Punto Isoelctrico de Aminocidos y Protenas

Objetivos:
Calcular los valores de pKa de un aminocido polar con carga y un aminocido no polar, utilizando la titulacin con lcali. Determinar el punto isoelctrico de los aminocidos polares y no polares del grafico pH vs volumen de base. Mediante la tcnica de precipitacin determinar el punto isoelctrico de una protena.

Introduccin:
El punto isoelctrico es el pH al que una sustancia anftera tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminocidos y tambin en las protenas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancio es casi nula. Para calcularlo se deben utilizar los pKa. Las molculas complejas, tales como las protenas, se combinan con los iones hidrgenos y con otros iones presentes en la disolucin, dando lugar a la carga neta de la molcula. A la concentracin de iones hidrgeno, o al pH, para el cual la concentracin del ion hbrido de una protena es mxima y el movimiento neto de las molculas de soluto en un campo elctrico es prcticamente nulo, se le denomina punto isoelctrico. (Wall Street journal, 2009). La presencia de grupos acido (-COOH) y bsico (-NH2) otorga a los aminocidos unas propiedades cido base caractersticas. En medios cidos fuertes, tanto el grupo amino como el grupo cido se encuentran protonados. Al subir el pH se desprotona el grupo ms cido, H de menor pKa, formndose una especie neutra llamada Zwitterin. Cuando el aminocido se encuentra en medios bsicos pierde el protn del grupo amino, dando lugar a la especie desprotonada. Se llama pH isoelctrico o punto isoelectrico al pH en el que la concentracin de Zwitterin es mxima (el aminocido no presenta carga neta). (Fernndez, G, 2009)

Materiales:
Buretas Soportes Pinzas de bureta Matraces de 125ml y 250mL Pipetas de 25mL Potencimetro de pH

Reactivos:
Reactivo Acido glutmico C5H9NO4 Glicina NH2CH2C OH Propiedades fsicas Densidad Masa molar Punto de fusin Apariencia Propiedades qumicas 1460 kg/m3; 1,46 g/cm3 Solubilidad en agua 147,13 g/mol 472,15 K (199 C) slido blanco Toxicologa Causa irritacin, nauseas, vomito Muerte por hiperactivid ad

cido clorhdrico HCl

Hidrxido de sodio NaOH

Etanol

Acidez 2,4; 9,8 pKa Solubilidad en agua Densidad 1607 kg/m3; 1,607g/cm3 225 g/l Punto Masa molar 75,07 g/mol isoelctrico(pH)5,97 Punto de fusin 509 K (236 C) Apariencia lquido incoloro o Acidez -6.2pKa levemente amarillo Densidad 1190 (solucin 37%) 1160 solucin 32% 1120 solucin 25% kg/m3; 1.12 g/cm3 Masa molar 36.46 g/mol Punto de 247 K (-26 C) fusin Punto de 321 K (48 C) ebullicin Viscosidad 1.9 Estado de agregacin Slido Solubilidad en agua Apariencia Blanco 3 g/100 ml (20 C) 111 Densidad 2100 kg/m3; 2,1 g/cm Masa molar 39,99713 g/mol Punto de fusin 591 K (318 C) Punto de ebullicin 1 663 K (1 390 C) Estado de Lquido Acidez15,9 pK
a

Es corrosivo puede causar vmito, diarrea.

Puede 111 g/100 ml (20 C causar irritacin al contacto, igual que quemaduras Puede 15,9 pK

C2H5OH

agregacin Apariencia Densidad Masa molar Punto de fusin Punto de ebullicin Temperatura crtica Presin crtica Viscosidad

Incoloro 789 kg/m3; 0,789g/cm3 46,07 g/mol 158,9 K (-114 C) 351,6 K (78 C) 514 K (241 C) 63 atm 1.074 mPas a 20 C.

Solubilidad Miscible en agua

causar mareos y confusin al ser inhalado por mucho tiempo

Miscibl

Eter C4H10O Agua H2 O Densidad: 1.000,00 kg/m Masa molar: 18,0153 g/mol Punto de ebullicin: 99,98 C Punto de fusin: 0,0 C ----------

Sistema de anestesia. Narcosis ------------

Procedimiento:
I. Titulacin de aminocidos: 1. Agregamos 25 mL de aminocido en un vaso qumico de 250 mL. 2. titulamos con NaOH a 0,2M. 3. Lemos el pH inicial, y despus de cada mL de NaOH agregado. 4. Tabulamos y confeccionamos el grfico correspondiente. 5. Estimamos pIexp y comparamos con pIteo. Punto isoelctrico y solubilidad: 1. Preparamos 3 tubos de ensayo con 3mL de H2O, 3mL de S.A. con pH4.0 y 3mL de S.A con pH10. 2. Aadimos cristales de glicina, agitamos. 3. Anotamos el resultado observado. 4. Repetimos con triptfano y acido asprtico. Determinacin del pI de la casena de la leche: 1. Aadimos 50 mL de leche en un vaso qumico ms 150 mL de H2O. 2. Titulamos con HCl 2%, y lemos el pH en cada 0.5 mL agregados. 3. Observamos hasta que la leche precipite completamente. 4. Comparamos pI observado con el pI terico.

II.

III.

Resultados: I. Titulacin de aminocido:

Grfica 1. Curva de titulacin de aminocido

Cuadro 1. Valores obtenidos de pH para el aa.

mL pH

mL OH- vs pH

0 1.0 12 1 1.0 10 2 1.1 3 1.1 8 4 1.2 5 1.3 6 6 1.5 4 7 1.6 8 1.8 2 9 2.0 10 2.2 0 0 5 10 15 20 11 2.4 Equivalente de OH 12 2.7 13 3.5 14 8.3 Con respecto al grfico Podemos calcular pI: 15 9.2 podemos estimar: 16 9.6 pKa1: 2.8 17 9.9 pKa2: 9.6 18 10.1 19 10.4 Valor terico pI: 6.10 20 10.8 21 11.2 22 11.4 Como resultado obtenemos una grfica (grfica 1) que presenta un acenso acelerado de su pH en un momento determinado. Sabemos que este es el momento donde se expresa el punto isoelctrico de nuestra titulacin, el punto inicial corresponde a la parte positiva y la final a la parte negativa y el punto isoelctrico es aquel donde se encuentra como in dipolar. En nuestro vaso qumico tenamos fenilalanina con HCl, con pH inicial de 1.0. Podemos estimar el valor de pIexperimental que corresponde a aproximadamente 6.2, mientras que pIterico es 6.1, un valor cercano al estimado. Si observamos los valores presentes en el cuadro 1, se aaden 22 mL de NaOH 0,2M, y probablemente encontramos ciertas fuentes
pH

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de error que se pudieron deber a los instrumentos o mediciones inexactas a la hora de trabajar. II.

Punto isoelctrico y solubilidad:

Cuadro 2. Resultados de solubilidad H2O pH4 Soluble Soluble Insoluble Insoluble Soluble Soluble pH10 Soluble Insoluble Insoluble

Reactivo Glicina Triptofano Acido asprtico

Para la solubilidad debemos considerar que en agua los aminocidos tienden a ser poco solubles en su punto isoelctrico. Continuando tenemos que en el cuadro 2 se presenta el resultado de solubilidad obtenido en el laboratorio. Para la glicina fue completamente soluble; triptfano fue completamente insoluble en todos los casos; y el acido asprtico fue soluble en los 2 primeros casos.

Imagen 1. Solubilidad de los diferentes reactivos. De izquierda a derecha podemos apreciar las 3 muestras de triptfano, acido asprtico y glicina

Debemos considerar que los aminocidos tienen a ser sustancias anfteras, y hacemos referencia a esto porque son capaces de ionizarse, dependiendo del pH en el que se encuentren. Probablemente un caso de error en este laboratorio fue el exceso de solido en las diferentes muestras liquidas, ocasionando poca disolucin y saturacin. Tenemos al triptfano el cual tiende a repeler el agua, es un aminocido hidrofbico al igual que la glicina, en nuestra prueba la glicina es soluble. Mientras que el cido asprtico es hidroflico y tiende a asociarse con el agua.

III.

Determinacin del pI de la casena de la leche:

Cuadro 3. pH para la casena de la leche pH mL de HCl 2% 6.85 8.0 6.70 8.5 6.61 9.0 6.50 9.5 6.42 10.0 6.25 10.5 6.16 11.0 6.09 11.5 6.02 12.0 5.94 12.5 5.86 13.0 5.79 13.5 5.70 14.0 5.65 14.5 5.63 15.0 5.55 15.5 pH 5.53 5.48 5.42 5.39 5.28 5.27 5.19 5.12 5.10 4.98 4.99 4.82 4.70 4.58 4.54 4.51

mL de HCl 2% 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

En el cuadro 3 se aprecia las variaciones de pH de la casena a medida que se le adicionaban 0.5 mL de HCl 2%. Partimos de un pH de 6.85; adicionamos 14.0 mL de HCl 2% para que se diera la formacin de la casena llegando a un pH de 4.70 El pH en el que precipitan las protenas de la leche es el punto isoelctrico (pI), en este caso nuestro valor de pI(experimental) es de 4.70 (resaltado en negritas del cuadro 3), consultando encontramos el valor de pI(terico) que corresponde a 4.60 para la leche, nuestro valor es muy cercano al terico, de diferencia solo tenemos 0.10. Este resultado cercano se puede deber a posibles errores en la titulacin, o bien diferentes propiedades en la leche, como la marca la cual pudo haber influido debido a que a veces no se conservan las mismas concentraciones proteicas en las diferentes marcas de la leche, y tienden a variar un poco en la
Imagen 2. Titulacin de la leche prxima a precipitar.

formacin del precipitado.

Conclusin:
El pKa es la fuerza que tienen las molculas de disociarse, un cido ser ms fuerte cuanto menor es su pKa y en una base ocurre al revs, que es ms fuerte cuanto mayor es su pKa. Esta consta de disociacin no es fija, ya que puede variar por efecto de temperatura o concentracin e incluso por la accin de un catalizador. Las curva de titulacin nos permiti determinar el pKa, y por medio de esto, el punto isoelctrico del aminocido fenilalanina. El conocer el comportamiento cido-base de los aminocidos es de vital importancia para realizar este procedimiento. Conociendo el punto isoelctrico de una determinada molcula, es posible aislarla,. El punto isoelctrico se refiere al pH en el cual las protenas son menos solubles. Mediante la titulacin con cido clorhdrico logramos alcanzar el punto isoelctrico de la casena donde es menos solubles, en base a esa menor solubilidad, la casena se precipita y se puede aislar, que en la experiencia el pI fue en un pH de 4.7, en este punto la casena se separa del resto de los componentes de la muestra de leche formando un precipitado. Se utiliza alcohol para el lavado posterior del precipitado de la protena obtenida, debido a que la casena es insoluble en l alcohol y adems el alcohol remueve la grasa de la leche, eliminando las impurezas del que pueda contener la muestra de casena.

Bibliografa: Referencias:

Wall Street journal. (2009). Punto isoelctrico. Recuperado http://georgezarauzbioquimica.blogspot.com/2009/04/punto-isoelectrico.html

de

Qumica orgnica. (2009). Aminocidos - Punto Isoelctrico. Recuperado de http://www.quimicaorganica.org/aminoacidos-peptidos/528-aminoacidospunto-isoelectrico.html

Texto:

Brown, T. LeMay, H. Bursten, B. Murphy, C, (2009); Qumica, la Ciencia Central;Mexico: decimotercera edicin; Pearson Educacin

Smith, C; Marks, A; Lieberman, M. Bioqumica Bsica de Marks. Madrid, Espaa: McGraw-hill-interamericana de Espaa.

Foster, C; Mistry, N; Peddi, P; Sharmas, S. (2010); Manual Washington de terapia medica; Barcelona, Espaa: treinta y tres ava edicin; WoltersKluwer.

Cuestionario:
1. Por qu no se alcanza el pH 1 con HCl 0.1M en las soluciones en las que se prepararon los aa? R-Las protenas son buenos amortiguadores por que los aminocidos que lo constituyen se comportan como cidos dbiles .El gasto realizado con HCl al titular se deduce que mientras ms estabilizada y estructurada esta la protena mayor cantidad de volumen se requiere para lograr varia el pH de la solucin cumpliendo as la propiedad amortiguadora que poseen las protenas. En cambio cuando se desnaturaliza la protena el gasto de HCl es mucho menor debido a que no alcanza mantener el pH constante. Como la concentracin de acido clorhdrico es de 0.1M, no se logra alcanzar un ph 1 debido a la estabilidad de los aminocidos y a la baja concentracin del acido clorhdrico. 2. Compare los puntos isoelctricos de glicina, glicil-glicina y glicil-glicil-glicina.que concluye sobre estos resultados? R- La glicina es un aminocido no esencial, lo que significa que tiene igual cantidades de grupo amino como cido, al formar enlaces glicina-glicina, se forma una macromolcula por perdida de agua y su valor de pI no se altera bruscamente debido a que es el aminocido ms pequeo y neutro. 3. Por qu las molculas con grupos ionizables se hacen menos solubles en el punto isoelctrico? R. Las molculas se hacen menos solubles en el punto isoelctrico debido a que el punto isoelctrico representa el equilibrio de las cargas positivas y negativas presentando una carga neta de cero y la protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada ya que las partculas se agregan. 4. En la precipitacin de la casena que pasara si se aade muy rpido el acido y se alcanza un pH ms bajo que en 4.8 Qu se debe hacer en este caso? R- El acido Clorhdrico, por su capacidad acida, desnaturaliza a la protena, rompe sus enlaces peptdicos, y cambia las propiedad estructurales y fisiolgicas de la protena. Al alcanzar un pH menor a 4.8 la casena no se precipita, ya que se ha sobre pasado el punto isoelctrica de la casena, el efecto de de un pH menor a el punto isoelctrico desnaturaliza a la casena y se debe repetir la experiencia. 5. Por qu es necesario lavar la casena precipitada con alcohol (Etanol 95%) y ter? R- Se usa el alcohol debido a que la casena es insoluble en l y adems el alcohol remueve la grasa de la leche, se puede decir que purifica la casena ya que se elimina todo los residuos que no sean la protena extrada.