi Vi Vi x x x x U U U E E E B,E B,E A A A E A A A A A A,F A ST SD ST,D,SD D,SD SD,ST SD,ST,T SD,ST SD,ST ST U ST ST ST ST C U U U SD SD,ST SD,ST SD,ST SD,ST SD,ST SD,ST R U U U U U U x x x x x x D,SD D U n. r. para el EC Vi Vi
Long-billed Starthroat Swallow-Tailed Hummingbird
x x
TROGONIDAE Pharomachrus pavoninus Trogon melanurus Trogon viridis Trogon collaris Trogon rufus Trogon curucui Trogon violaceus ALCEDINIDAE Megaceryle torquata Chloroceryle amazona Chloroceryle americana Chloroceryle inda
Pavonine Quetzal Black-tailed Trogon White-tailed Trogon Collared Trogon Black-throated Trogon Blue-crowned Trogon Violaceous Trogon
Chloroceryle aenea
Ringed Kingfisher Amazon Kingfisher Green Kingfisher Green-and-rufous Kingfisher American Pygmy Kingfisher
Broad-billed Motmot Rufous Motmot Blue-crowned Motmot
MOMOTIDAE Electron platyrhynchus Baryphthengus martii Momotus momota GALBULIDAE Galbalcyrhynchus leucotis Galbula albirostris Galbula chalcothorax Galbula dea Jacamerops aureus BUCCONIDAE Notharchus macrorynchos Notharchus tectus Bucco macrodactylus
White-eared Jacamar Yellow-billed Jacamar Purplish Jacamar Paradise Jacamar Great Jacamar
x x x x x x x
White-necked Puffbird Pied Puffbird Chestnut-capped Puffbird
145
146
Spotted Puffbird Collared Puffbird White-chested Puffbird Brown Nunlet Black-fronted Nunbird White-fronted Nunbird Yellow-billed Nunbird Swallow-wing Puffbird A A,E,F A,D,E,F A,E,F A,E,F A,E,F A A,E,F A,D,E,F A A A,B A A A A A A,F A,E,F ST D D,SD D,SD D,SD D D,SD ST D D,SD,ST D,SD D,SD,ST C C R U R R R U U U U C SD SD SD SD C C U U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi D,SD D,SD D,ST C C U Au Vi,Au Vi,Au x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
A A A A A,E,F A,E,F A,E,F A,E,F
D ST ST ST SD,ST D,SD,ST SD D,SD
R R U R C U U C
Vi,Au Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi
x x x x x x x x
Bucco tamatia Bucco capensis Malacoptila fusca Nonnula brunnea Monasa nigrifrons Monasa morphoeus Monasa flavirostris Chelidopthera tenebrosa CAPITONIDAE Capito aurovirens Capito auratus Eubucco richardsoni RAMPHASTIDAE Pteroglossus pluricinctus Pteroglossus inscriptus Pteroglossus azara Selenidera reinwardtii
Scarlet-crowned Barbet Gilded Barbet Lemon-throated Barbet
Many-banded Araari Lettered Araari Ivory-billed Araari Golden-collared Toucanet
Ramphastus vitellinus Ramphastus tucanus PICIDAE Picumnus rufiventris Picumnus lafresnayi Piculus flavigula
Channel-billed Toucan White-throated Toucan
Piculus leucolaemus
Rufous-breasted Piculet Lafresnay's Piculet Yellow-throated Woodpecker White-throated Woodpecker
Piculus chrysochloros Celeus elegans Celeus grammicus
Golden-green Woodpecker Chestnut Woodpecker Scale-breasted Woodpecker
Celeus flavus
Cream-colored Woodpecker
Dryocopus lineatus Melanerpes cruentatus
Lineated Woodpecker Yellow-tufted Woodpecker
Colaptes punctigula A A A A,E,F A,E,F F A A A A A A A A A A A A A A A A ST ST D,SD,ST ST,T ST ST ST ST ST ST U U U U U R U U U R D, SD U ST U Vi Vi, Au Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi D, SD C Vi, Au D,SD,ST U Vi ST SD,ST D,SD,ST C R U Vi Vi Vi D,SD R Vi x D D D,SD U U C Vi Vi Vi x x x SD,ST U Vi
Spot-breasted Woodpecker
Veniliornis passerinus Veniliornis affinis Campephilus melanoleucus
Campephilus rubricollis
Little Woodpecker Red-stained Woodpecker Crimson-crested Woodpecker Red-necked Woodpecker
FURNARIIDAE Synalaxis albigularis Cranioleuca gutturata Ancistrops strigilatus
Dark-Breasted Spinetail Speckled Spinetail Chesnut-winged Hoockbill
x x x x x x x x x x x x x x x
Hyloctistes subulatus
Eastern Woodhaunter
Philydor erythropterus
Philydor pyrrhodes
Philydor erythrocercus
Automolus infuscatus
Automolus ochrolaemus
Automolus rubiginosus Automolus rufipileatus
Automulus melanopezus
Xenops tenuirostris Xenops minutus Sclerurus caudacutus DENDROCOLAPTIDAE Dendrocincla fuliginosa
Chestnut-winged FoliageGleaner Cinnammon-rumped Foliage-gleaner Rufous-Rumped FoliageGleaner Olive-backed Foliagegleaner Buff-throated Foliagegleaner Ruddy Foliage-gleaner Chesnut-crowned Foliagegleaner Brown-rumped Foliagegleaner Slender-billed Xenops Plain Xenops Black-tailed Leaftosser
Plain-brown Woodcreeper
Deconychura longicauda
Long-tailed Woodcreeper
147
Glyphorynchus spirurus A,B A A,B A A A A,B A,B A,B A A A A ST ST U U ST U Vi Vi Vi ST U Vi D,SD,ST D,SD,ST D,SD,ST U C U Vi Vi Vi ST C Vi SD,ST U Vi x x x x x x x x x SD,ST D,SD,ST D U U U Vi Vi Vi x x x SD,ST C Vi
Wedge-billed Woodcreeper
148
Sittasomus griseicapillus Nasica longirostris Dendrexetastes rufigula
Xiphocolaptes promeropirhynchus Xyphorhynchus picus
Olivaceus Woodcreeper Long-billed Woodcreeper Cinnamon-throated Woodcreeper Strong-billed Woodcreeper
Straight-billed Woodcreeper
Xiphorhynchus ocellatus Xiphorhynchus guttatus Xiphorhynchus chunchotambo Dendrocolaptes certhia
Ocellated Woodcreeper Buff-throated Woodcreeper Tschudi's Woodcreeper
Dendrocolaptes picumnus
Amazoonian BarredWoodcreeper Black-banded Woodcreeper
Lepidocolaptes albolineatus Campyloramphus trochilirostris THAMNOPHILIDAE Cymbilaimus lineatus Taraba major Frederickena unduligera Thamnophilus aethiops A A,F A B A A A A A A A A A D,SD D,SD D,SD ST ST ST ST ST ST SD,ST ST SD,ST ST U U R R C U R U R U C C R
Lineated Woodcreeper Red-billed Scythebill
Fasciated Antshrike Great Antshrike Undulated Antshrike White-shouldered Antshrike
Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi
x x x x x x x x x x x x x
Thamnophilus schistaceus Thamnophilus murinus Thamnophilus sp. Pygiptila stellaris Megastictus margaritatus Thamnomanes ardesiacus Thamnomanes caesius Myrmotherula brachyura Myrmotherula ignota
Plain-winged Antshrike Mouse-colored Antshrike (cf. T. amazonicus) Spot-winged Antshrike Pearly Antshrike Dusky-throated Antshrike Cinereous Antshrike Pygmy Antwren Griscom's Antwren
Myrmotherula obscura Myrmotherula multostriata A,B A A A A,B A,B A A A A A A A A ST ST ST ST ST ST ST ST ST ST D,SD D, SD U R U U U C U U U U U U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x R C U C U U U U U U C C U U U R R Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi x x x x x x x ST,SD,D ST U U Vi, Au Vi
x x
Myrmotherula hauxwelli Myrmotherula haematonota Myrmotherula fjelsaai Myrmotherula ornata Myrmotherula erythrura Myrmotherula axillaris Myrmotherula longipennis Myrmotherula sunensis Myrmotherula menetriesii Microrhopias quixensis Herpsilochmus dugandi Terenura humeralis A A A A A A A A A A A A A A A A A SD ST ST ST ST ST ST ST ST ST ST ST ST ST ST ST ST
Terenura spodioptila Cercomacra cinerascens Cercomacra serva Myrmoborus myotherinus Hypocnemis cantator Hypocnemis hypoxantha Hylophylax naevia Hylophylax poecilinota Dichrozona cincta Sclateria naevia Myrmeciza hyperythra Myrmeciza melanoceps Myrmeciza fortis Pithys albifrons Gymnopithys leucaspis Gymnopithys lunulata Rhegmatorhina melanosticta
Short-billed Antwren Amazonian StreakedAntwren Plain-throated Antwren Stipple-throated Antwren Yasuni Antwren Ornate Antwren Rufous-tailed Antwren White-flanked Antwren Long-winged Antwren Ro Suno Antwren Gray Antwren Dot-winged Antwren Dugand's Antwren Chestnut-shouldered Antwren Ash-winged Antwren Gray Antbird Black Antbird Black-faced Antbird Warbling Antbird Yellow-browed Antbird Spot-backed Antbird Scale-backed Antbird Banded Antbird Silvered Antbird Plumbeous Antbird White-shouldered Antbird Sooty Antbird White-plumed Antbird Bicolored Antbird Lunulated Antbird Hairy-crested Antbird
149
150
Black-Spotted Bare-Eye Reddish-winged Bare-eye A A A A A B A A A A A A A B B A A A A A,B A A ST D, SD D ST ST D ST ST D D ST U U U U U C U U U U U Vi D, SD C ST ST D, SD D,SD U U C C Vi Vi Vi, Au Vi Vi, Au Vi Vi Vi Vi Vi Vi, Au Vi Vi Vi ST U VI,Au ST,T U Vi ST,T ST,T ST,T ST,T U U C C Vi Vi Vi x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x
C A
ST ST
U R
Vi Vi
x x
Noble Antthrush Rufous-capped Antthrush Black-faced Antthrush Thrush-like Antpitta
Ash-throated Gnateater
Phlegopsis nigromaculata Phlegopsis erythroptera FORMICARIIDAE Chamaeza nobilis Formicarius colma Formicarius analis Myrmothera campanisoma CONOPOPHAGIDAE Conopophaga peruviana RHINOCRYPTIDAE Liosceles thoracicus TYRANNIDAE Zimmerius gracilipes Zimmerius chrysops Ornithion inerme Camptostoma obsoletum
Rusty-belted Tapaculo
Tyrannulus elatus
Slender-footed Tyrannulet Golden-faced Tyrannulet White-Lored Tyrannulet Southern BeardlessTyrannulet Yelow-Crowned Tyrannulet
Myopagis gaimardii Myopagis caniceps Mionectes oleaginea
Forest Elaenia Gray Elaenia Ochre-bellied Flycatcher
Lophotriccus vitiosus
Corythopis torquata Myiornis ecaudatus Hemitriccus zosterops Cnipodectes subbrunneus Poecilotriccus capitalis
Todirostrum chrysocrotaphum Rhynchocyclus olivaceus
Double-banded PygmyTyrant Ringed Antpipit Short-Tailed Pygmy-Tyrant White-eyed Tody-Tyrant Brownish Twistwing Black-and-white ToddyFlycatcher Yellow-browed TodyFlycatcher Olivaceous Flatbill
Tolmomyias assimilis Tolmomyias poliocephalus Tolmomyias viridiceps Terenotriccus erythrurus Myiobius atricaudus Myiobius barbatus A,F A A A F F x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x A A A D SD,ST D,SD U R C Vi Vi Vi x x x A A E A A A A,F A E,F D,E,D D,E,F A,D,E,F D,E D,E E,F A A,D A A,D,E,F A A A,F A D, SD D, SD ST,T D D SD D D, SD SD,ST ST ST D,ST ST ST ST D, SD D D D,ST SD,ST D D,SD SD U U C U U U U C U C C U C C U M U U C U U U U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi D, SD D,SD D, SD ST ST ST U U C U R U Vi Vi Vi, Au Vi Vi Vi
Zimmer's Flatbill Gray-crowned Flycatcher Yelow-Breasted Flycatcher Ruddy-tailed Flycatcher Black-tailed Flycatcher Sulphur-rumped Flycatcher
x x x x x x
Contopus virens Contopus cooperi Ochthornis littoralis Attila spadiceus Attila cinnamomeus Rhytipterna simplex Sirystes sibilator Myiarchus tuberculifer Myiarchus ferox Pitangus sulphuratus Philohydor lictor Megarynchus pitangua Myiozetetes similis Myiozetetes granadensis Myiodynastes maculatus Myiodynastes luteiventris Legatus leucophaius Tyrannopsis sulphurea Tyrannus melancholicus Pachyramphus marginatus Platypsaris minor Tityra cayana Tityra semifasciata COTINGIDAE Iodopleura isabellae Laniocera hypopyrrha Lipaugus vociferans
Eastern Wood Pewee Olive-Sided Flycatcher Drab Water-Tyrant Bright-rumped Attila Cinnamon Attila Grayish Mourner Sirystes Dusky-Capped Flycatcher Short-crested Flycatcher Great Kiskadee Lesser Kiskadee Boat-billed Flycatcher Social Flycatcher Gray-capped Flycatcher Streaked Flycatcher Sulphur-bellied Flycatcher Piratic Flycatcher Sulphury Flycatcher Tropical Kingbird Black-capped Becard Pink-throated Becard Black-tailed Tityra Masked Tityra
White-browed Purpletuft Cinereous Mourner Screaming Piha
151
Purple-throated Cotinga E,F A,E,F A A,S B A A A A A A A A A,B A A,E,F A A A A A A A C,F A,B A,B ST ST T D,SD D,SD D,SD D, SD ST D ST D,SD C M,C U C R R M,R M,U C U U ST ST ST D U U C U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi SD,ST ST ST ST ST ST U R C U U U Vi Vi Vi Vi Vi Vi x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x SD D,SD D D SD,ST U U U C R Vi Vi Vi Vi Vi x x x x
D,SD
Vi
152
Porphyrolaema porphyrolaema Cotinga maynana Cotinga cayana Gymnoderus foetidus Querula purpurata Phoenicircus nigricollis PIPRIDAE Pipra erythrocephala Dixiphia pipra Lepidothrix coronata Pipra filicauda Chiroxiphia pareola Manacus manacus
Plum-throated Cotinga Spangled Cotinga Bare-necked Fruitcrow Purple-throated Fruitcrow Black-necked Red-Cotinga
Golden-headed Manakin White-crowned Manakin Blue-crowned Manakin Wire-tailed Manakin Blue-backed Manakin White-bearded Manakin
Striped Manakin Green Manakin Dwarf Tyrant-Manakin Wing-barred Piprites
Machaeropterus regulus Chloropipo holochlora Tyranneutes stolzmanni Piprites chloris CORVIDAE Cyanocorax violaceus VIREONIDAE Vireo olivaceus Vireo flavoviridis Hylophilus hypoxanthus Hylophilus thoracicus Hylophilus ocraceiceps
Violaceous Jay
Red-eyed Vireo Yellow-Green Vireo Dusky-capped Greenlet Lemon-chested Greenlet Tawny-crowned Greenlet
TURDIDAE Catharus minimus Catharus ustulatus Turdus ignobilis Turdus lawrencii Turdus hauwxwelli
Gray-cheeked Thrush Swainson's Thrush Black-billed Thrush Lawrence's Thrush Hauwxwell's Thrush
Turdus albicollis HIRUNDINIDAE Progne chalybea Progne tapera Tachycineta albiventer Atticora fasciata Neochelidon tibialis Stelgidopteryxs ruficollis A C,F C,F C,F C,F C,F C,E V V V V V V U U C C R U Vi Vi Vi Vi Vi Vi ST U Vi
White-necked Thrush
Gray-breasted Martin Brown-chested Martin White-winged Swallow White-banded Swallow White-thighed Swallow Southern Rough-winged Swallow C,F A,E,F A,B B,C C A,B A,B A A,B B B A A A,F A A A A A D D D,SD,ST D,SD,ST D,SD D,SD D,SD D,SD ST ST ST U U U M,U M,U C U U C C C Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi ST SD,ST ST ST --ST ST ST,T C C U U C U C U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi x x x x x x x x x
Black-capped Donacobius Thrush-like Wren Coraya Wren Buff-breasted Wren House Wren White-breasted Wood-Wren Southern Nightingale-Wren Musician Wren
Tawny-faced Gnatwren Long-billed Gnatwren Tropical Gnatcatcher
TROGLODYTIDAE Donacobius atricapillus Campylorhynchus turdinus Thryothorus coraya Thryothorus leucotis Troglodytes aedon Henicorhina leucosticta Microcerculus marginatus Cyphorhinus aradus POLIOPTILIDAE Microbates cinereiventris Ramphocaenus melanurus Polioptila plumbea PARULIDAE Dendroica aestiva Dendroica striata THRAUPIDAE Euphonia xanthogaster
Yellow Warbler Blackpoll Warbler
x x x x x x x
Orange-bellied Euphonia
Euphonia minuta Euphonia laniirostris Euphonia rufiventris
White-vented Euphonia Thick-billed Euphonia Rufous-bellied Euphonia
Euphonia chrysopasta Cyanerpes caeruleus
White-lored Euphonia Purple Honeycreeper
153
154
Chlorophanes spiza Dacnis cayana Dacnis lineata Dacnis albiventris Dacnis flaviventer Tangara velia Tangara callophrys Tangara chilensis Tangara schrankii Tangara xanthogastra Tangara nigrocincta Tangara mexicana Tangara gyrola Tersinia viridis Thraupis episcopus Thraupis palmarum Ramphocelus carbo Ramphocelus nigrogularis Piranga rubra Piranga olivacea Habia rubica A A A A A A A A,F A,F A A A,F A A A,D,F A,F A,F A,F A A A x x x x U U U R U U U C A A D D,SD C U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi x x x x x x x D,SD D,SD D, SD D,SD SD A A A A A A A,B F D,SD,ST D,SD,ST D,SD D,SD D,SD D,SD D,SD D,SD D,SD D,SD D,SD D,SD,ST D,SD D,SD D,SD,ST D,SD D D,SD,ST D,SD D,SD,ST D,SD,ST D,SD D,SD,ST D,SD,ST C C C R U U U C C U U C U U U C C C U C U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi
Green Honeycreeper Blue Dacnis Black-faced Dacnis White-bellied Dacnis Yellow-bellied Dacnis Opal-rumped Tanager Opal-crowned Tanager Paradise Tanager Green-and-gold Tanager Yellow-bellied Tanager Masked Tanager Turquoise Tanger Bay-headed Tanager Swallow Tanager Blue-gray Tanager Palm Tanager Silver-beaked Tanager Masked-Crimson Tanager Summer Tanager Scarlet Tanager Red-crowned Ant-Tanager
x x x x x x x x x x x x x
Lanio fulvus Tachyphonus cristatus Tachyphonus surinamus
Fulvous Shrike-Tanager Flame-crested Tanager Fulvous-crested Tanager
Tachyphonus luctuosus Eucometis penicillata Hemithraupis guira Hemithraupis flavicollis Cissopis leveriana CARDINALIDAE Saltator maximus Saltator grossus
White-shouldered Tanager Gray-headed Tanager Guira Tanager Yellow-backed Tanager Magpie Tanager
Buff-throated Saltator Slate-colored Grosbeak
x x
Paroaria gularis Cyanocompsa cyanoides EMBERIZIDAE Volatinia jacarina Sporophila castaneiventris E A,B x C C C C C A A A,B,E,F A,B,E,F A,B,E,F A,F A,B,E,F A A F A,C,E A,E D D,SD D D D D D,SD,ST D,SD SD SD D SD,ST R U C U C R C R U R U U Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi Vi ST ST ST M,R U C Vi Vi Vi x x x x x x x x X x x ST ST U C Vi Vi SD,ST ST C U Vi Vi
Red-capped Cardinal Blue-backed Grosbeak
Blue-black Grassquit Chesnut-bellied Seedeater
Sporophila bouvronides Oryzoborus angolensis Ammodramus aurifrons ICTERIDAE Ocyalus latirostris Clypicterus oseryi Psarocolius decumanus Psarocolius viridis Psarocolius angustifrons Psarocolius yuracares Cacicus cela Cacicus haemorrhous Cacicus solitarius Lampropsar tanagrinus Icterus chrysocephalus Icterus croconotus
Lesson`s Seedeater Lesser Seed-Finch Yellow-browed Sparrow
Band-tailed Oropendola Casqued Oropendola Crested Oropendola Green Oropendola Russet-backed Oropendola Olive Oropendola Yellow-rumped Cacique Red-rumped Cacique Solitary Cacique Velvet-fronted Grackle Moriche Oriole Oranged-backed Troupial
TOTAL
54 Familias
420 Especies
137 spp.
119 spp.
358 spp.
155
Leyenda
Especies de bandadas mixtas de sotobosque comunes para ms de un estudio Especies de bandadas mixtas de sotobosque exclusivas para el estudio de Ojeda (2011) Especies de bandadas mixtas de sotobosque exclusivas para el estudio de Erazo (2010)
156
Hbitat:
Sotobosque (ST) Bosque Tierra Firme (A) Terrestre (T) Bosque Temporalmente Inundado Registro: (B) Bosque de Moretal (C) Visual (Vi) Auditivo (Au) Abund./Estado (Ridgely et al., 1998): Comn (C)
reas abiertas (D)
Especies de bandadas mixtas de sotobosque exclusivas para el estudio de Buitrn (2005) Especies de bandadas mixtas de sotobosque exclusivas para el estudio de Tobar (2006) Especies compartidas para bandadas mixtas de dosel y sotobosque
Margen de Bosque Ro/Laguna (E)
Margen de Bosque Carretera (F)
Estrato del Bosque: Poco Comn (U) Raro (R) Vagrante (Va) Migrante (M) 63 74 56 193
Especies de bandadas mixtas de dosel comunes para Piedrahita (2007) e Iglesias (2007) Especies de bandadas mixtas de dosel exclusivas para el estudio de Piedrahita (2007) Especies de bandadas mixtas de dosel exclusivas para el estudio de Iglesias (2007)
En Vuelo (V) Dosel (D) Subdosel (SD)
Spp. Compartidas por BMS y BMD Spp. Exclusivas BMS Spp. Exclusivas BMD Total spp. En bandadas mixtas
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Del total de especies registradas, 137 Munn CA. 1986. Birds that cry wolf. Natuforman parte de las bandadas mixtas de sore, 319:143145. tobosque y 119 participan en las bandadas Ojeda I. 2011. Composicin de bandadas mixmixtas de dosel, lo que da como resultado tas de sotobosque en 25 ha del Parque un total de 193 especies (45 %) participanNacional Yasun, Amazonia Ecuatoriana tes en bandadas mixtas, debido a que 63 de y la influencia del canto de Thamnomaestas especies fueron compartidas entre las nes ardesiacus (Thamnophilidae) en su bandadas de dosel y sotobosque. De las 420 cohesin. Tesis de Licenciatura, PUCE. especies encontradas en los alrededores de 110 pp. la ECY, 358 (84 %) fueron registradas den- Piedrahita P. 2007. Aspectos socioecolgicos tro de la parcela de 100 ha. de bandadas mixtas de dosel en el bosSe registraron 38 especies de aves acutique tropical del Parque Nacional Yasun, cas, la mayora de las cuales estn restringidas Ecuador. Tesis de Licenciatura, PUCE. a los hbitats de borde de ro y lagunas. 131 pp. Ridgely RS y Greenfield PS. 2001 The birds REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS of Ecuador. Volume 1. Cornell University Buitrn G. 2005. Competencia interespecfica Press, Ithaca, New York. en aves de bandadas mixtas de sotobos- Ridgely RS y Tudor G. 1989. The Birds of que en el Parque Nacional Yasun, AmaSouth America, Volume 1: the Oscine zonia ecuatoriana. Tesis de Licenciatura, Passerines. University of Texas Press, PUCE. 167. Pp. Austin. Erazo MJ. 2010. Estructura social y dinmica Ridgely RS y Tudor G. 1994. The birds of de bandadas mixtas de aves de sotobosSouth America. Volume 2. Univ. of Texas que en el Parque Nacional Yasun, AmaPress, Austin, Texas. zonia ecuatoriana. Tesis de Licenciatura, Tobar M. 2006. Movimiento, composicin y PUCE. 85 pp. territorio de bandadas mixtas de sotobosIglesias A. 2007. Efectos de varios factores que en el Parque Nacional Yasun, Ecuabiticos y abiticos en la composicin dor. Tesis de Licenciatura, PUCE. 122 pp. y utilizacin de territorios de bandadas Wallace AR. 1889. A narrative of travels in mixtas de dosel en una parcela de 50 ha the Amazon and Rio Negro (Dover, New en el Parque Nacional Yasun. Tesis de LiYork, reprint, 1972). cenciatura, PUCE. 156 pp. Munn CA. 1985. Permanent canopy and understory flocks in Amazonia: species composition and population density. Pp. 683712 in Neotropical Ornithology. Ornithological Monographs, no. 36 P. A. Buckley, M. S. Foster, E. S. Morton, R. S. Ridgely and F. G. Buckley (Eds.). American Ornithologists Union.
HOJAS DE VIDA
El Dr. Plutarco Naranjo Vargas
en la Alergologa e Inmunologa
Sergio F Barba A1, 2, 3
1
Sociedad Ecuatoriana de Alergologa, Inmunologa y Ciencias Afines; 2Universidad Central del Ecuador; 3 Centro mdico AXXIS, Quito. sergiobarbaecuador@yahoo.com Recibido: 11, 10, 2012; aprobado: 15, 10, 2012
La actividad del Dr. Plutarco Naranjo Vargas en el campo de la Medicina y la Alergologa tuvo una singularidad que es difcil encontrar en la mayora de los profesionales. El mdico, generalmente parte de la observacin clnica, hace un diagnstico provisional y apoyado en exmenes complementarios, llega al diagnstico definitivo; aplica la teraputica recomendada y cura en la mayora de veces. Algunos pocos mdicos, entre ellos Plutarco Naranjo, no se contentaban con diagnosticar, tratar y curar; sino que iban ms all, en bsqueda de las verdaderas causas de los padecimientos. Fue estrictamente alerglogo, cuando investigaba el origen etiolgico de la rinitis, del asma bronquial, de la dermatitis atpica, de la urticaria; pero ms tarde, una vez soslayada la etiologa del padecimiento, se preguntaba el por qu de ellas, de los mecanismos de su produccin, y as, se introdujo en la inmunologa y en los complejos mecanismos fisiopatognicos a nivel molecular. La evolucin cientfica del Dr. Naranjo se complement estupendamente cuando una gran parte de sus esfuerzos intelectuales los dedic a la farmacologa; y predominantemente, a la investigacin bsica de los mediadores qumicos, as como a los frmacos con aplicacin alergolgica. No cabe duda que Plutarco Naranjo fue uno de los primeros frmaco-alerglogos de Amrica. En su relacin a la Alergologa e Inmunologa, tengo a bien recordar algunos hitos de su prolfico paso, como: Miembro fundador de la Sociedad Latinoamericana de Alergia (1965) Presidente de la Sociedad Latinoamericana de Alergia (1967-1969). Miembro fundador y primer Presidente de la Sociedad Ecuatoriana de Alergia y Ciencias Afines (1969). Vicepresidente del Congreso Internacional de Alergia e Inmunologa (1972). Relator y Conferencista en varios Congresos Internacionales de Alergia e Inmunologa. Recibi Placa de Honor como ex presidente en el Congreso Latinoamericano de Alergia e Inmunologa, Mxico (1997). Presidente Vitalicio de la Sociedad Ecuatoriana de Alergia, Inmunologa y Ciencias Afines (1992). Public aproximadamente 108 artculos de la especialidad en algunas revistas cientficas del pas y del extranjero. Muchos de ellos son de investigacin epidemiolgica como calendarios polnicos de algunos lugares de la sierra ecuatoriana, otros, sobre investigacin farmacolgica pura, sobre los efectos antihistamnicos de algunas drogas, acerca de la alergia a los medicamentos; sobre la clnica inmunoalergolgica, sobre el tratamiento alergolgico.
Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas de la Casa de la Cultura Ecuatoriana
159
Su libro Timo, Inmunicin y Alergia, publicado en 1969, es uno de los primeros que sobre esta nueva ciencia (la Inmunologa) se escriben en idioma espaol, y en el cual se discuten los aspectos celulares de la inmunidad y se anticipan las relaciones de la inmunidad y la gentica. Con su fallecimiento, actualizado, con pleno conocimiento de la actual doctrina alergo-inmunolgica, pone fin a su enorme y multifactica produccin de cientfico, de mdico, de maestro y de amigo. La Patria ha perdido un hombre positivo que dej mucho ms de lo que necesit en su austera vida. Sus amigos deseamos paz en su tumba.
Breve perfil cientfico del Dr. Plutarco Naranjo Vargas

1
Universidad Central del Ecuador. oswaldobaez@hotmail.com Recibido: 11, 10, 2012; aprobado: 15, 10, 2012
Oswaldo Bez Tobar1
Plutarco Naranjo Vargas fue un hombre de ciencia y de cultura. Cultiv las ciencias naturales en sus diversas disciplinas; fue cientfico y humanista, acadmico, profesor universitario, escritor cientfico, periodista de opinin. Su formacin cientfica la inici con el Dr. Alfredo Paredes, eminente botnico, quien fue su maestro y mentor. Son destacables sus contribuciones a los estudios de la flora ecuatoriana y a la etnobotnica desde el Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Central donde se desempe como investigador y ms tarde como director. Dedic varias dcadas a la docencia universitaria en las ctedras de Farmacologa, Fisiologa, Alergologa, Etnomedicina, Tcnicas de Investigacin Cientfica, en la Universidad Central del Ecuador, Universidad del Valle de Colombia, Universidad Tcnica Equinoccial y ltimamente en la Universidad Andina Simn Bolvar. Anim la actividad cientfica en seis dcadas del siglo pasado y en la primera del presente, perodo en el que fue protagonista destacado y referente de la comunidad cientfica nacional. Fue motivador de iniciativas cientficas, desde muchos espacios, la ctedra, la academia, el foro cientfico y la Seccin de Ciencias Biolgicas de la Casa de la Cultura Ecuatoriana. Infatigable investigador y prolfico escritor cientfico, Plutarco Naranjo dej innumerables publicaciones: 40 libros como autor nico, 59 como coautor, 300 artculos cientficos en revistas de varios pases y en varios idiomas, adems de centenares de artculos periodsticos sobre temas de ciencia y sociedad. En su ltimo artculo dej expresada su vocacin por el periodismo cientfico: Ante la superabundancia de comentarios sobre poltica, divertimentos, deportes, crnica y similaresyo he deseado insistir en algo ms difcil, ms instructivo: en la ciencia. A esta entraable causa dedic 70 aos de su vida.
INSTRUCTIVO PARA AUTORES

REVISTA ECUATORIANA DE MEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS DE LA CASA DE LA CULTURA ECUATORIANA
La Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas (REMCB) circula anualmente y su objetivo es publicar las investigaciones cientficas originales en el campo de las ciencias biolgicas, biomdicas, biotecnolgicas, conservacin, manejo de recursos y ciencias de la vida en general. Los manuscritos podrn ser sometidos bajos las siguientes modalidades: Trabajos cientficos (3000 a 6000 palabras) reportan resultados originales producto de un procesos de investigacin cientfica, tanto terica o experimental, en las areas de interes para la REMCB. Los autores son responsables del uso de datos de terceros. Los trabajos cientficos constarn de las siguientes partes: ttulo, autor(es), afiliacin institucional, resumen, palabras clave, abstract, keywords, introduccin, materiales y mtodos, resultados, discusin, conclusiones (opcionales), agradecimientos y referencias bibliogrficas. Revisin de Trabajos Cientficos (4000 a 7000 palabras) de un tema cientfico especfico. Las revisiones tendrn un formato personalizado por sus autores, pero es obligatorio el uso de las siguientes secciones: ttulo, autor(es), afiliacin institucional, texto y referencias bibliogrficas. Notas cientficas (2000 a 4000 palabras) reportan resultados preliminares de procesos investigativos experimentales. Las notas cientficas constarn de las siguientes partes: ttulo, autor(es), afiliacin institucional, resumen, palabras clave, abstract, keywords, introduccin, materiales y mtodos, resultados y discusin (unido), agradecimientos y referencias bibliogrficas. Hojas de vida y Reseas Institucionales (hasta 1500 palabras) de un tema especfico relacionado a los objetivos de la revista. Los ensayos y comentarios tendrn un formato personalizado por sus autores, pero es obligatorio el uso de las siguientes secciones: ttulo, autor(es), afiliacin institucional, texto y referencias bibliogrficas. Formato del manuscrito 1. Los manuscritos deben ser presentados, en idioma espaol o ingls, en papel A4, en formato de columna normal, con los cuatro mrgenes de 2.5 cm, tipo de letra Times New Roman 12 puntos, doble espacio, justificado y pginas numeradas. 2. Ttulo en minsculas, con una extensin ideal de 18 palabras, negrita, centrado, 14 puntos. Ejemplo: Preferencia de estratos boscosos en la alimentacin de Turdus fuscater del Pasochoa 3. Autor o Autores: Nombre(s), Apellido(s), en negrita, centrado, 12 puntos. Ejemplo: Juan Eduardo Pueblo P1 y Estelita Estrella2 4. Afiliacin institucional: Institucin, ciudad, pas, correo electrnico del autor encargado de la correspondencia: Si los autores representan a diferentes instituciones indicar con un numeral, el texto en 10 puntos, centrado. Ejemplo: Centro de Investigaciones Cientficas del IASA, Facultad de Ciencias Agropecuarias, ESPE, Sangolqu, Ecuador. j_salazar@espe.edu.ec. 2 Departamento de Zoologa, Escuela de Biologa, Universidad Amaznica del Uruguay.
1
161
5. Para los nombres genricos y especficos usar itlicas y al ser descritos por primera vez en el texto, se debe incluir el nombre del/los autor/es de la descripcin original de la especie. Ejemplo: En este trabajo se reporta los resultados del anlisis de los cromosomas metafsicos de Drosophila chorlavi Cspedes & Rafael, 2012. 6. En los trabajos que as lo requieran es necesario presentar el listado del material examinado, con las coordenadas de las localidades muestreadas (dentro de lo posible), asimismo citar las instituciones depositarias de los especmenes. Ejemplo: Material examinado: Holotipo (disectado y guardado en microtubo), etiquetado D. quillu holotipo DVela det. 2003/Pasochoa, Pichincha, Ecuador DVela col., mar. 2001. Ocho paratipos (disectados y guardados en microtubos), etiquetados D. quillu paratipo DVela det. 2003/Pasochoa, Pichincha, Ecuador DVela col., abr. 2002. Holotipos y paratipos depositados en el QCAZ. 7. RESUMEN con una extensin mxima de 200 palabras. PALABRAS CLAVE: cinco palabras separadas por coma y en orden alfabtico. 8. ABSTRACT resumen en ingls, KEYWORDS: cinco palabras clave en ingls. 9. Los ttulos de las secciones van en maysculas, negrita, 12 puntos. Si se requiere un subttulo este va en el mismo prrafo con minsculas, negrita, separado del texto por punto y raya. 10. Representacin de numeracin y simbologa de datos.- Los decimales debern ser representados con punto como en el ejemplo, 0.007 1.005 y con un mximo de hasta 3 decimales. Los miles debern ser representados con un espacio entre los nmeros como en el ejemplo, 1 958; 32 485; 105 896. Las coordenadas debern ser representadas as, 783117.2 W 01122S. Para citar los grados de temperatura estos deben citarse de la siguiente manera, 32 C, 115 F. En el caso de existir un smbolo o abreviatura de unidad despus de un nmero este debe tener un espacio entre los dos mencionados como en el ejemplo, 32 %, 32 ml, 88 g. Las palabras compuestas deben separarse con guin medio como en el ejemplo, fsico-qumico, terico-prctico, cirujano-anestesista. Los rangos de nmeros arbigos deben ser separados con el tipo de smbolo Word en dash (). Ejemplo 1: Dyke FG, Broke RH y Shaw HG. 1986. Use of road track count as indices of mountain lions presence. Journal of wildlife Management, Bethesda, 50(1): 102109. Ejemplo 2: La especie se encuentra en el piso altitudinal tropical de 01 000 m 11. Las figuras (esquemas, diagramas, dibujos, grficos, fotografas y mapas), deben presentarse con el ttulo en la parte inferior, de un modo conciso y explicativo, en 10 puntos. Deben iniciar con la palabra Figura y el nmero arbigo correspondiente en negritas, por ejemplo, Figura 1. deben ser preparadas en formato JPG o TIFF, y presentarse en hoja aparte, adoptando el criterio de rigurosa economa de espacio, considerando, el rea til de un pgina A4. La posible ubicacin de las figuras deben sealarse en el texto del manuscrito con una cita en parntesis y resaltado amarillo. Ejemplo (Figura 1, aqu). Las figuras debern ser informativas, de alta calidad y resolucin para ser incorporadas en el texto. El comit editorial se reserva el derecho de ubicar las figuras, en funcin del espacio disponible, o solicitar a los autores hacer los cambios correspondientes para obtener una mejor resolucin de las mismas. 12. Las tablas deben presentarse con el ttulo en la parte superior, de un modo conciso y explicativo, en 10 puntos. Las tablas estarn construidas solo con lneas horizontales. Deben iniciar con la palabra Tabla y el nmero arbigo correspondiente en negritas,
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13.
14.
a)
b)
c) d)
por ejemplo Tabla 1. deben ser preparadas en formato XLS (EXCEL), y presentarse en hoja aparte, adoptando el criterio de rigurosa economa de espacio, considerando, el rea til de una pgina A4. La posible ubicacin de las tablas deben sealarse en el texto del manuscrito con una cita en parntesis y resaltado amarillo. Ejemplo (Tabla 1, aqu). El Comit Editorial se reserva el derecho de ubicarlas en funcin del espacio disponible, o solicitar a los autores hacer los cambios correspondientes para obtener una mejor resolucin de las mismas. CONCLUSIONES.- Es una parte opcional del texto, deben ser sintticas y consistentes con los resultados y la discusin; se deben separar con vietas de crculo, ejemplo: Las especies ecuatorianas D. chorlavi y D. rucux comparten el nmero cromosmico 2n = 10 con las especies que conforman el grupo de especies D. mesophragmatica. D. chorlavi y D. rucux difieren entre ellas en el tamao y morfologa del cromosoma 5; esta caracterstica se considera como indicio para posicionar a D. chorlavi en uno de los subgrupos que tienen el autosoma 5 puntiforme (D. gaucha o D. viracochi) y a D. rucux en el subgrupo D. mesophragmatica. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.- Las referencias sern citadas en orden alfabtico segn el apellido del primer autor, si existen varios artculos del mismo autor, estos sern citados en orden cronolgica del ms reciente al ms antiguo, con formato de Word de sangra especial francesa. Se prefieren citas bibliogrficas que provengan de artculos publicados (o en prensa) en revistas cientficas indizadas, libros especializados, tesis de doctorado, maestra o pre-grado. Se sugiere evitar el uso repetitivo de comunicaciones personales; estas no formarn parte de la bibliografa. Ejemplos de citaciones en referencias bibliiogrficas: Artculo de revista cientfica: Los nombres de las revistas debern ser escritos en su forma completa y con cursiva: Duchicela EJ. 2004. Diversidad funcional de las micorrizas arbusculares asociadas a Brosimun utile en condiciones naturales. Ciencia, 7(8): 6577. Dyke FG, Broke RH y Shaw HG. 1986. Use of road track count as indices of mountain lions presence. Journal of wildlife Management, Bethesda, 50(1): 102109. Staikou A y Lazaridou-Dimitriadou M. 1991. The life cycle, population dynamics, growth and secondary production of the snail Xeropicta arenosa Ziegler (Gasteropoda: Pulmonata) in northern Greece. Zoological Journal of Linnean Society, London, 101: 179188. Captulo de libro Eisenberg JF. 1979. Habitat, economy and society: some correlations, and hypotheses for the Neotropical primates. En: Bernsteind IS y OE Smiths (eds) Primates Ecology and Human Origins: Ecologycal influences on social organization,7: 215262. Granland STPM Press. New York y London. Tesis de grado Jimnez PJ. 1995. rea de vida y uso preferencial del hbitat de Cebus albifrons (Primates: Cebidae) en Cuyabeno, Amazona Ecuatoriana. Tesis de Licenciatura en Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador. Quito, Ecuador. Libros enteros Krebs CH. 1985. Ecologa: estudio de la distribucin y abundancia. Segunda edicin. Harla. Ciudad de Mxico. 340 pp.
163
e) Informacin proveniente de internet Ciertas pginas que tengan informacin cientfica relevante pueden citarse as: Di Fiore A. 2001. Proyecto Primates Ecuador. Pgina de Internet: www.nyu.edu/projects/difiore Consultada 13-enero-2012. 15. CITAS EN EL TEXTO. Use el siguiente formato para la citacin de literatura en el texto, la cual tiene que tener un orden cronolgico: (Salceda, 2011; Montenegro y del Pino, 2010; Barba et al., 2009). 16. ENCABEZADO (RUNNING HEAD). Para las versiones digitales, proporcionar una versin corta de ttulo con un mximo de 10 palabras. Ejemplo: Ttulo original del manuscrito: Palmeras aceiteras del Ecuador: Estado del arte en la investigacin de nuevos recursos oleaginosos provenientes del bosque tropical; ttulo corto o encabezado: Palmeras aceiteras del Ecuador.
El autor principal deber enviar el manuscrito original en versin electrnica va e-mail a la direccin revecuatorianamedycb@gmail.com o en la seccin de contacto en la pgina web www.puce.edu.ec/revistaciencia, bajo el formato Word 3000 o inferior, acompaado de una carta dirigida al Editor de la Revista, indicando la originalidad del trabajo y el aporte de la investigacin. Los manuscritos sern revisados por rbitros annimos asignados por el Editor, su aprobacin estar sujeta al contenido cientfico, respaldado por el parecer de los rbitros y/o del Comit Editorial. El Editor solicitar a los autores realizar los cambios y sugerencias pertinentes mediante la devolucin del documento electrnico (o del manuscrito), acompaando las sugerencias respectivas. Informacin sobre la revista e instructivo para publicacin, en el portal de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas (REMCB) http:// www.puce.edu.ec/revistaciencia/

Revista Ciencias Xxxiii 2012

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MEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS

Instructivo para autores 160

Natalia Senz Ponce, Michelle Arias Contreras y Eugenia M. del Pino

Natalia Senz Ponce, Michelle Arias Contreras y Eugenia M. del Pino

La placa del techo del gastrocele de Epipedobates tricolor (Anura: Dendrobatidae)

Natalia Senz Ponce, Michelle Arias Contreras y Eugenia M. del Pino

La placa del techo del gastrocele de Epipedobates tricolor (Anura: Dendrobatidae)

Tabla 1. Comparacin del desarrollo embrionario de E. tricolor con otras ranas

4 das 4 das 14 das

Natalia Senz Ponce, Michelle Arias Contreras y Eugenia M. del Pino

La placa del techo del gastrocele de Epipedobates tricolor (Anura: Dendrobatidae)

Natalia Senz Ponce, Michelle Arias Contreras y Eugenia M. del Pino

La placa del techo del gastrocele de Epipedobates tricolor (Anura: Dendrobatidae)

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

RGANO DE BIDDER IZQUIERDO

IMETRO MXIMO OOCTOS

B) RGANO DE BIDDER DERECHO

DIMETRO MXIMO OOCTOSD

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

Diana Vargas Hurtado y scar D. Prez

Ana Beatriz Mafla M.

Cariologa beta de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica

Cariologa beta de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica 39

Ana Beatriz Mafla M.

Tabla 1. Datos de coleccin de las especies analizadas

Especie Colector Localidad

Determinado Cdigo del por holotipo

Quito: Cruz Loma, D. rucux D. 0119S, D. Cspedes Cspedes 783125.1W, 3 325 m

Cariologa beta de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica 41

Ana Beatriz Mafla M.

Cariologa beta de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica 43

Tabla 2. Distribucin de la heterocromatina en valores porcentuales

rucux 2.00 2.78 2.83 2.41 6.66 11.16 27.84

Ana Beatriz Mafla M.

Cariologa beta de tres especies pertenecientes al grupo de especies Drosophila mesophragmatica 45

Recibido: 16, 03, 2012; aceptado: 05, 10, 2012

Tabla 1. Anlisis estadstico empleado para medir la degradacin de la carboximetilcelulosa.

Prueba de Kruskal-Wallis Grupo N

Mediana del promedio Z -0.02 0.72 0.62 -0.29 -1.03

Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador

Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador

Recibido: 27, 04, 2012; aceptado: 04, 10, 2012

Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador

Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador

Tabla 1. Datos de coleccin e identificacin molecular de los hongos estudiados.

Nmero de asccesin id/boot.b

% cobertura/ Max. 86/98/97 100/100/100 99/100 99/100/100 100/100 100/100 >99/100

>99/100/43 >99/100/43 >99/100/68

Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador

Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador

Tabla 2. Crecimiento de las colonias en MA y PDA: descripcin de la coloracin.

Cepa Especie Media (mm)

Desviacin tpica (mm)

Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador

Identificacin y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador

Media halos (mm)