INGENIERIA GENETICA

TRANSGENICOS OGM: ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS OVM: ORGANISMOS VIVOS MODIFICADOS

REDISEO DE GENOTIPOS:
GENERACION DE INDIVIDUOS RECOMBINANTES (A NIVEL NUCLEAR): NUEVAS COMBINACIONES DE GENES HIBRIDACION SEXUAL: RECOMBINANTES GENERADOS POR INTERCAMBIOS RECIPROCOS ENTRE CROMOSOMAS PATERNO/MATERNO (ENTRECRUZAMIENTO, MEIOSIS) INGENIERIA GENETICA: RECOMBINANTES GENERADOS POR INTRODUCCIN DE SECUENCIAS EXOGENAS (INDEPENDIENTE DE MEIOSIS)

Recombinantes por hibridacin sexual

Cantidad Origen Localizacin de las regiones genmicas

F1 F2

F8-9

homocigotas

INGENIERIA GENETICA
receptor Casete de transgenes

T I M

IS S O

T0

hemicigoto

MEIOSIS

T1
homocigoto hemicigotos homocigoto para el transgen

Con la tecnologa de ADN recombinante y otros desarrollos metodolgicos ha sido posible:

Aislar un gran nmero de secuencias gnicas (regiones reguladoras y estructurales) de virus, bacterias, hongos, plantas y animales. Identificar las diferentes seales en el gen necesarias para su efectiva expresin Delimitar las regiones reguladores y conocer su patrn de expresin Elaborar catlogos de secuencias reguladoras con diferentes patrones de expresin Elaborar catlogos de secuencias de sealizacin Elaborar catlogos de secuencias codificantes de protenas.

Biotecnologa:
Aplicacin de tcnicas de cultivos celulares y de biologa molecular como apoyo al mejoramiento gentico y la produccin

TRANSFORMACION: Proceso de alteracin del genotipo de una clula mediante la introduccin de uno o ms genes por va no sexual Los transgenes pueden provenir de individuos de diferentes gneros, familias y reinos. El pool gentico a utilizar es ilimitado

2- El desarrollo de plantas transgnicas

Definiciones Requisitos Obtencin de trigo transgnico

DEFINICIONES INGENIERIA GENETICA=TRANSFORMACION transferencia de ADN entre individuos mediante tecnologas distintas de hibridacin sexual TRANSGENE ADN introducido integrado en el genoma

LOCUS TRANSGENICO unidad heredable detectada por el fenotipo transgnico

ADN

Sistema celular en activa divisin (mitosis)

Requisitos:
i) sistema de regeneracin de clulas blanco (totipotentes)
PLANTA CELULAS EN DIVISION PLANTA

ii) secuencias gnicas (estructural y reguladora) necesarias para su expresin iii) sistema de transformacin biolgica o fsica para introducir el gen o los genes iv) estrategia de seleccin de clulas/plantas transformadas

PLANTA
Protoplasto Clula Callo Meristema

Desdiferenciacin SISTEMA CELULAR Transformacin

Casete de genes)

Seleccin (clula) Regeneracin

(organognesis)

Seleccin (planta) PLANTA (To);(Ro); TRANSGENICO PLANTA CLON

Secuencia gnicas: reguladoras y estructurales

Expectativa:
El juego de secuencias reguladoras y estructurales es apropiado para obtener los niveles de expresin esperados: ARNm (cantidad, localizacin) protena (cantidad, funcin) fenotipo
Prever modificaciones si el gen es de origen procariota

Sistemas de transformacin
1. Agrobacterium clulas blanco (protoplastos, tejido daado, meristema apical, semillas, planta, callo derivado de embriones inmaduros o escutelo) bajo nmero de copias, regiones gnicas 2. Transferencia gnica directa protoplastos, clulas, tejidos microinyeccin, fibras de silicona, bombardeo de microproyectiles,electroporacin

Modelo de vector de transformacin

GEN MARCADOR SELECCIN P E

GEN P E

GEN REPORTERO P E

fenotipo

Herb R (PPTR)

Color azul (GUS+)

Confirmacin de transformacin estable

1. Deteccin de ADN transgene en ADN genmico 2. Deteccin de ARNm del transgene 3. Presencia de la protena o actividad enzimtica 4. Herencia estable del marcador en plantas T0-Tn

Produccin rpida de mltiples lneas independientes de trigo transgnico frtil

Weeks et al, 1993

Casete de transgenes

HindIII

BamHI

HindIII

BamHI

EcoRI

Ubi

chi

Ubi

bar

nosT

2.0 kb

1.1 kb

2.0 k

0.6 kb 0.3 kb

Transgen de inters Marcador de seleccin Quitinasa Resistencia a herbicida (gen de arroz) (gen bacteriano)

SISTEMA DE TRANSFORMACION Plantar semillas 55 d Antesis 15 d Escisin de embriones (inic. Callo) BOMBARDEO (seleccin,reg) Enraizamiento 14d Transferencia a suelo 14d Invernculo 35d Antesis plantas T0 Semillas maduras T1 30d 5 d 100 d

168d

Eficiencia del proceso

168 das 1-2 plantas transgnicas/1000 embriones bombardeados. Cada planta proviene de un evento diferente de transformacin falsos positivos 9 lneas transgnicas independientes (eventos de transformacin)

EVALUACION DE LINEAS TRANSGENICAS

Plantas To, T1 clasificacin segn tipo de evento de transformacin estudio expresin (ARNm, protena, fenotipo) estudio estabilidad (To a T4) Ideal es comenzar evaluando 50-60 plantas To para seleccionar las lneas homocigotas T4 o T5 del mejor evento: alta expresin,integraciin simple, alta estabildiad.

EVENTO DE TRANSFORMACION
El proceso de integracin del transgen ocurre independientemente en cada cella Mediante el proceso de diferenciacin/regeneracin, clulas transgnicas individuales dan origen a plantas transgnicas independientes Cada una de las variantes de la integracin del transgen encontradas en plantas regeneradas de un mismo experimento de transformacin se denomina EVENTO DE TRANSFORMACION. Los eventos difieren en: Nmero de copias del transgen integradas al genoma Nivel de integridad del transgen Localizacin del transgen en el genoma (cromosoma, brazo, etc)

Evento 1
Insercin en tres cromosomas Mltiples copias en cada locus Cada copia sufri un rearreglo
del transgn

Evento 2

Evento 3

Evento 4
Insercin en un cromosoma Pocas copias en cada locus Cada copia es el transgen
ntegro

LA INGENIERIA GENETICA COMO HERRAMIENTA DE INVESTIGACION Verificacin funcin in planta de secuencias gnicas (secuencia estructural y reguladora) Modificacin del patrn de expresin Sobreexpresin Silenciamiento Localizacin temporal y espacial de la expresin gnica