Latin American Journal of Pharmacy (formerly Acta Farmacutica Bonaerense) Lat. Am. J. Pharm.

26 (2):270-4 (2007)

Comunicaciones breves Recibido el 3 de julio de 2006 Aceptado el 4 de noviembre de 2006

Actividad antiparasitaria de Gaillardia spp. (Asteraceae)

Maria A. ROSELLA 1, Amparo CASTILLO 2, Luz ROMERO 2, Etile D. SPEGAZZINI 1, Luis UREA 2, Jos GONZLEZ 2, Eduardo ORTEGA-BARRIA 2 & Silvia L. DEBENEDETTI 1 Ctedra de Farmacognosia-LABRAM, Departamento de Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, 47 y 115, 1900 La Plata, Argentina, 2 Instituto de Investigaciones Cientficas Avanzadas y Servicios de Alta Tecnologa (INDICASAT), Panam
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RESUMEN. Los extractos diclorometnico y metanlico de dos especies argentinas del gnero Gaillardia (Asteraceae): G. cabrerae Covas y G. megapotamica (Spreng.) Baker var. scabiosoides (Arn. ex DC.) Baker, fueron ensayados para determinar su actividad antiparasitaria in vitro frente a Plasmodium falciparum, Leishmania mexicana y Trypanosoma cruzi. El extracto metanlico de Gaillardia cabrerae fue activo frente a P. falciparum (IC50 = 37 g/ml) y T. cruzi (IC50 = 9,37 g/ml), mientras que el extracto diclorometnico de G. megapotamica var. scabiosioides present actividad frente a P. falciparum, T. cruzi, y L. mexicana (IC50 = 2 ; 3,37 y 34 g/ml respectivamente). El extracto metanlico de G. cabrerae fue fraccionado (A-F). Cuatro de las fracciones obtenidas exhibieron actividad frente a T. cruzi (IC50 9,58 - 30,55g/ml), mientras que slo dos fracciones fueron activas contra P. falciparum (IC50 17 y 18 g/ml). El screening fitoqumico de las fracciones activas revela la presencia de sesquiterpenlactonas, flavonoides glicosilados y sus agliconas como componentes mayoritarios. SUMMARY. Antiparasitic Activity of Gaillardia spp. (Asteraceae). Dichloromethane and methanol extracts from two argentine species of Gaillardia (Asteraceae): G. cabrerae Covas and G. megapotamica (Spreng.) Baker var. scabiosoides (Arn. ex DC.) Baker were assayed for their in vitro antiparasitic activity against Plasmodium falciparum, Leishmania mexicana and Trypanosoma cruzi. Methanolic extract of Gaillardia cabrerae was active against P. falciparum (IC50=37 g/ml) and T. cruzi (IC5 0= 9.37 g/ml) while dichloromethane extract of G. megapotamica var. scabiosioides showed activity against T. cruzi, P. falciparum and L. mexicana (IC50 = 2, 3.37 and 34 g/ml, respectively). The methanol extract of G. cabrerae was fractionated (A-F). Four fractions were active against T. cruzi. (IC50 = 9.58 - 30.55 g/ml) and only two fractions were active against P. falciparum (IC50 = 17 and 18 g/ml respectively). Phytochemical screening of the active fractions showed the presence of sesquiterpene lactones, aglycones and glycosilated flavonoids as main compounds.

INTRODUCCIN Segn estimaciones de la Organizacin Mundial de la Salud, 3.500 millones de personas sufren infecciones parasitarias y 450 millones, principalmente nios, manifiestan la enfermedad 1. Estas enfermedades afectan especialmente las reas ms pobres de Asia, Africa y Amrica Latina. Los parsitos son responsables de una amplia gama de enfermedades infecciosas tanto en seres humanos como en animales. Tres de estas parasitosis: malaria, leishmania y la enfermedad de Chagas, son especialmente importantes en Latinoamrica debido a su alta incidencia.

La malaria, causada por el Plasmodium falci parum, es probablemente una de las enfermedades parasitarias de mayor prevalencia que afecta a los seres humanos. Contina siendo uno de los grandes problemas de las regiones tropicales. Esta enfermedad es responsable de considerable mortalidad y morbilidad en Sudamrica, especialmente en Bolivia y actualmente en el norte de Argentina 2. En el mundo 2.100 millones de personas se encuentran en riesgo y existen 270-400 millones afectados por esta enfermedad 1. De acuerdo a la Organizacin Panamericana de la Salud, el 0,7% de la poblacin

PALABRAS CLAVE: Actividad antiparasitaria, Argentina, Chagas, Gaillardia cabrerae, G. megapotamica var. scabiosioides, Leishmaniasis, Malaria. KEY WORDS: Antipartasitic activity, Argentina, Chagas, Gaillardia cabrerae, G. megapotamica var. scabiosioi des, Leishmaniasis, Malaria.
* Autor a quien dirigir la correspondencia. E-mail: sdebenedetti@biol.unlp.edu.ar

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argentina est en riesgo de contraerla. Uno de los principales problemas en el control de la malaria es la prevalencia de cepas multirresistentes de P. falciparum. Bajo el trmino leishmaniasis se conoce una serie de enfermedades tropicales causadas por un protozoario flagelado perteneciente al gnero Leishmania spp., que es transmitido por la hembra de un insecto del gnero L u t z o m y a (mosca de la arena), de madre a hijo, o bien por transfusin. La leishmaniasis afecta principalmente a 88 pases en Centro y Sudamrica, Africa y Asia, con 350 millones de personas en riesgo y 12 millones de casos reportados 1. Existe bajo dos formas, segn la parte del cuerpo afectada: cutnea y visceral. La forma cutnea es la ms extendida, predominando en Amrica Central y del Sur. Los tratamientos clnicos actuales bsicamente se limitan al uso de isotionato de pentamidina o anfotericina B, los cuales pueden causar serios efectos secundarios 3. La enfermedad de Chagas es una parasitosis endmica en varias regiones de Amrica Latina (Argentina, Bolivia, Paraguay, Uruguay, Brasil, Chile), con un alto nivel de mortalidad (ca. 400.000 muertes por ao). En el mundo existen 120 millones de personas se encuentran en riesgo de contraerla y 17 millones sufren la enfermedad 1. Es causada por el Trypanosoma cruzi, un protozoario flagelado transmitido por las vinchucas (Triatoma infectans, T. sordida, T. dimi diata), o por transfusin 4. El T. cruzi tiene una muy baja sensibilidad a los agentes quimioterapeticos, como nitroimidazol o derivados nitrofuranlicos (benznidazol, nifurtimox) y muy frecuentemente estas drogas tienen efectos secundarios txicos en las dosis utilizadas en el tratamiento de la enfermedad. Por otra parte, debido a razones de mercadeo, las compaas farmacuticas tienen escaso inters en el desarrollo de nuevas drogas tripanocidas 5-7. Existe una imperiosa necesidad de desarrollar nuevas drogas destinadas a prevenir o combatir las enfermedades parasitarias, ya sea por los riesgos que conllevan, como a causa de la resistencia desarrollada por los parsitos a las drogas disponibles 8. Es bien conocido que las plantas medicinales son consideradas una fuente potencial de nuevas drogas antiparasitarias ms efectivas, menos txicas y de menor costo 9-11. En suma, la escasa disponibilidad de una quimioterapia eficaz para el tratamiento de las infecciones parasitarias, junto al alto costo del tratamiento, conspiran para lograr una efectiva

profilaxis en las reas endmicas. El incremento de la resistencia a las drogas convencionales hace que se necesiten nuevas drogas o bien combinaciones de nuevas drogas con drogas convencionales para el tratamiento de estas enfermedades y es el principal impulso para el descubrimiento de nuevas drogas. Adems, el creciente conocimiento del modo de accin de los extractos de plantas medicinales, junto con la disponibilidad de la secuencia total o parcial del genoma de los parsitos, facilita la bsqueda de nuevas drogas antiparasitarias 9. En el presente trabajo se evalan las actividades antiparasitarias de dos especies argentinas del gnero Gaillardia, las cuales fueron seleccionadas en base a sus antecedentes etnofarmacolgicos 10,11. El gnero Gaillardia (Asteraceae) es originario de Amrica, y est ampliamente distribuido en Estados Unidos y Mxico. Comprende ca. 58 especies, incluyendo variedades y formas. La especie sudamericana silvestre Gai llardia megapotamica var. scabiosioides es conocida con el nombre de choiqu-la wen y crece en Uruguay, Centro y Este de Argentina. G. cabrerae, conocida como margarita pampeana, margarita de la sierra o botn de oro, crece slo en el Parque Nacional Lihuel-Calel, en la provincia de La Pampa, Argentina 12,13. Las infusiones de las partes areas de ambas especies han sido utilizadas en la medicina tradicional como analgsicos, antispticos, en el tratamiento de afecciones de la piel, tales como problemas de alopecia y escabiosis (sarna), esta ltima causada por un pequeo parsito, Sarcop tes scabiei 14,15. Estudios fitoqumicos previos describen el aislamiento de la sesquiterpenlactona helenalina, el flavonoide nepetina 11 y la composicin del aceite esencial de G. cabrerae y G. megapotami ca var. scabiosioides, 16,17 y la identificacin de pseudoguayanlidos en esta ltima especie 18. En el presente trabajo se evalu la actividad antiparasitaria de los extractos diclorometnico y metanlico de G. cabrerae y G. megapotamica var. scabiosioides frente a Plasmodium falcipa rum, Leishmania mexicana y Trypanosoma cru zi, realizando el fraccionamiento bioguiado del extracto activo de G. cabrerae. MATERIALES Y MTODOS Material vegetal Las partes areas de ambas especies fueron recolectadas en Argentina, en sus hbitats naturales, durante la poca de floracin. Gaillardia cabrerae Covas. Recolectada por:

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Ing. Agr. Mario Frecentese en Lihuel Calel, La Pampa (Argentina), Nov. 1999 y Nov. 2002. Clasificado por la Dra. Etile D. Spegazzini. El ejemplar de herbario se encuentra depositado en el Museo de Botnica y Farmacognosia Carlos Spegazzini, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP (LPE 994). Gaillardia megapotamica (Spreng.) Baker var. scabiosoides (Arn. ex DC.) Baker. Recolectada por el Ing. Agr. Mario Frecentese en Lihuel Calel, La Pampa (Argentina), Nov. 2002. Clasificado por: Dra. Etile D. Spegazzini. El ejemplar de herbario est depositado en el Museo de Botnica y Farmacognosia Carlos Spegazzini, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP (LPE 995) Extractos y fracciones Las partes areas secas (150 g) de ambas especies fueron maceradas sucesivamente con diclorometano y metanol a temperatura ambiente durante 48 h. Los solventes fueron evaporados in vacuum, obtenindose extractos crudos de polaridad creciente. Los extractos crudos fueron evaluados in vitro frente a tripomastigotes de Trypanosoma cruzi (cepa Tulahuen C4), Plas modium falciparum cloroquina resistente (cepa W2 Indochina) y formas amastigotes de Leish mania mexicana (MOHM/B2/BELZ). El extracto metanlico de G. cabrerae fue fraccionado en columna de Sephadex LH20, utilizando MeOH como fase mvil. Las fracciones colectadas fueron reunidas segn su comportamiento cromatogrfico, para dar seis fracciones finales (A-F), que fueron ensayadas frente a T. cruzi (cepa Tulahuen C4). Bioensayos. Cultivo del parsito y ensayo de inhibicin. Plasmodium falciparum La actividad antimalrica fue evaluada midiendo la inhibicin del crecimiento de P. falci parum (W2 Indochina) mediante el ensayo microfluoromtrico basado en la tincin del DNA del parsito con el colorante PicoGreen 19. El ensayo se llev a cabo en placas de microtitulacin de 96 pozos, conteniendo 250 l del cultivo del parsito (Parasitemia 1%, Hematocrito 2%). Los extractos fueron ensayados por duplicado a tres concentraciones (50, 10 y 2 g/ml) en medio RPMI 1640 (Gibco-BRL Laboratories, Gaithersburg, MD) suplementado con 10% de suero humano tipo O+ inactivado por calentamiento (Valley Biomedical, Inc., Winchester, VA), 25 mM NaHCO3 , 2 mM glutamina, y 25 HEPES (Sigma, St. Louis, MO). El cultivo se

mantuvo en una suspensin de eritrocitos tipo O+ (hematocrito 2%). Los parsitos fueron mantenidos en una atmsfera conteniendo 5% CO2, 5% O2 y 90% N2 a 37 C durante 48 h. En la ltima hora de incubacin, los glbulos rojos infectados fueron lisados con una solucin conteniendo 2% de Tritn X, buffer TE 1X y 1% de PicoGreen diluido en agua estril. La seal de fluorescencia fue medida como unidades relativas de fluorescencia (URF), con un fluormetro (FLx 800; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT) a 485/20 nm de excitacin y 528/20 nm de emisin). La concentracin inhibitoria del 50% del crecimiento (IC50) fue calculada por regresin logartmica de los valores de URF, comparados con el control no tratado. Se consideraron activos aquellos extractos con valores de IC50 < 50 g/ml. Leishmania mexicana La actividad antileishmania de los extractos fue evaluada fue evaluada midiendo la inhibicin de la proliferacin del crecimiento de Leishmania mexicana (MOHM/B2/BELZ) mediante el ensayo microfluoromtrico basado en la tincin del DNA del parsito con el colorante PicoGreen 19. Las formas amastigotes (25 000) de L. mexi cana provenientes de un cultivo axnico fueron incubadas por triplicado en placas de 96 pozos, junto con tres concentraciones diferentes de los extractos a ensayar (300, 46 y 6 g/ml). Las condiciones de incubacin fueron de 32 C durante 72 h en atmsfera libre de CO2. En la ltima hora de incubacin, los parsitos fueron lisados con una solucin conteniendo 2% de Tritn X, buffer TE 1X y 1% de PicoGreen diluido en Buffer TE. La seal de fluorescencia fue medida como unidades relativas de fluorescencia (URF), con un fluormetro (FLx 800; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT) a 485/20 nm de excitacin y 528/20 nm de emisin). La concentracin inhibitoria del 50% del crecimiento (IC50) fue calculada por regresin logartmica de los valores de URF, comparados con el control no tratado. Se consideraron activos aquellos extractos con valores de IC 5 0 < 50 g/ml. Trypanosoma cruzi La inhibicin del desarrollo del parsito fue evaluada por el mtodo colorimtrico basado en la reduccin de la -galactosidasa resultante de la expresin del gen correspondiente del T. cru -

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Extracto

Plasmodium falciparum IC50 (g/ml) Q R

Trypanosoma cruzi IC50 (g/ml) Q R

Leishmania mexicana IC50 (g/ml) Q R

Gaillardia cabrerae Gaillardia cabrerae G. megapotamica var. scabiosioides G. megapotamica var. scabiosioides

DCM MeOH DCM MeOH

>50 37 2 >50

I A A I

3 3 3 3

>50 9,37 3,37 >50

I A A I

3 3 3 3

>52 >88 34 >74

I I A I

3 3 3 3

Tabla 1. Actividad antiparasitaria in vitro de extractos de Gaillardia spp. IC50: concentracin inhibitoria 50; Q:

calificacin, A: activo, I: inactivo; R: nmero de repeticiones.

zi (Tulahuen C4) 20-22. El ensayo se realiz sobre tripomastigotes, formas intracelulares del parsito que infectan las clulas renales del mono verde africano (clulas VERO). Estos tripomastigotes fueron incubados durante 120 h, a 37 C en atmsfera de aire con 5% de CO2, con tres diferentes concentraciones (50, 10 y 2 g/ml) de los extractos a ensayar. Los ensayos se hicieron por triplicado. La intensidad del color resultante del clivaje del rojo de clorofenol--D-galactsido (CPRG) por la -galactosidasa fue medida a 570 nm utilizando un lector de micro placas Benchmark Bio-Rad. La concentracin inhibitoria del 50% del crecimiento del parsito fue calculada por regresin logartmica de los valores de densidad ptica obtenidos, comparados con el control no tratado. Consideramos activos aquellos extractos con valores de IC50 < 50 g/ml. RESULTADOS El extracto metanlico de Gaillardia cabre rae result activo frente a P. falciparum (IC50 = 37 g/ml) y T. cruzi (IC50 = 9,37 g/ml), mien-

tras que el extracto diclorometnico de G. me gapotamica var. scabiosioides present actividad frente a P. falciparum, T. cruzi y L. mexicana (IC50 = 2; 3,37 y 34 g/ml respectivamente), (ver Tabla 1). El extracto metanlico de G. cabrerae fue fraccionado en columna de sephadex LH20 obtenindose seis fracciones (A-F). Cuatro de las fracciones obtenidas exhibieron actividad frente a T. cruzi (IC50= 9,58- 30,55 g/ml), mientras que slo dos fracciones fueron activas contra P. falciparum (IC50= 17 y 18 g/ml) (ver Tabla 2). El screening fitoqumico de las fracciones activas revela la presencia de sesquiterpenlactonas, flavonoides glicosilados y sus agliconas como componentes mayoritarios. DISCUSIN El extracto metanlico de Gaillardia cabre rae fue activo frente a P. falciparum y T. cruzi mientras que el extracto diclorometnico de G. megapotamica var. scabiosioides present actividad frente a T. cruzi, P. falciparum y L. mexica na (Tabla 1). Cuatro de las fracciones del extracto metan-

Fraccin

Plasmodium falciparum IC50 (g/ml) Q R IC50 (g/ml)

Tripanosoma cruzi Q R

A B C D E F

ND ND 17 >50 18 >50

A I A I

3 3 3 3 3 3

30,55 10,48 24,42 >50 9,58 >50

A A A I A I

3 3 3 3 3 3

Tabla 2. Actividad antiparasitaria in vitro de las fracciones del extracto metanlico de G. cabrerae. IC50: concen-

tracin inhibitoria 50; Q: calificacin, A: activo, I: inactivo R: nmero de repeticiones; ND: no determinado.

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lico de G. cabrerae (A, B, C, E) exhibieron actividad frente a T. cruzi con una IC50 de 30,55; 10;48; 24,42 y 9,58 g/ml respectivamente. Slo la fraccin E tiene una actividad similar a la del extracto entero, probablemente debido a la existencia de una sinergia entre los componentes del extracto. Slo dos fracciones (C, E) fueron activas contra P. falciparum con una IC50 de 17 y 18 g/ml respectivamente. Ambas fracciones resultaron con mayor actividad que el extracto original (ver Tabla 2). La actividad antileishmaniasis de las fracciones no fue determinada ya que el extracto metanlico crudo result inactivo. El screening fitoqumico de las fracciones activas revel la presencia de sesquiterpenlactonas, glicsidos de flavonoides y sus agliconas como componentes mayoritarios. El fraccionamiento del extracto diclorometnico de G. me gapotamica var. scabiosioides se encuentra en etapa de desarrollo.
Agradecimientos. CONICET (PIP 024199). Proyecto OEA. Subprograma X - CYTED.
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