NOTA CIENTFICA

Contaminao Microbiana na Propagao in vitro de Cattleya walkeriana e Schomburgkia crispa

Gislene Crrea Sousa1,2, Pollyanna Loureno Clemente1,2, Valquiria Lorena Ramos Isaac1,2, Syd Pereira Faria1,2 e Maria Rita de Cssia Campos3 Introduo
As orqudeas esto entre as plantas ornamentais mais apreciadas e de grande valor comercial. Desde o trabalho pioneiro de Warming [1], at levantamentos mais recentes [2], Orchidaceae tem sido apontada como uma das cinco famlias mais representativas da flora do Cerrado. Uma das formas de aumentar a produo de mudas com qualidade gentica, e conservar espcies de orqudeas ameaadas de extino tem sido a micropropagao e a propagao in vitro [3,4]. A clonagem in vitro de matrizes selecionadas tem permitido a compatibilizao de demandas especficas do mercado. Um dos maiores problemas da produo em escala comercial a contaminao do meio nutritivo por fungos e bactrias durante as etapas de propagao in vitro. A contaminao estabelece-se no meio de cultura e/ou material vegetal competindo pelos nutrientes, produzindo substncias txicas e inibindo o desenvolvimento do explante, ocasionando, assim, sua perda. Em princpio, existem quatro fontes de contaminao: a fonte de explante, meio nutritivo, o ambiente e o operador (habilidade). Outro fator relacionado contaminao na propagao in vitro de orqudeas o tamanho da semente (1-2mm de comprimento por 0,5 a 1,0mm de largura) [5]. O mais importante destes a fonte de explante que deve ser desinfestada antes da inoculao in vitro a fim de eliminar microrganismos exgenos. O etanol o desinfestante mais empregado [6]. Alm da ao germicida, o etanol tem ao surfactante e facilita a ao de outros produtos sendo utilizado em concentraes de 70 a 80%. Dentre as vrias substncias germicidas a base de cloro, utilizadas para desinfestao de explantes, as mais comuns so o hipoclorito de sdio, encontrado em formulaes comerciais de gua sanitria ou o hipoclorito de clcio encontrado na forma de p em lojas comerciais [7]. Outras substncias tm sido adicionadas ao meio de cultivo a exemplo de reguladores de crescimento, antibiticos, fungicidas, carvo ativo na tentativa de minimizar o problema. Considerando a importncia de estudos in vitro de espcies orqudeas, principalmente relacionados conservao da espcie, este trabalho objetivou avaliar o efeito da contaminao na propagao in vitro de Cattleya walkeriana Gardner e Schomburgkia crispa Lindl. de ocorrncia no Cerrado .

Material e mtodos
A. Material vegetal Foram usadas sementes das espcies Cattleya walkeriana e Shomburgkia crispa obtidas a partir de cpsulas maduras coletadas na regio de Morrinhos-GO. Antes de serem inoculadas no meio de cultivo essas sementes passaram por um processo de desinfestao [8]. B. Meio para inoculao de sementes As sementes foram inoculadas no meio de germinao [9] acrescido de 2% de sacarose (g/L). Esse mesmo meio foi dividido em duas pores, em uma delas foi adicionado 0,1% de carvo ativado (g/L), pH 5,6. Cada meio foi distribudo em 42 tubos de ensaio de 150 x 18 mm. Aps a inoculao, os tubos contendo as sementes foram conservados em ambiente escuro por sete dias e a seguir mantidos na luminosidade at a formao de plntulas. As condies de temperatura e luminosidade foram as do ambiente do laboratrio de Biologia da Universidade Estadual de Gois Unidade Morrinhos. C. Anlise dos resultados Cada espcie foi analisada separadamente e a cada 15 dias. Para isso foi quantificado o nmero de explantes contaminados por espcie e por tipo de meio. O experimento foi repetido duas vezes.

Resultados
Neste trabalho observou-se grande contaminao, principalmente por fungos e bactrias (Figura 1) com diferenas entre os meios de cultivos utilizados. A contaminao foi observada logo aps a transferncia do escuro para o ambiente de luminosidade. Verificou-se a ocorrncia de maior freqncia de contaminao entre a primeira e segunda avaliao e a partir da houve considervel reduo. Dentre a contaminao analisada 97% foi proveniente de contaminao por fungos e apenas 3% por bactria. Uma das causas de contaminao por fungos est relacionada a cuidados no ambiente. Mesmo com cuidados com assepsia, em biofbricas brasileiras j foram registradas porcentagens de contaminao superiores a 30% causadas tanto por fungos como por

________________ 1. Bolsista de Iniciao Cientfica e acadmico do Curso de Cincias Biolgicas do Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Gois. Rua 14, 625, Morrinhos, GO, CEP 75650-000 2. Acadmico do Curso de Cincias Biolgicas do Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Gois. Rua 14, 625, Morrinhos, GO, CEP 75650-000 3. Professor do Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Gois. Rua 14, 625, Morrinhos, GO, CEP 75650-000. E-mail: mariarita_ueg@yahoo.com.br

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bactrias [10]. O uso de fungicidas no meio de cultivo visando a reduo da contaminao por fungos usado por alguns autores [11]. Neste trabalho verificou-se que com algumas medidas de limpeza e at com a prtica na manipulao houve considervel reduo na contaminao por fungos. Todos os gentipos responderam bem ao cultivo in vitro. De acordo com o que se observa na Figura 2 houve diferena na resposta entre os meios. Nota-se que na inoculao de novembro de 2005 (Figura 2A) a presena de carvo ativo no meio de cultivo foi significante para a espcie C. walkeriana. Nesta espcie, em meio suplementado com carvo ativo a contaminao foi em torno de 20% contra 60% em meio sem carvo. O mesmo no foi observado para S. crispa nesta inoculao. No entanto, com a repetio do experimento (Figura 2B) observou-se que a presena de carvo ativo influenciou a resposta de ambas espcies. Alm disso, mesmo as sementes que no contaminaram, em ambas espcies, no meio sem carvo no chegaram converso em plntula e os explantes apresentaram necrose. O mesmo no foi observado quando se utilizou carvo ativo no meio de cultivo. Devem ser testadas novas espcies de orqudeas e outros agentes que assegurem uma melhor assepsia sem prejudicar o desenvolvimento dos explantes. Diante destes resultados pode-se inferir que o uso de carvo ativo no meio para as espcies estudadas contribuem no somente na reduo de contaminao como na converso em plntula.

Referncias
[1] WARMING, E. Et 1892.Bidrag til den biologiske Plantegeografi. Bianco Los Kgl. HofBotrykkeri, Kjobenvavn. [2] MENDONA, R.C.; FELFILI, J.M. WALTER, B.M.T.; SILVA JUNIOR, M.C.; REZENDE, A.V. FILGUEIRAS, T.S.& NOGUEIRA, P..E. 1998. Flora vascular do cerrado. In: SANO, S.M. & ALMEIDA, S.P. (Eds), Cerrado: ambiente e flora. EMBRAPA-CPAC, Planaltina., Braslia. p. 289-556. [3] STANCATO, G.C. et al 2001. Produo de mudas de orqudeas a partir de sementes in vitro e sua viabilidade econmica:estudo de caso.Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, 7 (1): 25-33. [4] MARTINI, P.C.; WILLADINO, L.; ALVES,G.D. & DONATO, V.M.T.S. 2001. Propagao de orqudeas Gongora quinquenervis por semeadura in vitro. Pesquisa Agropecuria Brasileira. 36 (10): 13191324, 2001. [5] PIERIK, R. L. M. 1997.In vitro culture of higher plants. 1a ed. The Nertherlands: Kluwer Academic Publishers. [6] HIRATA, M.H. & MANCINI-FILHO, J. 2002. Manual de biossegurana. Barueri: Editora Manole. 496p. [7] GRATTAPALIA, D. & MACHADO, M.A. 1998. Micropropagao. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L. S. & BUSO, J. A. (Eds). Cultura de tecidos e transformao gentica de plantas. Braslia: Embrapa SPI/Embrapa CNPH. p. 183-260. [8] CAMPOS, D.M. 1998.Orqudeas: Manual prtico de cultura, Expresso e Cultura, 143p. Rio de Janeiro. [9] KNUDSON, L. 1922. Nonsymbiotic germination of orchid seeds. Botanical Gazette, 73 (1): 1-25. [10] OLIVEIRA, R. P. et al. 2000. Efeito da desinfestao e do uso de meios de indicadores de contaminao na micropropagao de bananeira. Rev. Bras. Fruticult., Jaboticabal, 22 (1): 57-61. [11] COLOMBO, L.A.; FARIA, R.T.; CARVALHO, J.F.R.P.; ASSIS, A.M. & FONSECA, C.B. 2004. Influncia do fungicida clorotalonil no desenvolvimento vegetativo e no enraizamento in vitro de duas espcies de orqudeas brasileiras. Acta ScientiarumAgronomy, 26(2): 253 258.

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Figura 1. Tipos de contaminao observados quando da inoculao in vitro de sementes das espcies Cattleya walkeriana (A e B) e Sciomburgkia crispa (C).

100 80 60 40 20 0 C. walkeriana S.crispa c/c s/c

100 80 60 40 20 0 C. walkeriana S.crispa c/c s/c

Figura 2. Porcentagem de contaminao na propagao in vitro de C. walkeriana e S. crispa em meios Knudson modificado (1922) suplementados ou no com carvo ativo. A) Mdia de 7 avaliaes com inoculao em novembro de 2005 e B) Mdia de 7 avaliaes com inoculao em janeiro de 2006.

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