Biodegradacin de Petrleo Diesel

Autor: Rmulo Aycachi Inga

Docente: MSc. Carmen Rosa Carreo Farfn

Facultad de Ciencias Biolgicas Departamento de Microbiologa y Parasitologa Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallos

Lambayeque, 04 de abril del 2008.

I.

Introduccin:

La industria petroqumica es importante en una sociedad moderna, no obstante la falta de un programa de proteccin ambiental, hace que el medio ambiente se contamine al producirse derrames de petrleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los oleoductos, descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a travs de fisuras de la corteza terrestre y debido a la produccin, transporte y almacenamiento de este recurso natural. A nivel mundial, el volumen de derrame de petrleo es de 1.7 a 8.8 millones de toneladas mtricas por ao y en nuestra regin (Pacfico Sudeste) es de 6000 toneladas mtricas al ao. En el Per se registran derrames de petrleo desde 1978, uno de ellos fue el producido en el oleoducto marino de Talara, estando entre los ltimos el ocurrido el ao 2000 en el ro Maran que afect la Reserva Pacaya-Samiria y el producido el 30 de enero del 2008 en el que, debido a una explosin producida en un barco carguero, se derramaron frente al mar de Tumbes 1300 barriles de crudo de petrleo. Pero no slo derrames mayores causan contaminacin sino tambin los constantes derrames accidentales en suelos de nuestra selva, los que se producen por el rompimiento del Oleoducto Nor-Peruano, debido a accidentes naturales y por la actividad extractiva. Los mares del planeta sufren cada ao millones de pequeos derrames contaminantes procedentes de barcos, refineras costeras y plataformas petrolferas. Un estudio de la Universidad Politcnica de Catalua advierte de que el impacto ambiental de los pequeos vertidos diarios es mucho mayor que el ocasionado por un gran accidente y han lanzado una seria advertencia sobre el enorme impacto ambiental que provocan los pequeos vertidos de petrleo -desde un litro a unas 80 toneladas- por su excesiva frecuencia. Los dispersantes qumicos utilizados para favorecer la remediacin de los ambientes contaminados pueden causar un mayor impacto ecolgico que el mismo derrame, por su toxicidad y recalcitrancia a la biodegradacin. Por tanto, una mejor alternativa de solucin es el proceso de biorremediacin, que es el tratamiento biolgico del suelo, aire y agua, mediante la biodegradacin de compuestos txicos para transformarlos en compuestos de menor o ningn impacto ambiental. As en la biodegradacin de hidrocarburos, se utilizan bacterias con alta capacidad degradativa, entre estas: Brevibacterium, Spirillum, Xanthomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Nocardia, Flavobacterium, Vibrio, Achromobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia rubidae, Bacillus sp., Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aureofasciens, etc., las cuales disminuyen la concentracin de hidrocarburos presentes en el ambiente y al mismo tiempo son inocuas para la salud y el medio ambiente. Estas bacterias producen bioemulsificantes y biosurfactantes que disminuyen la tensin superficial entre el petrleo y el medio acuoso facilitando el acceso microbiano a la fuente de carbono insoluble para su degradacin.

II.

Generalidades: a. El crudo de petrleo:

El crudo de petrleo se caracteriza por ser un lquido negro, viscoso y con una composicin qumica sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, bsicamente de la familia de los hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un 50-98% de la composicin), por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales ms importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales. Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos o nparafinas), alcanos ramificados (en menor cantidad), cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables de hidrocarburos aromticos. La composicin elemental de un crudo est condicionada por la predominancia de los compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14% de H, de 0-8% de S, y de 0-4% de O y N y metales como el nquel y el vanadio. Los principales componentes se subdividen y purifican en distintas fracciones: i) fraccin saturada (nalcanos, alcanos ramificados con cadenas alqulicas y las cicloparafinas), ii) fraccin aromtica (monoaromticos, diaromticos y hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs), iii) fraccin de resinas y iv) fraccin de asfaltenos que son menos abundantes y consisten en compuestos ms polares, pudindose encontrar hidrocarburos heterocclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso molecular .

b. Refinado del crudo de petrleo: Para comprender la naturaleza qumica de los diferentes derivados del petrleo que potencialmente pueden ser contaminantes en el medio ambiente, hay que entender el proceso de refinado del crudo utilizado para la obtencin de estos productos petrolferos. El refinado pasa por un proceso de destilacin, con la finalidad de eliminar el color y olor, as como tambin, los compuestos del azufre. Se destila a emperaturas crecientes obteniendo 4 fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios (querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo. Este residuo se destila al vaco obtenindose otros aceites lubricantes (ms pesados), ceras y parafinas y betumes asflticos (alquitranes). Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fraccin asfaltnica (altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios (gasoil, fueles, querosenos y tambin las gasolinas) sean productos relativamente ms biodegradables que los coques o alquitranes residuales. As pues, la composicin qumica de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido como productos de destilacin del petrleo a partir de diferentes intrvalos de temperatura (tabla 1.4). La obtencin de gasolina es menos directa que la de los fueles y gasleos, ya que en una primera fase se obtiene por destilacin del crudo entre 20-180C. Esto implica una composicin de n-alcanos ms ligera (C6-C11) que los fueles y gasleos (C10-C25). En la gasolina encontramos como componentes ms abundantes: nbutano, isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetil hexanos, trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono y dimetilados y heptano (de menor ndice de octanaje).

Los fueles ligeros y el gasoil forman parte de la fraccin intermedia de destilacin en el proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebullicin entre 185-345C, encontrando compuestos de 10 a 25 tomos de carbono, siendo los ms abundantes los C15-C17. (fig. 1.2). Su composicin es de un 30% en parafinas (nalcanos e isoprenoides), 45% de naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromticos. En concreto a nivel de compuestos aromticos encontramos alquilbencenos, y ms abundantemente, el naftaleno y sus alquilados. Tambin se ha encontrado, en cantidades menores, el fenantreno y el fluoreno. No contienen pireno ni fluoranteno (compuestos de 4 anillos aromticos), cuyos puntos de ebullicin son ms elevados que el intervalo utilizado en la destilacin de fracciones intermedias.

c. Biorredediacin del petrleo Diesel usando diversos microorganismos: La biorremediacin es la adicin de materiales a ambientes contaminados para producir una aceleracin del proceso natural de biodegradacin1.

Biodegradacin: se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u otros microorganismos alteran y convierten molculas orgnicas en otras sustancias, como cidos grasos y CO2.

La elevada complejidad de la composicin del crudo de petrleo y derivados, implica la existencia de una amplia capacidad enzimtica si se quiere conseguir una degradacin significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinacin de diferentes cepas aisladas. En la mayora de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos son los componentes ms abundantes del crudo de petrleo. No obstante en algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alqulicas de ciertos HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo. Recientemente, se han descrito algunas cepas con la capacidad de degradar tanto HAPs de elevado peso molecular como alcanos pero sta, no parece que sea una norma general. De hecho los degradadores de alcanos citados habitualmente en la bibliografa generalmente no son capaces de romper el anillo aromtico de los HAPs, mientras que los degradadores de HAPs generalmente no crecen con alcanos. La alternativa a la utilizacin de cepas individuales es la obtencin y utilizacin de cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos. Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinacin de cepas aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre s. Los consorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de contaminacin y por lo tanto no son el resultado de una combinacin de cepas previamente aisladas. d. Biosurfactantes Se dice que un soluto es un agente tensoactivo o surfactante cuando da lugar a un descenso significativo de la tensin superficial. El descenso de la tensin facilita la eliminacin de las partculas de la suciedad de las superficies slidas. Son molculas que contienen un segmento liposoluble (soluble en aceite) y otro hidrosoluble (soluble en agua o disolventes polares). La solubilidad parcial tanto en agua como en aceite permite al surfactante ocupar la interfase. As pues, reducen la tensin superficial y las tensiones interfaciales entre molculas individuales en la superficie y la interfase, respectivamente. Tienen propiedades emulsionantes. Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sera una molcula biolgica (orgnica) con propiedades surfactantes o tensoactivas producidas sobre superficies vivas, mayormente superficies de clulas microbianas, o excretados al medio extracelular. Con excepcin del poder bactericida de ciertos surfactantes, fenmeno del cual no hay una explicacin absolutamente segura, se puede decir que todas las propiedades y usos de los surfactantes provienen de dos propiedades fundamentales de estas sustancias: su capacidad de adsorberse a las interfases y de otra parte su tendencia a asociarse para formar estructuras organizadas.

Clasificacin de los biosurfactantes Los surfactantes microbianos son molculas complejas que cubren un amplio rango de estructuras qumicas incluyendo pptidos, cidos grasos, fosfolpidos, glicolpidos, antibiticos, lipopptidos, etc. Los microorganismos tambin producen en algunos casos, surfactantes que son combinaciones de muchas estructuras qumicas como los surfactantes microbianos polimricos. Muchos surfactantes microbianos han sido purificados y sus estructuras qumicas son conocidas. Mientras que los de alto peso molecular son generalmente heteropolisacridos polianinicos que contienen tanto polisacridos como protenas, los de bajo peso molecular suelen ser glicolpidos. Podemos clasificar los biosurfactantes atendiendo a tres criterios: naturaleza qumica, peso molecular y carga inica de la parte superficialmente activa de la molcula. 1. Naturaleza qumica a) Lpidos b) Hidrtos de carbono c) Aminocidos 2. Peso molecular a) Bajo peso molecular: Suelen ser glicolpidos. El ms estudiado es el rhamnolpido, producido por diversas especies como Pseudomonas. La funcin principal de estos biosurfactantes es reducir la tensin superficial entre fases (agua-roca por ejemplo). b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacridos, protenas, lipoprotenas, lipopolisacridos o mezclas de estos polmeros. Estos biosurfactantes no son tan eficaces en cuanto a la reduccin de la tensin superficial entre fases, pero si son bueno emulsionantes. Adems se ha demostrado que son muy eficaces a bajas concentraciones y poseen una considerable afinidad por el sustrato. Un ejemplo sera Alasan producido por Acinetobacter radioresistens. d) Glucolpidos e) Lipopptidos

3. Carga inica a) Agentes aninicos: Contiene generalmente uno de cuatro grupos polares solublescarboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una cadena hidrocarbonada hidrfoba. Si esa cadena es corta son muy hidrosolubles y en el caso contrario tendrn baja hidrosolubilidad y actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se usan principalmente en la industria de jabones y detergentes. b) Agentes catinicos: Estn compuestos por una molcula lipoflica y otra hidroflica, consistente de uno o varios grupos amonio terciarios o cuaternarios. Son utilizados comnmente en detergentes, agentes limpiadores, lquido de lavaplatos, tratamiento de textiles, como sustancias activas antimicrobianas y en cosmtica. c) Agentes no inicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso. Las propiedades hidroflicas son provistas por hidratacin de grupos amido, amino, ter o hidroxilo.

d) Otros tipos de surfactantes: La combinacin en la misma molcula de un grupo con tendencia aninica y de un grupo con tendencia catinica produce un surfactante anfotrico, como por ejemplo los aminocidos, las betainas o los fosfolpidos. Segn el pH del medio una de las dos disociaciones prevalece. Este tipo de surfactante se usa slo en casos particulares debido a su alto costo. Utilizacin de los Biosurfactantes Los contaminantes hidrofbicos presentes en los hidrocarburos del petrleo, suelos y aguas del medio ambiente requieren su solubilizacin antes de ser degradados por la clula microbiana. La mineralizacin est gobernada por la desorcin de los hidrocarburos del suelo. Los surfactantes pueden aumentar el rea de los materiales hidrofbicos, como pesticidas en suelos y agua del medio, aumentndose as su solubilidad en agua. Por tanto, la presencia de biosurfactantes puede aumentar la degradacin microbiana de los contaminantes. Se le ha dado una atencin considerable a la produccin de molculas tensoactivas de origen biolgico por sus aplicaciones en el procesado de alimentos, aromatizacin de bebidas alcohlicas, reciclaje de papel, fabricacin de pulpa de papel,

en farmacologa, y la industria del aceite. En relacin a esa ltima aplicacin, los accidentes que llevan a vertidos de aceite han llegado a ser numerosos y han causado catstrofes tanto sociales como ecolgicas. La habilidad de los biosurfactantes para emulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha sido ampliamente divulgada. Estas propiedades emulsionantes tambin se ha demostrado que favorecen la degradacin de los hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los hacen muy tiles para el control de la contaminacin por vertidos de aceites. En la biorremediacin en vertidos de petrleo, estudios recientes han mostrado que se puede utilizar el poder solubilizante de las micelas para extraer ciertas sustancias contaminantes an cuando su concentracin sea extremadamente baja.

Las funciones que haran estos biosurfactantes a la hora de aumentar la biodisponibilidad seran: - Dispersar el petrleo aumentando la superficie de contacto. - Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofbicos. Seran en este caso sobre todo los de bajo peso molecular. - Poseen tambin funciones evolutivas para los propios microorganismos. Pueden ayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de petrleo una vez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba. Hay que tener en cuenta que un microorganismos suele utilizar un solo tipo de hidrocarburo entre la mezcla que existe. Por eso les sera til poderse desprender de estas interacciones hidrofbicas que mantiene la membrana con la gota de petrleo, para as ir en busca de nuevas fuentes de carbono. Adems deja una microcpsula alrededor de la gota para marcarla como usada, favoreciendo as a toda la poblacin. Una propiedad de los biosurfactantes curiosa es su actividad bactericida. Dicha actividad se debe a su capacidad detergente.

Surfactantes Microbianos El inters por los surfactantes microbianos ha estado en aumento en los ltimos aos debido a sus diversas caractersticas deseables tales como una efectiva selectividad, respetuosos para la naturaleza, su estabilidad a elevadas temperaturas, a pH y concentracin de sales. Hay que aadir que los biosurfactantes han aumentado la versatilidad en comparacin a muchos surfactantes sintticos y tienen la ventaja de poder producirse por fermentacin. Hay clulas microbianas intactas con una superficie celular altamente hidrofbica que son ellas mismas surfactantes. En algunos casos, los propios surfactantes juegan un papel natural en el crecimiento de las clulas microbianas sobre sustratos insolubles en agua. Los surfactantes extracelulares estn implicados en la adhesin celular, emulsin, dispersin, floculacin, agregacin celular y fenmenos de desorcin. Aunque el tipo y cantidad de surfactante microbiana producido depende primeramente del organismo productor, factores como el carbono y el nitrgeno, elementos traza, temperatura, y aireacin, tambin afectan a su produccin por el organismo. Existen varios biosurfactantes producidos por bacterias, entre ellos tenemos:

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Algunos ejemplos de bacterias y la produccin de biosurfactantes: 1. Bacillus pumilus (estirpe 28-11) produce biosurfactantes con una gran capacidad de emulsionar y eliminar compuestos hidrocarbonatos. Esto hace que se considere esta estirpe como prometedora en el campo de la tecnologa medio ambiental. 2. Candida ishiwade (Tailandia) es una levadura termotolerante que produce monoacilgliceroles y glicolpidos. 3. Pseudomonas sp. Pueden reducir la tensin superficial, estabilizar emulsiones, y promover la formacin de espumas y generalmente son no txicos, no peligrosos y

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biodegradables. Debido a su diversidad, inocuidad para el medio ambiente, posibilidad de produccin a gran escala, selectividad, efectividad bajo condiciones extremas en pequeas cantidades, produccin sobre recursos renovables, y sus aplicaciones potenciales para la proteccin del medio ambiente, los biosurfactantes han ganado importancia frente a los surfactantes qumicos. Hay que aadir el valor del carbohidrato presente, la ramnosa de los ramnolpidos biosurfactantes, es usada para el transporte de drogas insolubles en humanos y acta como precursor de componentes de saborizantes de alta calidad. Los biosurfactantes potencian la emulsin de hidrocarburos y por eso tienen el poder de solubilizar contaminantes hidrocarbonados y aumentar su disponibilidad para la degradacin microbiolgica. As los microorganismos productores de biosurfactantes pueden jugar un importante papel en la biorremediacin acelerada de lugares contaminados con hidrocarburos. Debido al alto costo de los procesos de remediacin y otras aplicaciones potenciales, la necesidad de aumentar la produccin de biosurfactantes es determinada por la gentica del microorganismo, otros factores tales como las condiciones ambientales y la naturaleza del sustrato tambin influyen en el nivel de expresin. As, la optimizacin de esas condiciones puede llevar a una produccin elevada y segura de biosurfactantes. Existen estudios para el desarrollo de mtodos econmicos para aumentar la produccin usando materias primas de bajo costo. 4. Pseudomonas aeruginosa LBI es un ejemplo claro de estructura qumica, propiedades superficiales y actividad biolgica en la produccin de biosurfactantes. La naturaleza qumica de los biosurfactantes producidos sera en este caso ramnolpidica, cuya estructura de ramnosa contiene propiedades biosurfactantes. 5. Pseudomona putida PCL1445 produce biosurfactantes interesantes a nivel industrial. En este caso se caracterizo dos lipopptidos con actividad biosurfactante: putisolvin I y putisolvin II; los cuales inhiben la formacin de biopelculas o provoca la destruccin de las mismas. Esta estirpe PCL1445 fue aislada de la raz de una planta, crecida en una zona contaminada con PAHs (hidrocarburos aromticos policclicos). Se vi que la estirpe PCL1445 produce actividad biosurfactante hasta el final de la fase de crecimiento. Teniendo en cuenta el uso potencial de los tensioactivos en las tecnologas de biorremediacin, la utilizacin de los biotensioactivos parece tener ms potencial que los tensioactivos de sntesis (qumicos), debido a la mayor diversidad estructural, biodegradabilidad y biocompatibilidad de los biotensioactivos. Los biotensioactivos ms estudiados han sido los emulsanos de Acinetobacter sp. y el grupo de ramnolpidos producidos por Pseudomonas aeruginosa. e. Ventajas y limitaciones de los procesos de biorremediacin de suelos contaminados. Entre las distintas tecnologas disponibles para la descontaminacin de un suelo, es importante diferenciar aqullas que suponen una solucin temporal o el posible traslado del contaminante a otros compartimentos ambientales de aqullas que potencialmente pueden transformar los contaminantes en productos inocuos. La tecnologa de la biorremediacin, basada en la utilizacin de los microorganismos y su

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potencial metablico biodegradador para eliminar o transformar los contaminantes del medio en productos inocuos, tiene ciertas ventajas respecto a los mtodos fisicoqumicos (excavacin, extraccin qumica y incineracin) tanto por su menor coste econmico, como por la no afectacin de otros compartimentos ambientales y la optimizacin de los recursos. Los costes de las tcnicas biolgicas (bioventing, biopila, landfarming y plantas de tratamiento biolgico) son mucho ms rentables econmicamente que las tcnicas fisicoqumicas. Una consecuencia de ello es que en Alemania, por ejemplo, en 1998, aproximadamente de las 2,2 MTm de suelo que fueron tratadas en las 109 plantas de tratamiento que dispone, un 60% fueron tratadas de forma biolgica. Si tenemos en consideracin que cada planta de tratamiento de suelos, tiene una capacidad de 4 x 10 5 Tm x ao-1, se podra llegar a tratar una cantidad de suelo 10 veces superior que la procesada en 1998. Una de las limitaciones que presentan las tcnicas biolgicas respecto a las tcnicas fisicoqumicas es el tiempo necesario para alcanzar una biodegradacin aceptable segn las normativas. Durante un proceso de biorremediacin se produce una ralentizacin del proceso de biodegradacin ya sea por un enriquecimiento de componentes ms recalcitrantes o por una disminucin de la biodisponibilidad de los contaminantes. Sin embargo, las tcnicas fisicoqumicas, an pudiendo ser ms rpidas y efectivas en la disminucin de la concentracin de contaminantes, alteran o eliminan por completo la microbiota autctona del suelo, modifican las caractersticas fisicoqumicas del suelo, y adems, no eliminan los contaminantes, si no que los trasladan a otro compartimento ambiental. Por lo tanto no cumplen con los criterios de sostenibilidad en los que se debera basar la ley de proteccin de suelos. Factores que condicionan la biorremediacin de un suelo. La biodegradabilidad de una mezcla de hidrocarburos presente en un suelo contaminado depende de diversos factores como son: la presencia de una poblacin microbiana degradadora potencialmente activa, la estructura molecular del contaminante, su concentracin y biodisponibilidad, y factores ambientales como el pH, temperatura, humedad del suelo, presencia de aceptores de electrones disponibles, y la existencia de nutrientes inorgnicos (fuente de N y P) disponibles. El pH, temperatura y la humedad Cada cepa microbiana tiene un determinado rango de tolerancia a factores ambientales como son: la temperatura, el pH y la salinidad, los cuales pueden afectar al crecimiento y actividad de las poblaciones microbianas. En consecuencia, cuanto mayor sea la diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor ser el rango de tolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas que sean ptimas en todos los casos, pero en trminos generales a pH y temperaturas extremas y en suelos salinos la biodegradacin se ralentiza, siendo los rangos ptimos para la biodegradacin: pH entre 6- 8 y temperaturas entre 20-30C. La variacin del pH del suelo afecta a la actividad microbiana y tambin a la solubilizacin y adsorcin/absorcin de los contaminantes y de los iones. Las formas catinicas (NH4+, Mg2+, Ca2+) son ms solubles a pH cido mientras que las formas aninicas (NO3-, NO2-, PO43 Cl-) son ms solubles a pH alcalino. En general, el pH ptimo para las bacterias hetertrofas es neutro (pH 6-8), mientras que es ms cido
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para los hongos (pH 4-5). El pH ptimo establecido para procesos de biodegradacin es neutro (pH 7,4-7,8). La temperatura es uno de los factores ambientales ms importantes que afecta la actividad metablica de los microorganismos y la tasa de biodegradacin. La mayor parte de estudios realizados indican que las condiciones mesoflicas (20-30C) son las ptimas para la biorremediacin de suelos contaminados. No obstante, tambin se ha descrito biodegradacin de hidrocarburos temperaturas extremas: a 10C en suelos subrticos y subalpinos, 5C en suelos rticos y hasta 60C por una cepa termfila de Bacillus stearothermophilus aislada de un suelo contaminado con crudo de petrleo del desierto kuwait. La humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradacin, fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el contenido de agua. No obstante el nivel ptimo de humedad depende de las propiedades de cada suelo, el tipo de contaminacin y si la biodegradacin es aerbica o anaerbica. Un dficit de agua puede disminuir el transporte de nutrientes y de contaminantes, as como tambin la migracin bacteriana a travs del suelo. El exceso de agua en un suelo desplaza el aire residente en los poros del suelo, generndose con mayor facilidad condiciones anaerbicas, al agotarse el oxgeno disuelto en agua. Estructura qumica De las distintas familias de hidrocarburos del petrleo, los n-alcanos y los alcanos ramificados (isoprenoides) de cadena intermedia (C10-C20) son los sustratos ms fcilmente degradables por los microorganismos del suelo, y que por lo tanto tienden a ser eficazmente biodegradados. Sin embargo, los alcanos de cadena larga (>C20) son ms difciles de degradar debido a su (elevado peso molecular) y su baja solubilidad en agua. Los cicloalcanos, por norma general, se degradan ms lentamente que los nalcanos y alcanos ramificados. Asimismo, los HAPs que contienen de 2 a 3 anillos aromticos pueden ser biodegradados eficazmente en el suelo en condiciones ambientales ptimas, mientras que los HAP de 4 anillos, y especialmente, los de 5 o ms anillos bencnicos presentan una mayor recalcitrancia inherente y una baja solubilidad. Las fracciones de resinas y asfaltenos son las que presentan una menor degradabilidad debido a las complejas estructuras qumicas y al elevado peso molecular de sus molculas. Biodisponibilidad La tasa de degradacin depende tanto de la capacidad de transporte y del metabolismo microbiano, como de la transferencia de masas del compuesto. La relacin entre estos factores se conoce como biodisponibilidad. En los suelos uno de los factores limitantes para la biodegradacin es la transferencia de masas, ya que los microorganismos de los suelos contaminados, suelen tener amplias capacidades biodegradativas al estar expuestos a una gran variedad de compuestos orgnicos diferentes. Por lo tanto la adsorcin, la absorcin, desadsorcin, disolucin y la difusin son fenomenos, propios de la transferencia de masas, que condicionan la biodisponibilidad de los contaminantes. Un fenmeno que afecta de forma negativa a la biodisponibilidad de los contaminantes es el envejecimiento o ageing que se define como la prdida de la biodegradabilidad de los compuestos a lo largo del tiempo en el suelo (aunque la poblacin microbiana mantenga intacto su potencial catablico), el cual es ms importante en suelos con elevado contenido en materia orgnica. Este efecto

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se produce por una serie de fenmenos como son: la adsorcin con la materia particulada del suelo, absorcin a la materia orgnica del suelo, a la baja difusividad de los compuestos, principalmente desde los microporos; a la disolucin en fases lquidas no acuosas (FLNAs), o a la formacin de uniones covalentes con la materia orgnica e inorgnica del suelo. Con la finalidad de aumentar la biodisponibilidad de los contaminantes existen numerosos ejemplos en la bibliografa de la utilizacin de tensioactivos sintticos y biotensioactivos en la biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos. Presencia de aceptores de electrones La mayor parte de hidrocarburos presentes en los productos petrolferos son degradados con mayor extensin y rapidez de forma aerbica (O2 como aceptor final de electrones), ya que en ausencia de O2, y en presencia de aceptores de electrones alternativos (NO3-, SO42-, CO2, Mn4+ y Fe3+) los hidrocarburos pueden ser degradados, pero con unas tasas de biodegradacin muy inferiores a las aerbicas. Nutrientes inorgnicos Las concentraciones de nitrgeno y fsforo asimilables presentes en el suelo, suelen ser limitantes para un incremento y activacin de la poblacin microbiana, mientras que otros nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO42- ya estn presentes en cantidades suficientes en el suelo. La adicin de fuentes de N y P inorgnicas, generalmente tiene un efecto positivo incrementando las poblaciones microbianas y las tasas de biodegradacin de hidrocarburos en suelos contaminados. Las proporciones molares de C:N:P, descritas en la bibliografa, respecto al contenido de carbono a degradar son muy distintas. La Agencia de Proteccion Ambiental de USA recomienda utilizar proporciones C:N de 100:10 a 1000:10 para la biodegradacin de suelos contaminados por hidrocarburos, y dentro de este intervalo se han descrito proporciones C:N de 600:10, 500:10 y de 100:10:1 a 300:10:1 respecto al Carbono Orgnico Total a degradar. Aunque en general la adicin de fuentes inorgnicas de N y P al suelo es beneficiosa para los procesos de biodegradacin, existen estudios que han descrito efectos inhibitorios en la adicin de nutrientes inorgnicos. Adems es importante destacar que la accin de los nutrientes inorgnicos puede estar limitada debido a la interaccin qumica con los minerales del suelo (el amonio se puede unir a las arcillas por intercambio catinico y el fosfato puede unirse y precipitar con iones calcio, hierro y aluminio). f. Microorganismos reportados como degradadores de Petrleo: Todos los ecosistemas acuticos y marinos contienen algn tipo de microorganismos degradadores de petrleo, entre los gneros reportados estn: Bacterias: o Achrornobacter o Acinetobacter o Actinomyces o Alcaligenes o Arthrobacter o o o o o Bacillus Beneckea Brevebacterium Coryneformes Erwinia 15

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Flavobacterium Klebsiella Lactobacillus Leumthrix Moraxella Nocardia Peptococcus

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Pseudomonas Sarcina Spherotilus Spirillum Streptomyces Vibrio Xanthomyces Oidiodendrum Paecylomyses Phialophora Penicillium Rhodosporidium Rhodotorula Saccharomyces Saccharomycopisis Scopulariopsis Sporobolomyces Torulopsis Trichoderma Trichosporon

Hongos: o Allescheria o Aspergillus o Aureobasidium o Botrytis o Candida o Cephalosporium o Cladosporium o Cunninghamella o Debaromyces o Fusarium o Gonytrichum o Hansenula o Helmintrosporium o Mucor

Tambin se ha reportado la utilizacin de dos especies de camarones en la biodegradacin del petrleo, siendo estos Peanus duorarum y Peanus aztecuz cuya capacidad de degradar los hidrocarburos casi en su totalidad van desde los compuestos de 12 carbonos hasta los compuestos de 22 carbonos. La cantidad y diversidad de los microorganismos degradadores de petrleo depende de la exposicin de las aguas a estos hidrocarburos. La velocidad de degradacin de los compuestos presentes en el petrleo es como sigue:

HC saturados > aromticos ligeros > aromticos de alto PM > asfaltenos, resinas III. IV. Objetivos: Aislar bacterias degradadoras de de Petrleo Diesel. Cuantificar la actividad degradativa del Petrleo Diesel de cada una de las bacterias aisladas. Materiales y mtodos:

Materiales: o Muestra: 100 g de suelo de servicentro contaminado con Petrleo Diesel. o Medios: Agar Bushnell Hass, Agar Tripticasa Soya, Petrleo Diesel. o Frascos estriles.

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o o o o o o o o o o

Tubos de dilucin Tubos medianos Placas de Petri Gradillas Mechero Bunsen Asas bacteriolgicas Viales Pipetas Jeringas Biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift

Mtodo: o Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptacin de los microorganismos a concentraciones crecientes de petrleo. Disear y acondicionar dos biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift con flujo descendente de 1 L de capacidad. Pesar 50 g de muestra de suelo previamente tamizada y llevarla hacia un biorreactor conteniendo 100 mL de caldo Bushnell Hass (BH) con 1% de Petrleo Diesel. Incubar a 30 C durante 72 h. Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el segundo biorreactor conteniendo 100 mL de caldo BH con 2% de Petrleo Diesel. Lavar y esterilizar el primer biorreactor. Incubar a 30 C durante 72 h. Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el primer biorreactor conteniendo 100 mL de caldo BH con 4% de Petrleo Diesel. Incubar a 30 C durante 72 h. o Aislamiento de las bacterias degradadoras de Petrleo Diesel. A partir de la muestra enriquecida en caldo BH con 4% de Petrleo Diesel (PD) tomar una alcuota y sembrarla mediante la tcnica de agotamiento y estra sobre la surficie de placas de Petri conteniendo Agar BH con 4% de PD. Incubar a 30 C durante 48 h. Seleccionar y repicar las cinco colonias que presenten la mayor biomasa y mayor rapidez en el crecimiento hacia viales conteniendo agar BH con 4% de PD y agar Tripticasa Soya (TSA). Incubar a 30 C durante 48 h. Conservar las cepas de bacterias biodegradadoras de PD en refrigeracin o Cuantificacion de la actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas de bacterias aisladas. La actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas bacterianas aisladas ser cuantificada a travs del tiempo requerido para la utilizacin del PD como fuente de carbono y energa y del nmero de Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) de cada una de ellas.

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Preparacin del inculo: o Reactivar cada una de las cepas bacterianas degradadoras del PD en 5 mL de caldo nutritivo a 30 C durante 24 h. o Cantrifugar el caldo nutritivo a 3500 RPM durante 15 min; eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento con SSFE por dos veces. o Con el paquete celular obtenido preparar una suspensin de celulas en SSFE y estandarizarla con el tubo N 3 del Nefelmetro de McFarland (9x108 celulas/mL). Tiempo requerido para la utilizacin del PD como fuente de carbono y energa: o De cada inculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo 10 mL de caldo BH con 0,2 mL de resarzurina y 0,1 mL de PD (dejar un tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo). o Incubar a 30 C hasta por 5 das en agitacin constante (150 RPM). o Observar diariamente en busca del cambio de coloracin del indicador resarzurina (azul a rosado brillante) que ser interpretado como positivo para la utilizacin del PD como fuente de carbono y energa. Cuantificacin de las Unidades de Actividad Emulsificante: o De cada inculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e inocular por triplicado con tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo 10 mL de caldo extracto de levadura ms 0,2 mL de etanol. Dejar un tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo. o Incubar a 30 C durante 3 das en agitacin constante (150 RPM). o Diariamente observar en busca de la informacin de burbujas y turbidez del medio de cultivo. o Centrifugar el contenido de cada uno de los tubos, a 2000 RPM durante 30 min. o Tomar 1 mL de cada uno de los sobrenadantes y colocarlos en tubos de prueba conteniendo 9 mL de caldo levadura etanol ms de 0,2 de PD. Tapar hermticamente los tubos y agitarlos durante un min. Hasta lograr la emulsin. o Calibrar a cero el espectrofotmetro con tubo blanco conteniendo caldo extracto de levadura con etanol no inoculado (testigo) y leer la absorvancia de cada una de las muestras a 540 nm. o Realizar la conversin de la absorvancia de cada una de las muestras a UAE considerando 0.816 de absorvancia como una Unidad de Actividad Emulsificante por mL (1 UAE/mL). Resultados: Tiempo requerido para la utilizacin del PD como fuente de carbono y energa:
CEPA DAS DE VIRAJE COLOR DE VIRAJE pH

V. -

Cepa 01 Cepa 02 Cepa 03

---5 das 12 das

---Violeta Amarillo

--- 6.8 5.2

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El indicador utilizado en este proceso de cuantificacin fue el prpura de bromocresol. Este indicador se caracteriza por virar de acuerdo al pH, siendo amarillo a un pH menor o igual a 5.2 y violeta a un pH mayor o igual a 6.8.

Inculos al 1 da

Inculos al 5 da

Inculos a 15 das Cuantificacin de las Unidades de Actividad Emulsificante: CEPA Cepa 01 Cepa 02 Cepa 03 UAE 1.281 1.353 1.561

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Con el tubo blanco se lee la absorvancia a 540 nm. Luego los resultados obtenidos se los divide entre 0.816 (1 UAE = 0.816). Identificacin de las cepas aisladas: CEPA 01 Bacilos cortos, espora central no deformante De a dos o en cadenas cortas Positivo Positivo Pelcula, turbidez y sedimento CEPA 02 Bacilos largos, delgados, espora terminal no deformante De a dos Positivo Positivo Pelcula, turbidez y sedimento CEPA 03 Bacilos medianos no esporulados Aislados y de a dos Negativo Positivo Pelcula, turbidez y sedimento

CARACTERISTICAS Morfologa Disposicin Tincin Gram Catalasa Crecimiento en caldo Reduccin de NO3O F glucosa Rojo de Metilo Voges Proskawer Hidrlisis de almidn Indol Caldo glucosa Caldo maltosa Hidrlisis de gelatina Gnero VI. Referencias:

+ + + + + Bacillus sp.

+ + + + + Bacillus sp.

Pseudomonas sp.

LU CHAU, T. (2006). Biorremediacin. Dpto. de Ingeniera Qumica. Universidad de Santiago de Compostela. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en http://www.usc.es/uscmn/investigacion/documento/PrestigeBiorremediaci%F3n.pdf VIAS C., M. Biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos: caracterizacin microbiolgica, qumica y ecotoxicolgica. Facultad de Biologa. Universidad de Barcelona. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0920105085623//TESIS_MVI%D1AS_CANALS.pdf ALTAMIRANO, M. G. (2005). Aislamiento e identificacin de bacterias hidrocarburolticas provenientes de un suelo sometido a biorremediacin. ORTIZ, J. y J. RODRIGUEZ (2007). Biomarcadores y su utilidad en la evaluacin de la biodegradacin del petrleo. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en http://ingenierosdeminas.org/docu/documentos/biomarcadores_petroleo.pdf V. BOTELLO, A. (1974) Utilizacin y degradacin del petrleo crudo por dos especies de camarn: Penaeus duorarum y Peneaus aztecas. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Centro de Ciencias del Mar y Limnologa. Obtenido el 24 de marzo del 2008 en http://biblioweb.dgsca.unam.mx/cienciasdelmar/centro/1975-1/articulo11.html

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SULBARAN MORA, Miguel, BAHSAS, Ali, VELASQUEZ, William et al. Caracterizacin de Biosurfactantes producidos por Pseudomonas Fluorescentes aisladas de emulsiones de petrleo pesado. CIEN, jun. 2005, vol.13, no.2, p.228239. ISSN 1315-2076. PINEDO R., T. (2005) Biosurfactantes. Obtenido el 24 de marzo del 2008 en http://www.personal.us.es/evpolo/pdf/trab_dirig/pinedorevilla_trigochorda.pdf Anexos:

VII.

Fluxograma de trabajo:

Tamizar

Muestra: 100 g de suelo contaminado con PD A 50g de tamizado

B

100 mL de caldo BH + 1% PD
30 C x 72 h

10 mL de la muestra enriquecida A

100 mL de caldo BH + 2% PD 10 mL de la muestra enriquecida A

C
30 C x 72 h

100 mL de caldo BH + 4% PD 30 C x 72 h

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Sembrar

Agar BH + 4% PD
30 C x 48 h

Tomar una alcuota de la muestra enriquecida C Seleccionar y repicar 3 colonias

Repicar

> biomasa, > rapidez de crecimiento

Incubar

Agar BH + 4% de PD + TSA

30 C x 48 h

Conservar las cepas en refrigeracin Cuantificacin de la actividad degradativa de las cepas aisladas sobre PD. Tiempo requerido para su utilizacin Reactivar Incubar 30 C x 24 h 5 mL caldo nutritivo Centrifugar

3500 rpm x 15 min. 22

Lavar sedimento con SSFE x 2 veces consecutivas

Realizar esto por cada cepa

Eliminar sobrenadante

1 mL Inocular de cada cepa en botellas Preparar suspensin al Tubo N 3 del NMF (9x108 cel/mL)

Dejamos un tubo con medio no inoculado como testigo

10 mL caldo BH con 0.2 mL de resarzurina y 0.1 mL de PD

Observar diariamente si cambia de azul a rosado brillante

Incubar a 30 C x 5 d. a agitacin cte. (150 rpm)

Como se us prpura de bromocresol veremos el cambio de color de lila a amarillo

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 Cuantificacin de las unidades de actividad emulsificante (UAE). Del inculo preparado al Tubo N 3 del NMF (9x108 cel/mL)

1 mL Inocular en tubos de dilucin con 10 mL de caldo Extracto de Levadura + 0.2 mL de etanol Incubar 30 C x 3 d. en agitacin constante (150 rpm)

Observar y diariamente formacin de burbujas y turbidez del medio

Tomar el sobrenadante (1mL)

Centrifugar cada uno de los tubos (2000 rpm) 9 mL caldo levadura etanol + 0.2 mL de PD Agitamos 1 min. hasta lograr una emulsin

Tapamos hermticamente

Leer absorvancia a 540 nm Calibramos a cero el espectrofotmetro con el tubo blanco

Realizar la conversin de la absorvancia de cada una de las muestras a UAE

Considerar 0.816 de 24 absorvancia como 1 UAE/mL

NDICE

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