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Curso: Patologa y Fisiopatologa General Docente: Erik Morales Mejas Integrantes: Francisca Hernndez C. Medeline Labarca C. Felipe Leal V. Claudia Ramrez V. Javier Valderrama S. Alfonso Vargas L. Vanessa Villagra A. Fecha de entrega: 28 de junio del 2011 Fecha de presentacin: 4 Julio del 2011
Introduccin: Los microRNAs (miRNAs) son una clase evolutivamente conservada de pequeos RNAs y estn implicados en muchos procesos relacionados con la medicina regenerativa. Entre ellos destacan los procesos regenerativos cardiovasculares y hepticos, reparacin de heridas cutneas y enfermedades neurolgicas como la esclerosis lateral amiotrfica. Los miRNAs sepresentan como un campo joven de investigacin que pueden utilizarse como posibles blancos teraputicos y tratar diversos padecimientos humanos en relacin a su rol en la medicina regenerativa. Objetivo: Dentro de los objetivos de esta revisin bibliogrfica est obtener informacin sobre qu son los miRNAs y cules son sus bases moleculares, descifrar su importancia en la medicina regenerativa, qu funciones cumplen y cmo podramos identificar y manipular dichas molculas para poder de encontrar tiles y novedosos blancos teraputicos en este campo. Resultados: Se pudo hallar informacin del tema,la que ordenamos y analizamos.A pesar de que profundizamos nuestros conocimientos, no quedamos satisfechos, ya que hay varias carencias. Falta que se realicen ms estudios para poder confirmar cada vez ms los roles de los miRNAs. Por otra parte, hay reas en las que an no se descubierto o se conoce muy poco de la participacin de ellos. Si bien es cierto que hay varios estudios, la mayora trata de experimentaciones en animales, pero falta que los estudios futuros se enfoquen en mayor proporcin a los humanos. Mtodos: Para llevar a cabo nuestra revisin bibliogrfica utilizamos diversas fuentes, como revistas mdicas, libros del tema y bases de datos como Cochrane, Scielo, y principalmente PubMed con el fin de obtener informacin actual sobre el tema. Conclusiones: Tras realizar nuestra revisin, podemos concluir que los miRNA tienen una base molecular compleja y que hay un sinnmero de posibles aplicaciones teraputicas de ellos en la medicina regenerativa, pero an es una materia nueva en donde se necesitan muchos estudios futuros para esclarecer la forma en que podemos accedera ellos y usarlos con fines teraputicos. II. INTRODUCCIN La presente revisin bibliogrfica pretende hallar respuesta a varias inquietudes que surgen del tema de microRNAs y medicina regenerativa. Entre estas dudas estn, por ejemplo, En qu medida los microRNAs contribuyen a la medicina regenerativa? Cules son las funciones que cumplen los microRNAs en el organismo y cmo podemos usar el conocimiento de ellas en favor de la medicina? De qu forma podemos identificar y manipular a los microRNAs? Cules son las posibles aplicaciones de la medicina regenerativa? Para poder comprender estas temticas es necesario, en primer lugar, definir los principales conceptos a tratar, que son los microRNAs y tambin medicina regenerativa. Los microRNAs (miRNAs) son una clase evolutivamente conservada de pequeos RNAs. Estn codificados en el genoma y en principio son transcriptos como parte de grandes molculas que luego se modifican hasta alcanzar su forma madura de 22 nucletidos de largo aproximadamente. La medicina regenerativa es un nuevo campo de la ciencia que hace una integracin de varias disciplinas con el fin de poder aplicar los conocimientos que otorga cada una de ellas a la bsqueda de nuevas estrategias teraputicas para sanar diversas enfermedades, tratar injurias o el proceso de envejecimiento. Los principales ejes en que se basa son la reparacin, el reemplazo y la regeneracin de clulas, tejidos u rganos. Los conceptos mencionados son muy importantes, ya que su asociacin puede resultar en nuevos tratamientos y aplicaciones clnicas para muchas patologas. Por otro lado, los miRNAs representan posibles blancos teraputicos que requieren ser estudiados para poder 2
Los microRNAs participan en aspectos esenciales de la regulacin de nuestra maquinaria gentica, influyendo en numerosos procesos de nuestro organismo. Por esta razn, muchos padecimientos humanos como diversos tipos de cncer, enfermedades neuronales e infecciones virales se relacionan con fallas en la expresin de estas molculas (22). Existen distintas formas de modular los microRNAs con fines teraputicos y entre stas se encuentran la inhibicin y la sobreexpresin artificial de los microRNAs. Cuando hay dficit de un determinado miRNA, el hecho de introducir nuevamente el miRNA maduro o inducir su expresin en el tejido afectado podra restaurar la regulacin de su 6
Inhibicin de miRNAs Un mtodo teraputico para corregir el mal funcionamiento de un miRNA es utilizar oligonucletidos anlogos los cuales son capaces de inhibir o silenciar la actividad de estos miRNA. Estos oligonucletidos anti-microRNA sintticos son conocidos como Antagomirs (23) o AMOS (Oligonucletidos Anti-miRNAs) (24). De esta manera, estos anti-miRNAs pueden tener el potencial de emerger como una nueva clase de agentes teraputicos (22). La utilidad potencial de los oligonucletidos anti-miRNAs depender de si existen concentraciones efectivas de stos que se unan al sitio de accin in vitro o in vivo. Aunque se ha visto que algunos oligonucletidos actan contra objetivos in vitro, stos son rpidamente degradados cuando son usados in vivo (22). Por lo tanto, es indispensable el desarrollo de oligonucletidos modificados para que cumplan su funcin. Se conocen muchas modificaciones que han sido usadas para mejorar la accin de los oligonucletidos, como por ejemplo: Fosforotioatos, 2 O-Me, Morfolino, 2-fluoro (2-F) y cidos nucleicos bloqueados (LNAs) son las modificaciones usadas ms importantes (22). Sobreexpresin artificial de miRNAs Entre las estrategias destinadas a restaurar la funcin de un miRNA, la ms simple es introducir directamente el precursor de miRNA, producido por Drosha, dentro de las clulas. Este pre-miRNA ser procesado por Dicer para producir el duplicado miR/miR* deseado. Al igual que en la inhibicin de miRNAs anteriormente descrita, el uso de estos pre-miRNAs es altamente eficiente in vitro, pero podra presentar mltiples dificultades en su aplicacin in vivo, para lo que se necesitara de las modificaciones qumicas al azcar 2 (fosforotioatos, 2 O -Me, morfolino, 2-fluoro y LNA) para mejorar su resistencia ante la degradacin por nucleasas. Por otro lado, para mejorar la distribucin de estos pre-miRNAs, se han considerado estrategias con (si)RNAs (22, 25). microRNAs en diversos tejidos 1) microRNAs implicados en el corazn Roles conocidos de los miRNAs en el desarrollo y funcin cardiaca La expresin no regulada de los miRNAs se relaciona a enfermedades cardiacas en humanos, as como al inhibir la maduracin de estos en corazones de roedores, ha revelado que los miRNAs son vitales para el desarrollo y funcionamiento del corazn. Por otro lado, estudios genticos han identificado distintos roles para miRNAs especficos durante la cardiognesis, hipertrofia cardiaca y conduccin elctrica (1). Estudios recientes han demostrado una asociacin entre diversos miRNAs con varios defectos cardiacos. Por ejemplo miR-1 favorece numerosas anormalidades cardiacas, incluyendo arritmias, tabicacin ventricular deficiente, hipertrofia cardiaca e hiperplasia del miocito, mientras que miR-133 tiene un potencial arritmognico y tambin un rol en la hipertrofia 7
Expresin de miRNA durante la remodelacin cardiaca: El corazn es sensible al estrs y a una gran variedad de estmulos. El principal elemento de estrsbiomecnico del corazn y de sus estmulos patolgicos es experimentar una gran remodelacin cardiaca conocida como hipertrofia cardiaca (27). La hipertrofia cardiaca se define macroscpicamente como un engrosamiento de la pared y/o el septo interventricular; en la clula se caracteriza por un incremento del tamao del cardiomiocito, con aumento de la sntesis protenica y un cambio en la organizacin de la estructura sarcomrica (28). La hipertrofia cardiaca se presenta junto a la reactivacin de genes cardiacos fetales que normalmente se expresan en el corazn antes de nacer. Esta reactivacin en cardiomiocitos postnatales indica que los eventos moleculares que controlan la expresin de genes cardiacos durante el desarrollo son redistribuidos para regular el crecimiento hipertrfico o incluso, la regeneracin del corazn (29). Si la hipertrofia se mantiene en el tiempo podran surgir consecuencias adversas como fallas cardiacas y muerte repentina (30). Se han realizado estudios que revelan que existen cambios en la expresin de miRNAs en corazones humanos defectuosos, incluyendo el aumento de miRNAs que estn expresados normalmente en el desarrollo cardiaco (31, 32). Se haestablecido un nexo entre miRNAs e hipertrofia cardiaca al demostrar que los miRNAs regulados por estrs pueden influenciar la respuesta hipertrfica cardiaca tanto positiva como negativamente (31, 33,34). MiRNAs modulan la hipertrofia cardiaca: Estudios muestran que aumenta la produccin de MiR-195 durante la hipertrofia cardiaca en humanos y ratones (31). Adems, la sobreproduccin de este microRNA en corazones de roedores indujo hipertrofia varias semanas despus del nacimiento. Si esta sobreproduccin es sostenida, resulta una cardiomiopata dilatada y una insuficiencia cardiaca en ratones jvenes (31). Los mecanismos por los que acta y la funcin de miR-195 an no estn claros ya que todava no existen genes blanco que hayan sido confirmados. miR-214 tambin se incrementa durante la hipertrofia, sin embargo, la sobreexpresin de ste en los ratones transgnicos no caus un fenotipo cardiaco anormal (31). Todo esto indica que ciertos miRNAs, pero no otros, son suficientes para inducir la respuesta hipertrfica. Claramente, se necesitan otros estudios para determinar si estos miRNAs son necesarios para la respuesta hipertrfica y poder identificar sus genes blanco. Por otro lado,existe una disminucin de miR-1 y miR-133 durante la hipertrofia (31, 34, 35). Sus patrones de expresin coincidentes no sorprenden, ya que ambos son transcritos juntos desde los mismos genes policistrnicos. La sobreexpresin de miR-1 o miR-133 inhibi la hipertrofia cardiaca en un modelo in vitrousando cardiomiocitos primarios (34,35). Aunque la expresin de miR-1 disminuye durante la hipertrofia cardiaca (31, 34, 35), se necesitan otros estudios genticos que demuestren un rol directo de este miRNA en la regulacin de la hipertrofia cardiaca. Tanto miR-1 como miR-133 se han propuesto para regular la expresin de genes ligados al crecimiento (34, 35, 36), sugiriendo que ambosactuaran como supresores del crecimiento y que estn reducidos durante la hipertrofia cardiaca. 8
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2) MiRNAs en la regeneracin heptica: El hgado adulto es un rgano nico en su capacidad de proliferacin con hepatocitos totalmente diferenciados (50), los hepatocitos adultos estn en reposo y normalmente se dividen slo una vez o dos veces al ao en ratones e incluso con menos frecuencia en humanos (51). Sin embargo, los hepatocitos adultos tienen la posibilidad de dividirse muchas veces en respuesta a una lesin o prdida de tejido heptico (52, 53). Despus de dos tercios de hepatectoma parcial (2 / 3 PH) en ratones, los hepatocitos entran y progresan a travs del ciclo celular en una forma altamente sincronizada (54). Todos los hepatocitos se dividen una vez, y todos los otros hepatocitos se dividen una vez ms para restaurar la masa heptica en un plazo de 7 das (50). Hay muchos factores que influyen en la regulacin del ciclo celular de los hepatocitos, por lo tanto tambin en su proliferacin, y se ha demostrado que los microRNAs (miRNAs) regulan post-transcripcionalmente genes que manejan la proliferacin en el desarrollo y cncer, aunque su papel en la regeneracin de rganos es en gran parte desconocida (55). Pero un anlisis de los cambios en la expresin del miRNA durante la regeneracin del hgado del ratn, llev a la identificacin de miR-21 y miR-378 como reguladores de la regeneracin de rganos (56). Se ha investigado sobre los miRNAs y sus genes diana implicados en la regeneracin del hgado mediante la generacin de ratones con inactivacin hepato-especfica de DGCR8, que es un componente esencial del complejo microprocesador. Con recientes descubrimientos sobre dao proliferativo en clulas madre de ratn deficientes de DGCR8, se ha indicado que la iniciacin de la sntesis de ADN estaba retrasada en los hepatocitos deficientes de DGCR8 despus de una hepatectoma parcial 2/3 (57). Por lo tanto, lo anterior sugiere que los miRNA regulan la progresin de los hepatocitos desde la fase G1 a S durante la regeneracin heptica. Para identificar de qu manera los miRNAs actan regulando la regeneracin en el hgado, se busc cambios de expresin de miRNAs en hgados de ratones silvestres adultos despus de una HP 2/3. Debido a que los miRNAs reportados como promotores de la proliferacin en clulas madre de ratn no se expresan en los hepatocitos, no fue sorpresa que ninguno de esos miRNAs fue inducido por la HP 2/3 (56). En vez de eso se encontr especficamente niveles incrementados de miRNA-21, un promotor establecido de proliferacin que se expresa en gran cantidad en muchos tipos de cncer (58). En cuanto al descubrimiento de genes diana, se encontr que Btg2 es un objetivo directo de miR-21. Ms an, algunos datos sugieren que la expresin incrementada de miR-21 sirve para antagonizar al inhibidor del ciclo celular Btg2 durante la regeneracin del hgado (56). El efecto promotor de la proliferacin del incrementado miR-21 despus de la HP 2.3 parece ser apoyada por una disminucin en la expresin de miR-378 y una subsecuente de-represin de Odc1. La inhibicin especfica de miR-21 y miR-378 in vivo podra ser usada para delinear sus contribuciones individuales a la regulacin de la regeneracin heptica (59). Los niveles del gen promotor proliferativo Ccnd1 se incrementaron en los hepatocitos con una deficiencia global de miRNA antes de la HP 2.3. Un perfil revel que miR-16, un miRNA conocido por inhibir Ccnd1 en la prstata, es expresado en el hgado (60). Por lo tanto, la prdida de miR-16 podra explicar la de-represin de Ccnd1 en los ratones Dgcr8del/fl. Anlogamente, es posible que la perdida de otros miRNAs normalmente expresados en los 11
HIF-1
miR-210
E2F3
El uso de un antagonista o un imitador de miR-210, nos va permitir respectivamente una inhibicin o una sobreexpresin de miR-210 en estos queratinocitos. As coherentemente se observ que la disminucin de los niveles basales de miR-210 en queratinocitos aument significativamente la proliferacin celular. y la induccin de un imitador de miR-210 claramente comprometi la proliferacin de los queratinocitos (67).
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4) MicroARN y regeneracin de la sinapsis en la Esclerosis Lateral Amiotrfica La esclerosis lateral amiotrfica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa que resulta en la prdida de las motoneuronas, la denervacin de los msculos de destino, atrofia muscular y parlisis de extremidades inferiores y msculos respiratorios (70). Hoy en da, no existen tratamientos efectivos para esta enfermedad, por lo cual es necesario identificar mediadores y vas de sealizaciones claves (72) para una terapia a futuro, en la que es considerada la enfermedad de motoneuronas ms comn en adultos (71). MiR-206 es un microARN especfico del msculo esqueltico, por lo tanto un regulador importante en la sinapsis neuromuscular y justamente es inducido durante la ELA, ya que en modelos experimentales con ratones, hay una rpida progresin de la enfermedad en ausencia de miR-206. Este microARN actuara sobre la histona deacetilasa-4 y tambin por medio de la accin del factor de crecimiento fibroblstico, detectando lesiones de neuronas motoras y promoviendo la regeneracin sinptica (70). Varios experimentos se han llevado a cabo para comprobar la accin de miR-206 posterior a la denervacin en la Esclerosis Lateral Amiotrfica, por ejemplo, se extrajo el nervio citico de ratones salvajes, provocando un gran aumento tanto de miR-206, como de pri-miR206 en los msculos tibial anterior y gastrocnemios principalmente (73); los axones en regeneracin reinervan de preferencia los sitios originales de unin sinptica (74, 75). Por lo tanto, esta reinervacin compensatoria, puede dar cuenta de la clnica casi asintomtica en esta enfermedad, hasta que los restos de motoneuronas no pueden compensarla (76, 77). Tambin en ratones deficientes en la enzima SOD1 y con bajos niveles de miR-206 artificial, se vio una rpida progresin de la enfermedad, as como tambin una atrofia acelerada del msculo esqueltico, lo que llev a cifosis, parlisis y muerte de estos ratones (70). En los ratones de tipo salvaje (presentan miR-206), la reinervacin se manifest entre la 2 y 3 semana despus de la denervacin, y se complet casi a las 5 semanas. Sin embargo, en los ratones deficientes en miR-206, la reinervacin comenz tres semanas despus y adems dur por lo menos dos semanas ms, lo que indica, que el retraso en la reinervacin en ratones deficientes en miR-206 se debe principalmente a la falta de una seal que emana de estos msculos y que influye en la interaccin de los axones motores regenerados y la fibra muscular. Por otra parte, las vesculas sinpticas no se agregaron correctamente en las terminaciones nerviosas y los axones crecieron ms all de las uniones neuromusculares en los ratones mutantes, lo que sugiere una posible falta de las seales que emanan desde el msculo (70).(Ver figura 4a) La histona deacetilasa-4 (HDAC4) ha sido implicada en el control de la expresin gnica neuromuscular (78, 79), miR-206 reprime la traduccin de sta y distintos factores de organizacin de la sinapsis neuromuscular son afectados de manera opuesta por miR-206 y HDAC4. En distintos experimentos, posterior a la denervacin HDAC4 aumenta en ratones deficientes de miR-206, en comparacin con ratones que presentan este microARN (70).(Ver figura 4b) Los niveles de ARNm de varios reguladores conocidos en la formacin de la sinapsis (80, 81, 82), como FGF7/10/22 no son afectados en la denervacin en ratones normales y mutantes, por el contrario una protena vinculada al FGF (FGFBP1) fue regulada en gran medida en ratones deficientes de miR-206 (mutantes) (70), sta protena interacta con FGF7/10/22 y aumenta la accin del FGF7 en mioblastos (83). Estos factores de crecimiento 14
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Figura 1
Tabla 2
Figura 1. Biognesis y mecanismo del microRNA: a) La biognesis comienza con la transcripcin del miRNA primario por la RNA polimerasa II, de unidades transcripcionales independientes con longitudes que van desde varios cientos a varios miles de nucletidos que pueden codifican un slo miRNA o aveces dos o ms. En adicin a las unidades independientes, algunos miRNAs se originan dentro de los intrones de transcriptos de mRNA. b) Los miRNAs primarios entran en su va de procesamiento y sufren escisin nuclear por el Complejo Microprocesador en el cual las RNasa III endonucleasas: Drosha y DGCR8 producen un precursor intermediario de miRNA de unos 70 nucletidos de largo (premiRNA), cuyas caractersticas son una estructura bicatenaria en forma de horquilla y un corte escalonado en la base de dicha horquilla. c) La exportina-5 reconoce el corte escalonado y exporta el premiRNA al citoplasma. d) Una vez en el citoplasma, Dicer, otra RNasa III endonucleasa, corta los extremos del precursor y genera un duplicado. Una sola cadena del duplicado resultante de 22 nucletidos aprox. es incorporada selectivamente dentro del Complejo Silenciador inducido por RNA (RISC), mientras que la otra posiblemente es degradada. e) La regulacin de la expresin del gen blanco por un RISC cargado con miRNA es facilitada por un apareo complementario de bases con la secuencia blanco dentro del extremo 3 UTR de los mRNAs. Generalmente, en animales, el perfecto o semi-perfecto apareamiento complementario de bases entre el RISC cargado y el mRNA resulta en una inmediata degradacin del mRNA. Sin embargo, la gran mayora de los miRNAs son imperfectamente complementarios a sus mRNAs objetivo y median su degradacin.
Figura 2
Roles conocidos de los miRNAs en el desarrollo y funcin cardiaca: Estudios recientes han demostrado una asociacin entre diversos miRNAs con varios defectos cardiacos. Estos se muestran en la figura 2.
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Figura 3
En la imagen superior izquierda se puede observar el desarrollo de heridas isqumicas y no isqumicas desde el da 0 hasta el da 7. En la imagen superior derecha est representado el cierre de heridas isqumicas (lnea continua) comparado con heridas no isqumicas (lnea punteada). Por ltimo, en la imagen inferior se analiza el porcentaje de epitelizacin en heridas isqumicas y no isqumicas. Todas estas imgenes evidencian la mejor cicatrizacin de las heridas en que no est presente el componente isqumico. Imgenes adaptadas de Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds (67).
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Rol de los miRNAs en Esclerosis Lateral Amiotrfica. Imagen adaptada de MicroRNA-206 Delays ALS Progression and Promotes Regeneration of Neuromuscular Synapses in Mice (70).
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I. RESUMEN..... 2 II. INTRODUCCIN.. 2 III. DESARROLLO... 3 MicroRNAs........... Medicina Regenerativa.... Terapias asociadas a microRNA... MicroRNA en diversos tejidos........... 7 MicroRNAs implicados en el corazn.. MicroRNAs en la regeneracin heptica... MicroRNAs en la reparacin de la piel... MicroARN y regeneracin de la sinapsis en la ELA...14 7 11 12 3 3 6
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