Bioensaios de toxicidade gentica com Tradescantia

Separata preparada a partir de RODRIGUES, G. S.; MA, T. S.; PIMENTEL, D. & WEINSTEIN, L. H. 1996. Tradescantia bioassays as monitoring systems for environmental mutagenesis. A review. Critical Reviews in Plant Sciences. 16(4):325-359. RODRIGUES, G. S. Assessment of the Abatement of Pesticide Mutagenesis in Situ by a Corn/Soybean Integrated Pest Management Program. 1995. Tese (Ph.D.) - Cornell University. Ithaca, NY. 141 p. RODRIGUES, G. S.; PIMENTEL, D.; WEINSTEIN, L. H. In situ assessment of pesticide mutagenicity in an integrated pest management program I - Tradescantia micronucleus assay. Mutation Research. in press, 1998.

Geraldo Stachetti Rodrigues

Centro Nacional de Pesquisa de Monitoramento e Avaliao de Impacto Ambiental Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria - EMBRAPA

1. Tradescantia e o bioensaio do microncleo na clula me do plen.

Desde os primrdios dos estudos da atividade gentica de compostos qumicos e agentes fsicos, vrias espcies e clones do gnero Tradescantia tm sido utilizados como organismos experimentais, em virtude de uma srie de caractersticas genticas favorveis. Apresentando apenas seis pares de cromossomos grandes e facilmente observveis, clulas de quase todas as partes da planta, da ponta da raiz ao tubo polnico em desenvolvimento, fornecem material excelente para estudos citogenticos (Ma & Grant, 1982). Como consequncia do uso intenso de Tradescantia em estudos genticos, encontrou-se uma srie de caractersticas que permitem a deteco de agentes que afetam a estabilidade do genoma. Pelo menos quatro dessas caractersticas foram selecionadas como indicadores em bioensaios de avaliao de toxicidade gentica. Dois desses ensaios, o da mitose em ponta de raiz e o do tubo polnico, so ensaios de aberrao cromossmica nos quais se observa deformaes morfolgicas visveis nos cromossomos (Ma, 1982). Um terceiro, o ensaio da mutao para clula cor-de-rosa em plo estaminal (Trad-SHM) (Underbrink et al., 1973b) um teste de mutao mittica pontual que se baseia na expresso de um gene recessivo para cor da flor em plantas heterozigotas. O quarto ensaio um teste citogentico que se baseia na formao de microncleos (Trad-MCN) que resultam da quebra cromossmica nas clulas meiticas geradoras do plen (Ma, 1979b). Este ensaio foi aqui escolhido para uma anlise completa (in situ, de estratos de solo, e de formulaes comerciais) da genotoxicidade dos pesticidas aplicados em um programa de manejo integrado de pragas (MIP). A presente escolha deste sistema para esta anlise detalhada da toxicidade gentica de pesticidas se deveu no somente versatilidade e propriedade do ensaio para testes in situ em campo e in vivo em laboratrio, como tambm sua extraordinria sensibilidade (Ma et al., 1982). No presente texto examinam-se as caractersticas e fundamentos dos ensaios Trad-MCN e TradSHM e revisam-se os resultados at hoje obtidos com estes sistemas na avaliao de genotoxicantes ambientais. Adicionalmente, apresenta-se uma anlise dos experimentos conduzidos para a avaliao dos possveis efeitos que um programa de MIP poderia apresentar no sentido de abater a genotoxicidade de pesticidas visando diretamente um incremento na qualidade da agricultura atual.

1.1 Trad-MCN: Fundamentos e desenvolvimento do bioensaio

Estudos sobre o genoma de Tradescantia iniciaram-se com os trabalhos pioneiros de Sax & Edmonds (1933) sobre o gametfito masculino de T. reflexa Raf., quando foram descritas as vrias fases do desenvolvimento do micrsporo e a determinados os perodos e o ritmo dos eventos meiticos. Observaes importantes foram feitas sobre os efeitos de raios-X nos micrsporos dessa espcie (Sax & Edmonds, 1933). Primeiramente, determinou-se que cromossomos meiticos eram mais suscetveis a quebra (breakage) que cromossomos mitticos; e mais importante, cromossomos em diviso eram ao menos dez vezes mais susceptveis que aqueles em repouso. Em segundo lugar, quebras (breaks) no se distribuam aleatoriamente nos cromossomos. Loci posicionados proximamente aos centrmeros apresentavam maior probabilidade de sofrer ruptura sob efeito da radiao. Estas observaes levaram concluso de que a espiralao dos cromossomos durante a replicao, devido s tenses mecnicas envolvidas, influenciaria fortemente a suscetibilidade a eventos mutacionais. Estas inferncias seriam mais tarde confirmadas em um estudo dos efeitos da radiao gama gerada por 60Co em T. paludosa And. and Woods. (Sparrow & Singleton, 1953). Os conceitos de temporalidade e sensibilidade que emergiram desses estudos tornaram-se extremamente importantes na seleo de bioindicadores para mutagnese, uma vez que sincronia no desenvolvimento celular e preciso nos perodos de recuperao aps os tratamentos mostraram-se dois fatores decisivos para a performance dos bioensaios. A maior suscetibilidade dos cromossomos meiticos quando comparados com os mitticos foi mais tarde confirmada em um estudo da influncia da falta de oxignio na meiose em T. paludosa (Steinitz, 1944). Esta pesquisa representou a primeira tentativa de observao de microncleos nas clulas me do plen como indicadores diretos de fragmentao cromossmica. Uma taxa espontnea de 0,87% de clulas contendo microncleos foi definida para T. paludosa, aumentando para 8,0% em clulas expostas a anaerobiose nos estgios iniciais da prfase. O ritmo dos estgios da meiose foi ainda melhor caracterizado em um estudo da diferenciao das anteras de T. paludosa (Taylor, 1950). Aproximadamente 24 h se passaram para compleio do ciclo meitico, permitindo a definio do perodo de recuperao apropriado entre a exposio das inflorescncias

a agentes txicos, e sua fixao para anlise do nmero de microncleos, consequentemente da atividade genotxica. O crescente interesse nas capacidades radiomimticas (especialmente genotxicas) de substncias qumicas nos anos 50 sugeriram a utilizao de Tradescantia como um bioindicator. Um ensaio de mitose no tubo polnico foi primeiramente empregado em um estudo comparativo de agentes qumicos simples em T. paludosa (Smith & Lofty, 1954). xido de etileno (um agente mutagnico conhecido), queteno (um composto com resultados inconclusivos), e cloreto de metila (um agente alquilante de baixa potncia) foram comparados para induo de quebras em cromtides e eroso e contrao nos cromossomos. O ensaio do tubo polnico mostrou-se efetivo na deteco de genotoxicidade, os resultados revelando que os compostos mais ativos (xido de etileno e queteno) causavam mais numerosas e extensivas aberraes cromossmicas. A propcia seleo de compostos a serem testados nesta pesquisa permitiu a demonstrao da sensibilidade de Tradescantia, e sua capacidade para diferenciar precisamente efeitos comparativamente similares. Numa srie de artigos a respeito do papel de determinados nutrientes na meiose, a produo de microncleos nos micrsporos de T. paludosa foi tomada como indicativa de quebra cromossmica (Steffensen, 1953; Steffensen, 1954; Steffensen, 1955). Estudando os efeitos da deficincia em magnsio (Mg) na meiose, o autor notou uma maior sensibilidade dos micrsporos quando comparados com pontas radiculares, de acordo com as evidncias prvias de maior suscetibilidade de clulas meiticas que mitticas. Microncleos apareciam em maior nmero em plantas deficientes em Mg, clcio (Ca) e enxofre (S). Note-se que os dois primeiros nutrientes so responsveis pela ligao de macromolculas no ncleo, contribuindo para a estabilidade de protenas e DNA. Uma taxa espontnea de microncleos de 0,84% foi registrada, aumentando para 3,89% em plantas cultivadas com meio deficiente em Ca (Steffensen, 1955). Estes nmeros vm corroborar observaes prvias de produo de microncleos em T. paludosa (Steinitz, 1944). Mais de 30 anos aps a observao de microncleos para deteco de danos meiose feita por Steinitz, Ma e colaboradores (Ma et al., 1978) no Laboratrio Nacional Brookhaven desenvolveram o ensaio do microncleo-na-ttrade (Trad-MCN) para mutagnese. Empregando o clone hbrido 4430 (T. hisutiflora Bush x T. subacaulis Bush) eles compararam a reduo de microncleos nas clulas me do plen com

mutaes para clulas cor-de-rosa nos plos estaminais de Tradescantia expostas ao conhecido agente mutagnico 1,2-dibromoetano (DBE). J naquele tempo o ensaio da mutao em plos estaminais (Underbrink et al., 1973b) vinha sendo extensivamente empregado e era um teste reconhecido para mutagnese radiobiolgica e qumica. O ensaio do microncleo, contudo, exibiu uma eficincia aproximadamente 36 vezes maior. Esta sensibilidade extraordinria foi creditada muito menor especificidade do dano necessrio para produzir microncleos quando comparada mutao nos plos estaminais. De acordo, poderia assumir-se que numerosos loci em qualquer dos 12 cromossomos de Tradescantia estaria sujeitos a danos que resultariam em quebra dos cromossomos, e consequentemente em microncleos. Em contraste, somente um locus em um nico cromossomo poderia sofrer mutao para produo de clulas cor-de-rosa em plos estaminais (Ma et al., 1978). A enorme sensibilidade e simplicidade do ensaio Trad-MCN foi ainda demonstrada em experimentos nos quais baixas doses de raios-X eram comparadas com dois agentes mutagnicos conhecidos, EMS e azida sdica (NaN3) em ambas formas gasosa e lquida (Ma, 1979a). Uma dose de raios-X de apenas 20-rad induziu altas frequncias de microncleos (23 MCN/100 ttrades), enquanto apenas 1,8 MCN/100 clulas foram induzidos por 50-rad de raios-X em linfcitos humanos (Countryman and Heddle, 1976 cited in Ma, 1979a), ou 2,5 MCN/100 eritroblastos de camundongo em cultura de medula ssea expostas a 35-rad de raios-X (Janssen and Ramel, 1976 cited in Ma, 1979a). Enquanto ocorria 0,2% mutaes por rad no ensaio do plo estaminal (Trad-SHM), ocorria 1,6% MCN por rad no ensaio Trad-MCN. A relao entre dose e efeito no ensaio Trad-MCN com raios-X resultou num coeficiente de correlao de 0,99. Os resultados obtidos com os agentes qumicos confirmaram estes dados, tanto em relao a sensibilidade quanto em relao ao efeito pela dose (Ma, 1979a). Uma vantagem adicional do ensaio Trad-MCN o curto perodo de exposio necessrio para se completar um teste - apenas 6 hrs, seguidas de uma recuperao de 24 hrs para permitir que as clulas tratadas na prfase atinjam o estgio de ttrade, apropriado para contagem de microncleos. Esta periodicidade da meiose foi testada em um estudo da sensibilidade por estgios usando exposio a raios-X em T. paludosa (Ma et al., 1980). Grupos de talos contendo inflorescncias receberam uma dose singular de

35 rad de raios-X, aps o que inflorescncias eram removidas e fixadas em intervalos de 3 hrs por 48 hrs psirradiao. Um pico de sensibilidade ocorreu depois de 24 hrs, concordando com as observaes de Taylor (1950). Um segundo pico apareceu aps cerca de 39 hrs, sugerindo que ao incio da prfase I e/ou estgios pr-meiticos so tambm muito sensveis. O emprego do ensaio Trad-MCN para o monitoramento de agentes clastognicos ambientais foi primeiramente proposto aps estudos envolvendo agentes pr-mutagnicos (benzo--pireno) e localidades poludas (Ma, 1979b; Ma, 1981). Uma grande vantagem percebida nestes estudos era que nenhuma atividade enzimtica externa era necessria para ativar os agentes pr-mutagnicos, dado que o aparato enzimtico continuava totalmente funcional nos talos extrados das plantas e expostos nos tratamentos. Por outro lado, vrias limitaes do ensaio Trad-MCN tm sido apresentadas. O teste obviamente oferece apenas um ndice relativo de danos genticos. Translocaes, inverses e outros tipos de rearranjos nos cromossomos e cromtides no so revelados como microncleos, consequentemente passam sem serem detectados pelo ensaio. No possvel tambm extrapolar facilmente os resultados de frequncia de microncleos para carcinogenicidade, e os passos metablicos de agentes mutagnicos e promutagnicos podem ser bastante diferentes em Tradescantia e outros organismos (especialmente mamferos). Alm disso, a alta sensibilidade do sistema resulta em variaes considerveis na frequncia espontnea de microncleos em diferentes experimentos, requerendo um sempre cuidadoso controle das condies experimentais e a utilizao simultnea de amostras controle (Ma, 1981). Uma desvantagem adicional do teste Trad-MCN so os procedimentos laboriosos e demorados para contagem de microncleos nas ttrades (Ma, 1990). Para sanar esta limitao, facilitando e padronizando o processo de contagem, um sistema de anlise de imagens para microncleos foi desenvolvido (Ma et al., 1992b). O sistema computadorizado capaz de realizar contagens a uma velocidade 3,5 vezes maior que a contagem manual, e com uma congruncia de 90% nas frequncias observadas. Uma reviso relativamente recente do monitoramento in situ de agentes clastognicos no ambiente (Ma, 1990) revelou que at 1990 cerca de 300 testes haviam sido conduzidos com o ensaio Trad-MCN numa ampla variedade de situaes. Cerca de 50% desses testes apontaram genotoxicidade. Amostras de guas e

solos apresentaram resultados positivos em cerca de 60% das ocasies estudadas. Na prxima seo alguns desses resultados so apresentados e discutidos, de forma que os resultados dos experimentos a serem mais tarde apresentados possam ser colocados em perspectiva.

1.2 O ensaio Trad-MCN como um sistema de monitoramento para genotoxicidade no ambiente - uma reviso da literatura
1.2.1 Poluio do ar
Tradescantia foi exposta a vrios locais poludos no estado de Illinois (EUA) e a gases comumente encontrados em atmosferas poludas numa combinao de testes in situ no ambiente e in vivo em laboratrio (Ma et al., 1982). Ensaios in situ expondo as plantas por 2 a 6 hr em estacionamentos, reas industriais, fazendas e laboratrios apresentaram resultados positivos, especialmente quando emisses de agroqumicos estavam envolvidas. Plantas expostas em um escritrio, uma fazenda de criao animal e uma rea residencial no apresentaram aumentos na frequncia de microncleos. Quando fumigadas com os poluentes atmosfricos NO2, SO2, e O3, assim como cido hidrazico gasoso (HN3) e EMS, as plantas tambm indicaram clastognese, sugerindo serem estes gases os possveis agentes genotxicos da atmosfera (Ma et al., 1982). Como uma consequncia de sua versatilidade, Tradescantia foi proposta como um biomonitor para poluio de ambientes fechados, sendo que vrios estudos tm avaliado sua proficincia para os baixos nveis de contaminao que costumeiramente ocorrem em ambientes residenciais. Dentre os resultados positivos j encontrados nessas situaes citam-se diversos odorizantes comerciais, fumaa de tabaco, p-diclorobenzeno (bolas de naftalina) e outros inseticidas indicados para uso domstico, alm de gases de combusto de leo diesel (Ma & Harris, 1987a; Ma & Harris, 1987b). Um grupo relativamente incomum de poluentes atmosfricos estudados in situ para clastognese com o ensaio Trad-MCN foram as fumaas qumicas empregadas pelo exrcito norte americano. Estes experimentos envolveram outros ensaios incluindo aberraes cromossmicas e trocas de cromtides irms (SCE) em um roedor nativo (Schaeffer et al., 1987). As fumaas eram geradas a partir de diesel para tanques, fogoil, e hexacloroetano. Todos estes compostos induziram eventos genotxicos em ao menos uma das doses. Houve um alto grau de variabilidade (expressa como maiores desvios padro na produo de

microncleos) em todos os tratamentos realizados in situ em relao aos controles de laboratrio. Embora este efeito estatstico tenha sido discutido meramente como obscurecendo a relao dose-efeito dos resultados, isto pode ser mesmo indicativo de uma caracterstica inerente deste bioensaio. Isso se deve ao fato de os botes menores das inflorescncias jovens de Tradescantia estarem sempre encobertos sob botes maiores e folhas, o que pode resultar em sua proteo contra exposio direta, especialmente em experimentos com poluentes atmosfricos, um efeito antecipado por Ma (1979b). Em um estudo realizado no Mxico, avaliaram-se ao longo do ano os picos de frequncia de microncleos em Tradescantia expostas a uma rea pesadamente industrializada, uma rea residencial e uma rea de ocupao mista (Ruiz et al., 1992). Plantas expostas rea industrial sempre apresentavam mais microncleos que as plantas controle ao longo de todo o ano, enquanto plantas expostas rea residencial tendia a apresentar incrementos na frequncia de microncleos somente em meses especficos. O ensaio TradMCN permitiu a deteco de riscos de genotoxicidade causados por emisses de incineradores de lixo municipal (Ma et al., 1993b) e dos drenos de gases de aterros sanitrios (Ma et al., 1993a; Ma et al., 1996). Dos estudos acima mencionados pode-se concluir que o ensaio Trad-MCN adequado para a avaliao de contaminao atmosfrica, seja de reas pesadamente poludas, industriais ou urbanas, ou sob condies normais de ambientes residenciais. Condies atmosfricas como variaes na velocidade e direo dos ventos normalmente levam a variaes estatsticas relativamente altas nos dados. Um resumo dos resultados obtidos com Tradescantia na avaliao da poluio atmosfrica e agentes gasosos est disponvel na Tabela 1.

Tabela 1 - Resumo dos resultados de avaliaes de genotoxicidade no ambiente empregando o ensaio Trad-MCN de Tradescantia em atmosferas poludas e poluentes atmosfricos.

Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. Monitoramento In situ 4 - 6 hrs Poluio do ar

Agente

Resultado +/ Significncia - estatstica

Comentrios

Referncia

p < .01

EstacionamentoChicago (IL-EUA) Ar fresco vindo de lago. EstacionamentoDecatur (IL-EUA).

Ma et al., 1982

1-4.5 hrs

p < .01

Agente

Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. 2 - 6 hrs

Resultado +/ Significncia - estatstica + p < .01

Comentrios

Referncia

EstacionamentoPeoria (IL-EUA). Parada de nibus e caminhes. Parada de nibus e caminhes. Parada de nibus e caminhes. rea industrial, Granite City (IL-EUA). rea industrial, Granite City (IL-EUA). rea residencial, China. Indstria de pesticidas, China. Rodoviria, China. Fbrica de borracha, China. Escritrio, China. Herbrio tratado com bolas de naftalina, China. Fazenda de criao animal, Exausto de chiqueiro suno. Concentrao medida como hidrocarbonetos. Fumaas geradas por motor ligado. Concentrao medida como hidrocarbonetos. Fumaas geradas por motor ligado.

2 - 4 hrs

p < .01

2-3 hrs

p < .01

2.5-5 hrs

p < .01

3 mo

p < .01

3.5 hrs

p < .01

4.5 hrs 4 - 6 hrs

p < .01 p < .01

5 hrs 6 hrs 4 hrs 3 - 6 hrs

+ +

p < .01 p < .01 p < .01 p < .01

6 hrs

p < .01

Fumaa de diesel

23-70 min

.3-4.2 ppm

p < .01

23-70 min

6-13 ppm

p < .01

Gases em cmaras 6-24 hrs NO2

5.0 ppm

p < .01

Positivo apenas em longas exposies. Positivo apenas em longas exposies.

SO2

6-22 hrs

1.0 ppm

p < .01

Agente Tempo de exposiomax. O3

Dosagem Concentrao

Resultado +/ Significncia - estatstica

Comentrios

Referncia

5.5 hrs

5.0 ppm

p < .01

Exposies prolongadas no foram tentadas. Aplicao nica do gs, sem renovao. Idem ao anterior.

Ma, 1981

HN3

6 hrs

136-272 ppm

p < .01

EMS Benzo pireno 1,2-dibromo etano Distrito industrial Distrito residencial Distrito misto

6 hrs 6 hrs

1000 ppm .05-.10 mM

+ +

p < .01 p < .01

6 hrs 6-12 hrs

5 - 80 ppm

+ + p < .01

Coeficiente de correlao dose-efeito 0.99 Variabilidade sazonal, Mxico. Variabilidade sazonal, Mxico. Variabilidade sazonal, Mxico. Concentrao de gases dada em termos relativos. Todas as distncias produziram resultados positivos. Idem ao anterior.

Ma et al., 1979 Ruiz et al., 1992

6-12 hrs

p < .01

6-12 hrs

p < .01

Fumaas qumicas Fogoil 30 min

15 - 100 m da fonte da fumaa

p < 0.1

Schaeffer et al., 1987

Diesel para tanque Hexacloro etano Emisso de aterro sanitrio Incinerador municipal

30 min

15-100 m da fonte 15 - 100 m da fonte

p < 0.1

Ma et al., 1993

30 min 4 - 6 hrs

+ +

p < 0.1

Idem ao anterior. Respostas positivas em 5 de 13 experimentos. Gases queimados no dreno. Resultados positivos obtidos com atmosfera estagnada.

4 - 6 hrs

50 - 500 m da fonte

Ma et al., 1993

Poluentes de interiores Lavanderia a 15 hrs seco Casa Casa Fumaa de cachimbo 16 hrs 17 hrs 24 hrs

p < .05

Turno noturno

Ma and Harris, 1987

+ +

p < .05 p < .05 p < .05

Aps lavagem em carpete. Ar limpo. Escritrio.

Agente Tempo de exposiomax. Sala para fumantes Odorizantes Gs formaldeido

Dosagem Concentrao

Resultado +/ Significncia - estatstica

Comentrios

Referncia

10 hrs

p < .05

Escola pblica.

1-6 hrs 1-6 hrs

+ +

Vrias marcas. Relao dose-efeito positiva.

1.2.2 Poluio aqutica

Praticamente todo estudo que envolva a avaliao da presena de agentes mutagnicos em guas naturais deve incorporar um passo de concentrao dos possveis agentes txicos nas amostras a serem quimicamente analisadas. Isto ocorre devido intrnseca baixa mutagenicidade dos agentes mais frequentemente presentes nas guas, devido sua concentrao muito baixa, ou ambos. A necessidade de concentrao das amostras foi claramente demonstrada numa avaliao da probabilidade de se detectar um agente mutagnico em gua utilizando-se o teste de Ames (Johnston & Hopke, 1980). Neste estudo props-se uma varivel que ponderava a potncia mutagnica e a concentrao mdia de agentes mutagnicos orgnicos comumente encontrados em guas, e a quantidade do agente necessria para induzir uma duplicao no nmero de clulas mutantes no teste de Ames. Considerando-se que (a) geralmente apenas alquotas de 1 ml so aplicadas por placa de teste, b) compostos orgnicos tipicamente correm em guas em concentraes na faixa de g/L, e c) 95% dos agentes testados at o momento apresentavam uma dose de duplicao de pelo menos 1500 g, concluiu-se que uma amostra ambiental mdia que permitisse a deteco de contaminantes com uma confiana de 95% deveria conter 1500 L. Isto significa que um fator mdio de concentrao de seis ordens de magnitude seria necessrio para reduzir o volume de uma tal amostra para os testes. Deduziu-se que a exposio a agentes mutagnicos presentes em gua potvel que ocorre no decorrer da vida de uma pessoa pode ser aprecivel, mesmo que no seja possvel detectar estes agentes em amostras ambientais (Johnston & Hopke, 1980).

Talvez a qualidade mais importante do ensaio Trad-MCN, assim como de alguns outros bioensaios vegetais, sua capacidade de detectar baixssimos nveis de toxicidade gentica tanto em exposies de curto termo in situ, quanto em testes in vivo com amostras no concentradas. Isto foi demonstrado em um estudo de dois anos sobre a genotoxicidade das guas de um reservatrio para coleta de gua de abastecimento municipal, e da gua tratada proveniente desse reservatrio (Ma et al., 1985). Amostras de gua eram coletadas semanalmente e testadas para genotoxicidade e para presena de nutrientes e metais. Os resultados mais importantes desse estudo demonstraram uma recorrncia sazonal na expresso de picos de frequncia de microncleos que coincidia com perodos de intensa precipitao e carreamento de solo e gua dos campos de soja e milho ao redor do reservatrio. A produo de microncleos nas amostras de gua tratada seguia a tendncia observada para as amostras do reservatrio, mas os picos de frequncia eram menores. Em uma investigao complementar, os ensaios Trad-MCN foram conduzidos conjuntamente com o teste do microncleo em eritrcito de camundongo, e amostras adicionais de um poo raso e um de mdia profundidade existentes na mesma rea do reservatrio foram analisadas (Ma et al., 1987). Um padro similar de frequncia de microncleos seguindo-se a precipitao pesada ou derretimento de neve na bacia do lago foi detectado pelo ensaio Trad-MCN. Anlises das amostras de gua dos poos mostraram nveis detectveis de compostos orgnicos como cloreto de metileno, diclorebromoetano, tricloroetileno, a tetracloroetileno. Os testes com eritrcitos de camundongo confirmaram os resultados, embora exposies por 6 meses s amostras tivessem sido necessrias, enquanto o ensaio Trad-MCN requisesse apenas exposies de 30 hr. Estes experimentos acima descritos de avaliao da genotoxicidade de guas no podem ser qualificados como in situ, j que em todos os casos as amostras eram trazidas ao laboratrio e ensaiadas sob condies controladas. Avaliaes propriamente in situ de mutagenicidade em ambientes aquticos somente tornou-se possvel com a introduo do aquatoon, um aparato flutuante desenvolvido especificamente para sustentar material vegetal para exposio a corpos de gua. O aquatoon foi empregado com sucesso em um estudo in situ da mutagenicidade dos efluentes de uma fbrica de papel e celulose na margem norte do Lago Superior, no Canad (Grant et al., 1992). Os ensaios do microncleo e do plo estaminal em Tradescantia, e o ensaio de aberrao cromossmica em ponta radicular em Vicia faba L. foram aplicados no crrego que recebia os efluentes brutos e na baa do lago na qual este crrego desaguava. O ensaio Trad-MCN e o ensaio

com V. faba apresentaram resultados positivos aps 24 hrs de exposio em ambos os locais, enquanto o ensaio Trad-SHM produziu resposta inconclusiva. Alm de serem mais sensveis, os dois ensaios que apresentaram melhores resultados melhor se adaptaram s condies de experimentao in situ. Isso se deve ao fato de o material desses ensaios poder ser fixado imediatamente aps a exposio, ao passo que o ensaio Trad-SHM requer longos perodos de recuperao em condies controladas antes da anlise, o que traz dificuldades em condies de campo e durante o transporte das amostras. Um estudo da genotoxicidade de efluentes industriais no Mxico demonstrou incremento na frequncia de microncleos no ensaio Trad-MCN mesmo aps diluio tripla dos efluentes (Ruiz et al., 1992). Da mesma maneira, as lixvias de um aterro sanitrio abandonado h 20 anos apresentavam genotoxicidade aps diluies de at 20 vezes, enquanto diluies menores que 10 vezes resultavam em efeitos txicos (Ma et al., 1993a). A genotoxicidade de guas subterrneas contaminadas com hidrocarbonetos policlorados (PAHs) tratadas em uma usina de purificao implantada com o objetivo de descontaminar um dos mais importantes aquferos da ustria, foi avaliada numa srie de experimentos com o ensaio Trad-MCN (Helma et al., 1993; Helma et al., 1994). Os mtodos de purificao consistiam de filtrao em carvo ativado e irradiao com luz ultra violeta (UV). Amostras coletadas antes de qualquer tratamento exibiam atividade clastognica e dependente da dose aps exposies por 24 hrs. Quando tratadas no laboratrio com quantidades crescentes de UV (at 1500 J/m2) estas amostras exibiam aumento na frequncia de microncleos de forma dosedependente em relao irradiao com UV, enquanto os resultados para o controle de gua limpa irradiada com UV eram negativos. Os parmetros qumicos medidos rotineiramente na usina de purificao indicavam que as amostras filtradas em carvo ativado apresentavam qualidade de gua potvel. Em muitos casos, contudo, maiores frequncias de microncleos foram registradas nessas amostras, tanto antes quanto aps irradiao com UV. O mecanismo responsvel por esses efeitos era provavelmente a ativao pela luz UV de poluentes da gua a compostos genotxicos. Tal concluso se baseia no fato de a clastogenicidade das amostras irradiadas decrescer com a estocagem das amostras, com uma meia-vida de aproximadamente 1 dia. Os autores sugeriram que tratamentos similares com UV para guas de abastecimento poderiam produzir

compostos perigosos que pudessem passar sem serem detectados nas estaes de tratamento (Helma et al., 1993; Helma et al., 1994). Estudos sobre poluio aqutica demonstram as aptides e vantagens do ensaio Trad-MCN para a avaliao in situ de agentes genotxicos no ambiente. A capacidade de detectar efeitos biolgicos em amostras consideradas puras em anlises qumicas e a possibilidade de se evitarem os tediosos procedimentos de concentrao de amostras, que podem resultar em perdas ou alterao nos compostos presentes, so caractersticas especialmente convenientes do mtodo. A Tabela 2 apresenta um resumo dos resultados obtidos com o ensaio Trad-MCN na avaliao de poluentes do ambiente aqutico.

Tabela 2 - Resumo dos resultados de avaliaes de genotoxicidade de poluentes no ambiente aqutico empregando o ensaio Trad-MCN de Tradescantia.

Agente Tempo de exposiomax. Poluio da gua gua de abastecimento pblico

Dosagem Concentrao

Resultado +/ Significncia - estatstica

Comentrios

Referncia

30 hrs

p < .05

Tanto gua do reservatrio quanto na torneira produziram picos de frequncia seguindo-se estao chuvosa. guas do reservatrio e de poos de mdia e pequena profundidades foram analisadas. A frequncia de microncleos aumentou em seguida estao chuvosa.

Ma et al., 1985

gua de abastecimento pblico

30 hrs

Ma et al., 1987

Exposio in situ no Lago Superior (Canad) guas residurias

24 hrs

p < .05

guas do Lago Superior do crrego afluente poludo por efluente de fbrica de papel e celulose. Efluentes industriais presentes. Respostas positivas ocorreram ao longo de todo o ano.

Grant et al., 1992

30 hrs

Diluio tripla

p < .01

Ruiz et al., 1992

Lixvia de aterro sanitrio

Diluio de 20 vezes

Ma et al., 1993

Agente

Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. guas 30 Diluio tripla subterrneas hrs

Resultado +/ Significncia - estatstica + p < .05

Comentrios

Referncia

guas subterrneas contaminadas com PAHs. Tratamento com luz UV aumentou a clastogenicidade.

Helma et al., 1993; Helma et al., 1994

1.2.3 Contaminantes e acondicionantes do solo

Vrios estudos tm avaliado a mutagenicidade de solos in situ, de extratos de solos de reas contaminadas, antes e depois da aplicao de medidas de remediao, e de materiais acondicionantes de solos propriamente ditos. Talvez o acondicionante edfico produzido em maiores volumes no mundo seja o lodo de esgoto municipal. Em geral o impacto desse material no ambiente se relaciona sua contaminao por metais pesados (L'Hermite & Dehandtschttler, 1980), mas compostos orgnicos complexos so muitas vezes introduzidos nos sistemas de tratamento de esgotos. A possvel mutagenicidade desses lodos foi avaliada em Chicago (EUA), utilizando dois bioensaios vegetais (plen ceroso em Z. mays e Trad-MCN) e duas linhagens de Salmonella no teste de Ames (Hopke et al., 1982). Os ensaios demonstraram que diluies qudruplas de lodo ainda eram capazes de aumentar a frequncia de microncleos em Tradescantia. Este resultado foi corroborado pelos outros testes, e sero discutidos em maiores detalhes na seo sobre ensaios com Z. mays. A clastogenicidade de vrios compostos qumicos comumente encontrados em depsitos de resduos perigosos foi estudada com o ensaio Trad-MCN, numa srie de experimentos cujo objetivo era elucidar as possveis interaes sinergsticas ou antagonsticas dos compostos quando ocorrendo em misturas (Sandhu et al., 1989). Inicialmente sete compostos selecionados da Lista de Compostos Prioritrios da Environmental Protection Agency (EPA) dos EUA (Waters et al., 1987) foram testados para determinar suas mnimas doses efetivas (MEDs). Cinco dos compostos testados produziram resultados positivos e foram listados em ordem decrescente de potncia no ensaio Trad-MCN como segue: tetracetato de chumbo em dimetilsulfxido (DMSO) (0,4 ppm), heptacloro em DMSO (2,0 ppm), dieldrim em DMSO (3,8 ppm), trixido de arsnico em NaOH (4,0 ppm), e 1,2-benz[a,h]antraceno em etanol (12,5 ppm). Tetracloro etileno (TCE) e aldrin foram

imiscveis em gua, impedindo exposio adequada em soluo. Quando expostos na forma gasosa a 30 ppm por 2 hrs, TCE apresentou resposta positiva, mas aldrin no. De posse desses resultados, Ma et al. (1992a) avaliaram a clastogenicidade dos compostos em misturas. Todas as misturas de TCE (um agente no clastognico) e dieldrin (em concentraes abaixo da MED) resultaram positivas, sugerindo uma interao sinergstica. Surpreendentemente todas as misturas de tetracetato de chumbo e trixido de arsnico (ambos potentes agentes clastognicos) foram negativas, sugerindo uma interao antagonstica. As outras combinaes eram em geral levemente antagonsticas, enquanto algumas misturas eram txicas, impedindo o desenvolvimento normal das ttrades. Essas complexas e frequentemente imprevisveis respostas induzidas por misturas de compostos qumicos levaram os autores a concluir que avaliaes in situ so necessrias quando vrios compostos interagem, como normalmente acontece em depsitos de resduos perigosos. Gill & Sandhu (1992) expandiram esses estudos testando os mesmos compostos aps incorporao no solo, o que permitiu o uso de Tradescantia intacta (inclusive razes), no apenas dos talos. A maioria dos resultados concordavam com os descritos acima, mas em alguns casos as interaes no solo alteraram a expresso da clastogenicidade. Por exemplo, trixido de arsnico e tetracetato de chumbo, embora no induzissem aumentos na frequncia de microncleos em soluo (como em Ma et al., 1992a), o fizeram no solo. Em geral plantas enraizadas produziram maiores frequncias de microncleos que apenas talos tratados em soluo. Possveis razes para esse efeito so aumento de eficincia na ativao metablica das misturas no sistema radicular das plantas ou por microrganismos do solo . Estes resultados demonstraram novamente que predizer as atividades genotxicas de misturas de compostos a partir da anlise de seus componentes pode ser uma falcia, enfatizando o valor das avaliaes in situ. A importncia dessas concluses foi acentuada pela demonstrao que cidos tnicos podem agir como sinergistas na induo de clastogenicidade em Tradescantia (Knasmuller et al., 1992). Exposio de Tradescantia por 24 hrs a quantidades crescentes de cidos tnicos causou um aumento dramtico e dependente da dose, nos efeitos clastognicos de raios-X (35 rad), enquanto cidos tnicos por si s mostraram apenas genotoxicidade moderada. Resultados similares foram obtidos com cidos tnicos em combinao com outros compostos qumicos. Este resultado pode se revestir de grande importncia, pois

cidos tnicos esto presentes na maioria dos alimentos e bebidas, assim como em guas e solos naturais. Consequentemente, praticamente todo produto qumico liberado no ambiente pode interagir com, e ser potencializado por, cidos tnicos. O valor do ensaio Trad-MCN como uma ferramenta na avaliao ambiental foi novamente enfatizado num estudo das medidas de bioremediao num depsito de resduos perigosos (Baud-Grasset et al., 1993a; Baud-Grasset et al., 1993b). Solos pesadamente contaminados com creosoto (mais de 5.000 ppm de PAHs) foram incubados com o fungo degradador de lignina Phanerochaete chrysosporium Burdsall por 8 semanas, e os extratos aquosos desses solos foram estudados com o ensaio Trad-MCN. Extratos dos solos pr-incubao eram altamente clastognicos. P. chrysosporium causou uma diminuio na contaminao, duplicando a concentrao de extrato de solo necessria para induzir uma frequncia de microncleos similar quela previamente incubao (de 1 para 2%). Novamente o ensaio Trad-MCN mostrou-se extraordinariamente sensvel, permitindo a deteco de diferenas entre amostras proximamente comparveis. Os resultados obtidos com Tradescantia na avaliao de contaminantes do solo esto resumidos na Tabela 3.

Tabela 3 - Resumo dos resultados de avaliaes de genotoxicidade de contaminantes do solo empregando o ensaio TradMCN de Tradescantia.

Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. Contaminantes de solo Lodo de esgoto 24 hrs Diluio qudrupla Aldrin 30 hrs 2.0-36 ppm

Agente

Resultado +/ Significncia - estatstica

Comentrios

Referncia

Hopke et al., 1982 p < .05 Sandhu et al., 1989 Positivo somente quando exposto na forma gasosa. Diludo em NaOH.

Tetracloro etileno Trixido de arsnico 1,2-benz[a,h] antraceno

2 hrs

30 ppm

p < .05

30 hrs

3.96 ppm

p < .05

30 hrs

12.5 ppm

p < .05

Diludo em etanol.

Agente

Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. Dieldrin 30 hrs 3.81 ppm 30 hrs 30 hrs 1.88 ppm 0.44 ppm

Resultado +/ Significncia - estatstica + + + p < .05 p < .05 p < .05

Comentrios

Referncia Baud-Grasset et al., 1993a, b

Diludo em DMSO. Diludo em DMSO. Diludo em DMSO.

Heptacloro Tetracetato de chumbo Solo de depsito de resduos perigosos

30 hrs

0.5% extrato aquoso

p < .05

Mais de 5000 ppm de PAHs.

1.2.4 Pesticidas e produtos de sade

Plantas so os receptores biolgicos diretos dos pesticidas aplicados no campo. Consequentemente, no surpreende a ateno devotada aos estudos de toxicologia gentica de pesticidas em plantas. Uma extensa reviso da genotoxicidade de pesticidas em plantas superiores (Sharma & Panneerselvan, 1990) listou um total de 178 ingredientes ativos testados em pelo menos um de 31 espcies vegetais diferentes, empregando uma variedade de rgos e parmetros genticos. Aproximadamente 30% dos compostos foram considerados genotxicos, enquanto apenas 6% puderam ser considerados incuos nesses termos. Tradescantia aparece somente uma vez nessa reviso, indicando que esse ensaio no est entre os preferidos para avaliao da toxicidade gentica de pesticidas, a despeito de sua sensibilidade e propriedade para avaliaes em campo. As primeiras referncias ao uso de Tradescantia para testar a genotoxicidade de pesticidas envolveram as atividades citolgicas do inseticida mevinfs e o herbicida cianazina (Ahmed & Grant, 1972b), e o fungicida para tratamento de sementes Panogen 15 (metilmercrio diciandiamida) (Ahmed & Grant, 1972a). Nesses casos testou-se a aberrao cromossmica em mitose de pontas radiculares. Ahmed & Grant (1972b) mostraram que mevinfs e cianazina induziam aumentos na frequncia de aberraes, mas as doses estudadas foram muito elevadas, (200 a 600 ppm), consideradas muito extremas em termos de contaminao ambiental. Por outro lado, doses de apenas 10 ppm de Panogen 15 causavam citotoxicidade, enquanto genotoxicidade bvia era notada com apenas 1 ppm (Ahmed & Grant, 1972a). Estes resultados apontam para possveis riscos significativos sade nas operaes de preparo de calda e aplicao, nos tempos em que este produto era comercialmente disponvel.

Reconhecendo o mrito especial de se estudar agroqumicos in situ, Grant (1982) opinou que nenhum outro organismo seria to til quanto Tradescantia e no haveria qualquer teste to adequado quanto o ensaio Trad-MCN para a avaliao dos riscos genticos in situ. Estas afirmaes foram verificadas em um estudo da genotoxicidade do inseticida malation usado no controle de pragas em uma casa de vegetao (Ma et al., 1983). Em um tratamento, vasos com plantas intactas foram pulverizadas, simulando o controle convencionalmente usado. Tratamentos adicionais envolveram absoro de malation pelos talos (com ou sem prvia dissoluo com DMSO ou tratamento com a frao microssmica S-9 de fgado macerado de camundongo induzido com Aroclor), e exposio de plantas intactas a vapores de malation gerados por aquecimento em cmaras hermeticamente fechadas. Todas as exposies a solues de malation, seja pulverizado ou absorvido pelo talo, foram negativas. J os talos expostos a vapores de malation sofreram um significativo aumento na frequncia de microncleos, sugerindo que formas gasosas do pesticida podem ser particularmente efetivas (Ma et al., 1983). As clastogenicidades do Benlate (benomil) e do tiofanato, dois fungicidas usados na conservao de frutos para armazenagem, foram estudadas com o ensaio Trad-MCN em concentraes de 0.05 e 0.07%, respectivamente (Huang & Chen, 1993b; Huang & Chen, 1993c). Ambos agentes induziram altos nveis de microncleos. Os resultados obtidos at o presente da genotoxicidade de pesticidas em Tradescantia so resumidos na Tabela 4.

Tabela 4 - Resumo dos resultados de avaliaes de genotoxicidade de pesticidas selecionados empregando o ensaio Trad-MCN de Tradescantia. Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. Pesticidas Mevinfs 3-12 hrs 200-600 ppm Agente Resultado +/ Significncia - estatstica Comentrios Referncia

p<.001

Mitose em ponta radicular.

Ahmed and Grant, 1972a Ahmed and Grant, 1972b

Cianazina Panogen 15 (mercurial)

3-12 hrs 1-3 hrs

200-600 ppm 1 - 5 ppm

+ +

p<.001 p < .05

Mitose em ponta radicular. Mitose em ponta radicular.

Agente

Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. Malation 6 hrs 5.5-1650 ppm

Resultado +/ Significncia - estatstica p < .05

Comentrios

Referncia

Absoro pelo talo e pulverizao. Fumaa gerada por calor. Inseticida

Ma et al., 1983 Ma and Harris, 1987 Huang and Chen, 1993a,b

Malation Diclorvs

6 hrs 1-6 hrs

0.25-0.65%

+ +

p < .05

Benlate

0.05%

Tiofanato

0.07%

Ma et al. (1984) apresentaram os resultados de 140 ensaios Trad-MCN realizados com uma variedade de agentes fsicos e qumicos. Os agentes foram classificados em 9 categorias (nmeros entre colchetes indicam o nmero de agentes testados na categoria): (a) agentes reconhecidamente carcinognicos/mutagnicos [15], (b) bebidas comuns [8], (c) produtos qumicos comuns [30], (d) drogas comuns [32], (e) pesticidas [18], (f) produtos qumicos de uso domstico [16], (g) radiao ionizante e radioistopos [3], (h) monitoramento in situ [13], e (i) misturas qumicas complexas [8]. Alguns resultados positivos nesses grupos foram: (a) benzopireno (50 M), EMS (50mM), e azida sdica (0,2 mM); (b) etanol (5%), caf descafeinizado (25%), e cola (50%); (c) vapores de formaldedo, xido nitroso e dixido de enxofre; (d) sacarina, aspirina; (e) Bladex (cianazina), dicamba, vapores de diclorvs, hidrazida malica, pdiclorobenzeno, Tordon (picloran); (f) alguns odorizantes e cosmticos; (g) todas formas de radiao; (h) vrios locais poludos; e (i) vrios tipos de gases de combusto e amostras de gua no concentradas. Entre os resultados negativos encontravam-se (a) 1,2-benzantraceno, metil metanosulfonato e dinitrotolueno; (d) mitomicina C; e (e) atrazina, simazina e 2,4-D. De 39 agentes testados com o ensaio Trad-MCN e para os quais haviam resultados disponveis de testes de Ames, 26 forneceram os mesmos resultados, representando uma congruncia de 67%. Para pesticidas, 11 de 18 agentes testados resultaram positivos. De 8 pesticidas testados tanto em Trad-MCN quanto no teste de Ames somente simazina forneceu resultados diferentes nos dois testes (Ma et al., 1984).

Os resultados disponveis de avaliaes das propriedades clastognicas de agentes qumicos selecionados e estresses fisiolgicos em Tradescantia so apresentados na Tabela 5.

Tabela 5 - Resumo dos resultados de genotoxicidade de agentes qumicos selecionados e estresses fisiolgicos em Tradescantia. Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. Agentes qumicos selecionados EMS 24 hrs 50-100 mM Agente Resultado +/ Significncia - estatstica Comentrios Referncia

Solues aquosas absorvidas pelos talos.

Ma, 1979

9 categorias qumicas

140 compostos estudados, sendo 52 positivos, 20 no limiar, e 5 txicos.

Ma et al., 1984

Estresses fisiolgicos Anaerobiose 12-48 hrs

Max. 2% de oxignio

Aumento em aberraes cromossmicas, incluindo microncleos em micrsporos. p<.001 Replicao cromossmica anormal e microncleos na meiose. Idem ao anterior.

Steinitz, 1944

Deficincia de magnsio

contnuo

< 1 ppm

Steffensen, 1953

Deficincia em sulfato Deficincia em clcio

contnuo

4.0 ppm

Steffensen, 1954 Steffensen, 1955

contnuo

2.5 ppm

p<.001

Idem ao anterior.

1.2.5 Raios csmicos e campos eletromagnticos

T. paludosa foi utilizada para estudar os efeitos potenciais de fatores associados com vo espacial, como acelerao, vibrao, falta de gravidade e radiao ionizante (Delone et al., 1986). As inflorescncias foram fixadas quimicamente a vrios intervalos de tempo desde o lanamento da nave at aps a aterrissagem, e as figuras mitticas dos micrsporos foram analisadas em termos de aberraes. Um tipo especial de aberrao foi observado nesse material, consistindo de translocaes no-recprocas complexas e fragmentos esfricos. O surgimento de tais aberraes no estava associado com a durao do vo, ou com

lanamento ou aterragem. Especulou-se que o agente causativo seria o pesado bombardeio por radiao csmica (Delone et al., 1986). A sensibilidade de Tradescantia a radiao tem sido demonstrada em relao a raios-X, fontes radioisotpicas internas e externas, e raios csmicos. Similarmente, ondas longas de rdio e campos magnticos de ondas curtas presentes nas vizinhanas de antenas de transmisso tm sido constatados como danosos a cromossomos em replicao. Em uma srie de experimentos in situ (Haider et al., 1994), talos de Tradescantia foram expostos em cinco distncias de uma antena, e em gaiolas plsticas (no isolante) e de Faraday (isolante eletromagntico) distribudas ao derredor de locais que excediam os padres para campos eltricos da Associao Internacional de Proteo a Radiao. Todos os tratamentos resultaram em incrementos na frequncia de microncleos quando comparados com os controles de laboratrio, e, mais importante, comparaes entre amostras de gaiolas isolantes e no isolantes resultaram em diferenas altamente significantes (Haider et al., 1994). Este resultado particularmente interessante, uma vez que ambos os grupos foram expostos a exatamente as mesmas condies ambientais, exceto pela influncia da radiao eletromagntica. Uma relao dependente da dose com respeito a distncia de exposio tambm suporta a concluso de que os efeitos observados eram realmente devidos ao campo eletromagntico. As atividades clastognicas de raios-X e outras formas de radiao ionizante em Tradescantia esto resumidas na Tabela 6.

Tabela 6 - Resumo dos resultados de genotoxicidade em Tradescantia com especial referncia a raios-X e outras formas de radiao ionizante. Agente Tempo de exposiomax. Radiao Raios-X Dosagem Concentrao Resultado +/ Significncia - estatstica Comentrios Referncia

8 min

75-200 rad

Raios-X

~5 min

77-416 rad

p < .05

Quebras (breaks) nos cromossomos, principalmente em mitose. Aberraes cromossmicas nos tubos polnicos e micrsporos, e significncia medida por coeficientes de ajuste exponencial dos dados.

Sax, 1938

Kirby-Smith and Daniels, 1953

Raios- de 60 Co

30 min

100-400 rad

p < .01

Dosagem Tempo de Concentrao exposiomax. 20 min 100-400 rep Raios- de 32 P 16 d 0.41 rad Raios- de 60 Co Raios-X em clulas tratadas com 5-FUdR 36 hrs 5-FUdR + 2 min raios-X segundos 100 rad + 10-6 M 5-FUdR

Agente

Resultado +/ Significncia - estatstica + + p < 0.1 p<0.05

Comentrios

Referncia

Microncleos em micrsporos. Atraso mittico resultando em nmero reduzido de trocas e quebras nas cromtides. Relao dose-efeito positiva para microncleos. Coeficiente de correlao para dose-efeito 0.995 Interao sinergstica, relao dose-efeito positiva.

p < .05

Sparrow and Singleton, 1953 Rushton, 1969

Raios-X

20-40 rad

Ma, 1979

Raios-X Raios-X + cidos tnicos

segundos 12 hrs

10-58 rad 35 rad raios-X + 0.1-1.0 mM cidos tnicos

+ +

Ma et al. 1980 Knasmuller et al., 1992

Raios csmicos

exposio in situ em satlite espacial

Aberraes cromossmicas incomuns, como translocaes norecprocas e fragmentos esfricos. p < .05 Microncleos em ttrades, talos em gaiolas de Faraday no diferiam dos controles laboratoriais.

Delone and Antipov, 1986

Radiao em frequncia de rdio

30 hrs

Eltrica 40-170 V/m Magntica.01-.11 A/m

Haider et al., 1994

Em um estudo recente apoiado pelo Programa Internacional de Segurana Qumica a utilidade do ensaio Trad-MCN (juntamente com outros trs ensaios vegetais) foi avaliada com quatro compostos genotxicos conhecidos (Grant & Salamone, 1994) em cinco diferentes laboratrios (Sandhu et al., 1994a; Sandhu et al., 1994b). Embora os resultados no tenham sido idnticos, houve boa concordncia entre todos laboratrios, sugerindo que o ensaio Trad-MCN um bioensaio confivel para agentes clastognicos (Ma et al., 1994b). Os estudos revisados neste estudo demonstram que Tradescantia, e em particular o ensaio TradMCN, oferece um sistema muito sensvel e facilmente manusevel para avaliaes de toxicidade gentica, especialmente para condies in situ indispensveis em pesquisas ambientais. O desempenho alcanado em

tal variedade de situaes e os nveis de contaminao extremamente baixos detectados com sucesso nesses testes justificam a escolha desse sistema como o bioindicador para os estudos que se seguem.

1.3 Avaliao de um programa de MIP com o ensaio Trad-MCN

A induo de mutaes apenas um dos muitos impactos ambientais de pesticidas (Durham & Williams, 1972; Epstein & Legator, 1971; Yoder et al., 1973). A maioria dos pesticidas capaz de induzir mutaes em pelo menos um tipo de bioensaio (Laborda et al., 1985; Sharma & Panneerselvan, 1990; Waters et al., 1982), embora algumas vezes em doses muito acima daquelas observadas em condies de campo, especialmente se consideradas as diluies a que os compostos so sujeitos imediatamente aps a aplicao. Os experimentos apresentados nas sees que se seguem so uma tentativa de estimar in situ e sob condies normais da boa prtica agrcola, a genotoxicidade de pesticidas e seus resduos. Em particular, avalia-se o possvel abatimento de tais efeitos genotxicos por meio de redues nas doses alcanadas atravs de um programa de MIP (Rodrigues et al., 1998a). O primeiro passo dessa avaliao foi uma anlise da genotoxicidade dos pesticidas aplicados no campo (in situ), seguido de uma estimativa da atividade genotxica remanescente no solo brevemente aps a pulverizao, e um estudo das propriedades clastognicas das formulaes comerciais empregadas. Tais avaliaes requerem uma aproximao eminentemente in situ, e necessitam de alta sensibilidade para permitir a deteco de nveis muito baixos de contaminao, como ocorre, por exemplo, em extratos de solos. Como discutido nas sees prvias, o ensaio Trad-MCN atende estes requisitos, e ento foi escolhido como o bioindicador para este segmento do estudo. Outros ensaios empregando outras espcies vegetais foram conduzidos para aferir in situ os resultados obtidos com o ensaio Trad-MCN, e sero apresentados e discutidos adiante.

1.3.1 O programa de MIP em estudo

O desenvolvimento de procedimentos agrcolas direcionados reduo do uso de pesticidas tem sido um objetivo de pesquisa muito explorado (Bottrell, 1979; Pimentel, 1993; Pimentel et al., 1993; Smith et al., 1976; Smith & van den Bosch, 1967) e uma meta algumas vezes estabelecida como poltica nacional em certos pases (Hurst et al., 1992). Talvez a iniciativa de maior sucesso para a reduo do uso de pesticidas, em

termos de aceitabilidade pelos agricultores e consequente adoo em larga escala, seja a integrao de prticas qumicas, fsicas e biolgicas comumente referida como manejo integrado de pragas (MIP) (Bottrell, 1979; Kuhr, 1994; Pimentel, 1991b). A efetividade do MIP para reduzir os impactos ambientais de pesticidas no pode ser colocada em dvida (Pimentel, 1991a; Pimentel & Andow, 1984). Em geral, medidas de MIP efetivamente reduzem impactos ambientais atravs da atenuao da contaminao de solos e guas (Pimentel & Levitan, 1986), da diminuio das perdas de inimigos naturais das pragas e de animais silvestres, e da reduo dos envenenamentos de animais domsticos (Pimentel et al., 1992), e atravs da minimizao da exposio de seres humanos no local de trabalho ou atravs de alimentos contaminados (Culliney et al., 1992). A pesquisa sobre MIP normalmente envolve a seleo de tcnicas apropriadas de manejo da cultura e controle de pragas, doenas e plantas invasoras, tomando em considerao caractersticas regionais e locais de clima e solo, e a aplicao dessas tcnicas em um programa integrado (Bottrell, 1979; Pimentel, 1985). Um componente adicional crucial comumente anexado pesquisa em MIP a manuteno de campos de demonstrao como uma ferramenta para difuso das tecnologias implementadas para os agricultores. Um tal campo de demonstrao foi estabelecido na fazenda experimental Musgrave, da Universidade Cornell, em Ithaca, NY, EUA, como parte do projeto de pesquisa Programa de manejo integrado para produo de milho (Bergstrom et al., 1992; Bergstrom et al., 1993; Bergstrom et al., 1994). Este campo de demonstrao foi o local escolhido para a srie pressente de experimentos.

1.4 Material e mtodos

1.4.1 Campo experimental estudado
O projeto de pesquisa e demonstrao para produo de milho, no qual os presentes experimentos foram realizados, foi idealizado e conduzido por quatro anos (1994) para testar um conjunto de prticas de manejo que envolvia rotao de culturas (milho contnuo, soja contnua, e milho-soja alternadamente em safras consecutivas), vrios sistemas de arao e preparo do solo, e trs nveis de tratamento qumico (Bergstrom et al., 1992). O projeto ocupava uma rea de aproximadamente 4,500 m2 separada em trs blocos, cada qual direcionado para a incorporao de um tipo de manejo em teste. Como na presente pesquisa somente os nveis de tratamento qumico eram de interesse, a parcela experimental consistiu de trs sub-

parcelas representando trs reas de amostragem independentes. Os estudos in situ e as amostragens de solo ocorreram nos anos de 1993 e 1994, ento aps pelo menos dois anos de pulverizaes de rotina, como previsto no projeto. As parcelas de milho contnuo foram escolhidas para experimentao a fim de assegurar consistncia em relao aos tratamentos qumicos sendo feitos previamente e durante o estudo. Os tratamentos de pesticidas aplicados parcela de milho contnuo consistiam de: a) nvel alto de tratamento - tratamento de sementes (captan) + tratamento triplo de semente do agricultor (carboxin+diazinon+lindane); inseticida de solo (clorpirifs); e controle de invasoras com aplicao convencional de herbicida (cianazina+metolaclor); b) nvel mdio de tratamento - tratamento de sementes (captan) + tratamento duplo de semente do agricultor (captan+diazinon); e controle de invasoras com aplicao de herbicidas em bandas, na linha de cultivo; c) nvel baixo de tratamento - tratamento de sementes apenas, sem qualquer aplicao de pesticidas em campo (Tabela 7).

Tabela 7 - Nveis de tratamento com pesticidas e detalhes das formulaes aplicadas nas parcelas de milho contnuo avaliadas quanto a genotoxicidade com o ensaio Trad-MCN. Manejo Nvel de tratamento com pesticida Nome comercial/ Produtor Observaes Formulao / taxa de aplicao de i.a.

Baixo Tratamento de sementes Comercial Agricultor - duplo +

Mdio

Alto

Ingrediente ativo (i.a.)

+ +

+ Agrox 2 vias Agway + Agrox DL-Plus Agway Lorsban 15G DowElanco

captan captan+diazinon

37 + 25% apr. 1.5 g/kg 14 + 15 + 25% apr. 1.4 g/kg Granular 1.12 kg/ha

Agricultor - triplo

carboxin+ diazinon/lindane clorpirifs

Inseticida de solo

Controle de invasoras Cultivo Herbicida em bandas 2x 1x + Bladex 90DF Shell e Dual Ciba cianazina+ metolaclor Grnulos disp. em gua 2.7 kg/ha Conc. Emul.

Manejo

Nvel de tratamento com pesticida Nome comercial/ Produtor

Observaes Formulao / taxa de aplicao de i.a. 2.34 L/ha

Baixo

Mdio

Alto

Ingrediente ativo (i.a.)

Herbicida convencional

Bladex 90DF Shell e Dual Ciba

cianazina+ metolaclor

Grnulos disp. em gua 2.7 kg/ha Conc. Emul. 2.34 L/ha

O plantio ocorreu aos finais de abril sob condies favorveis de tempo. O tratamento de sementes foi realizado no campo, seguindo-se imediatamente o plantio e aplicao de pesticidas com equipamento tracionado por trator. Amostras de solo foram coletadas antes e depois da pulverizao e talos de Tradescantia foram expostos ao campo tratado imediatamente aps o vencimento do intervalo de entrada restrita (REI) para os produtos, ou seja, 12 hrs.

1.4.2 Linhagem de Tradescantia, manuteno e condies gerais de experimentao

O clone 4430 de Tradescantia foi obtido da cultura do Dr. Shahbeb S. Sandhu, da Genetic Toxicolgy Division, Health Effects Research Laboratory, da US EPA em Research Triangle Park. O clone 4430 um hbrido diplide entre T. hirsutiflora Bush (2461C) de flor azul e T. subacaulis Bush (2441) de flor cor de rosa (Schairer & Sautkulis, 1982). Este clone especialmente adequado para experimentao em laboratrio e foi descrito em detalhe por (Emmerling-Thompson & Nawrocky, 1980). Devido ao fato de ser estril, no h risco de se perder a identidade e pureza gentica do clone 4430 por recombinao, e sua heterozigose para cor da flor permite seu emprego para ambos os testes, Trad-MCN e Trad-SHM (Ichikawa, 1992; Ma, 1988). Uma populao de aproximadamente 500 plantas maduras contendo uma mdia de 4 a 6 talos em diferentes estgios de desenvolvimento foi mantida durante o perodo experimental. Tal populao era grande o suficiente para produzir ao menos 200 talos em excelentes condies para exposio uma vez a cada duas semanas. As plantas foram mantidas em casas de vegetao ventiladas com ar filtrado em carvo ativado e Purafil numa temperatura de 27/21 2oC (dia/noite), com iluminao suplementar fornecida por lmpadas multivapor GE MVT-400 a fim de garantir um ciclo de 17 hrs de iluminao diria ao longo do ano. As

plantas eram cultivadas em vasos de papelo reciclvel de 12,5 cm contendo uma mistura de solo-turfa de musgo-vermiculita (Cornell Mix, Boodley & Sheldrake, 1982) suplementada com fertilizante de liberao controlada Osmocote e micronutrientes. Em geral as plantas eram aguadas dia sim dia no e recebiam uma soluo diluda de nutrientes semanalmente. Em cada colheita de talos para experimentao (a cada duas semanas) todos os vasos eram cuidadosamente inspecionados e as plantas podadas, a fim de mant-las limpas e livres de pragas. Nenhum pesticida foi aplicado sobre ou prximo s plantas durante o perodo experimental. Em cada experimento, 15 a 20 talos (por tratamento por rplica) de Tradescantia contendo inflorescncias jovens eram coletados 24 hrs antes do incio dos tratamentos e transferidos para cmaras de ambiente controlado. Estas cmaras eram ventiladas com ar filtrado em carvo ativado e Purafil ajustadas com fluxo de 6 m3 min.-1, resultando em ao menos duas trocas totais de ar por min; e equipadas com lmpadas de sdio de alta presso GE LU-400 Lucalux e lmpadas de multivapor de haletos metlicos MVR-400 fornecendo 800 watts m-2 ao nvel das plantas. As condies ambientais eram controladas com temperaturas de 21/19 0,2oC dia/noite, 65/70% de umidade relativa para dia/noite, e um ciclo dirio de iluminao de 17 hrs. Previamente s exposies os talos eram mantidos em frascos tipo beaker contendo gua deionizada sob constante aerao com ar filtrado para um perodo de adaptao de 24 hrs. Toda planta murchando era eliminada nesse momento, sendo que somente talos trgidos e com inflorescncias em expanso seriam tratados. Todas as exposies foram realizadas diluindo-se os agentes a serem testados em soluo nutriente de Hoagland (Downs & Hellmers, 1975) triplamente diluda, a qual tambm correspondia ao controle negativo em todos os experimentos. O controle positivo foi representado por tratamento por 30 hrs (sem perodo de recuperao) com uma soluo contendo 100 ppm de metanosulfonato de etila (EMS- Sigma Co.). A menos que diferentemente mencionado, exposies de 30 hrs seguidas imediatamente por fixao das amostras (sem perodo de recuperao) foram sempre realizadas. Este procedimento recomendado quando baixas concentraes de ingredientes ativos so testados (Ma, 1988).

Aps o tratamento as inflorescncias eram removidas dos talos e fixadas em soluo 1:3 (v/v) de cido actico:etanol por 24 hrs e ento preservadas em etanol 70% (v). Para contagem de microncleos as inflorescncias eram removidas, os botes jovens abertos, e as anteras maceradas sobre uma lmina de microscpio em soluo de corante aceto-carmim (preparado por fervura de 0,5 g de carmim em 100 ml de cido actico 45% v). Aps posicionar a lamnula, a lmina era aquecida repetidamente a aproximadamente 80oC e gentilmente pressionada entre folhas de papel absorvente para remover o excesso de corante (Ma, 1988). A contagem era realizada sob magnificao de 400x, anotando-se o nmero de microncleos presentes num grupo aleatrio de 300 ttrades jovens, em 5 lminas (Ma, 1979b; Ma, 1981), obtendo-se uma populao estatstica de 1,500 ttrades por tratamento. As lminas foram sempre codificadas e analisadas pelo mesmo observador, com o cdigo sendo revelado somente aps todos os tratamentos serem contados. Neste mtodo, cada boto contendo as ttrades jovens apropriadas para contagem (uma lmina vlida) considerado uma populao amostral, com botes dos outros talos representando as rplicas de um grupo experimental ou tratamento. Foi realizada uma anlise de varincia (ANOVA) do nmero de microncleos/100 ttrades, e as mdias dos tratamentos foram comparadas pelo teste t de Student assumindo distribuio bicaudal (nenhuma tendncia assumida a priori nos dados) e =0,01.

1.4.3 Amostragem, extrao e avaliao em solos

Quatro amostras de cada parcela de tratamento com pesticida s foram coletadas dos 5 cm superficiais e conservadas em sacos de papel a -20oC. Assim que possvel aps a coleta, pores iguais de cada amostra foram combinadas para extrao, modas em pistilo e peneiradas em uma combinao de peneiras de 1,168 mm e 420 m (14- e 35-mesh). A extrao consistiu em agitar 1 parte de solo com 2 partes de gua deionizada (p/v) em mesa rotatria por 24 hrs. A mistura foi ento centrifugada por 20 min. a 2400 rpm e o lquido supernadante recebeu os talos de Tradescantia para tratamento imediatamente e sem diluio.

1.4.4 Ensaio com formulaes comerciais

As trs formulaes comerciais de pesticidas aplicados ao campo (Tabela 7) foram avaliadas para genotoxicidade em condies de laboratrio. Lorsban 15G (clorpirifs) nome qumico (IUPAC) O,O-dietil O-3,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato, Bladex 90DF (cianazina) nome qumico (IUPAC) 2-(4-cloro-6-

etilamino-1,3,5-triazin-2-ilamino)-2-metilpropionitrilo, e Dual (metolaclor) nome qumico (IUPAC) 2-cloro6-etil-N-(2-metoxi-1-metiletil)acet-o-toluidina foram testados a concentraes de ingrediente ativo de 1, 10, e 50 ppm. Bladex (cianazina) e Dual (metolaclor) foram dispersos e emulsificados em soluo de Hoagland nessas concentraes, enquanto devido natureza insolvel dos grnulos de Lorsban contendo clorpirifs, e baixa solubilidade desse produto em gua (2 mg/L), somente uma concentrao nominal de ingrediente ativo pde ser assumida para essa suspenso. Talos de Tradescantia foram expostos diretamente por imerso nessas solues/suspenso.

1.4.5 Ensaio com exposio in situ

Talos de Tradescantia (25/rplica/tratamento) foram trazidos para o campo em frascos tipo beaker contendo soluo nutritiva de Hoagland diluda a 1/3 e em caixas hermeticamente fechadas no dia seguinte aplicao dos pesticidas, e foram expostos durante a noite num total de 14 hrs. A fim de aumentar a volatilizao dos pesticidas do solo, o local onde as amostras foram colocadas recebeu aproximadamente 10 L de gua imediatamente antes do incio da exposio (Prueger & Pfeiffer, 1994). O tratamento consistiu em colocar os frascos tipo beaker com os talos de Tradescantia sobre a superfcie do solo mido ao longo das linhas de plantio. Cada frasco foi ento coberto com um vaso de PVC invertido, criando uma cmara simples para proteo e que possivelmente poderia resultar num maior acmulo de vapores liberados do solo. Os controles consistiram no revestimento do solo a receber as amostras com uma folha de plstico, assim isolando a amostra de vapores provenientes do solo. O controle positivo recebeu uma alquota de EMS na soluo nutritiva produzindo uma soluo com 100 ppm EMS imediatamente antes do incio da exposio. Aps o tratamento as amostras foram trazidas para o laboratrio, as solues nutrientes foram repostas por solues frescas, e os talos foram mantidos na cmara de ambiente controlado por um perodo de recuperao de 24 hrs, a fim de permitir que as clulas mes dos gros de plen expostas em meiose atingissem o estgio de ttrade, adequado para contagem de microncleos. As inflorescncias foram ento fixadas e analisadas como descrito anteriormente.

1.5 Resultados
A variao observada nos dados para o controle negativo (frequncia espontnea de microncleos mnimo de produo de microncleos para uma dada condio) e para o controle positivo (EMS 100 ppm, que resultava aproximadamente na duplicao do nmero de microncleos em relao ao controle negativo, com diferenas estatisticamente significantes) representou aproximadamente o mximo de variao observada nos dados para todos os tratamentos, uma vez que apenas baixas concentraes, baixos nveis de resduos, e campos agrcolas apenas marginalmente contaminados foram avaliados. Como as condies de exposio foram mantidas constantes durante todos os ensaios de laboratrio, estes controles podem ser usados para aferir a sensibilidade (a capacidade do sistema para detectar baixas concentraes de um agente) e a reproducibilidade (a habilidade de responder consistentemente a um agente) do ensaio Trad-MCN como empregado nesse estudo. Quando circunscritas a cada grupo controle estudado (negativo ou positivo) todas as amostras compartilharam mdias similares (com exceo do tratamento in situ que apresentou um leve incremento em frequncia de microncleos), enquanto amostras dos diferentes controles foram significativamente diferentes. Em somente um caso ocorreu que uma amostra do controle negativo no diferiu significativamente de uma amostra do controle positivo, coincidentemente no mesmo experimento. Este evento representado pelo eixo E na Figura 1, e corresponde ao ensaio com a formulao comercial de clorpirifs.

16 14 12 10 8 6 4 2 0

A B

Tratamento Controle negativo Controle positivo

C

F E

Figura 1 - Frequncias de microncleos para os controles positivos e negativos dos ensaios Trad-MCN. O controle negativo representa a frequncia espontnea de microncleos para o clone 4430 de Tradescantia e consistiu de tratamento com soluo nutriente de Hoagland diluda a 1/3; o controle positivo consistiu de soluo aquosa de etil metanosulfonato (EMS) a 100 ppm. Os talos de Tradescantia foram expostos por 30 hrs em cmara de ambiente controlado. O tratamento com EMS induziu um aumento consistente na frequncia de microncleos para um nvel aproximadamente duas vezes maior que a frequncia espontnea para o clone 4430 (de 4,2 1,4 para 10,7 1,9, para n=40). A frequncia espontnea de microncleos foi tambm razoavelmente constante, com exceo do resultado do ensaio com metolaclor (correspondente ao eixo D na Figura 1), no qual ocorreu um decrscimo na frequncia de microncleos. Deve-se enfatizar que a frequncia espontnea de microncleos observada nos experimentos aqui descritos est em perfeita concordncia com dados disponveis na literatura, por exemplo em Grant et al. (1992); Ma, (1981), entre vrios outros.

1.5.1 Genotoxicidade de resduos de pesticidas extrados do solo

Dois ensaios independentes foram realizados com extratos de solos, um para amostras coletadas antes da aplicao dos pesticidas (correspondendo ao solo pulverizado somente na cultura do ano anterior) e um para amostras coletadas brevemente aps a aplicao. Cada ensaio foi acompanhado por seu prprio grupo de controles, e todas as condies foram mantidas constantes. Os resultados desses dois ensaios esto apresentados na Figura 2.

14 Solo no pulverizado 12

MCN / 100 ttrades

Solo pulverizado 10 8 6 4 2 0 Controle 1 2 Baixo 1 2 Mdio 1 Alto 2 EMS

Figura 2 - Produo de microncleos em clone 4430 de Tradescantia aps exposio a extratos aquosos de solos tratados com pesticidas. As barras representam desvios padro das mdias. Talos de Tradescantia foram expostos por 30 hrs em uma cmara de ambiente controlado. Os resultados representam dois experimentos separados, cada qual com seu prprio grupo de controles. O tratamento controle recebeu apenas soluo nutriente (soluo de Hoagland a 1/3) e o controle positivo (EMS) consistiu de uma soluo de etil metanosulfonato a 100 ppm. Amostras de solo no pulverizado e pulverizado foram coletadas antes e 12 hrs aps aplicao de pesticidas, respectivamente. O tratamento Baixo no recebeu aplicao, o Mdio recebeu cianazina + metolaclor em bandas, e o Alto recebeu cianazina + metolaclor em aplicao convencional e clorpirifs. Ambos os controles nos dois experimentos foram similares, atestando que as condies de exposio e procedimentos de contagem entre os experimentos eram comparveis. No houve diferenas estatisticamente significantes entre os extratos dos diferentes tratamentos para o solo no pulverizado, apenas o tratamento EMS (controle positivo) apresentou um aumento significativo na frequncia de microncleos em relao ao controle nesse experimento. Essa falta de efeito nas amostras no pulverizadas indicava que no havia agentes endgenos ou compostos antropognicos residuais nos extratos capazes de induzir clastogenicidade. Os extratos de solo pulverizado, entretanto, mostraram aumentos significativos na frequncia de microncleos para os tratamentos Mdio e Alto, em relao ao controle negativo e ao Baixo tratamento com pesticidas (nenhum pesticidas aplicado em campo, vide Tabela 7). Embora uma das rplicas do tratamento Alto (Alto 1, Figura 2) no tenha mostrado aumento na frequncia de microncleos, as amostras tratadas com pesticidas mostraram diferenas significativas quando comparadas com as amostras no pulverizadas. Estes resultados indicam que a atividade genotxica dos

pesticidas podia ser ainda detectada pelo ensaio Trad-MCN mesmo aps diluio no solo, seguindo-se ao uso recomendado pela boa prtica agrcola.

1.5.2 Ensaio com formulaes comerciais

Dos trs pesticidas avaliados para clastogenicidade com o ensaio Trad-MCN, os dois herbicidas (cianazina e metolaclor) apresentaram aumentos significativos na frequncia de microncleos em relao ao controle negativo, o que no ocorreu para o inseticida clorpirifs. Entretanto, notou-se um aumento na frequncia de microncleos para as doses de 10 e 50 ppm para clorpirifs (Figura 3)

14 12 MCN / 100 ttrades 10 8 6 4 2 0 Controle 1 ppm 10 ppm 50 ppm EMS

Figura 3 - Efeitos clastognicos do inseticida clorpirifs no ensaio Trad-MCN. As barras representam desvios padro da mdia. Talos de Tradescantia foram expostos a solues aquosas de clorpirifs por 30 hrs em uma cmara de ambiente controlado. O tratamento controle recebeu apenas soluo nutriente (soluo de Hoagland a 1/3) e o controle positivo (EMS) consistiu de uma soluo aquosa de 100 ppm de etil metanosulfonato. O controle negativo nesse experimento resultou em uma frequncia de microncleos levemente superior aos nveis normalmente obtidos (Figura 1, eixo 5), o que certamente contribuiu para a falta de significncia estatstica nesse ensaio. A comparao entre o tratamento com 1 ppm (que resultou em uma frequncia de microncleos similar espontnea para o clone 4430 de Tradescantia registrada ao longo desse

estudo) e as concentraes mais altas, indicaram um aumento significativo na frequncia de microncleos para clorpirifs. Cianazina mostrou-se um agente clastognico em concentraes de apenas 10 ppm (Figura 4). Mesmo a uma dose de apenas 1 ppm notou-se um aumento na frequncia de microncleos (=0,05). J para a dose de 50 ppm ocorreu um ligeiro decrscimo em relao 10 ppm. Esta tendncia foi confirmada quando o ensaio foi repetido, indicando que cianazina exerce um afeito txico para as clulas mes do plen de Tradescantia entre 10 e 50 ppm.

16 14 MCN / 100 ttrades 12 10 8 6 4 2 0 Controle 1 ppm 10 ppm 50 ppm EMS

Figura 4 - Efeitos clastognicos do herbicida cianazina no ensaio Trad-MCN. As barras representam desvios padro da mdia. Talos de Tradescantia foram expostos a solues aquosas de cianazina por 30 hrs em uma cmara de ambiente controlado. O tratamento controle recebeu apenas soluo nutriente (soluo de Hoagland a 1/3) e o controle positivo (EMS) consistiu de uma soluo aquosa de 100 ppm de etil metanosulfonato.

Uma clara relao dose-efeito foi observada para os efeitos clastognicos de metolaclor no ensaio Trad-MCN (Figura 5). Um desvio relativamente grande nas frequncias de microncleos para amostras tratadas com pesticidas, contudo, resultaram na ausncia de significncia na comparao do tratamento com 10 ppm em relao ao controle (p=0,054). Um aumento significativo na frequncia de microncleos foi observado para metolaclor na concentrao de 50 ppm quando comparado com o controle negativo.

14 12 MCN / 100 ttrades 10 8 6 4 2 0 Controle 1 ppm 10 ppm 50 ppm EMS

Figura 5 - Efeitos clastognicos do herbicida metolaclor no ensaio Trad-MCN. As barras representam desvios padro da mdia. Talos de Tradescantia foram expostos a solues aquosas de metolaclor por 30 hrs em uma cmara de ambiente controlado. O tratamento controle recebeu apenas soluo nutriente (soluo de Hoagland a 1/3) e o controle positivo (EMS) consistiu de uma soluo aquosa de 100 ppm de etil metanosulfonato. Em concluso, todos os trs pesticidas estudados foram capazes de causar algum grau de clastogenicidade no ensaio Trad-MCN em concentraes entre 10 e 50 ppm. Estas concentraes esto bem abaixo daquelas aplicadas conforme as recomendaes para uso em campo, e se aproximam daquelas supostamente encontrveis em solos logo aps a aplicao.

1.5.3 Ensaio de exposio in situ

Aumentos altamente significativos na frequncia de microncleos ocorreram quando talos de Tradescantia foram expostos in situ a campos tratados com pesticidas. Ambos os tratamentos Mdio e Alto, cada um representado por duas rplicas, diferiram do tratamento Baixo (sem aplicao de pesticidas). Com exceo de uma rplica do tratamento Alto todas as amostras tratadas com pesticidas tambm apresentaram um aumento significativo em relao ao controle negativo, que nesse experimento apresentou uma frequncia de microncleos relativamente alta. Estes resultados indicam que a hiptese nula de no existncia de diferenas em genotoxicidade entre campos recebendo ou no aplicao de pesticidas deve ser rejeitada

(=0,01), sugerindo que um aumento na atividade genotxica ocorre in situ aps tratamento do solo com pesticidas. No ocorreram diferenas significativas entre amostras dos tratamentos Mdio e Alto (Figura 6), que apresentaram frequncias de microncleos maiores que o tratamento com EMS (controle positivo). Embora esse incremento sobre o controle positivo no tenha sido estatisticamente significativo, isso implica uma frequncia de microncleos para as amostras expostas a campos pulverizados superior ao dobro do nvel espontneo para Tradescantia sob as condies de experimentao.

25 20 MCN / 100 ttrades 15 10 5 0

1 2

Controle

Baixo

Mdio

Alto

EMS

Figura 6 - Produo de microncleos em Tradescantia (clone 4430) aps exposio in situ a campos tratados com pesticidas. As barras representam desvios padro da mdia. Talos de Tradescantia foram expostos por 14 hrs, colocandose os frascos tipo beaker contendo os talos diretamente sobre a superfcie do solo umedecido. O tratamento controle recebeu apenas soluo nutriente (soluo de Hoagland a 1/3) e foi colocado sobre solo coberto por uma folha plstica; o controle positivo (EMS) consistiu de uma soluo aquosa de etil metanosulfonato a 100 ppm e tambm foi exposta sobre folha plstica. O tratamento Baixo no recebeu pesticidas, o Mdio recebeu cianazina + metolaclor aplicados em bandas e o tratamento Alto recebeu cianazina + metolaclor em aplicao convencional e clorpirifs. Os pesticidas foram aplicados 24 hrs antes do incio da exposio.

Interessantemente, os resultados desse experimento repetiram precisamente a tendncia observada no ensaio com extratos de solo (Figura 2), ou seja, uma frequncia de microncleos ligeiramente superior nas amostras do tratamento Mdio em relao ao tratamento Alto. Este resultado significa que a hiptese nula de no existncia de diferenas entre os tratamentos Mdio e Alto no deve ser rejeitada, indicando que no

ocorreu abatimento na atividade genotxica detectada pelo ensaio Trad-MCN quando o programa de MIP foi implementado, em relao ao uso normal de pesticidas como prescrito para a cultura de milho. Poderia especular-se que tal tendncia se deveu a uma taxa de aplicao efetivamente maior para o tratamento Mdio exatamente no local de exposio dos talos de Tradescantia, pelo menos em relao a herbicidas (j que no houve aplicao de inseticidas nesse tratamento). Isso seria o resultado do mtodo de aplicao em bandas empregado nesse tratamento, no qual uma faixa mais estreita de solo recebeu o tratamento, consequentemente concentrando os ingredientes ativos localmente. Como os talos de Tradescantia foram colocados na parte interna da faixa pulverizada, uma dose ligeiramente maior pode ter sido liberada para estas amostras em relao s amostras do tratamento Alto, que recebeu aplicao convencional de herbicidas, ou seja, distribuda por toda a rea. O ensaio Trad-MCN demonstrou-se altamente sensvel e, talvez mais importante, suficientemente reprodutvel para detectar atividade clastognica em todos os pesticidas estudados, assim como em extratos de solos pulverizados e in situ. A consistncia dos resultados obtidos para os controles nos oito testes de laboratrio descritos, e especialmente nas rplicas das anlises de extratos de solo e nas exposies in situ, enfatizam a utilidade desse sistema para a avaliao da genotoxicidade no ambiente, especialmente quando baixos nveis de contaminao so presentes. Deve-se enfatizar ainda, que os resultados foram consistentes a despeito de (a) somente concentraes nominais terem sido assumidas nos experimentos, devido falta de anlises qumicas comprobatrias nas amostras de solo e nas solues de pesticidas estudadas, e (b) formulaes comerciais foram empregadas, ao invs de compostos puros, mesmo na avaliao dos produtos em si, devido ao interesse em se aproximar o mximo possvel das condies prevalecentes no campo de demonstrao de MIP.

1.6 Discusso
A capacidade de um agente qumico oferecer riscos biota depende das relaes de partio que determinam sua disperso no ambiente, sua tendncia para ser imobilizado no meio ou absorvido por organismos, sua persistncia e toxicidade (Gillett, 1983). A induo de clastogenicidade observada in situ em

Tradescantia exposta a campos pulverizados com pesticidas faz com que se questione como os pesticidas alcanaram as clulas mes do plen no interior das inflorescncias. Mesmo apresentando uma presso de vapor relativamente baixa (2,5 mPa) (Tomlin, 1994), aproximadamente metade do clorpirifs aplicado a campos agrcolas volatiliza-se para a atmosfera (Whang et al., 1993), especialmente sob condies de solo mido, como ocorria quando Tradescantia foi exposta. Isto ocorre devido baixa solubilidade de clorpirifs, o que contrabalana sua baixa presso de vapor fazendo com que o composto apresente uma relativamente alta constante adimensional da Lei de Henry (Hc calc.= -3,75 (Gillett, 1992; Mackay, 1981)). A constante da Lei de Henry apropriada para avaliar a fugacidade de um composto quando h envolvimento de gua, j que a gua pode competir com os composto por stios de soro. Uma Hc calc. acima de -4,0 indica que o composto pode volatilizar-se espontaneamente de solues a superfcies midas (Gillett, 1992). Volatilizao foi a rota principal de perda de clorpirifs de um solo arenoso nos primeiros sete dias aps aplicao (Chapman & Chapman, 1986). Isto no ocorre, contudo, com cianazina, que no sofreu volatilizao em um estudo de laboratrio (Blumhorst & Weber, 1992). Com uma presso de vapor baixa (200 mPa) (Tomlin, 1994) e baixa Hc calc. (-6,92) cianazina virtualmente no voltil. Embora metolaclor adsorva fortemente a argilas, sua isoterma de adsoro tipicamente apresenta uma forma em S, o que significa que o composto facilmente dessorvido do solo pela gua (Chesters et al., 1989). A despeito de sua presso de vapor relativamente baixa (1,7 mPa) (Tomlin, 1994) a baixa Hc calc. (6,4), metolaclor pode volatilizar-se livremente (80% em 24 hrs) de superfcies (Prueger & Pfeiffer, 1994), e perdas do solo por volatilizao podem alcanar at 30% (Prueger, 1994). Consequentemente, concebvel que, especialmente para clorpirifs e metolaclor, vapores suficientes poderiam ter sido liberados do solo umedecido para causar a atividade clastognica detectada nos ensaios in situ realizados com Tradescantia. Os resultados da presente pesquisa corroboram os efeitos genotxicos observados para os pesticidas estudados em uma variedade de testes, incluindo outros bioensaios vegetais. Clorpirifs causou um aumento na frequncia de microncleos em eritroblastos de medula ssea se camundongo em tratamento oral e intraperitoneal (tratamento dermal foi negativo) com doses abaixo da LD50, e antes de causar sinais de efeitos

clnicos (Amer & Fahmy, 1982). Em contraste, clorpirifs no induziu aumentos nas trocas de cromtides irms (SCE) em embrio de galinha ou clulas de ovrio de hamster chins, assim como no foram observadas aberraes em blastocistos bovinos, embora o desempenho reprodutivo dos animais tenha diminudo aps tratamento com clorpirifs (Muscarella et al., 1984). Os efeitos citogenticos em linfcitos humanos de uma mistura de 15 pesticidas comumente encontrados em alimentos foram estudados por Dolara et al. (1994). Clorpirifs compunha 2% dessa mistura, que era genotxica somente quando o fungicida estava presente. Clorpirifs mostrou-se mutagnico nas clulas somticas a germinais de Drosophila, segundo o ensaio de induo de mosaico nas asas e no ensaio de letais recessivos ligados ao seco, na concentrao de apenas 5 x 10-6 % (Patnaik & Tripathy, 1992). Shirasu et al. (1976) avaliaram a mutagenicidade de clorpirifs empregando os testes microbiolgicos de Bacillus subtilis, Escherichia coli, e Salmonella typhimurium. Nenhum dos ensaios foi positivo. Contrariamente, clorpirifs mostrou-se mutagnico no ensaio do dano primrio ao DNA com estes mesmos organismos e com Saccharomyces cerevisiae em outro estudo (Waters et al., 1982). Outros ensaios utilizados, incluindo reverso em S. typhimurium e E. coli, letalidade recessiva em D. melanogaster, recombinao mittica em S. cerevisiae, e sntese no programada de DNA (UDS) em fibroblastos de pulmo humano foram todos negativos (Waters et al., 1982). Tambm foram negativos os ensaios para mutao em S. cerevisiae e S. typhimurium tanto antes como aps ativao do composto com homogenados microssmicos de plantas (S1) e animais (S9), assim como no teste do plen ceroso em Z. mays (Gentile et al., 1982). Aumentos significativos em mitoses anormais foram induzidos por clorpirifs em pontas radiculares de V. faba, tanto quando sementes ou razes foram tratadas (Amer & Farah, 1983). Similarmente, genotoxicidade mittica e meitica foram induzidas por clorpirifs em pontas radiculares e clulas mes do plen de Hordeum vulgare L. tanto aps tratamento das sementes quanto aps pulverizao (Kaur & Grover, 1985a; Kaur & Grover, 1985b). Estes ensaios produziram relaes positivas entre dose e efeito, e adesividade (stickiness) dos cromossomos foi o efeito mais aparente. Uma reviso sobre a toxicologia gentica de pesticidas (Sharma & Panneerselvan, 1990) listou vrios efeitos cromossmicos causados por clorpirifs, incluindo fragmentao, configurao de fragmento ponte (bridges), vagrancy, distrbio de anfase, e induo de mutantes para clorofila em Gossypium barbadence, V. faba, e H. vulgare. O potencial de risco

gentico do clorpirifs foi considerado incerto para danos no desenvolvimento e na reproduo, e positivo para risco gentico hereditrio. O aumento na frequncia de microncleos observado em Tradescantia com uma dose pequena (10 ppm por 30 hrs) de clorpirifs, assim como a provvel preponderncia desse composto na induo de resposta positiva obtida in situ, tm suporte nos resultados mencionados para Drosophila. O teste do recessivo letal ligado ao sexo o teste melhor validado em Drosophila, e uma resposta positiva nesse teste uma indicao muito forte de mutao e, mais importante, de aberrao cromossmica (Patnaik & Tripathy, 1992). Clorpirifs foi tambm positivo na maioria dos bioensaios vegetais j realizados, embora a doses mais elevadas que as aqui estudadas. A adesividade (stickiness) dos cromossomos observada em clulas mes do plen de H. vulgare mesmo aps simples tratamento das sementes (Kaur & Grover, 1985b) atestam a capacidade clastognica desse composto em clulas vegetais. Foi demonstrado que cianazina induz danos ao cromossomo, com aumento na frequncia de quebras (breaks), em linfcitos humanos in vitro a concentrao de apenas 1 ppm (Roloff et al., 1992). Este resultado, contudo, contrariado por dados de genotoxicidade de cianazina empregando-se os testes UDS e SCE em linfcitos periferais humanos (concentraes de 12 a 100 ppm) e uma anlise de aberrao cromossmica em clulas de medula ssea de rato ( doses variando de 56 a 224 mg/kg). Cianazina foi inefectiva nesses casos (Hrelia et al., 1994). A taxa de letais dominantes aparentes em D. melanogaster aumentou quando as moscas foram alimentadas com rao contendo 0,01% de cianazina. A ausncia de efeitos em testes de aberrao cromossmica , contudo, levou concluso que o decrscimo na ecloso dos ovos estava mais ligada a toxicidade fisiolgica ao esperma (Murnik, 1976; Murnik & Nash, 1977). A possibilidade de cianazina ser um agente pr-mutagnico foi examinada em ensaios com S. typhimurium e S. cerevisiae empregando-se homogenados microssmicos de plantas (1S) e animais (S9), assim como in situ com o ensaio do plen ceroso em Z. mays (Means et al., 1988). Cianazina foi positiva no ensaio com Salmonella somente aps ativao com 1S, e no ensaio com Z. mays. Evidncia adicional da

natureza mutagnica da cianazina foi obtida quando extratos de plantas de milho tratadas com cianazina se mostraram mutagnicos a Salmonella (Means et al., 1988). Cianazina induziu fragmentao cromossmica, configuraes de fragmento ponte (bridges) e suspenso da metfase em clulas meristemticas de raiz de H. vulgare (Sharma & Panneerselvan, 1990), e de Tradescantia e V. faba. As plantas foram expostas por at 12 hrs a concentraes de cianazina entre 200 e 600 ppm. Houve uma clara tendncia para os efeitos diminurem com o aumento da dose nessas duas espcies, indicando toxicidade aguda do composto (Ahmed & Grant, 1972b). Esse baixo limiar de toxicidade da cianazina foi tambm observado quando formulaes comerciais foram estudadas com Tradescantia na presente pesquisa. A mais alta frequncia de microncleos foi obtida repetidamente na concentrao intermediria de 10 ppm, enquanto a soluo com 50 ppm resultava em frequncias menores. Cianazina mostrou-se um agente mutagnico de ao direta assim com um agente prmutagnico em todos os ensaios vegetais estudados, alm de mostrar-se capaz de induzir mutaes in situ no ensaio com Z. mays em doses recomendadas pela prtica agrcola normal (Means et al., 1988). Metolaclor causou danos nos cromossomos de linfcitos humanos in vitro a uma concentrao de somente 0,1 ppm (Roloff et al., 1992). A capacidade de homogenados microssmicos animais para ativar metolaclor em metablitos mutagnicos foi demonstrada em S. typhimurium e S. cerevisiae (Plewa et al., 1984). Metolaclor mostrou-se tambm mutagnico diretamente (sem ativao) em S. typhimurium, e uma misture de metolaclor e cianazina induziu mutaes in situ no ensaio do plen ceroso de Z. mays (Plewa et al., 1984). A atividade mutagnica de metolaclor em doses to baixas e com sistemas to variados est de acordo com os resultados obtidos com o ensaio Trad-MCN. Uma relao positiva entre dose e efeito foi observada em Tradescantia tratada com solues de metolaclor com concentraes variando entre 1 e 50 ppm. Embora metolaclor possa ser ativado por homogenados microssmicos, similarmente a cianazina, normalmente no h necessidade de sistemas externos de ativao no ensaio Trad-MCN, j que os talos da planta contm seu prprio complemento enzimtico (Ma, 1981).

O impacto biolgico desses pesticidas no ambiente uma funo da concentrao em que eles so encontrados e de sua atividade intrnseca frente a seres vivos. Os trs pesticidas estudados devem ser considerados potencialmente genotxicos, j que todos mostraram resultados positivos em testes que cobrem desde organismos procariticos at ensaios in vitro com clulas de mamferos, e dois deles (cianazina e metolaclor) foram positivos em ensaios com clulas humanas in vitro (Roloff et al., 1992). Em adio aos potenciais impactos genotxicos que esses compostos podem apresentar ao nvel de campo agrcola aqui estudado, sua distribuio no ambiente pode trazer riscos adicionais. Tanto cianazina quanto metolaclor estavam entre os pesticidas mais frequentemente encontrados em guas de rios e em guas de abastecimento em um estudo conduzido por seis anos no Canad (Frank et al., 1990). Estes compostos estavam presentes em quase 30% das amostras analisadas, e em concentraes de at 10 g/L para cianazina e at 28 g/L para metolaclor. Os nveis mximos de contaminao aceitveis (interino) para esses produtos no Canad so 10 e 50 g/L para cianazina e metolaclor, respectivamente, ou igual ao nvel mximo encontrado para cianazina, e apenas menos que o dobro do nvel encontrado para metolaclor (Frank et al., 1990). Estes dois herbicidas esto tambm entre os mais comuns contaminantes de gua de chuva (Richards et al., 1987). Cianazina apareceu em 25% de 325 amostras de gua de chuva coletadas em Iowa (EUA), em concentraes de at 28 g/L. Metolaclor ocorreu em 20,7% das amostras, com uma concentrao mxima de 2,7 g/L (Nations & Hallberg, 1992). Cianazina tambm tem sido encontrada contaminando guas subterrneas (Nations & Hallberg, 1992). Embora menores que as concentraes normalmente mencionadas em estudos de mutagenicidade em condies de laboratrio, a presena ubqua desses compostos no ambiente pode apresentar consequncias adversas. Na presente avaliao do potencial genotxico oferecido por clorpirifs, cianazina e metolaclor em Tradescantia, cada um dos compostos exerceu alguma clastogenicidade, mesmo nas baixas concentraes presentes aps uso agrcola normal. Tambm ficou aparente que, como detectado por um bioensaio muito sensvel, a reduo no uso de pesticidas alcanvel com a implementao de programas de MIP podem ser insuficientes para eliminar a genotoxicidade em campos pulverizados. Isto se deve ao fato de no ter sido possvel notar qualquer reduo na expresso de microncleos em Tradescantia nas amostras dos tratamentos

Alto para Mdio, no programa de MIP estudado. Este resultado reforado pelo tratamento Baixo (sem aplicao de pesticidas) no diferir do controle negativo em nenhum dos casos. Devido a sua sensibilidade extraordinria, o ensaio Trad-MCN pode ser qualificado como um sistema averso a risco para a avaliao de genotoxicidade no ambiente (Ennever et al., 1988; Grant & Salamone, 1994). Entretanto, dada a importncia de pragmaticamente alcanarem-se prticas de manuseio mais seguras para pesticidas, e considerando o valor de avaliaes biolgicas idneas para a anlise de qualquer programa de reduo no uso de pesticidas, estudos adicionais so necessrios. De especial interesse seria a avaliao das possveis atividades mutagnicas que os pesticidas poderiam exercer sobre as plantas sendo cultivadas, e da possibilidade de um programa de MIP reduzir o potencial genotxico imposto por esses pesticidas sobre as plantas cultivadas e as invasoras presentes em campos agrcolas. Nos experimentos descritos no prximo captulo, ensaios de mutagenicidade empregando plantas de milho e soja foram usados para conferir in situ os resultados apresentados para o ensaio Trad-MCN.

2. Tradescantia e o bioensaio do plo estaminal.

2.1 Trad-SHM: Fundamentos e desenvolvimento do bioensaio e reviso de sua utilizao em avaliaes de mutagnese ambiental
O ensaio da mutao em plo estaminal (Trad-SHM) baseia-se em mutao pontual (mittica) na qual suprimida a expresso do carter azul dominante em flores de plantas heterozigotas, resultando no aparecimento da cor rosa recessiva (Emmerling-Thompson & Nawrocky, 1982; Mericle & Mericle, 1967; Mericle & Mericle, 1971; Nayar & Sparrow, 1967). Os estudos iniciais com esse sistema centraram-se na avaliao dos efeitos genotxicos e citotxicos de radiao ionizante e empregaram as clulas meristemticas dos plos estaminais do clone 02 de Tradescantia em substituio a culturas microbianas. Nesse ensaio, crescimento normal dos plos era considerado equivalente a formao de colnias, e plos atrofiados a eliminao celular nas culturas, devido a efeitos severos, altamente deletrios ou letais. Em adio utilizao de mutao (alterao de cor) como indicador final das avaliaes, alteraes genotxicas como expresso de clulas gigantes, duplas ou triplas, bifurcao e outras anomalias de crescimento eram tambm

consideradas juntamente com a perda da integridade reprodutiva das clulas dos plos como indicadores de genotoxicidade (Nayar & Sparrow, 1967). A base gentica para expresso de clulas cor-de-rosa nos plos estaminais do clone 4430 de Tradescantia foi estabelecida por meio de cruzamentos recprocos com a linhagem parental rosa e branca T. subacaulis Bush (Emmerling-Thompson & Nawrocky, 1980). Determinou-se que pigmentao rosa era dependente de um par de alelos em um nico locus, sendo azul (B) dominante sobre rosa (b); e demonstrouse que o clone 4430 homozigoto dominante para o locus branco. A identidade espectrofotomtrica de ambos pigmentos, rosa e azul, de quatro clones diferentes de Tradescantia est determinada (SandaKamigawara & Ichikawa, 1993). Mutao para rosa, assim como perda de integridade reprodutiva nos plos estaminais de vrias espcies e hbridos de Tradescantia (Ichikawa & Sparrow, 1967a; Ichikawa & Sparrow, 1967b; Ichikawa & Sparrow, 1968; Ichikawa & Sparrow, 1969; Ichikawa et al., 1969; Sparrow & Ichikawa, 1967) tornaram-se importantes indicadores para o estudo da atividade genotxica das radiaes (Alvarez & Sparrow, 1965; Kappas et al., 1972; Nauman et al., 1976; Nauman et al., 1974; Sparrow et al., 1973; Underbrink et al., 1973a; Underbrink et al., 1971). Sparrow e colaboradores (1972) estudaram os efeitos de neutrons e raios-X com o ensaio Trad-SHM (clone 02), estabelecendo um relao linear entre dose-resposta para ambos os agentes, e uma dose duplicadora da taxa de mutao de apenas 1 rad para raios-X. As frequncias espontneas de mutao de vrias espcies e hbridos de Tradescantia foram definidas com base em muitos anos de investigao no Brookhaven National Laboratory (Sparrow & Sparrow, 1976). Hbridos (i.e., clone 4430) e hbridos putativos (i.e., clone 02) apresentaram frequncias e variao menores na mutao espontnea quando comparados com clones de espcies puras, e foram considerados mais adequados para experimentao. Os efeitos da radioatividade natural sobre a expresso de mutaes foram estudados em vos orbitais (Sparrow et al., 1968) e pelo cultivo de Tradescantia em areia monaztica (Nayar et al., 1970). Notou-se que a taxa de mutao aumentava com todas as amostras, e os radionucldeos absorvidos pelas plantas eram muito mais efetivos que a simples radiao externa. Estes resultados foram mais tarde confirmados pela exposio

de plantas a solos coletados no campo experimental de exploses atmicas das Ilhas Bikini (Ichikawa & Ishii, 1991a). Solos que causavam aumentos significativos nas frequncias de mutao continham 137Cs e 60Co, entre outros radionucldeos. Outros estudos envolvendo a absoro de radionucldeos incluem compostos de trtio (Nauman et al., 1979; Tano et al., 1984) e 131I (Tano & Yamaguchi, 1979). O ensaio Trad-SHM foi empregado in situ para monitorar radiao ionizante nas vizinhanas de usinas nucleares em um estudo de larga escala realizado no Japo (Ichikawa, 1981). Aumentos significativos nas frequncias de mutao estavam correlacionados tanto com a direo preferencial dos ventos quanto com os perodos de efetivo funcionamento das usinas. Cebulska-Wasilewska (1992) observou incremento nas frequncias de mutao em Trad-SHM correlacionadas com contaminao causada em Cracvia pela exploso do reator de Chernobyl (a uma distncia de 700 km). Incrementos similares na taxa de mutao foram tambm notificadas de maio a junho de 1986 no Japo (mais de 800 km de distncia) (Ichikawa et al., 1996). Nesse caso, variaes na taxa espontnea de mutao registradas em um perodo de 10 anos (1982 a 1992) sempre podiam ser explicadas pelo fator temperatura, ao contrrio desse incremento em 1986. Exposies a radiao tambm permitiram a padronizao do ensaio Trad-SHM em relao a variaes de temperatura (Nauman et al., 1977a; Nauman et al., 1977b), dose (Nauman et al., 1977c; Nauman et al., 1975), e outras variveis comuns das condies de experimentao (Underbrink & Sparrow, 1974; Underbrink et al., 1975a; Underbrink et al., 1975b). A aplicabilidade do ensaio Trad-SHM a estudos de mutagnese qumica foi proposta por Underbrink et al. (1973b) e testada em comparao aos efeitos de radiao e EMS e DBE gaseificados (Nauman et al., 1976). As respostas a agentes qumicos apresentaram caractersticas similares quelas dos raios-X (incremento exponencial seguido de saturao na frequncia de clulas mutantes), e o clone 4430 foi mais sensvel que o clone 02. Estes resultados foram posteriormente confirmados com uma variedade de compostos qumicos e radionucldeos (Tano, 1987; Tano, 1990; Tano & Yamaguchi, 1985). Nesses estudos, os agentes mutagnicos foram aplicados topicamente, diretamente sobre as inflorescncias. Doses diminutas de 5 a 20 pg de N-nitroso-N-methiluria e N-nitroso-N-etiluria, e 100 pg de EMS foram efetivas e detectveis no teste Trad-SHM. O limite de deteco para radiao externa estava abaixo de 1 rad.

Essa alta sensibilidade do ensaio Trad-SHM a agentes mutagnicos qumicos foi primeiramente demonstrada aps exposio acidental das plantas (clone 02) a vapores que contaminavam o suprimento de ar de um laboratrio em Brookhaven. Um incremento sbito nas frequncia espontnea de mutaes levantou a suspeita que levou descoberta da contaminao (Sparrow & Schairer, 1971). Estudos adicionais com TradSHM na avaliao de agentes qumicos envolvem hidrazida malica (Gichner et al., 1982b), MMS, EMS, DMS (dimetil sulfato) (Ichikawa et al., 1990; Ichikawa & Takahashi, 1978; Sanda-Kamigawara et al., 1991), compostos N-nitroso e vrios solventes orgnicos, entre outros, assim como avaliaes de ao sinergstica entre agentes qumicos, e entre esses e radiaes (Badaev et al., 1989; Gichner et al., 1994; Gichner et al., 1982a; Gichner et al., 1988; Ichikawa, 1992; Ichikawa et al., 1990; Ichikawa et al., 1993; Kuglik et al., 1994; Sanda-Kamigawara et al., 1991; Shima & Ichikawa, 1994; Shima & Ichikawa, 1995a; Shima & Ichikawa, 1995b; Veleminsky et al., 1987; Villalobos-Pietrini et al., 1986). Demonstrou-se que o ensaio Trad-SHM ainda capaz de ativar agentes promutagnicos em agentes mutagnicos de ao direta (Gichner et al., 1980). Benzo--pireno, atrazina, e vrios compostos N-nitroso foram mutagnicos quando testados sem tratamento prvio com fraes microssomais (Veleminsky & Gichner, 1988). Xiao e Ichikawa (1995; 1996) relataram a ativao de hidrazida malica (MH) em um agente mutagnico por ao de peroxidase, e demonstraram que MH agia sinergisticamente (Cebulska-Wasilewska et al., 1981) e antagonisticamente com raios-X quando esses eram aplicados antes e depois da MH, respectivamente. Os rais-X suprimiam a ativao da MH quando aplicados a posteriori. Uma reviso da mutagenicidade de radiaes ionizantes e agentes qumicos estudada com Trad-SHM foi oferecida por Ichikawa (1992). Talvez a contribuio mais importante do ensaio Trad-SHM tenha sido uma srie de estudos sobre poluio atmosfrica realizado com um laboratrio mvel, nos EUA (Schairer, 1979; Schairer & Sautkulis, 1982; Schairer et al., 1982; Schairer et al., 1979; Schairer et al., 1983). Ar obtido em locais poludos induziam maiores frequncias de mutaes que ar filtrado das mesmas localidades ou ar coletado em reas controle, como o Grand Canyon. A mutagenicidade de atmosferas poludas (Sparrow & Schairer, 1974) tem sido tambm demonstrada nas vizinhanas de refinarias de leo e complexos petroqumicos (Lower et al., 1983a), fundies de chumbo (Lower et al., 1978; Lower et al., 1983b), fbrica de remdios (Cebulska-

Wasilewska & Guminska, 1987), e incinerador municipal de resduos slidos (Ma, 1994; Ma et al., 1993b; Ma et al., 1996). A atividade mutagnica de fumaas qumicas usadas pelo exrcito Norte-Americano tambm foi avaliada com Trad-SHM. Respostas positivas foram obtidas com fogoil e diesel para tanques, bem como para sua combinao (Schaeffer et al., 1987). Oznio, em concentraes ocasionalmente encontradas em reas poludas (300 a 800 ppb) no apresentou mutagenicidade no ensaio Trad-SHM (Gichner et al., 1992; Rodrigues et al., 1996), embora tenha sido positivo em concentraes mais altas (Schairer, 1979). Uma reviso do Trad-SHM como um ensaio para agentes mutagnicos gasosos foi publicada sob o Programa Gene-Tox, da USEPA (Van't Hof & Schairer, 1982). Em adio a estudos de agentes gasosos, Trad-SHM tem sido usado para avaliao de ambientes aquticos (Lower et al., 1985; Tano, 1989). Episdios de mutagenicidade nas guas de um reservatrio no estado Norte-Americano do Missouri apresentavam correlao com eventos que promoviam a transferncia dos agentes mutagnicos dos sedimentos para a coluna dgua (Lower et al., 1985). Grant e colaboradores (1992) analisaram in situ a genotoxicidade das guas em uma rea do Lago Superior nas vizinhanas de uma fbrica de papel e celulose usando Trad-SHM, Trad-MCN, e o ensaio de aberrao cromossmica com Vicia faba. Embora Trad-SHM fosse suficientemente sensvel para detectar atividade mutagnica, o ensaio foi considerado inferior aos outros em termos de facilidade para manipulao a campo, sendo que reas remotas trazem dificuldade para o cultivo das plantas no longo (14 dias) perodo de recuperao necessrio para esse teste. H escassz de informaes sobre atividade mutagnica de pesticidas em Trad-SHM (Mohammad & Ma, 1983). Tomkins e Grant (1972) estudaram os efeitos de menazon (um inseticida do grupo s-triazina), metobromuron (herbicida do grupo das urias substitudas), e Daconil 2787 (clorotalonil, fungicida do grupo dos hidrocarbonetos aromticos clorados), embrulhando inflorescncias de Tradescantia com algodo embebido em solues dos pesticidas (1500 ppm). Nenhuma resposta positiva foi obtida. A mutagenicidade do herbicida e regulador de crescimento hidrazida malica j foi demonstrada (Gichner et al., 1982b; Xiao & Ichikawa, 1995; Xiao & Ichikawa, 1996). O fungicida derivado de benzimidazol Benlate (benomil) foi testado em Trad-SHM (clone KU 20) em doses normalmente usadas na agricultura (0,5 a 4,0 g/l) (Sakamoto

& Takahashi, 1981). Novamente no houve resposta positiva. Em contraste com esses resultados, sete de nove inseticidas foram positivos quando testados com Trad-SHM usando o clone 4430 (Huang & Chen, 1993a). Diclorvs (0.1%), ometoato (0.04%), metamidofs (9.05%), Meobal (3,4-xylyl metilcarbamato) (0.05%), mevinfs (0.006%), Amobem (cloramben, em verdade um herbicida) (0.045%) e metil tiofanato (0.07%) resultaram positivos, enquanto triclorfon (0.1%) e Bassa (2-sec-butilfenil metilcarbamato) (0.02% efeito txico registrado) foram negativos. Atrazina resultou mutagnica aps exposio crnica (Schairer & Sautkulis, 1982), e cianazina tambm foi notificada como mutagnica em Trad-SHM (Veleminsky & Gichner, 1988). Um resumo dos resultados at hoje obtidos com Trad-SHM na avaliao de mutagnese ambiental est atresentado na tabela 8. Tabela 8 - Resumo dos resultados de avaliaes de mutagnese ambiental obtidos com o ensaio do plo estaminal em Tradescantia (Trad-SHM). Dosagem Tempo de Concentrao Exposio max Poluio atmosfrica Monitoramento in situ Vrias localidades 10 d poludas nos EUA Agente Resultado +/- Significncia estatstica

Comentrios

Referncia

Metalurgia de chumbo

Exposio crnica

0,3 - 11 km +/da fonte

Schairer, 1979; Schairer & Sautkulis, 1982; Schairer et al., 1982 p<.001 No ocorreu correlao entre Lower et al., taxa de mutao e distncia da 1978; Lower metalrgica. et al., 1983b p<.001 Todos os testes foram estatisticamente positivos para uma localidade no Texas, em relao aos controle da casa de vegetao. Respostas positivas obtidas em 7 de 13 exposies. Gases queimados na fonte de emisso. Resultados positivos obtivos com atmosfera estagnada. p>0.9 Lower et al., 1983a

p<.05

Taxas de mutao mais altas associadas com processamento de petrleo.

Refinaria de petrleo

Exposio crnica

100 - 500 m da fonte

Emisses gasosas de um aterro sanitrio Incinerador minicipal Fumaas qumicas

4 - 6 hrs

Ma et al., 1993a

4-6 hrs

Ma et al., 1993b Schaeffer et al., 1987

30 min

15 - 100 m da fonte

Agente

Dosagem Resultado Tempo de Concentrao +/- Significncia Exposio estatstica max Gases selecionados, em cmaras NO 6 hrs 250 ppm + p<.01

Comentrios

Referncia

6 hrs NO2 6 hrs SO2 DBE 6 hrs SEM 6 hrs Cloreto de 6 hrs vinila 6 hrs O3 O3 11 hrs/d

50 ppm 40 ppm 1 ppm 5 ppm 75 ppm 5 ppm 800 ppb

+ + + + + + -

p<.05 p<.01 p<.01 p<.01 p<.02 p<.02 p=.68

Schairer & Sautkulis, 1982; Van't Hof & Schairer, 1982 Gichner et al., 1992

O3

6 hrs/d

100 ppb

p>.05

Exposio cumulativa, trs dias

Rodrigues et al., 1996

Poluio da gua Monitorao In situ gua de um 24 hrs lago

Sedimento de fundo

Exposio crnica

Lago poludo com efluentes de fabricao de papel e celulose. Resultados foram inconclusivos. p<.005 Taxas de mutao foram altas em todos os 91 dias do perodo experimental.

p<.05

Grant et al., 1992

Lower et al., 1985

Agentes qumicos selecionados, em soluo 24 hrs 3.9 x 10-5 M + Benzo-pireno

p<.01

Cafeina NaN3 Benzidina SEM

Crnico 3 hrs 24 hrs 6 hrs

10-3 M 10-3 -7 5.4 x 10 M 10 ppm

+ + +

p>.05 p<.01 p<.01 Relao dose-resposta positiva de 10 a 500 ppm. Idem. Solues qumicas aplicadas diretamente sobre as inflorescncias.

Schairer & Sautkulis, 1982; Van't Hof & Schairer, 1982 Nauman et al., 1976 Ichikawa et al., 1990; Ichikawa & Takahashi, 1978; SandaKamigawara et al., 1991; Tano, 1987; Tano, 1990;

DBE EMS

6 hrs Agudo

10 ppm 100 ng +

Agente Tempo de Exposio max

Dosagem Concentrao

Resultado +/- Significncia estatstica

Comentrios

Referncia

Compostos N-nitrosos Hidrazida maleica

Agudo Agudo

100 ng + +

Ocorreu sinergismo com raios-X aplicados antes que hidrazida, e supresso dos efeitos com raios-X aplicados a posteriori.

Tano & Yamaguchi, 1985 Xiao & Ichikawa, 1995; Xiao & Ichikawa, 1996 Gichner et al., 1982b

compostos N-nitrosos Pesticidas Atrazina

24 hrs

Vrios +

Crnico

0.045 mg

p<.01

Dose aplicada por vaso

Van't Hof & Schairer, 1982 Tomkins & Grant, 1972 Sakamoto & Takahashi, 1981 Huang & Chen, 1993a

Menazon

24 hrs

1500 ppm -

p>.05 p>.05

Metobromuron Tetracloro isoftalonitrilo Benomil 2 hrs

1500 ppm 1500 ppm 4 g/L -

Inflorescncias embrulhadas com algodo embebido no pesticida. Dose equivalente recomendada para uso.

Nove inseticidas Radiao raios- de 60 Co Areia monaztica Raios-X

Vrios

+/-

Resposta positiva em sete de nove compostosos

16 hrs

500 R

Frequncia de mutaes diminuam acima de 300 R. p<.05

Nayar & Sparrow, 1967 Nayar et al., 1970

Crnico

1.3 mR/hr

mins

160 R

Relao dose-resposta positiva entre 10 e 160 rad. p<.01 Relao dose-resposta positiva entre 0,25 e 5 rad. Relao dose-resposta positiva entre 0,01 e 8 rad. Compostos marcados com Trtio e 131 I. Relaes doseresposta positivas. p<.05 Aumentos significativos nas taxas de mutao

Nauman et al., 1976 Sparrow et al., 1972 Tano, 1987

Raios-X

mins

100 R

Nutrons

mins

10 R

p<.01

Radiao endgena

Agudo

100 nCi

Exposio in situ a usinas

Crnico

Ichikawa, 1981

Agente Tempo de Exposio max nucleares

Dosagem Concentrao

Resultado +/- Significncia estatstica

Comentrios

Referncia

estavam relacionados com perodos de operao das usinas e direo dos ventos. 150 R/hr + p<.01 Radionucldeos principais eram 137Cs e 60Co. Logo aps o acidente de Chernobyl. Plantas expostas em Cracvia, 700 km da fonte de radiao. Logo aps o acidente de Chernobyl. Plantas expostas no Japo, 8.000 km da fonte de radiao. Ichikawa & Ishii, 1991a CebulskaWasilewska, 1992 Ichikawa et al., 1996

Solos das Ilhas Bikini Exposio in situ a atmosfera contaminada Exposio in situ a atmosfera contaminada

76 d

Crnico

p<.05

Crnico

2.2 Avaliao de um programa de MIP com o ensaio Trad-SHM

Dando sequncia aos estudos de genotoxicidade dos pesticidas aplicados em um programa de MIP, o ensaio Trad-SHM foi aplicado in situ, a fim de averiguar os resultados obtidos com Trad-MCN, descritos acima. Alm desses ensaios, os testes do mosaicismo em folhas de soja, e do gro de plen ceroso em milho foram tambm realizados (Rodrigues et al., 1998b), e sero discutidos em uma outra oportunidade, quando da realizao de cursos especficos.

2.3 Material e Mtodos 2.3.1 Linhagem de Tradescantia, Multiplicao e Manuteno

O clone 4430 de Tradescantia foi utilizado para o ensaio Trad-SHM in situ. Clone 4430 um diplide hbrido entre T. hirsutiflora Bush (2461C) de flr azul, e T. subacaulis Bush (2441), de flr cr-derosa. Para mais informaes sobre a origem, caractersticas e manuteno desse clone veja seo 1.4.2.

2.3.2 Exposio, Amostragem, e Anlise

Para cada experimento, 25 a 30 hastes florais (por tratamento) contendo inflorescncias jovens foram colhidas 24 hrs antes do incio da exposio e transferidas para uma cmara de ambiente controlado (para detalhes veja seo 1.4.2). As hastes florais foram mantidas em gua deionizada e aeradas por 24 hrs

para adaptao. As hastes foram ento transferidas para vasos tipo beaker embrulhados em papel alumnio contendo soluo de Hoagland (diluio 1/3) e trazidas para o campo de demonstrao de MIP em uma caixa hermeticamente fechada no dia seguinte aplicao dos pesticidas. Exposio consistiu na colocao dos vasos contendo as inflorescncias sobre o solo umidecido, cobrindo-os com um vaso de PVC invertido, por 14 hrs (veja seo 1.4.5 para detalhes). Aps exposio as amostras foram trazidas ao laboratrio em caixa hermeticamente fechada, as solues nutrientes foram substitudas por outras frescas, e as hastes florais conservadas sob aerao durante o perodo de recuperao. O ensaio Trad-SHM requer um perodo de recuperao de ao menos 14 dias, o tempo necessrio para que os botes florais contendo plos estaminais primordiais ao tempo de exposio floresam, expondo os plos desenvolvidos para avaliao. Durante o perodo de recuperao as hastes florais foram continuamente aeradas, as solues nutrientes trocadas diariamente, e as folhas murchas removidas. A partir do oitavo dia, as flores recentemente abertas foram coletadas e os estamens removidos, colocados em lminas de microscopia contendo uma gta de soluo etanol:glicerina (1:1 v/v) e avaliadas quanto proporo de clulas rosa sob magnificao de 40x em estereomicroscpio. O nmero de plos por estamen para cada dia de avaliao foi estimado contando-se os plos em dois estamens anti-spala e dois anti-ptala de duas flores obtidas ao acaso (Ichikawa & Ishii, 1991b). Um evento mutagnico consistiu de uma ou uma sequncia de clulas rosas adjacentes, entre as clulas dominantes azuis, em qualquer posio no plo estaminal (Underbrink et al., 1973b). Ao menos cinco flores foram avaliadas por tratamento por dia, totalizando 1800 plos/tratamento/dia. O nmero de eventos mutagnicos por flr foi transformado em eventos/1000 plos. A frequncia mdia de mutao de cada tratamento foi comparada para todos os dias em conjunto e para o dia que apresentava maior frequncia total de eventos mutagnicos. Anlise de varincia (ANOVA) foi utilizada para a comparao das mdias dos tratamentos; e Students t-test assumindo varincias equivalentes (nenhuma tendncia assumida a priori nos dados) e =0,05 foi empregado para a comparao entre o controle e os tratamentos.

2.4 Resultados
Um primeiro passo para a anlise dos resultados de ensaios Trad-SHM a determinao do dia no qual a maioria dos plos estaminais em formao ao tempo da exposio se expressam nas flores em avaliao. O dia 10 aps exposio produziu a maior taxa total de mutao para todos os tratamentos combinados, indicando ser este o dia mais apropriado para anlise (Figura 7)

45 40 Total de clulas rosa 35 30 25 20 15 10 5 0 Dia 8 Dia 9 Dia 10 Dia 11 Dia 12 Dias aps exposio

Figura 7 Taxa de mutao combinada no ensaio Trad-SHM aps exposio in situ a campos pulverizados com pesticidas. Hastes florais de Tradescantia foram expostas por 14 hrs colocando-se vasos tipo beaker contendo inflorescncias diretamente sobre o solo umidecido. O pico na taxa de mutao no dia 10 indica compleio do perodo de recuperao, e o dia mais apropriado para avaliao.

Um aumento significativo (=0,05) na frequncia de mutaes foi observado no ensaio Trad-SHM entre o tratamento Baixo e Alto no dia 10 aps exposio (figura 8). Contrariamente aos resultados obtidos com Trad-MCN (seo 1.5.3), no se observou aumento na frequncia de mutaes no tratamento Mdio.

16 Eventos rosa / 1000 plos 14 12 10 8 6 4 2 0 Controle Baixo Mdio Alto EMS

Figura 8 Mutao em plos estaminais de Tradescantia no dia 10 aps exposio a campo pulverizado com pesticidas. As barras representam desvios padro das mdias. O tratamento Controle consistiu de soluo nutriente Hoagland, o controle positivo (EMS) consistiu de uma soluo a 100-ppm de etilmetanosulfonato de etila. O tratamento Baixo no recebeu pesticidas, o Mdio recebeu cianazine + metolaclor em faixas, e o Alto recebeu cianazina + metolaclor e clorpirifs em toda rea. Os pesticidas foram aplicados 24 hrs antes da exposio.

O tratamento Baixo (sem aplicao de pesticidas) induziu um nvel de mutaes consistente com a taxa espontnea para o clone 4430 (Sparrow & Sparrow, 1976), sugerindo que as condies de exposio foram adequadas. O controle positivo (EMS) foi efetivo, causando um aumento na taxa de mutaes em relao taxa espontnea (representada pelo tratamento Baixo), confirmando o dia 10 como o perodo no qual os plos estaminais em formao ao tempo da exposio atingiram completo desenvolvimento. Ocorreu um inexplicvel alto nvel de mutaes para o controle negativo nesse experimento, o que confundiu os resultados finais. Esse problema estava tambm presente nos resultados da soma de todos os dias de avaliao agrupados, como aparece na Figura 9.

12 Eventos rosa / 1000 plos 10 8 6 4 2 0 Controle Baixo Mdio Alto EMS

Figura 9 - Mutao em plos estaminais de Tradescantia para o conjunto de dias de avaliao, aps exposio a campo pulverizado com pesticidas. As barras representam desvios padro das mdias. O tratamento Controle consistiu de soluo nutriente Hoagland, o controle positivo (EMS) consistiu de uma soluo a 100-ppm de etilmetanosulfonato de etila. O tratamento Baixo no recebeu pesticidas, o Mdio recebeu cianazine + metolaclor em faixas, e o Alto recebeu cianazina + metolaclor e clorpirifs em toda rea. Os pesticidas foram aplicados 24 hrs antes da exposio.

Novamente, a mesma tendncia foi observada, com a frequncia de mutaes aumentando do Tratamento Baixo para o Alto, e com o controle negativo mostrando uma taxa comparvel do controle positivo. Embora fragilizado por essa anomalia, os resultados obtidos com Trad-SHM do suporte, ou corroboram aqueles obtidos com Trad-MCN, sob as mesmas condies experimentais.

3. Concluso
As abundantes informaes bsicas sobre a gentica e o desenvolvimento de Tradescantia oferece uma slida estrutura de suporte para seu uso como como um bioindicador para ensaios de toxicidade gentica ambiental (Ma & Grant, 1982). Microncleos nas clulas-mes dos gros de plen so facilmente

observveis, permitindo um baixo grau de incerteza nas avaliaes, e diminuindo a subjetividade presente no reconhecimento de aberraes cromossmicas; enquanto a induo de mutaes para rosa em clulas dos plos estaminais oferecem um indicador somtico sensvel de mutagnese. Adicionalmente, os ensaios com Tradescantia tm se provado valiosos nos estudos de sinergismo entre agentes qumicos e entre esses e outros agentes genotxicos como radiaes, uma propriedade valiosa para a avaliao de riscos genotxicos em situaes ambientais complexas (Shima & Ichikawa, 1995b). Grant (1994) analisou recentemente a situao atual dos ensaios com plantas superiores para deteco de agentes mutagnicos ambientais, indicando as vantagens desses sistemas em relao possibilidade de se realizarem avaliaes in situ. Em um estudo recentemente patrocinado pelo Programa Internacional de Seguridade Qumica a utilidade dos dois ensaios com Tradescantia aqui discutidos (bem como outros trs ensaios vegetais) foi avaliada com quatro reconhecidos agentes qumicos genotxicos (Grant & Salamone, 1994) em cinco laboratrios diferentes (Sandhu et al., 1994a; Sandhu et al., 1994b). Os resultados obtidos nesse estudo consubstanciaram o ensaio Trad-SHM como um sistema confivel para a averiguao das propriedades mutagnicas de agentes qumicos (Ma et al., 1994a). Em relao ao ensaio Trad-MCN, embora os resultados obtidos para os quatro agentes no tenham sido idnticos, houve uma boa concordncia entre todos os laboratrios, sugerindo ser este um bioensaio confivel para clastogenicidade (Ma et al., 1994b), e como tem sido indicado nesse levantamento bibliogrfico (Rodrigues et al., 1997) TradMCN especialmente apropriado para a monitorao de agentes genotxicos in situ. Em concluso, os estudos aqui revisados demonstram que os ensaios baseados em Tradescantia oferecem sistemas facilmente manipulveis e muito sensveis para o estudo de toxicidade gentica, especialmente para as condies in situ indispensveis em estudos ambientais.

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