Conteo de Celulas de Purkinje

VISUALIZACIN Y CUANTIFICACIN DE ESPINAS DENDRTICAS EN IMGENES POR MICROSCOPA DE LUZ
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERA
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
MAESTRA EN INGENIERA BIOMDICA
VISUALIZACIN Y CUANTIFICACIN
DE ESPINAS DENDRTICAS DE
CLULAS DE PURKINJE
EN IMGENES POR MICROSCOPA DE LUZ
Tesis de Maestra
presentada ante la Universidad de Los Andes
por
Francisco Javier Durn Montilla
como requisito parcial para optar al Grado de
Magister Scientiae en Ingeniera Biomdica
Realizada bajo la Tutora del Profesor
Dr. Rubn de Jess Medina
1
AGRADECIMIENTOS
Agradezco ante todo a Dios por permitirnos plantear y lograr los objetivos, a mis Padres
Mara Faustina Montilla
y Benito Ramn Durn por esmerarse en mis inicios y logro de mi

formacin profesional.
A mis hijas Mara Jos Durn, Mara Fernanda Durn y a mi esposa Yane Margarita Durn,
por apoyarme en la obtencin del objetivo planteado en esta nueva etapa de mi formacin.
Al Dr. Ernesto Palacios Pr
, por su dedicacin a la formacin de personal en el rea de

investigacin, como textualmente lo deca Las instituciones nunca mejoran ni son ms
productivas, sino mejoran y aumentan la produccin de todos y cada uno de los individuos
que las integran
Al Personal del Centro de Microscopa Electrnica Dr. Ernesto Palacios Pr por la
colaboracin en el desarrollo de los experimentos para adquirir las imgenes, en especial a la
Dra. Rosa Virginia Mendoza Briceo, por la asesora brindada y permitir desarrollar en mi
ambiente de trabajo actividades para el mejoramiento de mi nivel acadmico.
Tambin agradezco a la Planta Profesoral del Grupo de Ingeniera Biomdica en especial al
Profesor Rubn de Jess Medina, quien me permiti adquirir herramientas esenciales para el
procesamiento de imgenes.
A los compaeros de estudio, por el apoyo incondicional en las horas nocturnas dedicadas a la
bsqueda del entendimiento del conocimiento y su aplicacin.
...de que el tiempo pase y no hagamos nada es mejor que pase haciendo algo.
...y a Dios por permitir hacer.
2
Introduccin XI
1. CAPTULO I 17
1. HERRAMIENTAS PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS CP 17
1.1. Introduccin. 17
1.2. Motivacin y Planteamiento del Problema 19
1.3. Bases Tericas 22
1.3.1. El Microscopio de luz 22
1.3.2. Microscopa digital de alta resolucin basada en luz 23
1.3.3. Aberraciones pticas en MLARD 28
1.3.4. Ruido aleatorio en las imgenes MLARD 29
1.3.5. Funcin de distorsin puntual 30
1.4. Imgenes Digitales 31
1.4.1. Tcnicas bsicas de procesamiento 33
2. CAPTULO II 40
2. UTILIZACIN DE FILTROS DE MEDIANA Y TRANSFORMADA WAVELET EN EL ANLISIS DIGITAL DE IMGENES
NEURALES 40
2.1. Introduccin 40
2.2. Materiales y Mtodos 42
2.2.1. Filtro de mediana 42
2.2.2. Filtro de mediana ponderado 43
2.2.3. Filtro de mediana ponderado ptimo 44
2.2.4. Transformada Wavelet 45
2.3. Resultado 45
2.3.1 Filtro de mediana 46
2.3.2 Filtro de mediana ponderado 46
2.3.3 Filtro de mediana ponderado ptimo 47
2.3.4 Transformada Wavelet 49
2.4. Conclusiones 52
3
3. CAPTULO III 53
3. PREPROCESAMIENTO DE IMGENES DE CLULAS DE PURKINJE UTILIZANDO DECONVOLUCIN 53
3.1. Introduccin 53
3.2.1 Convolucin 55
3.2.2 Deconvolucin 57
3.2.3 Relacin Seal a Ruido de Pico 63
3.3. Resultados 64
3.3.1 Validacin de los algoritmos de restauracin 64
3.3.2 Restauracin de Imgenes de Clulas de Purkinje 68
3.4. Conclusiones 72
4. CAPTULO IV 74
4. HERRAMIENTA DE CLASIFICACIN APLICADA A IMGENES DE CLULAS DE PURKINJE 74
4.1. Introduccin 74
4.2.1 Mquina de soporte vectorial (SVM) 77
4.2.2 Mquina de soporte vectorial de mnimos cuadrados (LSSVM) aplicados a imgenes de CP 80
4.2.2.1 Seleccin de Marcadores 81
4.2.2.2 Seleccin de No Marcadores 82
4.2.2.3 Entrenamiento de la LSSVM 83
4.2.2.4 Validacin de la LSSVM 86
4.2.2.5 Prueba de desempeo de la LSSVM en imgenes de CP 87
.4.2.3 Resultados 88
.4.2.3.1. Mquina de soporte vectorial de mnimos cuadrados aplicados a imgenes sintticas 89
4.2.3.1.1 Primer Ensayo 91
4.2.3.1.2 Segundo Ensayo 93
4.2.3.1.3 Tercer Ensayo 95
4.2.3.1.3.1 Resultado de la prueba de desempeo 100
Mquina de soporte vectorial de mnimos cuadrados aplicados a imgenes de CP 103
4.2.3.2.1 Anlisis de resultados de la LSSVM aplicados a imgenes de CP 109
4.2.3.2.2 Discusin acerca de los resultados de la LSSVM aplicados a imgenes de CP 114
4
5. CONCLUSIONES GENERALES 118
6. REFERENCIAS 121
5
ndice de Figuras
FIGURA 1-1. ORGANIZACIN CELULAR DE LA CORTEZA CEREBELOSA
(TOMADA DE [6]) 18
FIGURA 1-2. MODELO DETALLADO DE CP, DONDE SE RESALTAN LAS ESPINAS
DENDRITICAS. (FUENTE: CENTRO DE MICROSCOPA ELECTRNICA DR.
ERNESTO PALACIOS PR) 21
FIGURA 1-3. IMAGEN DE UN SEGMENTO DEL RBOL DENDRTICO DE CP
OBTENIDA CON MLARD, SIN SER SOMETIDA A PREPROCESAMIENTO. 22
FIGURA 1-4. MICROSCOPIO DE LUZ CONVENCIONAL (TOMADO DE [11]) 23
FIGURA 1-5. SISTEMA PTICO DEL POLYVAR REICHERT-JUNG (OJO: MANUAL
REFERENCIARLO) 24
FIGURA 1-6. ADQUISICIN DE IMGENES DE CP CON MLARD (FUENTE: EL
AUTOR). 25
FIGURA 1-7. MICRTOMO. (FUENTE: CENTRO DE MICROSCOPA ELECTRNICA
DR. ERNESTO PALACIOS PR) 26
FIGURA 1-8. ESQUEMA QUE ILUSTRA EL PROCESO DE TRANSILUMINACIN.
LA FLECHA AMARILLA REPRESENTA EL HAZ DE LUZ INCIDENTE SOBRE LA
MUESTRA, QUE ATRAVIESA LA MISMA. (TOMADO DE [12]) 26
FIGURA 1-9. ESQUEMA DE LA POSICIN DE LOS LENTES OBJETIVO Y OCULAR,
EN RELACIN CON EL ESPCIMEN Y EL OBSERVADOR. (TOMADO DE [12]) 27
6
FIGURA 1-10. DIFRACCIN DE UN HAZ DE LUZ AL PASAR A TRAVS DE UN
ORIFICIO. (TOMADO DE [11]) 28
FIGURA 1-11. DISCOS DE AIRY. (TOMADO DE [11]) 29
FIGURA 1-12. ABERRACIN ESFRICA. LOS RAYOS QUE INCIDEN
PARALELAMENTE AL EJE PRINCIPAL NO CONVERGEN TODOS EN UN MISMO
PUNTO. (TOMADO DE [11]) 29
FIGURA 1-13. MICROSCOPIO POLYVAR REICHERT-JUNG. (FUENTE: CENTRO DE
MICROSCOPA ELECTRNICA DR. ERNESTO PALACIOS PR) 32
FIGURA 1-14. IMAGEN DE LA ARBORIZACIN DENDRTICA DE UNA CP, A UNA
RESOLUCIN DE 4096X5120X3 Y 8 BITS DE PROFUNDIDAD 32
FIGURA 1-15. SEGMENTO DEL RBOL DENDRTICO DE UNA CP, IMPREGNADA
CON EL MTODO DE GOLGI Y SIN NINGN PREPROCESAMIENTO. 33
FIGURA 1-16. (A) IMAGEN DE CP, SIN PROCESAR (B) IMAGEN DE CP,
PREPROCESADA UTILIZANDO TRANSFORMACION PUNTUAL 35
FIGURA 1-17. (A) IMAGEN DE CP, SIN PROCESAR (B) IMAGEN DE CP,
PROCESADA CON UN FILTRO DE MEDIANA 36
FIGURA 1-18. (A) IMAGEN SIN PROCESAR DE CP. (B) IMAGEN DE CP
PROCESADA CON UN FILTRO DE MEDIA 37
FIGURA 1-19. (A) IMAGEN DE CP, SIN PROCESAR. (B) IMAGEN DE CP
PROCESADA CON UN FILTRO GAUSSIANO 38
7
FIGURA 1-20. (A) IMAGEN DE CP, SIN PROCESAR. (B) IMAGEN DE CP
PROCESADA CON UN REALCE LOGARTMICO 39
FIGURA 2-21. (A) DENDRITAS DE CP, SIN NINGN PREPROCESAMIENTO. (B)
DENDRITAS DE CP DESPUS DE UTILIZAR FILTRO DE MEDIANA, CON UNA
VECINDAD 5X 5. 46
DENDRITAS DE CP DESPUS DE UTILIZAR EL FILTRO DE MEDIANA
PONDERADO, CON UNA VECINDAD 5X5 47
DENDRITAS DE CP DESPUS DE UTILIZAR FILTRO DE MEDIANA PONDERADO
PTIMO, CON UNA VECINDAD 5X5. 48
DENDRITAS DE CP DESEADA 49
FIGURA 2-25. CURVA DE ERROR 49
FIGURA 2-26. DESCOMPOSICIN DE LA TW DE CP, CON LA WAVELET DB1 50
FIGURA 2-27. (A) IMAGEN AUMENTADA DE LAS DENDRITAS DE CP,
CORRESPONDIENTE A UNA SECCIN DE LA IMAGEN. (B) APLICACIN DE LA
TWI 51
FIGURA 3-28. EJEMPLO DE LA OPERACIN DE CONVOLUCIN 56
FIGURA 3-29. FUNCIN DE PROPAGACIN DE PUNTOS () 57
FIGURA 3-30. EJEMPLO DE LA OPERACIN DE DECONVOLUCIN 58
8
FIGURA 3-31. MODELO DE RESTAURACIN 60
FIGURA 3-32. DEGRADACIN ESPACIAL DE UNA IMAGEN 62
FIGURA 3-33. DIAGRAMA DEL TEST DE DECONVOLUCIN 65
FIGURA 3-34. (A) IMAGEN DE LENA (B) IMAGEN CONVOLUCIONADA CON
UNA GAUSSIANA (C) CLCULO DEL PSNR PTIMO APLICANDO EL FILTRO DE
REGULARIZACIN (D) IMAGEN RESTAURADA CON EL FILTRO DE
REGULARIZACIN 66
FIGURA 3-35. (A) IMAGEN DE LENA. (B) IMAGEN CONVOLUCIONADA CON
WIENER (D) IMAGEN RESTAURADA CON EL FILTRO DE WIENER 67
FIGURA 3-36. (A) IMAGEN DE LENA. (B) IMAGEN CONVOLUCIONADA CON
LUCY-RICHARDSON (D) IMAGEN RESTAURADA CON EL FILTRO DE LUCY-
RICHARDSON. 68
FIGURA 3-37. (A) IMAGEN CP SIN PREPROCESAMIENTO (B) IMAGEN CP
APLICANDO EL ALGORITMO DE REGULACIN CON UNA VENTANA DE 15X15 Y
VARIANZA 2,5 (C) IMAGEN ORIGINAL APLICANDO REALCE LOGARTMICO (D)
IMAGEN DE CP OBTENIDA POR REGULACIN E INMEDIATAMENTE SE LE
APLICA UN REALCE LOGARTMICO 70
FIGURA 3-38. (A) IMAGEN CP SIN PREPROCESAMIENTO. (B) IMAGEN CP
APLICANDO EL ALGORITMO DE WIENER CON UNA VENTANA DE 17X17 Y
VARIANZA 0,5 (C) IMAGEN ORIGINAL DE CP APLICANDO REALCE
LOGARTMICO (D) IMAGEN DE CP OBTENIDA POR WIENER Y SE LE APLICA UN
REALCE LOGARTMICO 71
9
FIGURA 3-39. (A) IMAGEN CP SIN PREPROCESAMIENTO. (B) IMAGEN CP
APLICANDO EL ALGORITMO DE LUCY-RICHARDSON, CON UNA VENTANA DE
17X17 Y VARIANZA 5 (C) IMAGEN ORIGINAL DE CP APLICANDO REALCE
LOGARTMICO (D) IMAGEN DE CP OBTENIDA POR LUCY-RICHARDSON Y SE LE
APLICA UN REALCE LOGARTMICO 72
FIGURA 4-40. HIPERPLANO DE SEPARACIN OPTIMO W.X+B 78
FIGURA 4-41. LA IDEA DE LA SVM ES ESTABLECER UNA CORRESPONDENCIA
DE LOS DATOS DE ENTRENAMIENTO EN UN ESPACIO CARACTERSTICO DE
DIMENSIN SUPERIOR UTILIZANDO Y AS, PODER CONSTRUIR UN
HIPERPLANO QUE SEPARE LAS CLASES CON UN MARGEN MXIMO 80
FIGURA 4-42. IMAGEN DE CP SELECCIN DE MARCADORES 82
FIGURA 4-43. IMAGEN DE CP UTILIZADA PARA LA SELECCIN DE NO
MARCADORES 82
FIGURA 4-44. MUESTRA LA ORGANIZACIN DE LOS PATRONES DE
ENTRENAMIENTO DE ENTRADA DE LA LSSVM DONDE X ES UNA MATRIZ DE
13200X317 E Y ES UNA MATRIZ DE TAMAO 13200X1 84
FIGURA 4-45. ESTIMACIN DE LOS VALORES PTIMOS DE LOS
HIPERPARMETROS SIGMA Y GAMMA 85
FIGURA 4-46. UBICACIN DE LOS MARCADORES SOBRE LA IMAGEN 87
FIGURA 4-47. DIAGRAMA DEL ALGORITMO DE LAS LSSVM 90
10
FIGURA 4-48. IMAGEN SINTTICA DE ENTRENAMIENTO 256X256 PIXELES Y 8
BIT DE PROFUNDIDAD (A) IMAGEN CON LOS MARCADORES (B) SE
SELECCIONAN LOS MARCADORES 91
FIGURA 4-49. IMAGEN SINTTICA SIN MARCADORES UTILIZADA PARA
EXTRAER LOS NO MARCADORES 92
FIGURA 4-50. IMGENES SINTTICAS DE VALIDACIN DEL CLASIFICADOR
LSSVM, (A) SE ENCONTRARON 10 MARCADORES (B) SE ENCONTRARON 14
MARCADORES 93
FIGURA 4-51 (A) IMAGEN DE ENTRENAMIENTO ( B) IMAGEN DE VALIDACIN 94
FIGURA 4-52. REPRESENTACIN DEL NIVEL DE GRIS UTILIZADO EN LOS
MARCADORES, NO MARCADORES Y FONDO DE LA IMAGEN 95
FIGURA 4-53. (A) IMAGEN SINTTICA SIN RUIDO (B) UNA DE LAS IMGENES
SINTTICA CON RUIDO (SNR=37,63 DB), UTILIZADAS EN LA PRUEBA DE
DESEMPEO DE LA LSSVM 96
FIGURA 4-54. (A) IMAGEN SIN RUIDO, LA LSSVM SELECCION LOS
MARCADORES EN EL TEST DE ENTRENAMIENTO (B) IMAGEN CON RUIDO
DONDE LA LSSVM SELECCION LOS MARCADORES, TEST DE VALIDACIN
(IMAGEN1, SNR=49,76 DB) 97
FIGURA 4-55. (A) IMAGEN SIN RUIDO, LA LSSVM SELECCION LOS
MARCADORES EN EL TEST DE ENTRENAMIENTO (B) IMAGEN CON RUIDO
DONDE LA LSSVM SELECCION LOS MARCADORES, TEST DE VALIDACIN
(IMAGEN8, SNR=23,74 DB) 97
FIGURA 4-56 CURVA ROC 100
11
FIGURA 4-57. RELACIN SEAL RUIDO 101
FIGURA 4-58. GRFICA DE SENSIBILIDAD VS SNR (DB) 102
FIGURA 4-59. GRFICA DE ESPECIFICIDAD VS SNR (DB) 102
FIGURA 4-60. GRAFICA DE ROC, CON REA BAJO LA CURVA DE 0,71 103
FIGURA 4-61. IMGENES DE CP DE ENTRENAMIENTO (A) CONTEO MANUAL (B)
CONTEO AUTOMTICO 106
FIGURA 4-62. IMGENES DE CP DE ENTRENAMIENTO (A) CONTEO MANUAL (B)
FIGURA 4-63. IMGENES DE CP DE VALIDACIN (A) CONTEO MANUAL (B)
FIGURA 4-64. IMGENES DE CP DE VALIDACIN (A) CONTEO MANUAL (B)
12
ndice de Tablas
TABLA 4-1. RESULTADOS APLICANDO LA LSSVM A LAS IMGENES DE
ENTRENAMIENTO 94
TABLA 4-2. RESULTADOS APLICANDO LA LSSVM A LAS IMGENES DE
VALIDACIN 94
TABLA 4-3. PRUEBA DE DESEMPEO 98
TABLA 4-4. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE DESEMPEO EN LAS IMGENES
SINTTICAS 101
TABLA 4-5. IMGENES DE CP, PARA EL ENTRENAMIENTO DE LA LSVM 110
TABLA 4-6. IMGENES DE CP, PARA LA VALIDACIN DE LA LSVM 112
TABLA 4-7. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE DIAGNSTICO EN LAS IMGENES
DE CP DEL GRUPO DE ENTRENAMIENTO 113
TABLA 4-8. RESULTADOS DE LA PRUEBA DE DIAGNSTICO EN LAS IMGENES
DE CP DEL GRUPO DE VALIDACIN 114
13
Introduccin
En el desarrollo de esta investigacin se utilizaron diferentes herramientas para el
procesamiento de imgenes que contienen clulas de Purkinje (CP). En tal sentido, en cada
uno de los captulos se desarroll una breve exposicin de las herramientas utilizadas,
presentando al final de cada captulo la conclusin respectiva.
Las neuronas de los diferentes centros de integracin del sistema nervioso central se
caracterizan por presentar una estructura morfolgica determinada conocida como fenotipia, la
cual depende de la funcin que debe cumplir y que hace posible distinguir un tipo de neurona
de otra. El propsito de este trabajo es proponer un esquema de procesamiento de imgenes
neurales, que permita la cuantificacin y el anlisis preciso del contorno neural
correspondiente a las clulas de Purkinje de la corteza cerebelosa de ratn.
En el captulo I, se presentan diversos aspectos de CP, tales como su ubicacin anatmica,
sus caractersticas morfolgicas definitivas y la importancia funcional dentro de todo el
contexto del sistema nervioso central. Adems, se describen las caractersticas bsicas del
sistema ptico, utilizado en microscopa de luz de alta resolucin digitalizada (MLARD), para
la adquisicin de las imgenes de CP.
El captulo II, se refiere al procesamiento de imgenes de CP con Transformada Wavelet
(TW) y diversos Filtros de Mediana. Estas tcnicas permiten obtener un mejor realce de las
espinas dendrticas, eliminando parte del ruido generado durante el proceso de adquisicin de
la imagen, sin degradar las caractersticas ms importantes de la imagen de CP.
En el captulo III, para procesar imgenes de las CP adquiridas con MLARD, se propone
una tcnica de restauracin basada en el algoritmo iterativo de deconvolucin de Lucy-
Richardson, utilizando la funcin de dispersin puntual (PSF: point spread function), que
representa las imperfecciones pticas del sistema de adquisicin de imgenes de CP. El
realce de las CP, utilizando deconvolucin, es necesario debido a que es difcil la total
visualizacin de su estructura, ya que las imgenes se adquieren a diferentes planos focales,
dando como resultado imgenes con segmentos que presentan borrosidad. El algoritmo de
deconvolucin de Lucy-Richarson corrige estas aberraciones y a la vez logra un realce
14
adecuado de las dendritas y espinas de CP. Este realce permitir utilizar una tcnica
automtica para la cuantificacin de las espinas dendrticas empleando reconocimiento de
patrones.
En el captulo IV, se utilizan las mquinas de Soporte Vectorial (SVM) para identificar y
clasificar espinas dendrticas de CP, las cuales fueron previamente procesadas con tcnicas de
deconvolucin iterativas.
Este proyecto ha dado lugar a las siguientes publicaciones:
Durn F, Medina R, Mendoza L, Mendoza R, Pea Z, Davila D. UTILIZACIN DE
FILTROS DE MEDIANA Y TRANSFORMADA WAVELET EN EL ANLISIS
DIGITAL DE IMGENES NEURONALES. Modelos Computacionales en Ingeniera
Desarrollos Novedosos y Aplicaciones. CIMENICS 2010. p PS25-PS29. 2010.
Duran F, Medina R, Vera M, Mendoza R, Pea Z, Dvila D, Balza

J, Mora N.
PREPROCESAMIENTO DE CLULAS DE PURKINJE UTILIZANDO EL
ALGORITMO DE DECONVOLUCIN DE LUCY-RICHARSON. LX
CONVENCIN ANUAL DE AsoVAC CIUDAD BOLVAR. 2010.
Duran F, Medina R, Vera M, Mendoza R, Pea Z, Dvila D Vera.VISUALIZACION
Y CUANTIFICACION DE ESPINAS DENDRITICAS DE CLULAS DE
PURKINJE EN IMGENES OBTENIDAS POR MICROSCOPA DE LUZ
VISIBLE. III Jornadas Cientfico Tcnica del Postgrado Ingeniera Biomdica.
Mrida-Venezuela. 2010.
Durn F, Medina R, Mendoza R, Mendoza L, Pea Z, Balza J, Garca N, Dvila D,
Labarca E, Colmenares M. TRANSFORMADA WAVELET APLICADA AL
PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMAGNES DE CELULAS DE PURKINJE. XIII
Congreso Venezolano de Microscopa y Microanlisis Cuman. p 66-69. 2008
Durn F, Medina R, Mendoza L, Mendoza R, Pea Z, Davila D. PROCESAMIENTO
DIGITAL DE IMAGNES NEURONALES APLICANDO TRANSFORMADA
WAVELET Y FILTROS NO LINEALES. I Jornadas de Ingeniera Biomdica.
Pamplona-Colombia.2009.
Castellanos R, Duran F, Mendoza L, Mendoza R, Pea Z, Davila D. OPTIMIZACION
MEDIANTE SEGMENTACION Y BINARIZACION DE IMGENES POR
MICROSCOPA DE LUZ DIGITAL DE CELULAS DE PURKINJE, UTILIZANDO
FILTRO DE MEDIANA Y TRANSFORMADA WAVELET. Desarrollo y avances en
15
mtodos numricos para ingeniera y ciencias aplicadas. CIMENICS 2008. p OP2-
OP6. 2008.
Duran F, Medina R, Mendoza R, Pea Z. ANALISIS Y PROCESAMIENTO DE
IMAGENAS DE LA CELULA DE PURKINJE. II Jornadas Cientfico Tcnica del
Postgrado Ingeniera Biomdica. Mrida-Venezuela.2007.
16
1. Captulo I
1. HERRAMIENTAS PARA EL PROCESAMIENTO DE LAS
CP
1.1. Introduccin.
Las CP son neuronas altamente diferenciadas, con una morfologa muy especfica, que se
encuentran ubicadas en la corteza cerebelosa de los vertebrados. Cuando se observan en
seccin transversal de una laminilla cerebelosa, sus globosos cuerpos celulares tienen forma
piriforme y el rbol dendrtico se extiende semejando una palma; mientras que en secciones
longitudinales, el cuerpo se observa alargado y las ramificaciones dendrticas se visualizan
como una estrecha franja o lmina vertical. Las CP estn dispuestas en un estrato o lmina
simple, localizada inmediatamente por debajo de la capa molecular o plexiforme y por encima
de la capa granulosa de la corteza del cerebelo (Figura 1-1). Las CP estn separadas por
espacios de aproximadamente 50 m en direccin trasversal y de 50 a 100 m
longitudinalmente y tienen un dimetro transversal de 30 a 35 m. Del cuerpo o soma neural
de cada CP, orientada hacia la periferia de la laminilla cerebelosa, emerge una dendrita
primaria que se ramifica casi inmediatamente, en dos grandes troncos lisos que se alejan el
uno del otro formando, en el plano trasversal de la laminilla, un ngulo cercano a los 45,
desde esta ramificacin surge una extraordinaria arborizacin de segundo, tercero y
subsiguientes rdenes de ramas, que se dirigen a la superficie pial de la corteza cerebelosa. La
dendrita primaria y las ramas de primer orden tienen superficies lisas, a pesar que se pueden
observar algunas espinas dendrticas aisladas; mientras que las ramas de segundo, tercer y
subsiguientes ordenes estn cubiertas por mltiples espinas dendrticas, que establecen
contactos sinpticos con los axones de las clulas granulosas, denominados fibras
paralelas [6,6].
17
Las CP envan proyecciones inhibidoras hacia los ncleos cerebelosos, constituyendo la
nica salida de toda la coordinacin motriz de la corteza cerebelosa. El inters en este estudio
est enfocado hacia la identificacin y cuantificacin de las espinas dendrticas de CP,
utilizando tcnicas de procesamiento digital de imgenes, que permitan obtener informacin
confiable, cercana a la realidad y con un mnimo de error.
Figura 1-1. Organizacin celular de la corteza cerebelosa (Tomada de [6])
Hasta ahora, en el mencionado Centro de Microscopa Electrnica, la cuantificacin de
espinas dendrticas se realizaba de forma manual y subjetiva, a travs de un simple anlisis
visual de las imgenes obtenidas con MLARD, lo cual se traduce en una mayor probabilidad
de error.
Existen diferentes paquetes de programas comerciales tales como Neurolcida, Imaris o
Methamorph [6], los cuales proporcionan interfaces que permiten, por ejemplo, reconstruir
secciones del rbol dendrtico de CP; sin embargo, estos tipos de programas presentan algunos
inconvenientes ya que son semiautomticos y su adquisicin es costosa.
Debido a estos inconvenientes se hace necesario el desarrollo de un algoritmo
computacional robusto, que utilice diferentes herramientas especializadas tanto para el
preprocesamiento de este tipo de imgenes como para la posterior deteccin y cuantificacin
de las referidas espinas dendrticas de CP.
18
Las imgenes a procesar en este estudio han sido obtenidas en el Centro de Microscopa
Electrnica Dr. Ernesto Palacios Pr de la Universidad de Los Andes, Mrida-Venezuela.
Dichas imgenes se adquieren a diferentes planos focales y en ellas es comn observar
segmentos borrosos o carentes de nitidez, originada por los diferentes planos de foco que
presenta la seccin tisular a observar y por un proceso de degradacin asociado al sistema
ptico del microscopio. Las imgenes obtenidas se utilizan, posteriormente, para aplicarles un
realce del rbol dendrtico y as determinar el nmero de espinas dendrticas presentes en las
dendritas de CP.
Se propone un conjunto de tcnicas de realce para realizar el preprocesamiento, entre ellas
Filtro de Mediana, Filtro de Mediana Ponderado, Filtro de Mediana Ponderado Optimo,
Transformada Wavelet (TW), Transformacin Logartmica y Tcnicas de Deconvolucin
[6,6]. Algunas de estas tcnicas permitirn realzar las caractersticas esenciales de CP, tales
como su rbol dendrtico y sus espinas, reduciendo el ruido y la borrosidad. Posteriormente,
se utilizarn tcnicas de aprendizaje supervisado, como las Mquinas de Soporte Vectorial
(SVM) [6] que permitirn cuantificar, de forma automtica, el nmero de espinas dendrticas
en las ramas de CP.
1.2. Motivacin y Planteamiento del Problema
Mediante tcnicas de microscopa de luz, como el mtodo cromo-argntico de Golgi [6], es
posible obtener imgenes que ofrecen importante informacin relativa a la morfologa de las
clulas neurales las cuales, a diferencia de las clulas de otros tejidos animales, tienen
morfologas muy diferentes dependiendo de la regin donde estn ubicadas y de las funciones
que deben cumplir. As se tienen neuronas piramidales en la corteza cerebral, neuronas
mitrales en el bulbo olfatorio, neuronas de Purkinje en la corteza cerebelosa, motoneuronas en
la mdula espinal, por citar algunas. Entre toda esta diversidad neural se escogi la clula de
Purkinje (CP) del cerebelo como modelo para realizar el anlisis, por ser una neurona que
posee una arborizacin dendrtica muy compleja pero a la vez nica y muy caracterstica y
que ha sido motivo de estudio en nuestro laboratorio, desde el punto de vista histolgico y
19
ultraestructural, tanto ontognica como filogenticamente, por lo cual su estudio reviste gran
importancia en el desarrollo de diversos proyectos de investigacin [6,6,6].
Las CP, funcionalmente, intervienen de manera integrada en importantes actividades
corporales sincronizadas, como son la modulacin del equilibrio y de la postura corporal;
adems, participa en el control de la ejecucin de movimientos, en la regulacin del tono
muscular y en el procesamiento de informacin visual indispensable para la orientacin
corporal en relacin a la fuerza de gravedad [6,6].
Para poder ejecutar todas sus funciones, las clulas neurales necesitan recibir, procesar y
enviar informacin a otras neuronas y a otras clulas efectoras como las clulas musculares.
Esta actividad se denomina Sinapsis y se realiza a travs de complejas estructuras antomo-
funcionales. En las sinapsis intervienen dos elementos celulares: el componente pre-sinptico
que transmite la informacin, y el componente post-sinptico, que recibe la informacin.
En el caso de la corteza cerebelosa, le corresponde a las CP ser el receptor directo, a travs
de las fibras trepadoras, e indirecto va fibras musgo-clulo-granulosas cerebelosas. De toda
la informacin de entrada emerge, a travs del axn de las CP, una nica va de salida de
informacin desde la corteza cerebelosa. Para que esta funcin se cumpla, las CP disponen del
citoplasma neural y de numerosas evaginaciones de la membrana, distribuidas
tridimensionalmente, en toda la extensin del rbol dendrtico y que reciben el nombre de
espinas dendrticas (Figura 1-2).
20
Figura 1-2. Modelo detallado de CP, donde se resaltan las espinas dendriticas. (Fuente: Centro de Microscopa
Electrnica Dr. Ernesto Palacios Pr)
Las dendritas de cada una de las CP se extienden hacia la superficie de la laminilla
cerebelosa, atravesando toda la capa plexiforme o molecular, la cual tiene un espesor
promedio de 400 m y cada rbol dendrtico, que se orienta, perpendicularmente, a la
direccin transversal de la laminilla cerebelosa, se extiende unas 200 m lateralmente y ocupa
una profundidad aproximada de 6 m [6]. El nmero de espinas dendrticas en CP repercute
en la parte funcional, ya que a travs de ellas se activa el control y la coordinacin de
actividades musculares y de otras complejas funciones cognitivas relacionadas.
En el procesamiento de las imgenes de CP se debe realizar el realce y la cuantificacin de
las espinas dendrticas. Los problemas que origina este procesamiento no son fciles de
resolver, debido a que estas imgenes son capturadas a diferentes planos focales utilizando
tcnicas de MLARD, presentando variacin tanto en su centro focal como en el contraste, lo
cual hace poco probable la superposicin de diferentes imgenes sin un previo pre-
acondicionamiento de las mismas.
Generalmente, la identificacin y cuantificacin de las espinas dendrticas neurales se
realiza manualmente por medio de un simple anlisis visual de las imgenes obtenidas con
MLARD (Figura 1-3) y es, por tanto, un proceso tedioso, subjetivo y con una mayor
probabilidad de error.
21

500 1000 1500 2000 2500 3000
500
1000
1500
2000
2500
3000
Figura 1-3. Imagen de un segmento del rbol dendrtico de CP obtenida con MLARD, sin ser sometida a
preprocesamiento.
Debido a estos inconvenientes para la cuantificacin de espinas dendrticas, se hace
necesario el desarrollo de un algoritmo computacional robusto que utilice diferentes
herramientas especializadas tanto para el preprocesamiento de este tipo de imgenes como
para la posterior deteccin y cuantificacin de las referidas espinas.
1.3. Bases Tericas
1.3.1. El Microscopio de luz
El funcionamiento de un microscopio de luz se basa en propiedades derivadas del empleo
de lentes pticos, correctamente acoplados a otros componentes, que en conjunto constituyen
cuatro grupos de dispositivos [6,6], que garantizan un funcionamiento ptimo (Figura 1-4),
los cuales se describen a continuacin:
Sistema mecnico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y dems
elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo).
22
Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolucin
(objetivos y oculares).
Sistema de Iluminacin: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y
transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a
incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de iluminacin, espejo, condensador y
diafragma).
Accesorios: Son componentes que permiten extender las capacidades del instrumento
(cmaras fotogrficas, de video, computadoras, accesorios para dibujo, entre otros).

Figura 1-4. Microscopio de luz convencional (Tomado de [11])
1.3.2. Microscopa digital de alta resolucin basada en luz
Es importante disponer de un microscopio de luz de alta calidad, para garantizar la
optimizacin de la alineacin de las trayectorias lumnicas y un excelente enfoque de la
imagen a analizar, tomando en consideracin que el haz de luz al incidir sobre un objeto es
dispersado por este, teniendo el sistema ptico la funcin de hacer converger nuevamente el
haz de luz hasta conseguir lo que se denomina el enfoque de la imagen. Un sistema ptico
ideal es aquel que permite que cada punto del objeto sea representado en un punto especfico
en la imagen, condiciones a las que tiene un alto grado de aproximacin el microscopio ptico
Polyvar Reichert-Jung. (Figura 1-5)
23
Figura 1-5. Sistema ptico del Polyvar Reichert-Jung (OJO: Manual referenciarlo)
Por otra parte, se debe tener presente que el sistema captador y procesador de imgenes ms
eficiente que existe est constituido por el ojo y el cerebro humano. Todas las aplicaciones
ofrecidas por la tecnologa no son equiparables con ese sistema, en lo que concierne a
velocidad y resolucin. La estructura del ojo puede ser comparada con la de una cmara
fotogrfica. En el caso del ojo, el cristalino conjuntamente con la superficie curva de la crnea
proyecta una imagen ptica sobre la retina, la cantidad de brillo de la luz incidente es
controlada por el dimetro variable del iris y la longitud focal es cambiada por los msculos
ciliares, de manera tal que el enfoque de cualquier punto del objeto sea posible y pueda ser
obtenida una imagen ntida. Un microscopio, basado en MLARD, es un instrumento ptico
que permite observar objetos que por su pequeo tamao son invisibles a simple vista y
adems, permite obtener una imagen digitalizada y considerablemente aumentada o
magnificada, El efecto de magnificacin permite ampliar la imagen, de forma directa, 2,5,
10, 25, 40 y 100 veces (2.5X, 10X, 25X, 40X y 100X, respectivamente). Este tipo de
microscopio magnifica en dos pasos como consecuencia de los dos sistemas de lentes que
posee. El primer sistema, denominado objetivo, que funciona como un proyector de imgenes,
produce una imagen aumentada del objeto y el segundo, denominado ocular, magnifica la
imagen producida por el objetivo, de la misma manera que lo hara una lupa. La digitalizacin
consiste en poder visualizar en un computador una imagen en determinado formato. El
procedimiento de adquisicin de imgenes descrito se esquematiza en la Figura 1-6 . Todo lo
24
anterior, permite confirmar que para utilizar la microscopa como una tcnica para la
observacin y anlisis de objetos se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
El objeto a estudiar
La fuente de iluminacin
El sistema ptico
Figura 1-6. Adquisicin de imgenes de CP con MLARD (Fuente: El autor).
Cuando se plantea el estudio de una muestra con microscopa de luz, previamente, se
deben realizar cortes o secciones de la muestra biolgica, los cuales pueden ser de espesor
variable, entre 1 m hasta 200 m; estas secciones se obtienen utilizando un instrumento
especializado denominado micrtomo (Figura 1-7), que es un instrumento mecnico que
permite la obtencin de cortes de muestras para observacin al microscopio. En el caso de
tejidos a los que se les ha aplicado el mtodo cromo-argntico de Golgi, el espesor de los
cortes debe estar en el rango entre 90 a 150 m.
25
Figura 1-7. Micrtomo. (Fuente: Centro de Microscopa Electrnica Dr. Ernesto Palacios Pr)
Posteriormente, se debe definir cules aspectos morfolgicos se desean analizar en la
muestra, en base a esto se selecciona la tcnica de visualizacin, el tipo de instrumento ptico
(seleccin de objetivos) y se debe considerar la intensidad de iluminacin que incide en la
muestra para obtener un buen contraste en la imagen. Para la iluminacin de la muestra se
puede utilizar la Transiluminacin [6], que consiste en el paso de un haz de luz a travs de un
objeto, en este caso una seccin de tejido (Figura 1-8).
Para mejorar la transparencia del tejido y facilitar la transmisin del haz de luz, se emplean
ciertas sustancias qumicas como el xilol, el toluol y/o el benzol, as como medios de montaje
como el blsamo de Canad.
Figura 1-8. Esquema que ilustra el proceso de transiluminacin. La flecha amarilla representa el haz de luz
incidente sobre la muestra, que atraviesa la misma. (Tomado de [12])
26
Para el anlisis de una muestra con microscopa de luz se deben considerar los trminos
aumento y resolucin [6], que deben ser bien conocidos por todo usuario del microscopio. El
aumento de una lente est determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia
focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor ser la distancia focal y
mayor ser el aumento. Como se indic anteriormente, el microscopio cumple el proceso de
magnificacin en dos etapas y para ello es necesario colocar en serie dos tipos diferentes de
lentes. El primero, que debe estar situado cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y
el segundo, que debe permitir la cercana del ojo del observador se denomina ocular (Figura 1-
9). Cada tipo de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con
la letra X, as que 10X significa que la imagen est aumentada 10 veces.
Figura 1-9. Esquema de la posicin de los lentes objetivo y ocular, en relacin con el espcimen y el observador.
(Tomado de [12])
El poder de aumento de un sistema ptico tiene sus lmites y el magnificar las imgenes
acarrea prdida de informacin o detalles del objeto estudiado, esto puede ser resuelto
mediante otro principio, la resolucin, que es la capacidad que tiene el objetivo del
microscopio de separar dos puntos que se encuentran muy prximos entre s, de manera que se
puedan ver individualizados uno del otro, lo cual permite observar detalles de la imagen en el
microscopio. Mientras ms corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, ms precisos
sern los detalles. Esto se puede comparar con algunos aspectos de la informtica como por
27
ejemplo, el tamao del pxel; mientras ms pequeo sea el tamao mayor ser la cantidad de
detalles de la imagen digital.
1.3.3. Aberraciones pticas en MLARD
Existen factores que limitan la resolucin en los sistemas pticos de un microscopio,
presentndose como errores que distorsionan las imgenes, ya sea por el comportamiento de la
luz al incidir sobre el objeto en estudio o por defectos propios de las lentes. Estos defectos son
conocidos como aberraciones. Algunos resultan de la esfericidad de la superficie de la lente y
son reproducidos al interaccionar la luz con dicha superficie, produciendo alteraciones de los
detalles en las imgenes. Esto es debido a la difraccin (del latn diffractus: quebrado). La
difraccin es el fenmeno que se observa cuando la luz, al pasar por el extremo de una
superficie se curva desvindose del trayecto y no sigue su propagacin en lnea recta (Figura
1-10). En la transiluminacin, las ondas luminosas encuentran obstculos en su trayecto, lo
que produce una expansin de la luz por difraccin y se obtiene una imagen borrosa que limita
la capacidad de aumento til de un microscopio. Cuando se observa un objeto transparente en
el microscopio, cada detalle iluminado de este, crea un patrn de difraccin denominado disco
de Airy (Figura 1-11), tambin llamado funcin de dispersin untual (PSF: point spread
function) y que representa las imperfecciones pticas del sistema, Este patrn est formado
por un punto central brillante y varios anillos brillantes separados por anillos oscuros.
Figura 1-10. Difraccin de un haz de luz al pasar a travs de un orificio. (Tomado de [11])
28
Figura 1-11. Discos de Airy. (Tomado de [11])
Otro de los factores importantes que limitan la resolucin, es la aberracin, principalmente
la aberracin esfrica [6], fenmeno que est relacionado con la forma de la lente y se
produce por falta de convergencia de las ondas luminosas que pasan por la periferia de la lente
cuando no son enfocadas en el mismo punto que aquellas ondas que pasan por el centro, las
cuales son refractadas ligeramente; mientras que las que inciden en la periferia son refractadas
en mayor grado y convergen en diferentes puntos focales (Figura 1-12). Esta es una de las
principales causas por las que una imagen aparece dispersa y borrosa, en lugar de enfocada y
ntida. Adems de la lente, la lmina cubre-objeto empleada en la preparacin histolgica,
puede producir este tipo de aberracin.
Figura 1-12. Aberracin esfrica. Los rayos que inciden paralelamente al eje principal no convergen todos en un
mismo punto. (Tomado de [11])
1.3.4. Ruido aleatorio en las imgenes MLARD
El proceso de adquisicin de las imgenes puede verse entorpecido por la presencia de los
denominados ruidos, que corresponden a los pxeles aleatorios que se entremezclan entre los
pxeles aceptables que componen la imagen. Esos pxeles aleatorios pueden ser generados por
fluctuaciones provenientes de la fuente de alimentacin elctrica del equipo, cambios de
temperatura en el rea de trabajo y aun por imperceptibles movimientos del microscopio al
29
momento de adquirir la imagen. El valor radiomtrico de un pxel sobre la imagen que procesa
un sensor es la representacin de la radiancia captada por el sensor a nivel del campo visual,
que es la superficie abarcada por el IFOV (Instantaneous Field of Vision) a lo largo del tiempo
de integracin. Como se indic, anteriormente, la imagen adquirida est determinada por
diferentes factores como la ptica del instrumento, la electrnica involucrada, los efectos
atmosfricos y el proceso de re-muestreo del sensor, que casi siempre presenta cierto
solapamiento entre pxeles contiguos.
1.3.5. Funcin de distorsin puntual
Todas las aberraciones pticas y ruidos presentados previamente estn descritos a travs de
la PSF (Point Spread Function, traducida al castellano como Funcin de Dispersin Puntual).
De acuerdo a todo lo anterior, se puede decir que si todos los factores involucrados en el
funcionamiento del sistema sensor, son englobados bajo la funcin de transformacin S, en la
ecuacin 1.1, se encuentra que:
)] , ( [ ) , ( y x punto S y x PSF

(1.1)
El significado de la PSF es que el sensor no slo responde a la radiancia procedente del
pxel que se considera en la resolucin espacial, sino que tambin procede de los pxeles que
se encuentran alrededor. Por ello, resulta de gran inters en estudios relacionados con la
discriminacin de facetas de imagen y en la deteccin de bordes. En este caso, se define la
funcin de dispersin lineal (LSF: Line Spread Function), como la respuesta dada por el
sistema de captacin a una lnea procedente del campo visual. La LSF se representa,
matemticamente, mediante la ecuacin 1.2.
dy y x PSF y x LSF

) , ( ) , (
(1.2)
30
La PSF puede ser expresada como una funcin que depende de las coordenadas del campo
focal (
q p,
) y de las coordenadas de la imagen (
y x,
), de la forma
) , , , ( y x q p PSF
; as, la
radiancia
) , ( y x R
de un pxel de la imagen, que procede de un objeto espacial en el campo
focal
) , ( q p g
, se expresa mediante una convolucin ecuacin 1.3.
dpdq q p g p y p x PSF y x R ) , ( ) , ( ) , (

(1.3)

La determinacin experimental de PSF de la ecuacin 1.3 es una tarea complicada y en
pocos casos se aporta una representacin o funcin que la define a tal efecto, resulta
instructivo el trabajo de Mannstein and Gesell [6] en el que presentan una aproximacin del
PSF. En cualquier caso, se puede imaginar que esta funcin es muy cercana a una gaussiana
2D, cuyo eje vertical representa la sensibilidad del sensor para ponderar la radiancia
proveniente de cada punto del campo focal. En este caso la funcin PSF vendra dada por una
expresin del tipo:
1
]
1
2
2 2
2
) ( ) (
exp ) , , , (
u y u x
v u y x PSF
(1.4)
Donde: x e y son las coordenadas cross-track y along-track del pxel en la imagen,
u y v son las coordenadas en el espacio imagen y
determina la dispersin el tamao del pxel del sensor.
1.4. Imgenes Digitales
Una imagen digital es un arreglo bi-dimensional de datos obtenidos al muestrear y
cuantificar una imagen contina generada por medios pticos. El muestreo se realiza con una
red rectangular de sensores igualmente espaciada. En el Centro de Microscopa Electrnica
Ernesto Palacios Pru, se utiliza un microscopio de luz de alta resolucin Polyvar Reichert-
Jung (Figura 1-13). Las imgenes de las arborizaciones dendrticas de las CP provenientes de
31
secciones de corteza cerebelosa de ratones adultos jvenes, se adquieren a una resolucin de
4096x5120x3 y 8 bits de profundidad (Figura 1-14).
Figura 1-13. Microscopio Polyvar Reichert-Jung. (Fuente: Centro de Microscopa Electrnica Dr. Ernesto
Palacios Pr)
Figura 1-14. Imagen de la arborizacin dendrtica de una CP, a una resolucin de 4096x5120x3 y 8 bits de
profundidad
Teniendo en consideracin el espesor del corte (90 a 150 m) y la distribucin
tridimensional de las clulas neurales (Figura 1-15), se presentan algunas dificultades para la
cuantificacin de las espinas dendrticas, debido a que las imgenes son capturadas a
diferentes planos focales, presentando variacin en su centro focal y variacin en el contraste,
lo cual dificulta la superposicin de diferentes imgenes sin un previo pre-acondicionamiento.
32

Figura 1-15. Segmento del rbol dendrtico de una CP, impregnada con el mtodo de Golgi y sin ningn
preprocesamiento.

1.4.1. Tcnicas bsicas de procesamiento
A las imgenes de CP, se les aplicar un realce, que es una de las principales tcnicas
bsicas de procesamiento digital de imgenes. Las operaciones que componen esta tcnica se
dividen en operaciones de procesamiento pxel por pxel [6] donde el valor de la imagen
realzada en un pxel est en funcin del valor de su pxel correspondiente en la imagen
original, y filtrado espacial que es una operacin de procesamiento por grupo de pixeles o
vecindades.
a) Filtraje por convolucin: Para aplicar un filtro espacial a una imagen
) , ( y x f
es
necesario definir una matriz que contendr los coeficientes del filtro, lo que a su vez define los
pxeles del entorno que sern utilizados como argumento del filtro que alterar el valor del
pxel; a esta matriz se le denomina mscara
) , ( t s w
y tiene una dimensin
[ ] n m,
. Se
utilizaron mscaras impares ya que dan un nico punto central, en la aplicacin del filtro
espacial se utiliz la ecuacin 1.5.
) , ( ) , ( ) , ( t y s x f t s w y x g
a
a s
b
b t
+ +

(1.5)
33
En la ecuacin 1.5, se cumple que: 1 2 + a m y 1 2 + b n . Siendo
a
y b las
coordenadas del centro de la mscara y
) , ( t s w
representa los trminos de la matriz de la
mscara de cuyo tamao es
[ ] n m,

y ) , ( t y s x f + + el valor de los pxeles de la vecindad
definida por la mscara.
Por otra parte, las operaciones espaciales, engloban las tcnicas de tipo convolutivo [6]. Un
filtro de convolucin para una imagen digital, en el espacio real
) , ( y x
, puede representarse
como una matriz cuadrada o rectangular (matriz de convolucin), de dimensiones
[ ] n m,

mucho ms pequeas que la de la imagen. La matriz de convolucin se desplaza sobre la
imagen de tal forma que el elemento central de la matriz de convolucin coincida con cada
uno de los pxeles de la imagen. En cada posicin, se multiplica el valor de cada pxel de la
imagen que coincida en posicin con un elemento de la matriz de convolucin, por el valor de
ste. El pxel de la imagen, que coincide con el elemento central de la matriz de convolucin,
es sustituido por la suma de los productos. La convolucin es una operacin matemtica que
tiende a conferir a una funcin
) , ( y x f
la forma de otra funcin
) , ( y x g
, como lo muestra
la ecuacin 1.6.

M
k
N
l
l y k x h l k f y x h y x f y x g
1 1
) , ( ) , ( ) , ( * ) , ( ) , (
(1.6)

Donde:
] , [ N M
es el tamao de la imagen
) , ( y x f
y
) , ( y x h
es la repuesta al impulso
del sistema.
Por tanto, al aplicar a una imagen
) , ( y x f
una convolucin con una funcin gaussiana
) , ( y x h
lo que se hace es forzar a que las variaciones de brillo existentes en la imagen se
parezcan ms a la forma de una gaussiana, haciendo suave el cambio de colores, lo cual
produce un efecto de desenfoque gaussiano.
b) Transformaciones por puntos: Al aplicar a la imagen de la Figura 1-15 una
transformacin puntual, que ajusta los tonos de gris del rango [0 255], utilizando la ecuacin
1.7 de la recta.
34
[ ]
( ]
0 60
( )
255 60 255

'
aX si X
Y T X
si X

(1.7)
As, se obtiene la imagen mostrada en la Figura 1-16 observndose que el filtro puntual
realza la estructura de CP, pero no se destacan claramente las espinas dendrticas de CP.
c) Filtro de mediana: es un filtro espacial (Figura 1-17) que corresponde a una tcnica no
lineal, y en este caso para una secuencia impar de k nmeros, se define como el nmero que
cumpla que es mayor que
1
2
k

nmeros, y menor que los otros
1
2
k
. Se utiliza en la
reduccin del ruido, sin difuminar la imagen.
Se puede observar en la Figura 1-17 contrastando la imagen original y la filtrada con el
filtro de mediana que la imagen sufre un suavizado y realce del rbol dendrtico de CP, pero
no se destacan las caractersticas fundamentales como lo son las espinas dendrticas de CP.

Figura 1-16. (a) Imagen de CP, sin procesar (b) Imagen de CP, preprocesada utilizando transformacion
puntual
35
Figura 1-17. (a) Imagen de CP, sin procesar (b) Imagen de CP, procesada con un filtro de mediana
d) Filtro media: es un filtro espacial que sustituye la intensidad de cada pixel de la imagen
por el promedio de los pixeles vecinos, es decir, sea una imagen
) , ( y x f
el procedimiento
consiste en generar una nueva imagen
) , ( y x g
, cuya intensidad para cada pxel se obtiene
promediando los valores de intensidad de los pxeles
) , ( y x f
incluidos en un entorno de
vecindad predefinido de tamao
] , [ n m
, ver ecuacin 1.8. Se caracteriza por difuminar el
ruido en la imagen.

+ +
a
a s
b
b t
t y s x f t s w y x g
mxn
t s w
) , ( ) , ( ) , (
1
) , (
(1.8)
x, y: varan dependiendo del tamao de la imagen
En la Figura 1-18 se observa un suavizado en la imagen y un aumento de densidad en la
estructura del rbol dendrtico de CP, tambin se produjo un realce del rbol dendrtico pero
no se destacan claramente las espinas dendrticas de CP.
36
Figura 1-18. (a) Imagen sin procesar de CP. (b) Imagen de CP procesada con un filtro de media
e) Filtro gaussiano: presentado en la ecuacin 1.9, permite que el valor de cada punto
sea el resultado de realizar la promediacin ponderada con distintos pesos representados por
una funcin gaussiana. El valor mximo aparece en el pixel central y disminuye hacia los
extremos tanto ms rpido cuanto menor sea el parmetro de desviacin (
).
) , ( ) , ( ) , (
2
) , (
2
4
) (
2
2 2
t y s x f t s w y x g
e
t s w
a
a s
b
b t
t s
+ +
(1.9)
t s,
: Varan dependiendo del tamao de la ventana o vecindad
y x,
: Varan dependiendo del tamao de la imagen
: Varianza
Se observa en la Figura 1-19, la imagen del rbol dendrtico de CP, realzada pero no se
resaltan los detalles como lo son las espinas dendrticas.
37
Figura 1-19. (a) Imagen de CP, sin procesar. (b) Imagen de CP procesada con un filtro gaussiano
f) Realce logartmico: segn la ecuacin 1.10 es una transformacin puntual donde se
ajusta la informacin de la imagen hacia una curva logartmica, se utiliza para mejorar
imgenes demasiado oscuras.
) 1 ) , ( ( log ) , ( + y x f N y x g
(1.10)
N : Factor de escala que fija el mximo nivel de salida
En la Figura 1-20, se observa que el filtro de realce logartmico realiz en la imagen de
CP, un realce extraordinario del rbol dendrtico de CP con respecto a los filtros anteriores,
este realce es mucho mejor pero de igual manera no realz las espinas dendrticas de CP.
38
Figura 1-20. (a) Imagen de CP, sin procesar. (b) Imagen de CP procesada con un realce logartmico
Se puede observar que en las tcnicas utilizadas no se visualizan cambios en el realce de
las espinas dendrticas de CP, que posibilite el conteo manual de dichas espinas.
39
2. Captulo II
2. UTILIZACIN DE FILTROS DE MEDIANA Y
TRANSFORMADA WAVELET EN EL ANLISIS DIGITAL
DE IMGENES NEURALES
2.1. Introduccin
El procesamiento de imgenes de espinas dendrticas neurales para la cuantificacin
presenta algunas dificultades, debido a que estas imgenes son capturadas a diferentes planos
focales, presentando variacin en su centro focal y variacin en el contraste, lo cual dificulta la
superposicin de diferentes imgenes sin un previo pre-acondicionamiento. Algunos autores
delimitan el procesamiento a una regin de la imagen, con el fin de disminuir el grado de
dificultad en el procesamiento de la imagen.
Fleuret y otros [6], utilizaron tcnicas estadsticas donde describen los resultados
preliminares respecto al seguimiento de las dendritas expandidas de una neurona en
imgenes de microscopa confocal. Sobre un nmero pequeo de imgenes, ellos obtienen
buenos resultados usando un algoritmo basado en la tcnica de Expectacin-Maximizacin (E-
M), para la estimacin de la probabilidad de que un pxel pertenezca al rbol dendrtico de
una neurona, para ello utilizan las propiedades globales del rbol del conjunto completo de
dendritas. El algoritmo EM se usa en estadstica para encontrar estimadores de mxima
verosimilitud de parmetros en modelos probabilstico que dependen de variables no
observables.
40
Young y otros [6], realizaron anlisis de imgenes celulares en tres dimensiones y
demuestran con resultados experimentales la viabilidad del seguimiento automatizado del
rbol dendrtico de las neuronas, con datos adquiridos por microscopa de fluorescencia
confocal. La salida del sistema es una representacin grfica etiquetada de la topologa neural
y esta espacialmente alineada con la data de la imagen en 3D. Una variedad de anlisis
topolgicos y mtricos se puede realizar usando esta representacin, como por ejemplo
mediciones precisas de volmenes longitudes, dimetros y tortuosidades. Se hace sobre
fracciones especficas de la neurona.
Bai y otros [6] realiza estudios en las espinas dendrticas ya que juegan un papel muy
importante en el sistema nervioso central y la tcnica de protenas fluorescente facilita la
bsqueda de espinas. Para analizar, cuantitativamente, las espinas dendrticas en las imgenes
adquiridas en microscopa de fluorescencia, se propone un mtodo para el anlisis
automtico de las espinas dendrticas. Debido al lmite de la resolucin axial, el mtodo se
dise para procesar la imagen de la proyeccin a lo largo del eje de z y analizar las espinas
dendrticas laterales. El mtodo puede extraer, automticamente, las lneas centrales de las
dendritas y el segmento de las espinas a lo largo de la dendrita de acuerdo a criterios basados
en el ancho. El criterio es utilizar caractersticas morfolgicas comunes de las espinas. Puede
detectar algunas formas de espinas perdidas no detectadas por otros mtodos. Para validar el
mtodo desarrollado el nmero de espinas, longitudes y densidades se analizaron de manera
manual y automtica.
Estos trabajos muestran resultados que tuvieron gran impacto, pero su desventaja es que
para su buen funcionamiento necesitan mucha intervencin manual por parte del especialista,
lo cual hace que el estudio sea lento y muy laborioso. Las imgenes de CP han sido poco
estudiadas desde el punto de vista de la ingeniera biomdica y el presente estudio se enfoca
hacia la bsqueda de una herramienta que atenu el ruido y a su vez realce la morfologa de las
imgenes de CP, especialmente en reas pequeas de las ramificaciones dendrticas, ms que
en el rbol dendrtico completo. Adicionalmente, que se considera que este estudio es
importante ya que permite realizar medidas comparativas del nmero de espinas durante las
diferentes etapas del desarrollo de las CP, aspecto importante en caso de enfermedades
neurales durante la infancia.
41
Tratando de conseguir un mejor realce morfolgico celular de CP, se utilizan filtros de
Mediana [6,6,6] y la transformada wavelet [6,6] que son herramientas que muestran buenos
resultados para el preprocesamiento de datos en las referidas imgenes.
2.2. Materiales y Mtodos
Para este estudio, se gener una base de datos que consta de 35 imgenes (4096x5120 y 8
bits de profundidad) de CP del cerebelo de ratones adultos jvenes, adquiridas utilizando un
microscopio Polyvar Reichert-Jung. A los cerebelos se les aplic la tcnica de impregnacin
cromo-argntica o mtodo de Golgi, modificada por Palacios-Pr [6]. Las imgenes fueron
obtenidas en el Centro de Microscopa Electrnica Dr. Ernesto Palacios Pr de la
Universidad de Los Andes (Mrida, Venezuela), visualizando los cortes con microscopa de
luz de alta resolucin digital (MLARD). Las diferentes tcnicas que se utilizaron para procesar
las imgenes de CP fueron: filtro de mediana, filtro de mediana ponderado, filtro de mediana
ponderado ptimo y transformada wavelet (TW). Estas tcnicas se usaron con el fin de
mantener las caractersticas relevantes de la imagen original. Se proces con estos filtros una
seccin de una imagen de CP de tamao 1024x1024 y 8 bit, en los filtros de mediana las
ventanas fueron de tamao impar y vecindad cuadrada, el tamao de la ventana se seleccion
de forma heurstica hasta encontrar un tamao optimo.
2.2.1. Filtro de mediana
Una de las tcnicas no lineales ms utilizadas para el procesamiento de imgenes, en cuanto
a la eliminacin de ruido, es el filtro de mediana. La mediana (operador median(.) ) de una
secuencia impar de k nmeros se define como el nmero que cumpla que es mayor que
2
) 1 ( k

nmeros, y menor que los otros
2
) 1 ( k
. Diversos autores [6] han demostrado las ventajas de
utilizar esta tcnica en el preprocesamiento de imgenes. La ecuacin 2.1, define
matemticamente este tipo de filtro.
42
)) ( ),... ( ),... ( ( ) (
R L
N n x n x N n x median n y +

(2.1)
Donde:

L R
N N N +
:

Tamao de la ventana de observacin

) (n x
: Elementos de la ventana de observacin
) (n y
: Salida del filtro
.
2.2.2. Filtro de mediana ponderado
Los Filtros de mediana sin ponderaciones son temporalmente ciegos todas las muestras en
la ventana de observacin son tratadas iguales sin importar su localizacin pero las
ponderaciones permiten realzar y/o despreciar la importancia de las muestras en la ventana de
observacin. El funcionamiento del filtro de mediana ponderado, cuya expresin matemtica
se presenta en la ecuacin 2.2, es similar al filtro de mediana ya descrito, pero se le asigna a
cada elemento de la matriz de coeficientes, una ponderacin que indica cuantas veces se repite
el valor del pxel [6].
( ) ( ) ( )) ) sgn( ,... ) sgn( , ) sgn( ( ) (
2 2 2 1 1 1 N N N
x W W x W W x W W median n y
(2.2)
Dnde:
N
W W W ...
2 , 1 : Son los coeficientes de ponderacin
N
x x x ...
2 , 1 : Representan el Nivel de Gris de cada pxel de la imagen
N : Tamao de la vecindad
:

Operador de repeticin que indica el nmero de veces que se repite el pxel de la
imagen segn la ponderacin ( i
W
)

) (n y
: salida del filtro
n
: Valor en el tiempo
sgn: Extrae el signo de su argumento
43
2.2.3. Filtro de mediana ponderado ptimo
En la aplicacin del filtro de mediana ponderado optimo se vectorizan las matrices de las
imgenes de igual tamao, este filtro se fundamenta en un proceso de optimizacin del vector
de ponderacin utilizando recursividad, donde la salida previa es usada para determinar la
salida actual. El nmero de iteraciones depende del nmero de componentes del vector
imagen. Durante este proceso se mide el error segn la ecuacin 2.3. Tal error es la
diferencia en valor absoluto del vector ideal
) (n D
y el vector con ruido procesada con el
filtro de mediana ponderado ) (
n D . La ecuacin 2.4 presenta la definicin matemtica

utilizada para generar nuevos pesos [6]. Esto permitir obtener la ponderacin ptima la cual
ser seleccionada a partir de la envolvente de la curva de error donde sta alcance un mnimo.
))) (
) ( (( ) ( n D n D abs n e
(2.3)
)) (
) ( sgn( * )) ( sgn( )) (
) ( ( ) ( ) 1 (
1
n D n S n W n D n D n W n W
j j j j
+ +
+

(2.4)
Donde:
) (n e
: Error
j
W
: Coeficientes previos de ponderacin
1 + j
W
: Coeficientes actuales de ponderacin
) (n D
: Imagen deseada
) (
n D : Imagen a procesar que se le aplico filtro de mediana ponderado

) ( ) ( ) ( n X n W n S
j j j

) (n X
j : Elementos de la ventana de observacin
sgn: Extrae el signo de su argumento
n
: Valor en el tiempo
: Coeficiente que determina la velocidad de convergencia del algoritmo
j: Componentes del vector de ponderacin (j=1..N)
44
2.2.4. Transformada Wavelet
La Transformada Wavelet (TW) es una herramienta que se utiliza en el procesamiento
digital de imgenes, tiene diferentes planos de resolucin espacio-escala [6]. El objetivo es
encontrar un estimado de una imagen
) , ( y x f
que conserve las caractersticas ms
relevantes, eliminando las componentes de ruido. La TW se considera como una herramienta
de anlisis multi-resolucin, que permite la representacin de la imagen mediante coeficientes
que miden el grado de correlacin o similitud entre la imagen original y las versiones escalada
y trasladada, en el espacio de la funcin bsica
) , ( y x
llamada wavelet madre.
Para
) , ( y x f
, las funciones wavelet y la transformada wavelet en el dominio continuo
bidimensional, estn dadas por la ecuacin 2.5
( ) ( )
( ) ( ) ( ) ( )dxdy y x y x f y x f y x f W
k y k x y x
ky kx j ky kx j
y
j
x
j j
ky kx j
, * , , , ,
2 , 2 2 ,
, , , ,
, ,

(2.5)
Donde x
k
y y
k
son respectivamente traslaciones en los ejes coordenadas x, y la TW
Inversa bidimensional. se representa mediante la ecuacin 2.6
( )
( ) ( )dxdy y x y x f y x y x f C
donde
y x C y x f
ky kx j ky kx j ky kx j
j kx ky ky kx j ky kx j
, * ) , ( , ) , (
, ) , (
, , , , , ,
, , , ,

(2.6)
El proceso de reconstruccin, tambin denominado sntesis, se encarga de la obtencin de
la imagen a partir de los detalles y aproximaciones. ste proceso se lleva a cabo con la
transformada wavelet inversa (TWI).
2.3.Resultado
45
Mediante la aplicacin de las diferentes tcnicas mencionadas se encontraron resultados
que demuestran su efectividad en cuanto al realce de la imagen, cuando se compara el
resultado con la imagen de CP original MLARD.
2.3.1 Filtro de mediana
Cuando se utiliz el filtro de mediana [6], con una vecindad 5x5, se observ la atenuacin
de ruido impulsivo de alta frecuencia; mientras que los bordes de las CP se realzan (Figura 2-
21b), y se mantienen inalteradas algunas estructuras de la imagen, como son las espinas
dendrticas.
En la aplicacin de este filtro se utilizaron mscaras o vecindades cuadradas de orden
impar y el tamao de la mscara optima se encontr utilizando una metodologa heurstica, es
decir, se ensayo con mscaras de tamao 3x3, 5x5, 7x7 25x25 y se observ un mejor realce
en la imagen de CP con la mscara de 5x5.
Figura 2-21. (a) Dendritas de CP, sin ningn preprocesamiento. (b) Dendritas de CP despus de utilizar
filtro de mediana, con una vecindad 5x 5.
2.3.2 Filtro de mediana ponderado
Al aplicar el filtro de mediana ponderado [6] se puede observar que se mantienen las
caractersticas fenotpicas de CP (Figura 2-22b), sin embargo, se aprecia cambios en el
contraste y suavizado en la imagen de CP. El filtro de mediana ponderado se caracteriza
46
porque a cada elemento de la mscara o vecindad cuadrada de tamao impar, se le asigna una
ponderacin ( i
W
). Los valores de ponderacin se seleccionan en forma: aleatoria,
heursticamente, considerando un Filtro de Repuesta Impulsiva Finita (FIR), entre otros. En
nuestro caso se utilizaron los coeficientes de un filtro FIR pasa banda normalizado con
respecto a la frecuencia de Nyquist, de orden 24 N (genera 25 coeficientes, para una
vecindad de 5x5 y frecuencia
7 . 0 1 . 0
n
f
). En el desarrollo del presente estudio se
modific heursticamente el tamao del filtro (N) y se modificaron los valores del intervalo en
n
f
, hasta observar mejoras en el realce de la imagen de CP.
Figura 2-22. (a) Dendritas de CP, sin ningn preprocesamiento. (b) Dendritas de CP despus de utilizar el
filtro de mediana ponderado, con una vecindad 5x5
2.3.3 Filtro de mediana ponderado ptimo
Se observa en la imagen obtenida por el filtro de mediana ponderado ptimo (Figura 2-
23b) que se obtiene una imagen con un mejor contraste y realce, que la imagen deseada
(Figura 2-24b), pero se observan algunos artefactos que distorsionan la imagen, estos se
muestran en el recuadro rojo donde se encierra unas franjas verticales que se originaron como
resultado al aplicar el filtro.
En la implementacin del filtro de mediana ponderado ptimo, es necesario inicializar los
pesos ( i
W
). Para ello se consideran los coeficientes del filtro FIR mencionado en la seccin
47
2.3.2. Tambin es necesaria una imagen de referencia
) (n D

y la imagen a procesar
) (
n D
de
CP (Figura 2-24) ambas imgenes estn vectorizadas. ) (
n D
Se obtiene aplicndole a la
imagen, que se desea optimizar, un filtro de mediana ponderado y
la imagen de referencia es
una imagen de CP restaurada mediante el algoritmo de Lucy-Richardson (ver captulo III) [6].
La Figura 2-25 muestra una curva de aprendizaje de error que se obtiene restando en valor
absoluto ) (
n D
y
) (n D , generando una curva envolvente del error. Para cada valor del error
se genera un vector de ponderacin de 25 componentes, utilizando la ecuacin 2.4. La mejor
ponderacin se obtiene cuando la curva envolvente del error se hace mnima (Figura 2-25) y
se logra en la iteracin 16000.
Figura 2-23. (a) Dendritas de CP, sin ningn preprocesamiento. (b) Dendritas de CP despus de utilizar filtro
de mediana ponderado ptimo, con una vecindad 5x5.
48
Artefactos Artefactos
Figura 2-24. (a) Dendritas de CP, sin ningn preprocesamiento. (b) Dendritas de CP deseada
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Numerodeiteraciones
E
r
r
o
r
Figura 2-25. Curva de error
2.3.4 Transformada Wavelet
En cuanto al procesamiento utilizando TW, inicialmente, se procedi a realizar la
descomposicin y procesamiento, considerando un solo nivel de descomposicin obtenindose
49
cuatro coeficientes, conocidos como: aproximacin, detalles horizontales, detalles verticales y
detalles diagonales (Figura 2-26). En la descomposicin se utiliz la Daubechies (db1)
originando resultados aceptables en el realce de CP. En la seleccin de la wavelet no existe
una transformada wavelet nica que resuelva los problemas a priori en la imagen tratada
(compresin, eliminacin de ruido, segmentacin de imagen,...), lo que se hace es busca la
familia de wavelets (Haar, Daubechies, Coiflets,...) que mejor realcen las caractersticas de la
imagen a estudiar generando mejores resultados en la imagen a procesar.
En la descomposicin de la imagen utilizando TW, los coeficientes de aproximacin
contiene la mayor parte de la energa de la imagen, mientras que los detalles (horizontal,
vertical y diagonal) tienen valores prximos a cero, la transformada wavelet permite aplicar
tcnicas de procesamiento de imgenes a cada uno de sus coeficientes.
Figura 2-26. Descomposicin de la TW de CP, con la wavelet db1
50
Los coeficientes fueron procesados utilizando tcnicas de procesamiento de imgenes
procesamiento pxel por pxel o filtrado espacial. Obtenindose mejores resultados aplicando
el filtro laplaciano de una gaussiana (matlab: fspecial('log',[17 17], 0 .07) ) a los coeficientes
de aproximacin, seguidamente se le aplico la transformada wavelet inversa, obteniendo un
realce del rbol dendrticos y las espinas de CP, para lo cual se muestran secciones de las
imgenes de CP para observar en detalle el realce de espinas dendrticas. (Figura 2-27a y
Figura 2-27b).
Figura 2-27. (a) Imagen aumentada de las dendritas de CP, correspondiente a una seccin de la imagen. (b)
Aplicacin de la TWI
51
a
2.4. Conclusiones
El procesamiento de imgenes de CP con filtros de mediana y TW es una metodologa
novedosa, a la cual se le ha dedicado poca atencin. Esto puede concluirse debido a la escasa
literatura encontrada al respecto. Los resultados obtenidos sugieren que las tcnicas estudiadas
podran ser una importante herramienta de procesamiento para este tipo de imgenes. En
cuanto a los resultados, el filtro de mediana ponderado es el que produce mejores resultados.
El filtro de mediana ponderado ptimo presenta como limitante el requerimiento de una
imagen de referencia, la cual en esta aplicacin no siempre est disponible. Por su parte, la
TW resalta y ofrece informacin importante relativa a los bordes de las CP, permitiendo una
mejor definicin de aquellos sitios donde las espinas dendrticas aparecen borrosas.
Las tcnicas de procesamiento propuestas resultan tiles para producir un realce adecuado
de las CP, lo cual puede contribuir a mejorar el procedimiento de cuantificacin de espinas
dendrticas que normalmente se realiza en forma manual.
52
3. Captulo III
3. PREPROCESAMIENTO DE IMGENES DE CLULAS
DE PURKINJE UTILIZANDO DECONVOLUCIN
3.1. Introduccin
Las imgenes obtenidas con microscopa de luz de alta resolucin digitalizada (MLARD) a
partir de secciones de tejido de 90 a 150 de espesor son imgenes bastante ntidas; sin
embargo, algunas son borrosas debido a los diferentes planos focales existentes por el espesor
del corte, lo cual produce un proceso de degradacin lineal e invariante espacial que afecta a
cada uno de los pixeles de la imagen en igual proporcin. Esta degradacin se model como
una convolucin matemtica bidimensional de una funcin
) , ( y x f
representativa de la
imagen original [6], con otra funcin de propagacin puntual (PSF), que modela el proceso de
degradacin de cada punto
) , ( y x h
, obtenindose una imagen degradada
) , ( y x g
. El
problema consiste en realizar la operacin inversa que permita recuperar la imagen original
) , ( y x f
a partir de la versin degradada
) , ( y x g
y del conocimiento que se tenga del
sistema ptico de adquisicin de imgenes representada por la funcin
) , ( y x h
, esto se
conoce como deconvolucin [6,6]. La deconvolucin, en este caso, es la correccin de los
efectos instrumentales originada por las aberraciones de los sistemas pticos.
Diversos autores han realizado trabajos utilizando la tcnica de deconvolucin en algunas
modalidades de imgenes. En este sentido, Poindexter (2008), realiz un estudio de
visualizacin y localizacin de los antimicrobios humanos beta 1, 2 y 3, alfa defensina
neutrfilos y LL-37, en piel [6]. Para ello, tom muestras de tejido en el cual las clulas
fueron marcadas con anticuerpos secundarios. Estas muestras fueron observadas con
53
microscopa de fluorescencia, las imgenes obtenidas fueron restauradas por deconvolucin
generando una secuencia adecuada para la posterior cuantificacin de las clulas en estudio.
Por otra parte, Park y otros [6], aplicaron la referida tcnica, conjuntamente con la PSF,
para ubicar con precisin la ubicacin del baricentro de los anillos que generan unas
micropartculas al analizar un movimiento tridimensional.
De igual manera, Maierhofer y otros [6], aplicaron la tcnica en la compresin de
enfermedades a nivel celular, analizando el ADN de manera eficiente en una celda a partir de
clulas de tejido en el contexto natural. Sin embargo, el anlisis de ADN en las clulas es til
para la comprensin del cncer. En el estudio presenta una hibridacin fluorescente in situ,
tcnica basada en la deconvolucin multicolor. Se utilizaron siete canales para la deteccin de
la sonda, que permite la localizacin simultnea en alta resolucin en una muestra biolgica
con un espesor de hasta 30 micras. Tambin utiliz un etiquetado de los ncleos que ofrece
una segmentacin simultnea.
En el proceso de deconvolucin existen diversas formas de enfocar la tcnica, entre ellas
se pueden mencionar los mtodos basados en alcanzar una solucin de mxima verosimilitud
(maximum likelihood), mtodos basados en la probabilidad Bayesiana, y mtodos de
deconvolucin a ciegas (blind deconvolution) [6]. Entre los mtodos de mxima verosimilitud
estn los mtodos iterativos para minimizar la diferencia entre la imagen distorsionada original
y la convolucin de la imagen verdadera con el PSF. Con respecto a los mtodos Bayesianos
destaca el algoritmo Pixon [6], este algoritmo permite la incorporacin de informacin a
priori, tales como restricciones de suavidad, para as mejorar la calidad de la imagen. El
algoritmo iterativo de Lucy-Richardson, se basa en alcanzar una solucin de mxima
probabilidad [6]. Los mtodos de deconvolucin a ciegas buscan extraer una PSF plausible a
partir de la informacin existente en la imagen y de cierto conocimiento a priori del contenido
de la misma. En nuestro caso, se implementarn los algoritmos iterativos [6] de los filtros de
regularizacin, filtro Winner y filtro de Lucy-Richardson. Dicha implementacin permitir
establecer comparaciones en cuanto al desempeo de tales algoritmos iterativos.
De lo descrito anteriormente, se puede intuir que los instrumentos pticos producen
ligeras desviaciones en la trayectoria de los fotones, lo que se traduce en aberraciones en la
54
imagen, de modo que sta nunca es una copia exacta del objeto real y ser necesario recurrir a
tcnicas de restauracin, para optimizar el posterior proceso de cuantificacin de la imagen.
En la presente investigacin se adquiri una base de datos de 35 imgenes, con una
resolucin de 4096x5120 pxeles y una profundidad de 8 bits. Las imgenes de CP son de un
corte del cerebelo de un ratn adulto joven, adquiridas utilizando un microscopio fotnico
Polyvar Reichert-Jung con un objetivo de 100X y una cmara fotogrfica Infinity. Al cerebelo
se le aplic el mtodo de Golgi modificado por Palacios-Pr [6]. Se visualizaron cortes (90
de espesor) con MLARD a diferentes planos focales. La tcnica utilizada para procesar las
imgenes de CP fue la deconvolucin, la cual fue implementada para realzar las caractersticas
ms importantes de las espinas de las ramificaciones dendrticas de CP.
3.2.1 Convolucin
La convolucin es una operacin matemtica que corresponde al filtraje de una funcin
) , ( y x f
con un cierto ncleo funcional h(x,y) para producir la forma de otra funcin
) , ( y x g
, como lo indica la ecuacin 3.1.

M
k
N
l
l y k x h l k f y x h y x f y x g
1 1
) , ( ) , ( ) , ( * ) , ( ) , (

(3.1)

Por tanto, al aplicar a una imagen una convolucin (Figura 3-28) con una funcin
gaussiana (Figura 3-29), lo que se hace es forzar a que las variaciones de brillo existentes en la
imagen se parezcan ms a la forma de una gaussiana, haciendo el cambio de colores suave, lo
cual produce un efecto de desenfoque gaussiano. En la formacin de la imagen expresa que lo
obtenido, cuando se adquiere cualquier imagen de un objeto real, es bsicamente el resultado
55
de una convolucin, donde la PSF (
) , ( y x h
) es una funcin que caracteriza las
imperfecciones de los dispositivos de adquisicin (microscopio y cmara LCC). En otras
palabras la PSF es la funcin matemtica que describe la distorsin que sufre un punto terico
de luz al atravesar un medio de difraccin (lente) como lo modela la ecuacin 3.2
R y x h y x f y x g + ) , ( * ) , ( ) , (

(3.2)
) , ( y x g
: Imagen observada

) , ( y x f
: Imagen real

) , ( y x h
: PSF
R : Ruido
*: Operador de convolucin
En condiciones ideales de observacin, en un microscopio con lentes con grado de
aberracin igual a cero, la PSF sera una delta de Dirac (funcin impulso), funcin
consistente en un pico nico cuya anchura tiende a cero y rea a uno. En estas condiciones la
convolucin sera una identidad, es decir, no modificara el objeto en observacin.
Figura 3-28. Ejemplo de la operacin de convolucin
56
Figura 3-29. Funcin de propagacin de puntos (
) , ( y x h
)
3.2.2 Deconvolucin
La deconvolucin (Figura 3-30), es la inversa de la convolucin con ausencia de ruido (
0 R ). Conocido el resultado de una convolucin y sabiendo qu forma tiene la PSF, es
posible revertir el proceso para obtener la funcin original
) , ( / ) , ( ) , ( y x h y x g y x f
donde
el smbolo / representa la deconvolucin. Esto es cierto en teora, pero no es tan sencillo en
la prctica. Trabajando con imgenes reales, no se puede llegar a un resultado razonable
aplicando una deconvolucin de forma fcil y hay varias razones para ello. Una, muy
importante, es que las imgenes digitales son representaciones discretas. Todo proceso de
muestreo necesariamente se realiza con un rango finito de frecuencias, con lo cual una parte de
la informacin se pierde de forma irreversible. Otra razn, igualmente importante, es que en
realidad no se conoce la PSF, debido a las perturbaciones que intervienen durante la
adquisicin de una imagen en microscopa, slo se puede modelar de forma aproximada, por
lo tanto una pequea variacin en la PSF tiene efectos muy importantes en el resultado de la
deconvolucin. Tambin hay que tener en cuenta en la adquisicin de imgenes, la presencia
del ruido ( R ), que es un componente aditivo que complica la solucin del problema. Esto es
debido a que es muy difcil caracterizarlo correctamente, y adems, porque es an ms difcil
separarlo de la imagen, ya que no se sabe de forma exacta que es el objeto y que es el ruido.
Otra causa es que PSF, posee valores igual a cero, y divisiones de ese tipo generan error. Por
todas estas razones, la deconvolucin de imgenes reales es un problema bastante complejo,
57
debido a esto se recurre a la implementacin de tcnicas basadas en algoritmos de
deconvolucin que se implementan mediante mtodos numricos.
Figura 3-30. Ejemplo de la operacin de deconvolucin
Los mtodos numricos que se utilizaron en la deconvolucin fueron los algoritmos de
regulacin, el de Wiener y el de Lucy-Richardson. Tales Algoritmos son procedimientos
iterativos que se utilizan para la restauracin de una imagen, que ha sido distorsionada por
una PSF.
Antes de definir los filtros anteriores se har referencia a los mtodos iterativos. Un
mtodo iterativo es un mtodo que progresivamente va calculando aproximaciones a la
solucin de un problema. Matemticamente, en un mtodo iterativo se repite un mismo
proceso de mejora sobre una solucin aproximada: se espera que lo obtenido sea una solucin
ms aproximada que la inicial. El proceso se repite sobre esta nueva solucin hasta que el
resultado ms reciente satisfaga ciertos requisitos. A diferencia de los mtodos analticos, en
los cuales se debe terminar el proceso para obtener la respuesta, en los mtodos iterativos se
puede suspender el proceso al trmino de una iteracin y se obtiene una aproximacin a la
solucin. Por ejemplo un mtodo iterativo ser encontrar la raz a una ecuacin cuadrtica,
donde se utiliza el mtodo de Newton, pero un mtodo directo consiste en aplicar la ecuacin
solucin por factorizacin, solucin por completacin de cuadrados o solucin por la
58
ecuacin general. La desventaja de los mtodos iterativos respecto a los mtodos directos es
que los iterativos calculan aproximaciones a la solucin. Los mtodos iterativos se usan
cuando no se conoce un mtodo para obtener la solucin en forma exacta.
Filtro de regularizacin: El algoritmo de regularizacin [6], es la aproximacin de un
problema mal condicionado, por medio de problemas bien condicionados similares. En
general la regularizacin conlleva a realizar ciertas suposiciones acerca de la solucin con
respecto a su tamao o suavidad de una imagen. Supngase que se tiene una imagen borrosa
con la cual se forma un vector b , por otro lado se tiene la imagen
x
vectorizada que se
quiere recuperar y el aparato con el que se adquiri la imagen representado por una matriz A
(PSF), de
nxn
, en otra palabras, una imagen
x
se captura mediante el dispositivo A para
obtener una imagen b , esto es equivalente a aplicar una transformacin lineal A a un vector
x
.
b Ax (3.3)
El problema se reduce a encontrar
x
que resuelva la ecuacin 3.3, desafortunadamente,
resolver el sistema de ecuaciones por cualquier mtodo numrico, no resulta factible debido al
mal condicionamiento de la matriz A, conduciendo a la propagacin de errores numricos y
as generar una imagen de mala calidad, debido a eso se utilizan los filtros de regularizacin
que consisten en reemplazar el problema mal condicionado b Ax por la
)
x que minimiza el
funcional (3.4).
b A I A A x x b Ax
T
n
T 1
2 2
) ( 0 ;

+ > +

(3.4)
: Parmetro de regularizacin
n
I
: Matriz identidad
nxn
Filtro de Wiener: El algoritmo de Wiener se dise para trabajar en los casos donde el
ruido (
) , ( y x N
) es significativo, este filtro requiere que se conozca en detalle el tipo de
ruido presente en la imagen. Es un filtro lineal de mnimos cuadrados para reducir al mnimo
la distancia media entre la seal de salida y una seal deseada. Dicho algoritmo es usado para
la restauracin de imgenes. Para disearlo se necesita tener un conocimiento previo
59
apropiado de las propiedades estadsticas de la imagen de entrada, el problema reside en que
este conocimiento no se puede obtener en forma precisa, en su lugar se usan filtros
adaptativos, que hacen uso de los datos de entrada para aprender los datos estadsticos
requeridos [6].

Figura 3-31. Modelo de restauracin
El modelo de la Figura 3-31, se representa mediante la ecuacin 3.5
[ ] ) , ( * ) , ( ) , ( * ) , ( ) , (
y x H y x N y x H y x F y x F
R D I I
+

(3.5)
Aplicando la transformada de Fourier, se tiene la ecuacin 3.6
[ ] ) , ( * ) , ( ) , ( * ) , ( ) , (
y x R y x y x D y x I y x I
w w h w w n w w h w w f w w f +
(3.6)
Donde
y x
w w ,
: son la frecuencia correspondiente a cada uno de los ejes de la trasformada de Fourier
bidimensional
) , ( ), , ( ), , ( ), , ( ), , (
y x R y x y x D y x I y x I
w w h w w n w w h w w f w w f
Son las transformadas de
Fourier de
) , ( ), , ( ), , ( ), , ( ), , (
y x H y x N y x H y x F y x F
R D I I

Aplicando mnimos cuadrados al error (3.7) que se obtiene entre la imagen deseada y la
imagen de salida
[ ] { }
2
) , (
) , ( y x F y x F E E
I I

(3.7)
60
La minimizacin de la ecuacin 3.7 conduce a estimar el filtro de Wiener que est dado por la
ecuacin 3.8.
) , (
) , (
) , (
y x
F
F
y x
F
F
y x R
w w W
w w W
w w H
O
O
O
I
(3.8)
Donde
) , (
y x
F
F
w w W
O
I
: es la correlacin entre la seal de entrada y la repuesta deseada ( Figura 3-
31)
) , (
y x
F
F
w w W
O
O
: Autocorrelacin de la entrada
En el caso de existir ruido de tipo aditivo ( Figura 3-31) entonces
) , (
y x
F
F
w w W
O
I
y
) , (
y x
F
F
w w W
O
O
se sustituyen por las ecuaciones 3.9 y la ecuacin 3.10 respectivamente en la
ecuacin 3.11.
) , ( ) , ( ) , (
*
y x F y x D y x
F
F
w w W w w H w w W
I
O
I

(3.9)
) , ( ) , ( ) , ( ) , (
2
y x N y x F y x D y x
F
F
w w W w w W w w H w w W
I
O
O
+
(3.10)
) , ( ) , ( ) , (
) , ( ) , (
) , (
2
*
y x N y x F y x D
y x F y x D
y x R
w w W w w W w w H
w w W w w H
w w H
I
I
+

(3.11)
Filtro Lucy-Richardson: En el presente estudio se utiliz el algoritmo de Lucy-
Richardson, debido a que genera excelentes resultados en el procesamiento de CP. Ellos
reportan [6] reportan resultados que se adquieren aplicando mtodos probabilsticos de
restauracin de imgenes degradadas por altos niveles de ruido. En el desarrollo de la tcnica
se asume que la degradacin de una imagen H es de la forma S W H * , donde W es la
61
imagen original, S es la funcin de dispersin puntual (PSF) y * denota la operacin de
convolucin (Figura 3-32). Se considera que W , S y H son una medida de la frecuencia
de ocurrencias de un evento en un punto dado.
Figura 3-32. Degradacin espacial de una imagen
Dada la imagen degradada H, la funcin de dispersin de puntos S, y el requerimiento de
conseguir la imagen original W, se puede recurrir al teorema de Bayes. Dicho teorema
establece la probabilidad condicional del evento
i
W
dado el evento
k
W
y se puede estimar
de acuerdo a la ecuacin 3.12.
K k J j I i
W P
W
H
P
W P
W
H
P
Wi P
j
i
i
k
i
i
k
.. 1 , .. 1 , .. 1
) ( ) (
) ( ) (
) (

(3.12)
Donde:
i
H
: Es la i-esimo pixel de H
i
W
: Es la i-esimo pixel de W
Considerando todos los i
H
y su dependencia con respecto a i
W
segn S , se puede
escribir.

k
k
k
i
k i i
H P
H
W
P H W P W P ) ( ) ( ) ( ) (

(3.13)
62
Como se cumple P (W H
k
) = P (W
i
H
k
)/1P (H
k
). Es posible obtener
k
j
j
j
k
k i
i
k
i
W P
W
H
P
H P W P
W
H
P
W P
) ( ) (
) ( ) ( ) (
) (
(3.14)
En la ecuacin 3.14
) (
i
W P
es considerada la solucin, pero en muchas aplicaciones del
teorema de Bayes el trmino no es conocido, por eso es necesaria la utilizacin de iteraciones
para estimar el valor
) (
i
W P
.
{ } ,.... 1 , 0 ;
) Pr( ) (
) ( ) ( ) (
) ( ) (
1

+
r
W
W
H
P
H P W P
W
H
P
W P W P
k
j
j
j
k
k i
i
k
i r i r

(3.15)
La ecuacin 3.15 es un procedimiento iterativo (r), inicializando
) (
0 i
W P
. La inicializacin
se puede realizar considerando una distribucin de probabilidad uniforme.

3.2.3 Relacin Seal a Ruido de Pico
La Relacin Seal a Ruido de Pico (PSNR: Peak Signal-to-Noise Ratio) es un trmino
utilizado en ingeniera para definir la relacin entre la mxima energa posible de una seal y
el ruido que afecta a su representacin fidedigna. Debido a que muchas seales tienen un gran
rango dinmico, el PSNR se expresa generalmente en escala logartmica, utilizando como
unidad el decibelio (dB). Para definir PSNR se hace indispensable la formulacin del error
cuadrtico medio representado en la ecuacin 3.16, que para dos imgenes
) , ( y x I
y
) , ( y x K
de tamao
] [ N M
se define el PSNR de acuerdo a la ecuacin 3.17.
2
1
0
1
0
1
) , ( ) , (

M
i
N
j
MN
j i K j i I MSE
(3.16)
63
El PSNR se define en la ecuacin 3.17 como:
,
_
MSE
PSNR
B
1 2
log * 20
10
(3.17)
B : Nmero de bits de profundidad en la representacin de la imagen
El uso del PSNR en este contexto es una medida cuantitativa de la calidad de una imagen
(
) , ( y x I
) que al aplicarle una convolucin con una PSF, genera una nueva imagen (
) , ( y x g
). La PSF (
) , ( y x h
) se representa por una gaussiana, con un tamao de ventana
de vecindad y varianza conocidas.
A partir de la imagen
) , ( y x g
se debe obtener una imagen ) , (
y x I muy aproximada a
) , ( y x I
. Para lograr esto se realiza una deconvolucin de
) , ( y x g
con una PSF (
) , ( y x h
)
de tipo gaussiana. Por lo tanto al calcular los PSNR, se genera una grfica modificando la
varianza y asumiendo una vecindad constante. En la grfica el pico ms alto, representa el
indicador del valor ptimo de varianza ya que es donde se lograr una mejor imagen ) , (
y x I
. El clculo del PSNR, se aplicar a la imagen de referencia con las diferentes tcnicas de
deconvolucin.
3.3. Resultados
3.3.1 Validacin de los algoritmos de restauracin
Antes de analizar los resultados obtenidos correspondientes a la restauracin de las
imgenes de CP por deconvolucin se realiz una validacin de la implementacin de los
algoritmos, basada en la imagen de Lena (Figura 3-34a) distorsionada con un ncleo
gaussiano. El objetivo es procesar la imagen distorsionada de Lena (Figura 3-34b) (que
emulara la imagen adquirida en un microscopio), que al aplicarle los mtodos numricos de
deconvolucin y luego estimar el PSNR permite estimar la imagen de Lena restaurada optima.
El procedimiento utilizado se muestra en la Figura 3-33, donde la imagen
) , ( y x f
convolucionada con la funcin gaussiana
) , ( y x h
con una vecindad cuadrada NxN de
64
15 15 x y varianza
5 , 2
permite generar la imagen
) , ( y x g
, que representa la imagen
distorsionada. Dicha imagen es procesada mediante filtros de deconvolucin que consideran
como informacin a priori diferentes ncleos PSF gausianos
) , ( y x h
i , obtenidos al
considerar diferentes valores para la varianza i
. El tamao del PSF es de 15 15 x . Luego de

aplicar el filtro de deconvolucin se obtiene la imagen estimada ) , (
y x f
i
. Posteriormente
dicha imagen estimada se compara con la imagen original al calcular el valor de la relacin
seal ruido PSNR de pico expresada en decibeles. El proceso se repite para otro valor i
de
la PSNR considerada a priori para modelar la distorsin. De esta manera es posible generar
una grafica del PSNR en funcin de i
, donde el mximo valor de la curva indicara el

) , ( y x f
i ms parecido a
) , ( y x f
que debera ocurrir para
5 , 2
.
Figura 3-33. Diagrama del test de deconvolucin
Aplicando el filtro de regularizacin a la imagen de Lena, se observa un desenfoque a
pesar de que se utiliz el valor ptimo de
5 , 2
i
(Ver Figura 3-34d), que se muestra en el

65
clculo del PSNR (Figura 3-34c), esto indica que cualquier otro valor de
i
presenta una
imagen con un desenfoque mayor.
Figura 3-34. (a) Imagen de Lena (b) Imagen convolucionada con una gaussiana 5 , 2 (c) Clculo del
PSNR ptimo aplicando el filtro de regularizacin (d) Imagen restaurada con el filtro de regularizacin
En la Figura 3-35 se muestran los resultados obtenidos al realizar la restauracin usando el
filtro de Wiener. En este caso, (Figura 3-35b) la imagen restaurada muestra menos
desenfoque que el obtenido con el filtro de regularizacin. Es decir, se logra un mejor realce
de la imagen (Figura 3-35d). De la misma manera que en el caso anterior se logra un PSNR
ptimo, cuando el PSF a priori tiene
5 , 2
i
.
66
Figura 3-35. (a) Imagen de Lena. (b) Imagen convolucionada con una gaussiana 5 , 2 (c) Clculo del
PSNR ptimo aplicando el filtro de Wiener (d) Imagen restaurada con el filtro de Wiener
Los resultados obtenidos al realizar la restauracin de la imagen con el algoritmo de Lucy-
Richardson se muestran en la Figura 3-36b. En este caso se logran los mejores resultados en
cuanto a la restauracin. Esto se deduce por el hecho que el PSNR mximo es ms elevado
que para los filtros considerados previamente.
67
Figura 3-36. (a) Imagen de Lena. (b) Imagen convolucionada con una gaussiana 5 , 2 (c) Clculo del
PSNR ptimo aplicando el filtro de Lucy-Richardson (d) Imagen restaurada con el filtro de Lucy-Richardson.
3.3.2 Restauracin de Imgenes de Clulas de Purkinje
En la restauracin de imgenes de CP, se busc una PSF utilizando la funcin gaussiana
ya que modela la distorsin en las imgenes de CP, donde los parmetros de la funcin son el
tamao de la vecindad y la varianza, para encontrar el valor ptimo de los parmetros se
utiliz una vecindad de tamao NxN y varianza () . La PSF se utiliza en la deconvolucin
de las imgenes de CP (Figura 3-37, Figura 3-38 ,Figura 3-39) para atenuar el ruido y realzar
68
los bordes de las espinas dendrticas de CP mantenindose inalteradas algunas estructuras de
la imagen. Se emplearon vecindades cuadradas de orden impar utilizando una metodologa
heurstica, es decir, se ensayo con vecindades de tamao 3x3, 5x5, 7x7 25x25 y en cada
una de ellas se vari la varianza dentro del intervalo (010, incrementando en 0,5),
permitiendo as observar el realce en la imagen de CP en cada ajuste de la vecindad e
intervalo. Estos ensayos permitieron encontrar el PSF adecuado. Inmediatamente se aplic
un realce logartmico ver ecuacin 3.18, donde a las imgenes originales de CP, y las
imgenes de CP obtenidas en la deconvolucin se ajustan los pixeles hacia una curva
logartmica, permitiendo as mejorar imgenes demasiado oscuras.
) 1 ) , ( ( log ) , ( + y x f N y x g
(3.18)
N : Factor de escala fija el mximo nivel de salida
En la Figura 3-37, se observan los resultados de la restauracin de las CP utilizando el
filtro de regularizacin y una PSF con una ventana de 15x15 y =2,5. En la Figura 3-37b se
muestra que se produce un realce en el rbol dendrtico y se resaltan las espinas, tambin se
logra atenuar el ruido que contiene la imagen de CP original (Figura 3-37a), lo cual facilitara
la cuantificacin de las espinas dendrticas que se aprecian en la Figura 3.10b.
Se aplica realce logartmico a las imagen de CP Figura 3-37a y Figura 3-37b generando su
respectivo resultado en las Figura 3-37c y Figura 3-37d, observndose en las imgenes que se
logra un realce de la estructura del rbol dendrtico de CP, pero no un realce de los bordes de
las espinas dendrticas.
Utilizando el filtro de Wiener, se observa en la imagen de CP (Figura 3-38a), que la imagen
resultante es suavizada (Figura 3-38b) y la restauracin no es adecuada para realizar la
cuantificacin de las espinas de CP, la distorsin en la imagen se modela utilizando una PSF
con una ventana de 15x15 y =2,5.
Como se observa en la Figura 3-37c y Figura 3-37d, obtenidas por un realce logartmico de
las imgenes de las Figura 3-37a y Figura 3-37b donde se elimina gran cantidad de ruido pero
no se realzan las espinas dendrticas de CP.
69
Figura 3-37. (a) Imagen CP sin preprocesamiento (b) Imagen CP aplicando el algoritmo de regulacin con una
ventana de 15x15 y varianza 2,5 (c) Imagen original aplicando realce logartmico (d) Imagen de CP
obtenida por regulacin e inmediatamente se le aplica un realce logartmico
70
Figura 3-38. (a) Imagen CP sin preprocesamiento. (b) Imagen CP aplicando el algoritmo de Wiener con una
ventana de 17x17 y varianza 0,5 (c) Imagen original de CP aplicando realce logartmico (d) Imagen de CP
obtenida por Wiener y se le aplica un realce logartmico
En la Figura 3-39a se muestra la imagen de CP y en la Figura 3-39b el resultado del
proceso de restauracin utilizando el algoritmo de Lucy-Richardson, observndose que se
logra una excelente restauracin de las espinas dendrticas en la imagen de CP (ver Figura 3-
39b), lo cual facilitara la cuantificacin de las espinas dendrticas. En este caso la PSF que
modela la distorsin se considera como una funcin gaussiana de tamao 17x17 y con una
varianza 5. Luego se aplica un realce logartmico sobre las imgenes de CP Figura 3-39a y
Figura 3-39b presentndose los resultados en las Figura 3-39c y Figura 3-39d obtenindose
un mejor realce en las imgenes de CP.
71
Figura 3-39. (a) Imagen CP sin preprocesamiento. (b) Imagen CP aplicando el algoritmo de Lucy-Richardson,
con una ventana de 17x17 y varianza 5 (c) Imagen original de CP aplicando realce logartmico (d)
Imagen de CP obtenida por Lucy-Richardson y se le aplica un realce logartmico
3.4. Conclusiones
El mtodo numrico iterativo de deconvolucin, que genero mejores resultados fue el
algoritmo de Lucy-Richardson. De lo descrito anteriormente, se puede intuir que los
instrumentos pticos, durante los procesos de adquisicin (convolucin) de la imagen,
producen ligeras desviaciones en la trayectoria de los fotones, lo que se traduce en
aberraciones de la imagen, de modo que sta nunca es una copia exacta de lo real. Sin
72
embargo, mediante la utilizacin de algoritmos de restauracin iterativos es posible lograr un
buen realce de la imagen, lo cual permitir facilitar la cuantificacin de las espinas dendrticas.
Las imgenes obtenidas se utilizarn en el siguiente captulo para determinar el nmero de
espinas presentes en las dendritas de CP, utilizando para ello alguna tcnica de aprendizaje
supervisado.
73
4. Captulo IV
4. HERRAMIENTA DE CLASIFICACIN APLICADA A
IMGENES DE CLULAS DE PURKINJE
4.1. Introduccin
El conteo de espinas en las clulas de Purkinje (CP) constituye un problema de gran
inters para el Centro de Microscopa Electrnica Ernesto Palacios Pr, justificado por la
diversidad de enfermedades que pueden afectar tanto la estructura como la funcionalidad del
cerebelo. Este rgano posee como neuronas principales las CP, que son estructuras
encargadas de recibir, modular y transmitir toda la informacin, que se procesa en la corteza
cerebelosa, a travs de las sinapsis que establecen por medio de las espinas dendrticas. Este
tipo de espinas son estructuras especializadas a las cuales se les ha dedicado particular
atencin debido a que su aspecto morfolgico, su nmero y su distribucin espacial,
representan la expresin anatmica del funcionamiento del cerebelo. Entre las manifestaciones
patolgicas cerebelosas, ms comunes, se encuentran la disimetra, la ataxia de la marcha, la
hipotona muscular; mientras que las menos frecuentes son la degeneracin cerebelosa,
neoplasias, atrofias del cerebelo, dificultades para el aprendizaje no verbal, degeneraciones
espinocerebelosas y el sndrome hidroceflico, que es una anomala congnita del cerebelo
debida a una expansin qustica del cuarto ventrculo hacia el cerebelo. El nmero de espinas
y el crecimiento dendrtico son dos variables dinmicas, expresin de la plasticidad del
sistema nervioso, que van modificndose durante el proceso de desarrollo y maduracin de los
vertebrados. De all la importancia de conocer los patrones normales propios de cada una de
las etapas de desarrollo, para poder determinar cualquier alteracin que en la prctica se
traduce en manifestaciones clnicas y patolgicas [6]. En los estudios que se realizan en el
referido Centro, es importante disponer de la informacin relativa al nmero de espinas
74
dendrticas en CP, ya que dicha informacin permite expresar las condiciones funcionales del
cerebelo y, por tanto, del individuo.
El procesamiento de imgenes y el desarrollo de tcnicas automatizadas de clasificacin
son herramientas que podran resultar tiles para la cuantificacin de las imgenes de clulas
de Purkinje. Algunas de las investigaciones relacionadas con estas herramientas se presentan a
continuacin.
Vera y otros [6], desarrollan una tcnica para la deteccin automtica del corazn a partir
de imgenes de Tomografa Multi-corte (MSCT), la tcnica implementada consta de dos
etapas. En la primera se detect automticamente un conjunto de marcadores anatmicos
sobre el borde del corazn, empleando una mquina de soporte vectorial de mnimos
cuadrados entrenada usando patrones de tamao 31x31, asociados tanto a los Marcadores
como a otras estructuras presentes en las imgenes de MSCT, denominadas No Marcadores.
Mediante el entrenamiento se construy una superficie de decisin que permiti clasificar los
patrones de entrada como Marcadores y No Marcadores. Durante el proceso de deteccin se
obtiene un 95,84% de reconocimiento. Los marcadores detectados fueron ubicados mediante
sus respectivas coordenadas sobre la imagen. Tales coordenadas fueron utilizadas para obtener
mediante B-splines un conjunto de contornos que modelan el corazn. Durante la segunda
etapa, se implement un algoritmo de triangulacin, el cual permiti generar una superficie en
3-D a partir de los contornos proporcionados la cual es desplegada utilizando algoritmos de
rendering de superficie.
Garca y otros [6], presentan una herramienta de diagnstico histolgico en los tumores de
partes blandas el cual resulta til como fase previa al abordaje teraputico de estas lesiones.
Las tcnicas de reconocimiento de patrones pueden ser una herramienta muy til tanto en el
diagnstico como en la extraccin de la informacin relevante, utilizando imgenes de RM
(Resonancia Magntica) y datos epidemiolgicos. Se han obtenido muy buenos resultados, por
encima del 90% de acierto, al discriminar entre estirpes utilizando tcnicas de clasificacin,
tales como: clasificadores de distancia (los k vecinos), Clasificadores paramtricos (Bernoulli,
gaussiana y multinomial), rboles de decisin y Funciones discriminantes lineales (mquinas
de soporte vectorial). La exactitud al diferenciar entre una estirpe y las dems ha sido tambin
75
muy elevada. Estos resultados, junto con informacin sobre benignidad/malignidad con
modelos previamente descritos, proporcionan clasificadores a integrar en una herramienta
mdica de apoyo al diagnstico de los tumores de partes blandas.
Gonzlez y otros [6], proponen la utilizacin de descriptores de textura conocidos en la
clasificacin de clulas espermticas en funcin de la distribucin intracelular que presentan.
Se emplean estadsticos de segundo orden derivados de la matriz de co-ocurrencia y se
comparan los resultados con los obtenidos utilizando caractersticas geomtricas. El
clasificador utilizado es el de k vecinos ms prximos. Los resultados indican que los
descriptores derivados de la matriz de co-ocurrencia clasifican este tipo de imgenes con un
error menor que los derivados de las caractersticas geomtricas.
Huang y otros [6], presentan un mtodo para la clasificacin del carcinoma prstatico en
imgenes patolgicas. Dado que la clasificacin realizada en forma manual es subjetiva y
lenta, este trabajo presenta un sistema automatizado para clasificar imgenes patolgicas
segn el grado de acuerdo al sistema de clasificacin de Gleason, que es el mtodo ms
utilizado para la clasificacin histolgica de los tejidos finos de prstata. Los autores proponen
dos mtodos de extraccin de caractersticas basadas en la dimensin fractal para analizar las
variaciones de la intensidad y la complejidad de la textura en las regiones de inters. Cada
imagen se puede clasificar en un grado apropiado de la escala de Gleason, utilizando Tcnicas
bayesianas, redes neurales y mquinas soporte vectorial (SVM). Los resultados experimentales
demuestran que el 91,2%, 93,7%, y el 93,7% de Tasas Correctas de Clasificacin (CCR) se
puede alcanzar por mtodos Bayesiano, redes neurales y clasificadores SVM, respectivamente,
para un conjunto de 205 imgenes patolgicas de la prstata. Si el sistema de base fractal de
caractersticas es optimizado la seleccin del CCR se puede mejorar hasta 94.6%, 94.2%, y
94.6%, respectivamente, usando cada uno de los tres clasificadores antes dichos. Los
resultados experimentales demuestran que el sistema de caracterstica es mejor que los
sistemas de caracterstica extrados de multi-wavelets, filtro Gabor y los mtodos de matriz de
la co-ocurrencia del nivel de gris.
En el procesamiento de las imgenes que contienen las CP, se utilizaron tcnicas de
deconvolucin, como se explic en el captulo III, obtenindose as un realce de las espinas
dendrticas de las CP, que permiti implementar un modelo, basado en mquinas de soporte
76
vectorial de mnimos cuadrados [6], para la clasificacin de las espinas dendrticas de CP.
Para ello, se realiz una revisin del estado del arte acerca de las Mquinas de Soporte
Vectorial de Mnimos Cuadrados, su idea original, sus extensiones propuestas, sus algoritmos
de entrenamiento y su aplicacin a la clasificacin de imgenes.
Para desarrollar el presente trabajo, se utiliz un procedimiento de clasificacin automtico
estructurado en dos etapas denominadas entrenamiento y deteccin. En primera instancia, se
implement la etapa de entrenamiento. Durante esta etapa, a partir de caractersticas
especificas de datos etiquetados, obtenidos de un conjunto de imgenes de entrenamiento, se
gener una superficie de decisin que asigna etiquetas a la informacin contenida en cualquier
imagen de entrenamiento y por ende permite clasificar los objetos presentes en ella. Luego, se
implement la etapa de deteccin, mediante la cual se asigna una etiqueta a cada uno de los
objetos presentes en imgenes no utilizadas durante la fase de entrenamiento.
La clasificacin fue aplicada a una base de datos que consta de 25 imgenes (1024x1024
a 8 bits de profundidad en niveles de gris) de CP, que se pre-procesaron con el algoritmo de
deconvolucin de Lucy-Richardson y realce logartmico para realzar las espinas dendrticas y
as poder utilizar las herramientas de clasificacin como lo son las mquinas de soporte
vectorial. Los resultados se presentan en la seccin 4.2.3.2. Antes de aplicar las herramientas
de clasificacin en CP, se realizaron validaciones de la tcnica de reconocimiento con un
conjunto de imgenes sintticas, que contienen formas conocidas para su identificacin y
clasificacin. Los resultados de esta validacin se presentan en la seccin 4.2.3.1.
4.2.1 Mquina de soporte vectorial (SVM)
Las SVM fueron desarrolladas por Vapnik [42] y constituyen un conjunto de algoritmos de
aprendizaje de tipo supervisado. Para resolver un problema de clasificacin las SVM deben
77
generar una superficie de decisin adecuada, basndose en el conjunto de datos de
entrenamiento. Para el caso especifico de mquinas de aprendizaje binarias, la superficie de
decisin es un hiperplano que separa los patrones de entrenamiento en dos clases. (Figura 4-
40).
Figura 4-40. Hiperplano de separacin optimo W.x+b
En la Figura 4-40 se dispone de un conjunto de N datos de entrenamiento llamados
patrones, de la forma
n
N N N
R x y x y x ), , ( ..., ), , (
1 1
, cada escalar i
y
(etiqueta) se
identifica con
{ } 1 t
, llamndose as vector de etiquetas
y
( )
N
y y y ... , ,
2 1
.
Problemas linealmente separables: existen muchos hiperplanos que pueden clasificar los
datos pero las mquinas no hallan uno cualquiera de estos hiperplanos, sino el nico que
maximiza la distancia entre el hiperplano y el dato ms cercano de cada clase, esta distancia
es llamada margen y el hiperplano que la maximiza se le llama el mejor hiperplano separador
(hiperplano de mximo margen). El hiperplano separador esta dado por la ecuacin.
) . ( x W 0 +b
x W,
R b R
n
,

(4.1)
78
El trabajo consiste en hallar el vector W de pesos que contiene la ponderacin de cada
atributo, indicando que tanto aporta en el proceso de clasificacin, en tanto que b define el
umbral de decisin. Para encontrar el hiperplano optimo se utiliza una funcin (d)
discriminante de distancia
Wx+b
W
W
, = W.W
d b)= (x,W,
(4.2)
Donde
W
es la norma asociada al producto escalar en
n
R
. Como se trata de patrones
linealmente separables, se puede re-escalar
W
y b , resultando la ecuacin
d b)= (x,W,
1
W
Wx + i b =1
(4.3)
As se obtiene el hiperplano de mximo margen cannico en el cual los patrones de
entrenamiento ms cercanos al plano tienen distancia normalizada
( d , ,W x 1 ) b
y los
dems patrones distancia
( d , ,W x 1 ) b
. Hallar el mejor hiperplano separador es un
clsico problema de maximizacin con restricciones de la ecuacin 4.3, el cual se puede
transformar en un problema ms sencillo utilizando el principio de dualidad, quedando como
W
2
min

(4.4)
Sujeto a:

y Wx + i i b >1, i=1...N

Clasificadores no lineales mediante kernel: se utilizan cuando no existe una superficie
lineal de decisin que separe los datos, en el espacio de entrada, se considera la
correspondencia del vector de entrada
W
a un espacio de mayor dimensin
c
R llamado
espacio caracterstico
, que este dotado de producto escalar (Figura 4-41). Eligiendo el

espacio
apropiado, se realiza la correspondencia y se busca el hiperplano separador

optimo siguiendo la mecnica expuesta en la clasificacin lineal, ya que ser lineal en
c
R ,
pero representa un hiperplano no lineal en el espacio de entrada
n
R
79
Figura 4-41. La idea de la SVM es establecer una correspondencia de los datos de entrenamiento en un espacio
caracterstico de dimensin superior utilizando
y as, poder construir un hiperplano que separe las clases con

un margen mximo
Existe una variante de las SVM, denominada mquina de soporte vectorial de mnimos
cuadrados (LSSVM). Las SVM han sido ampliamente utilizadas en la clasificacin y la
estimacin de la funcin no lineal. Sin embargo, el principal inconveniente de la SVM es su
mayor carga de clculo para la programacin de optimizacin con restricciones. La razn
principal para elegir trabajar con LSSVM en lugar de SVM es que las SVM abordan el
problema de clasificacin resolviendo un sistema de inecuaciones; mientras que las LSSVM
resuelven un sistema equivalente de ecuaciones pero en un tiempo, considerablemente, menor
comparado con el empleado por las SVM.
4.2.2 Mquina de soporte vectorial de mnimos cuadrados
(LSSVM) aplicados a imgenes de CP
Con el propsito de realizar la deteccin automtica de las espinas dendrticas de CP en
imgenes obtenidas por MLRD bajo igual condicin y luego preprocesadas con una tcnica
iterativa de deconvolucin (ver captulo III), se construy un clasificador LSSVM con kernel
gaussiano de base radial, utilizando un toolbox en MatLab (LS-SVMlab v1.7) [6]. Debido
a la capacidad de generalizacin que poseen las LSSVM y a fin de minimizar el
80
preprocesamiento de las imgenes de entrada, el clasificador solo utiliz, como atributo,
informacin de la densitometra (niveles de gris), de las espinas dendrticas de CP.
En el estudio se consideraron un total de 25 imgenes (512x512 y 8 bits de profundidad) de
CP, que se dividieron en dos grupos. El primer grupo se constituy por 15 imgenes,
denominado conjunto de entrenamiento, del cual se seleccionan los Marcadores y de una de
las imgenes se seleccionan los No Marcadores. Un segundo grupo de 10 imgenes,
denominado conjunto de validacin, se utiliz para realizar la identificacin de espinas
dendrticas, de las cuales la mquina no tiene una informacin exacta, solo que provienen de
la misma base de datos.
4.2.2.1 Seleccin de Marcadores
En este sentido, para detectar los marcadores, se utiliz un conjunto de vecindades
circulares de radio 10 pixeles, contentivos de los niveles de gris de las estructuras que
representan espinas dendrticas (Marcadores), esta vecindad permite incluir dentro del
circulo una espina dendrtica de CP (Figura 4-42). Los Marcadores fueron eliminados de
las imgenes (Figura 4-43) de CP, generando as nuevas imgenes donde no estn incluidos
los Marcadores, y una de estas nuevas imgenes ser utilizada en la seleccin de los No
Marcadores.
El nmero de Marcadores es de 825 vecindades que contienen las espinas dendrticas,
siendo el nmero total de espinas dendrticas que el experto estableci, de forma manual, en
las 15 imgenes de CP que son las imgenes que corresponden al grupo de entrenamiento.
81
Figura 4-42. Imagen de CP seleccin de Marcadores
4.2.2.2 Seleccin de No Marcadores
Para seleccionar los No Marcadores, se utiliz un conjunto de vecindades de igual
tamao que las vecindades de los Marcadores. La imagen que se utiliz en la seleccin de
los No Marcadores fue una de las que se generaron en la extraccin de los Marcadores, es
decir, los No Marcadores son vecindades del fondo de la imagen y todo aquello que no se
detecte como una espina dendrtica. Al desplazar una vecindad de radio 10 pixeles, sobre la
imagen, se obtiene un total de 242064 vecindades de No Marcadores en la imagen de CP.
Figura 4-43. Imagen de CP utilizada para la seleccin de No Marcadores
82
4.2.2.3 Entrenamiento de la LSSVM
Para el entrenamiento de las LSSVM, se cuenta con dos conjuntos de vecindades formados
por Marcadores (825 vecindades) y No Marcadores (242064 vecindades), ahora se debe
vectorizar las vecindades para lo cual se recorre el rea de la vecindad pixel a pixel y se
almacena en un vector, generando para cada vecindad un vector de 317 componentes.
Obtenindose para los Marcadores 825 vectores o patrones con 317 componentes cada uno y
para los No Marcadores se obtienen 242064 vectores o patrones con 317 componentes. Cada
uno de los vectores, tanto Marcadores como No marcadores, se deben normalizar para ser
procesados en la LSSVM, la normalizacin consiste en dividir cada vector por el valor de
profundidad del nivel de bits en la imagen, en este caso de dividi por 255 debido que las
imgenes tienen 8 bits de profundidad. A continuacin se define una relacin numrica de
proporcin entre Marcadores y No Marcadores, considerndose que entre ms grande sea la
proporcin mejores resultados se obtiene en la LSSVM pero el costo computacional es muy
elevado. En este estudio se consider una relacin de 1:15, esto quiere decir que por cada
Marcador se debe seleccionar 15 No Marcadores. Como se puede observar el conjunto de
vectores Marcadores se utilizan todos, pero en el caso de los No Marcadores se debe
seleccionar un grupo (825*15=12375) de 12375 vectores No Marcadores de un total de
242064 vectores No Marcadores. La seleccin de los No Marcadores, se realiz en forma
aleatoria, extrayendo cada vector No Marcador sin remplazo para as evitar que se repitieran
los vectores hasta obtener 12375 vectores. Seguidamente se asigna a los vectores Marcadores
la clase -1 y a los vectores No Marcadores la Clase +1 y se ordenan segn se muestra en la
Figura 4-44.
83
Figura 4-44. Muestra la organizacin de los patrones de entrenamiento de entrada de la LSSVM donde X es
una matriz de 13200x317 e Y es una matriz de tamao 13200x1
El proceso de entrenamiento de la LSVM tiene como objetivo construir una superficie de
decisin que permite la clasificacin de los patrones de entrada como lo son los Marcadores
y No Marcadores, utilizando un kernel gaussiano y los hiperparametros sigma y gamma que
son asignados de forma heurstica hasta lograr un entrenamiento adecuado que clasifica los
patrones. Donde sigma es la varianza del kernel gaussiano y gamma es un parmetro de
regularizacin. En este caso, un gamma pequeo minimiza la complejidad del modelo de lo
contrario aumenta la complejidad. En la estimacin de los valores ptimos de los
hiperparametros sigma y gamma de la LSSVM, se utiliza un mtodo heurstico, que consiste
en definir un conjunto de valores para gamma y sigma (Figura 4-45), donde cada valor de
gamma se combina con cada uno de los valores de sigma y se procesa en el test de
entrenamiento de la LSSVM. Para verificar la efectividad de la mquina, las salidas de los
Marcadores (-1) debe ser tal que su posiciones deben coincidir con las posiciones en la
imagen de entrenamiento, en donde se han seleccionado los marcadores. La forma visual que
se utiliza es imprimiendo sobre la imagen los resultados de la LSSVM, que deben coincidir
84
con los marcadores seleccionados manualmente. En caso de no coincidir, se debe seleccionar
un nuevo valor de gamma y combinarlo con los valores de sigma hasta lograr hacer coincidir
la seleccin de los marcadores en el test de entrenamiento con las etiquetas que produce la
mquina.
Figura 4-45. Estimacin de los valores ptimos de los hiperparmetros sigma y gamma
En el test de entrenamiento de la LSSVM se utiliz una instruccin de Matlab con sus
respectivos parmetros para entrenar la mquina
[W, ]= ({X,Y,` }) b trainlssvm classification`,gamma,sigma,`RBF_kernel`
donde X son datos
de entrada, Y las clases, classification es el procedimiento a aplicar a los patrones, gamma
es el valor de regularizacin, sigma es la varianza, 'RBF_kernel' permite procesar la data en
otro espacio, W vectores soporte, b umbral.
Despus del entrenamiento se realiza una simulacin colocando como datos de entrada los
mismos datos que se utilizaron en el entrenamiento en la instruccin de Matlab simlssvm que
permite realizar la simulacin.
Ytest= ({X,Y,` }) simlssvm classif ication`,gamma,sigma,`RBF_kernel`, `preprocess`, { ,b}, W X
luego se
85
verifican las posiciones de los ndices de las clases -1 en el vector Ytest, con respecto a la
posicin en el vector Y. Estas posiciones deben coincidir si la mquina opera con los
parmetros (gamma y sigma) correctos. En caso que no coincidan los vectores se deben variar
los parmetros sigma y gamma. Si al realizar el entrenamiento variando de forma heurstica
sigma y gamma no se logran hacer coincidir los ndices, se debe aplicar el procedimiento
denominado bootstrapping. Dicha procedimiento consiste en agregar la vecindad clasificada
errneamente a su respectiva clase y entrenar nuevamente la LSSVM.
4.2.2.4 Validacin de la LSSVM
Como se indic al inicio de la seccin 4.2.2 la data en estudio de imgenes de CP est
constituida por dos grupos uno de entrenamiento (15 imgenes de CP) y otro de validacin
(10 Imgenes de CP) en esta seccin se har uso del grupo de validacin. En la
implementacin de la validacin se emplea una instruccin de Matlab simlssvm. De acuerdo
con los datos de entrada, salida y los parmetros de la funcin de entrenamiento, se realiza la
validacin, la funcin usada es
Y s i m u = ( { X ,Y,` } ) s i m l s s v m c l a s s i f i c a t i o n ` , g a m m a , s i g m a ,` R B F _ k e r n e l ` , ` p r e p ro c e s s ` , { , b } , W VA L
donde
X son los patrones de entrenamiento, Y las clases, classification es el procedimiento a
aplicar a los patrones, gamma es el valor de regularizacin, sigma es la varianza, kernel
permite procesar la data en otro espacio, W vectores soporte, b umbral, preprocess indica
que los datos han sido normalizados y VAL que es la imagen de validacin vectorizada tal
como se explica a continuacin
Vectorizacin de la imagen: La vectorizacin de las imgenes de validacin de CP
implica realizar el siguiente procedimiento. Sobre la imagen se debe pasar una vecindad de
igual tamao como la utilizada en la etapa de entrenamiento de radio 10 pixeles, generando
un total de 242064 vecindades. Cada una de estas vecindades debe ser vectorizada
recorriendo la imagen pixel a pixel y almacenando cada pixel perteneciente a la vecindad
como una componente de un vector, es decir, cada vecindad genera un vector de 317
componentes. De igual modo, se almacenan las coordenadas del centro de cada vecindad en
un vector de dos componentes a objeto de establecer la ubicacin espacial de cada vector. Por
86
lo tanto, la VAL estar definida como una matriz de 242064x317, representando una imagen
vectorizada donde las filas sern identificadas por la mquina como un Marcador o un No
Marcador permitiendo la validacin de la LSSVM. Los resultados que genera la LSSVM es
un vector de 242064 x1 donde aquellas componentes igual a -1, se consideran Marcadores y
se podrn ubicar sobre la imagen original porque se tienen los valores de las coordenadas del
centro de cada vecindad tal como se muestra en la Figura 4-46.
Figura 4-46. Ubicacin de los marcadores sobre la imagen
4.2.2.5 Prueba de desempeo de la LSSVM en imgenes de CP
Para valorizar el desempeo del proceso de deteccin realizado por la LSSVM, se llev a
cabo la prueba de la estimacin de la sensibilidad. Cuando se analiza, en una imagen de CP, la
presencia de espinas dendrticas, se hace uso de una prueba de desempeo para determinar si
una imagen de CP presenta espinas dendrticas (positivos) o no la poseen (negativos), sin
87
embargo, es muy poco probable que la prueba funcione de manera perfecta en todas las
circunstancias, por ello existe la posibilidad de que en algunas imgenes de CP se detecten
estructuras que no son espinas dendrticas y se clasifiquen como positivo, ellas sern
consideradas como falsos positivos (FP), otra posibilidad es que algunas imgenes de CP
tengan espinas dendrticas y las mismas no sean detectadas como tales. En ese caso, se
denominan falsos negativos (FN) y por ltimo se tiene el caso en que se detecte la estructura
de una espina dendrtica de CP que es verdaderamente una espina dendrtica esto se define
como verdadero positivo (VP) . Para cuantificar el desempeo de la mquina se definen los
siguientes ndices:
Sensibilidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente espinas en cada imagen de
validacin que procese la LSSVM. La sensibilidad se calcula de acuerdo a la siguiente
ecuacin.
100 *
FN VP
VP
ad Sensibilid
+
(4.11)
Donde:
VP: Verdaderos positivos
FN: Falsos negativos
.4.2.3 Resultados
88
.4.2.3.1. Mquina de soporte vectorial de mnimos cuadrados aplicados
a imgenes sintticas
En la validacin de la tcnica de la LSSVM se utiliz un conjunto de imgenes sintticas
de 256x256 y 8 bits de profundidad. En el desarrollo de los ensayos con las imgenes
sintticas se sigui el diagrama de la Figura 4-47, en el diagrama se inicia con un conjunto de
imgenes que permiten construir un grupo de imgenes de entrenamiento y un grupo de
imgenes de validacin. Del grupo de imgenes de entrenamiento se seleccionarn los
Marcadores considerando una vecindad circular con 15 pixeles de radio. Adicionalmente
una de estas imgenes se utiliza para seleccionar los No Marcadores con una vecindad de
radio 15 pixeles. La cantidad de No Marcadores depende de la relacin de trabajo elegida
entre los Marcadores y los No Marcadores. Es decir, por cada Marcador se tendrn 30 No
Marcadores. Continuando con el diagrama mostrado en la Figura 4-47, se construyen los
vectores de atributos vectorizando las vecindades de los Marcadores y No Marcadores, esta
vectorizacin consiste en recorrer cada pixel de la imagen con la vecindad de 15 pixeles de
radio e irlos agregando como componentes en un vector. En este caso, las componentes de los
vectores estn definidas por la intensidad del gris de los elementos de la vecindad. Los
vectores de atributos sern los datos de entrada en la LSSVM, conjuntamente, con el valor de
las etiquetas -1 o +1 segn sea un Marcador (-1) o No Marcador (+1) y unos hiperparmetros
denominados sigma y gamma, tal como se explic anteriormente. Seguidamente se realiza el
proceso de test de entrenamiento o prueba, utilizando imgenes del grupo de entrenamiento,
de esta manera se puede determinar si existen falsos positivos o negativos. En caso de existir
falsos positivos o falsos negativos se deben variar los hiperparmetros para realizar un nuevo
entrenamiento de las LSSVM. Por ltimo, se realiza el test de validacin que consiste en
presentar una imagen vectorizada, a la entrada de la mquina para que realice la clasificacin
y detectar marcadores en el caso de las imgenes sintticas serian los signos (- +).
89
Figura 4-47. Diagrama del algoritmo de las LSSVM
90
4.2.3.1.1 Primer Ensayo
Se defini un conjunto de 9 imgenes sintticas, que contienen distribuido la simbologa
del signo (- + definidos como los Marcadores y los signos incompletos conjuntamente con
el fondo se definen como los No Marcadores). El ensayo tiene como objetivo clasificar
aquello que sea un signo (+ -) que serian los Marcadores de aquello que no es un signo
definindose como un No Marcadores. Del conjunto de imgenes sintticas, se seleccionaron
cinco imgenes para el entrenamiento y el resto de imgenes se asignaron para la validacin.
Entrenamiento: se seleccionaron los marcadores con una vecindad circular (Figura 4-48.b)
de radio 15 pixeles y luego de extrados de la imagen, los espacios es rellenaron con un nivel
de gris (Figura 4-49), estas imgenes, posteriormente, se utilizarn para extraer los No
Marcadores de una de ellas, con una vecindad circular de radio 15 pixeles, para obtener un
total de 51076 vecindades. Para hacer la vectorizacin de los Marcadores como los No
Marcadores se recorre cada vecindad de radio 15 pixeles, y se coloca cada elemento de la
vecindad como una componente de un vector generando un vector de 709 componentes.
Figura 4-48. Imagen sinttica de entrenamiento 256x256 pixeles y 8 bit de profundidad (a) imagen con los
marcadores (b) se seleccionan los marcadores
91
Figura 4-49. Imagen sinttica sin marcadores utilizada para extraer los No Marcadores
En el entrenamiento de la LSSVM se utiliz una relacin de 1:30, los No Marcadores se
seleccionaron en forma aleatoria, sin reemplazo.
Este tipo de entrenamiento es supervisado por lo cual se tienen dos clases: clase -1 se
asigna a los patrones correspondientes a los Marcadores y la clase +1 a los No Marcadores.
Adems, se utilizaron como valores de los hiperparmetros (gamma = 5 y sigma=0,01)
seleccionados heursticamente como aquellos que permiten optimizar la capacidad de
reconocimiento.
Validacin: Luego de entrenar las LSSVM, se realiza un test de validacin, para lo cual,
se introducen imgenes del grupo de validacin para realizar la clasificacin, como se puede
observar en la Figura 4-50, estas imgenes tienen que ser vectorizadas para introducir a la
mquina, para ello se utiliza una vecindad de igual tamao que la utilizada en los Marcadores
y No Marcadores que es desplazada sobre toda la imagen. Luego estas vecindades son
vectorizadas. Al realizar el test se observa qua la LSSVM, clasific correctamente los signos
que se utilizaron como Marcadores.
92
Figura 4-50. Imgenes sintticas de validacin del clasificador LSSVM, (a) se encontraron 10 marcadores
(b) se encontraron 14 marcadores
4.2.3.1.2 Segundo Ensayo
Se construy un conjunto de 10 imgenes sintticas que contienen letras distribuidas,
aleatoriamente, y a cada imagen se les agreg ruido gaussiano (sigma=0,04). Los Marcadores
se definen por las primeras cuatro letras (A, B, C, D) y el resto de las letras conjuntamente
con el fondo se consideraron como No Marcadores. Del conjunto de las 10 imgenes se realiz
una seleccin segn su posicin, par para el grupo de entrenamiento e impar grupo de
validacin.
Entrenamiento: se seleccionan los Marcadores (A, B, C, D) en las diferentes posiciones de
las 5 imgenes y de una de ellas se seleccionan los No Marcadores, para as, realizar el
entrenamiento de la mquina hasta encontrar los valores ptimos de los hiperparmetros de la
LSSVM .
Validacin: Son imgenes utilizadas para el test de validacin de la LSSVM, dicha
validacin consiste en encontrar los Marcadores en imgenes que provienen de la misma base
de datos y que no se han usado en el entrenamiento de la LSSVM.
93
a b
Figura 4-51 (a) Imagen de entrenamiento ( b) Imagen de validacin
Tabla 4-1. Resultados aplicando la LSSVM a las imgenes de Entrenamiento
Imagen Marcadores Marcadores
LSSVM
1 9 9
3 8 8
5 7 7
7 7 7
9 8 8
Tabla 4-2. Resultados aplicando la LSSVM a las imgenes de validacin
Imagen Marcadores Marcadores
LSSVM
2 8 6
4 11 11
6 8 8
8 6 6
10 3 3
Se puede observar, segn los resultados obtenidos en las Tabla 4-1 y Tabla 4-2, que la
LSSVM reconoci los marcadores tanto en el grupo de imgenes de entrenamiento como en
el grupo de validacin.
94
4.2.3.1.3 Tercer Ensayo
Consiste en generar una imagen asignndole niveles de grises diferentes al fondo de la
imagen (FI=128), elementos Marcadores (A=150, C=190, G=90, I=50, K=10) y elementos No
Marcadores (J=30, H=70, F=110, B=170, D=210) (ver Figura 4-52) para generar la imagen
sinttica que se muestra en la Figura 4-53.
Figura 4-52. Representacin del nivel de gris utilizado en los Marcadores, No Marcadores y fondo de la imagen
95
Figura 4-53. (a) Imagen sinttica sin ruido (b) una de las imgenes sinttica con ruido (SNR=37,63 dB), utilizadas
en la prueba de desempeo de la LSSVM
Se tomo la Figura 4-53a, y se generaron 25 imgenes agregndole ruido de tipo gaussiano
(Figura 4-53b) con varianza igual a 0,0001 (SNR =37,63dB) e incrementndola para cada
nueva imagen en 0,0001, y se aplica en la imagen original, luego se definieron dos grupos uno
de entrenamiento y otro de validacin. Del conjunto de las 25 imgenes se realiz una
seleccin segn su posicin, par para el grupo de entrenamiento e impar grupo de
validacin.
Entrenamiento: el grupo est formado por 13 imgenes que se generaron y son utilizadas
para seleccionar los Marcadores de igual manera se emple una de ellas para seleccionar los
No Marcadores. En la Figura 4-55a se muestra una imagen que pertenece al grupo de
entrenamiento y se utiliz para realizar el test de entrenamiento de la LSSVM y se observ
que la mquina seleccion solo los Marcadores.
Validacin: las 12 imgenes restantes se utilizan para la deteccin de los Marcadores
realizando el test de validacin de la LSSVM, en la Figura 4-55b se observa que la mquina
selecciona tanto Marcadores como No Marcadores en esta imagen se tiene una relacin seal
ruido alta (SNR=49,76 dB) observndose en la imagen que la LSSVM selecciona tanto
Marcadores como No Marcadores, tambin se utiliz otra imagen la cual contienen una
relacin seal ruido ms bajo (SNR=23,74 dB) y se observa en la imagen que la mquina
96
selecciona tanto Marcadores como No Marcadores. Los resultados obtenidos en las imgenes
nos conducen a realizar una prueba de desempeo.
Figura 4-54. (a) Imagen sin ruido, la LSSVM seleccion los Marcadores en el test de entrenamiento (b) Imagen
con ruido donde la LSSVM seleccion los Marcadores, test de validacin (imagen1, SNR=49,76 dB)
Figura 4-55. (a) Imagen sin ruido, la LSSVM seleccion los Marcadores en el test de entrenamiento (b) Imagen
con ruido donde la LSSVM seleccion los Marcadores, test de validacin (imagen8, SNR=23,74 dB)
Prueba de desempeo: consiste en determinar la capacidad de la LSVM para clasificar
correctamente los elementos en el test de validacin, con las imgenes sintticas ubicando los
elementos en el grupo Marcadores o No Marcadores. Se trata de determinar cmo se ajustan a
97
la realidad los resultados de clasificacin en la imagen sinttica obtenidos, con la prueba, es
preciso conocer esa realidad mediante algn mtodo alternativo y completamente fiable, lo
que en ocasiones con imgenes de casos reales como las de CP no es posible. Antes de aplicar
la prueba de desempeo se definirn algunas variables tales como:
Verdadero positivo (VP): el Marcador est en la imagen y se selecciona como
Marcador.
Falso Positivo (FP): los No Marcadores son seleccionados como Marcadores.
Verdaderos negativos (VN): Los No Marcadores son seleccionados como No
Marcadores.
Falso negativo (FN): los Marcadores son seleccionados como No Marcadores
Estas variables se visualizan mediante la Tabla 4-3, permitiendo hacer la identificacin del
elemento seleccionado en la imagen sinttica por la LSSVM de forma ms sencilla.
Tabla 4-3. Prueba de desempeo
Marcadores No Marcadores
Positivo (Marcador) VP FP
Negativo (No Marcador) FN VN
Sensibilidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un Marcador en una
imagen.
100 *
FN VP
VP
ad Sensibilid
+

(4.13)
Especificidad: Es la probabilidad de clasificar correctamente a un marcador, es
decir, la probabilidad de clasificar un Marcador como un No marcador.
*100
+
VN
Especificidad
VN FP

(4.14)
98
Relacin seal ruido: es la diferencia en dB entre el nivel de gris en la imagen que se
seleccion del grupo de validacin ( I ) y la imagen con ruido (
I
). La relacin seal ruido se

calcula con la siguiente ecuacin.

,
_

M
i
M
j
M
i
M
j
I I
I
SNR
1 1
2
1 1
2
) (
) (
log 20

(4.15)
Curva ROC (Receiver Operating Characteristic, o Caracterstica Operativa del Receptor):
Recorriendo todo el rango de valores posibles de los puntos de corte (puntos de la prueba de
desempeo) se obtendr una serie de pares Sensibilidad y Especificidad, que definirn cada
prueba desempeo, definindose como el punto ptimo de desempeo como el que tiene el
mejor par Sensibilidad, Especificidad. La representacin grfica de todos estos puntos define
la curva ROC y se utiliza el par Sensibilidad (1-Especificidad) para su representacin
grfica. La lnea de puntos expresa la capacidad nula de discriminacin. Cuanto ms se
acerque la curva al extremo superior izquierdo de la cuadrcula la prueba de desempeo tendr
ms capacidad de discriminacin. La curva ROC es la representacin grafica de la
discriminacin (Figura 4-56). Se entiende como el rea bajo la curva ROC y se calcula
utilizando mtodos numricos, en este caso se utilizo la regla del trapecio. El rea indica la
probabilidad de clasificar correctamente un par de individuos positivo y negativo
seleccionados al azar. Los valores del rea bajo la curva ROC van entre 0.5 y el mximo que
es 1. Se suele aceptar como valor aceptable de discriminacin cuando supera el 0.7.
99
Figura 4-56 Curva ROC
4.2.3.1.3.1 Resultado de la prueba de desempeo
. A continuacin se presentan los resultados de la prueba de desempeo obtenidos con las
imgenes sintticas, los cuales son mostrados en la Tabla 4-4, acompaadas de la graficas y
un breve anlisis de estas.
La relacin seal ruido (SNR) se muestra en la Figura 4-57, observndose en la curva, que a
medida que se varia en la imagen el nivel de ruido, la SNR disminuye, por lo tanto esto
implica que las imgenes se van haciendo muy diferentes con respecto a la imagen original, es
decir, el margen que hay entre la potencia de la imagen original y la potencia del ruido en la
imagen la va corrompiendo hacindolas muy diferentes.
En la Figura 4-58, se puede observar la evolucin de la sensibilidad respecto a SNR y se
aprecia en la curva variaciones bruscas debido a que la informacin que se manipula es
reducida y discreta. A medida que la SNR aumente se puede inferir que la sensibilidad tambin
aumenta indicando que las imgenes a medida que tienen menor ruido o mayor SNR la
SVM detecta mayor cantidad de marcadores.
Pero en la Figura 4-59, se mide la especificidad, se observan en la curva cambios bruscos
que va en aumentado a medida que crece SNR, esto indica que a medida que la mquina
contine seleccionando marcadores en nuevas imgenes va a tender a equivocarse,
seleccionando no marcadores como marcadores.
100
La curva ROC en la Figura 4-60, indica que el mejor par Sensibilidad-Especificidad tiene
una probabilidad de 0,71 de poder diferenciar un Marcador de un No Marcador.
Tabla 4-4. Resultados de la prueba de desempeo en las imgenes sintticas
.
.
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
R e l a c i o n S e a l R u i d o (S N R )
V a r i a n z a
S
N
R

(
d
B
)
Figura 4-57. Relacin seal ruido
101
Imagen
No
Patrones
detectados
VP FP V N F N SNR
Sensibilidad Especificidad
(M->M) (NM->M) (NM->NM) (M->NM)
1
51 10 41 16 0 49,76 1,00 0,28
2 52 10 42 15
0 37,63 1,00 0,26
3 51 9 42 15
1 32,72 0,90 0,26
4 50 9 41 16
1 29,78 0,90 0,28
5 42 7 35 22
3 27,89 0,70 0,39
6 39 7 32 25
3 26,26 0,70 0,44
7 22 4 18 39
6 24,84 0,40 0,68
8 11 3 8 49
7 23,78 0,30 0,86
9 5 1 4 53
9 22,78 0,10 0,93
10 3 0 3 54
10 21,96 0,00 0,95
11 2 0 2 55
10 21,16 0,00 0,96
12 1 0 1 56
10 20,42 0,00 0,98
.
Figura 4-58. Grfica de Sensibilidad vs SNR (dB)
.
Figura 4-59. Grfica de Especificidad vs SNR (dB)
102
Figura 4-60. Grafica de ROC, con rea bajo la curva de 0,71
4.2.3.2 Mquina de soporte vectorial de mnimos cuadrados aplicados a
imgenes de CP
En el Centro de Microscopa Electrnica Ernesto Palacios Pru, se sigue un
procedimiento manual subjetivo en el que se invierte mucho tiempo para realizar el conteo de
espinas dendrticas de CP. En la identificacin de espinas dendrticas en imgenes de CP el
investigador debe tener experticia para identificar las espinas dendrticas, debido que estn
presentes en la imagen con diferente densitometra o nivel de grises. El conteo de espinas
dendrticas permite estudiar los efectos de sustancias nocivas en los individuos, midiendo el
grado en que se afecta la estructura del rbol dendrtico y a su vez el nmero de espinas
dendrticas. Para mejorar el conteo de espinas de CP, se implement una herramienta
automtica la cual permitir mejorar el tiempo de conteo, el cual fue utilizado previamente en
un conjunto de imgenes sintticas. Despus de haber explicado el procedimiento de
clasificacin utilizando las LSSVM en imgenes sintticas, se aplic la tcnica de
clasificacin a 25 imgenes de CP, dividindolas en dos grupos, 15 de entrenamiento y 10 de
validacin.
103
Se les pidi a expertos que identificara las espinas en el grupo de imgenes de CP de
entrenamiento y validacin. Las espinas identificadas en el grupo de entrenamiento son las
espinas que sern seleccionadas como Marcadores y las espinas identificadas en el grupo de
validacin permitir contrastar los resultados de la LSSVM con los del experto.
Se debe hacer notar que la identificacin de espinas dendrticas por parte de los expertos es
un proceso subjetivo y por lo tanto el resultado vara, debido a la experticia de cada persona
para realizar la identificacin de espinas dendrticas en CP. Por lo general se considera el
promedio del conteo de espinas realizado por diferentes expertos. En la presente investigacin,
como el objetivo es mostrar las potencialidades del uso de mquinas de soporte vectorial en la
identificacin de espinas, se consideraron las imgenes con las espinas dendrticas marcadas
por un experto (Experto 2 indicado en la Tabla 4-5 y Tabla 4-6, que se muestran a
continuacin en la seccin 1), tanto para el grupo de entrenamiento y el de validacin.
Entrenamiento: En las imgenes se seleccionaron los Marcadores y No Marcadores
utilizando una vecindad con un radio de 10 pxeles, generando vectores de 317 componentes
y los valores de hiperparmetros sigma igual a 0,7 y gamma igual a 9, obtenidos de forma
heurstica tal como se explico en la seccin 4.2.2. Los resultados que se obtienen al realizar
el test de la etapa de entrenamiento son mostrados en la Figura 4-22b y Figura 4-23b. La
Figura 4-22 y Figura 4-23 muestra las imgenes 13, 14, 15 y 16 de CP del grupo de
entrenamiento, donde las espinas dendrticas de CP fueron sealadas por un experto (Figura
4-22a y Figura 4-23a). Las espinas seleccionadas por el experto son consideradas como
Marcadores e introducidas a la LSSVM para entrenarla e inmediatamente se realiza un test de
entrenamiento que permitir cotejar la posicin de las espinas en las imgenes de CP. Los
resultados de tal test son mostrados en la Figura 4-22b y Figura 4-23b. Se puede observar que
la mquina puede identificar 49, 59, 47 y 48 espinas de las 45, 58, 32 y 30 marcadas por el
experto. Tales resultados confirman la potencialidad de las mquinas de soporte vectorial para
realizar la identificacin automtica de las espinas dendrticas en CP.
Validacin: Despus de obtener resultados satisfactorios en el test de entrenamiento de la
LSSVM, se utilizaron imgenes de CP del grupo de validacin para realizar el conteo
104
automtico de espinas dendrticas utilizando la LSSVM. Dicha validacin permite demostrar
la efectividad de tal tcnica para realizar el conteo automtico de espinas dendrticas en CP.
En la Figura 4-63 y Figura 4-64, se muestra el conteo manual realizado por un experto (Figura
4-63a. y Figura 4-64a) y el resultado del test de validacin con la LSSVM (Figura 4-63b y
Figura 4-64b) en imgenes de CP del grupo de validacin, permitiendo estos resultados cotejar
resultados del conteo manual con el conteo automtico. En dicha imagen se observa que la
mquina de soporte vectorial detecta un nmero ms grande de espinas dendrticas que las
marcadas por los expertos. Sin embargo es importante recordar que el conteo es un proceso
subjetivo.
105
Figura 4-61. Imgenes de CP de entrenamiento (a) Conteo manual (b) Conteo automtico
.
106
.
.
.
Figura 4-62. Imgenes de CP de entrenamiento (a) Conteo manual (b) Conteo automtico
.
.
.
107
.
.
Figura 4-63. Imgenes de CP de validacin (a) Conteo manual (b) Conteo automtico
108
Figura 4-64. Imgenes de CP de validacin (a) Conteo manual (b) Conteo automtico
4.2.3.2.1 Anlisis de resultados de la LSSVM aplicados a imgenes de CP
Despus de aplicar las LSSVM, a imgenes de CP, del grupo de entrenamiento y
validacin se obtuvieron los resultados del conteo automtico. Para poder realizar un anlisis
de los resultados del conteo automtico, tres expertos realizaron, de manera independiente, un
conteo manual de espinas dendrticas en cada una de las imgenes de CP. Los resultados
obtenidos por ellos, para las imgenes de entrenamiento se presentan en la btener un
109
acotamiento superior y as poder cotejar adecuadamente con los valores obtenidos de forma
automtica.; mientras que los obtenidos para la imgenes de validacin aparecen en la Tabla
4-6.
En el estudio no se utilizaron formas diferentes de combinacin entre los expertos para
crear grupos de resultados promedios, solo se consider los expertos que tenan valores muy
parecidos donde no existieran gran variacin entre los datos para tener un acotamiento inferior
y un grupo donde se consideraran el promedio de todos los expertos, para obtener un
acotamiento superior y as poder cotejar adecuadamente con los valores obtenidos de forma
automtica.
Tabla 4-5. Imgenes de CP, para el entrenamiento de la LSVM
Imagen
N
Experto
1
Experto
2
Experto
3
Promedio
(Exp1,
Exp2)
Promedio
(Exp1,
Exp2,
Exp3) Automtico
Error1
(Exp1,
Exp2)
Error2
(Exp1,
Exp2,
Exp3)
11 45,00 50,00 124,00
47,50 73,00
56,00
8,50 17,00
12 42,00 48,00 98,00 45,00 62,67 60,00 15,00 2,67
13 40,00 50,00 112,00 45,00 67,33 49,00 4,00 18,33
14 62,00 55,00 157,00 58,50 91,33 61,00 2,50 30,33
15 35,00 30,00 117,00 32,50 60,67 47,00 14,50 13,67
16 33,00 27,00 88,00 30,00 49,33 48,00 18,00 1,33
17 36,00 40,00 83,00 38,00 53,00 47,00 9,00 6,00
18 20,00 25,00 67,00 22,50 37,33 42,00 19,50 4,67
19 19,00 20,00 65,00 19,50 34,67 40,00 20,50 5,33
20 21,00 26,00 100,00 23,50 49,00 37,00 13,50 12,00
21 24,00 20,00 95,00 22,00 46,33 38,00 16,00 8,33
22 24,00 22,00 70,00 23,00 38,67 34,00 11,00 4,67
23 20,00 18,00 108,00 19,00 48,67 25,00 6,00 23,67
24 29,00 31,00 97,00 30,00 52,33 28,00 2,00 24,33
25 18,00 23,00 62,00
20,50 34,33
21,00
0,50 13,33
Promedio 10,70 12,38
Desv Est 6,64 8,84
Min 0,50 1,33
Max 20,50 30,33
110
En los resultados obtenidos en el test de entrenamiento (btener un acotamiento superior y
as poder cotejar adecuadamente con los valores obtenidos de forma automtica.) los valores
del conteo manual por el Experto2 y el conteo automtico de las espinas dendrticas de CP
con las maquinas, no coinciden exactamente, ello podra ser debido a un conjunto de factores,
tales como: la mquina trabaja con niveles de gris y las espinas dendrtica tienen niveles de
gris parecidos a los no marcadores, permitiendo que la LSSVM los clasifique errneamente o
bien podra ser que se trate de espinas dendrticas que no fueron identificadas por el experto
debido a que el conteo del experto es subjetivo y est sujeto a errores.
Como continuacin del anlisis de la tabla en estudio se calcul el promedio entre las
columnas Experto1 y Experto2, dando como resultado la columna Promedio (Exp1, Exp2) .
En este caso se observa que los resultados no coinciden y son ms dispersos unos de otros,
con respecto a la comparacin con el conteo Automtico y Experto1.
Igual mente, se calcul el promedio entre los Experto1, Experto2 y Experto3, dando como
resultado la columna Promedio (Exp1, Exp2, Exp3), donde se observa que los resultados del
conteo automtico son mejores que los obtenidos mediante las comparaciones anteriores.
Para verificar cual de los resultados promedios presentan mejor resultado, se calcul el
error, es decir, Error1 (Exp1, Exp2), es la diferencia en valor absoluto de las columnas
Promedio (Exp1, Exp2) y Automtico, y el Error2 (Exp1, Exp2, Exp3) que es la diferencia en
valor absoluto de las columnas Promedio (Exp1, Exp2, Exp3) y Automtico. Para medir cual
de los resultados entre las columnas de errores es mejor, se utilizan los parmetros
estadsticos correspondientes al promedio, la desviacin estndar y el valor mnimo y mximo.
Analizando los resultados estadsticos en la Tabla 4-5 que pertenece al grupo de
entrenamiento, se tiene que el Error1 (Exp1, Exp2) es mejor que el Error2 (Exp1, Exp2,
Exp3), debido a que tiene un promedio de error menor 10,70 y desviacin estndar 6,64, con
un rango de variacin del error de 0,5 a 20,50.
111
Tabla 4-6. Imgenes de CP, para la validacin de la LSVM
Imagen
N
Experto
1
Experto
2
Experto
3
Promedio
(Exp1,
Exp2)
Promedio
(Exp1, Exp2,
Exp3)
Automtico
error
(Exp1,
Exp2)
error
(Exp1,
Exp2,
Exp3)
1 20,00 25,00 35,00 22,50 26,67 20,00 2,50 6,67
2 27,00 30,00 44,00 28,50 33,67 22,00 6,50 11,67
3 30,00 39,00 83,00 34,50 50,67 26,00 8,50 24,67
4 43,00 50,00 93,00 46,50 62,00 27,00 19,50 35,00
5 39,00 30,00 117,00 34,50 62,00 70,00 35,50 8,00
6 34,00 35,00 133,00 34,50 67,33 65,00 30,50 2,33
7 39,00 57,00 102,00 48,00 66,00 70,00 22,00 4,00
8 43,00 50,00 121,00 46,50 71,33 98,00 51,50 26,67
9 31,00 35,00 116,00 33,00 60,67 70,00 37,00 9,33
10 51,00 45,00 124,00 48,00 73,33 98,00 50,00 24,67
Promedio 26,35 15,30
Desv Est 17,49 11,38
Min 2,50 2,33
Max 51,50 35,00
Adems, en la Tabla 4-6 del test de validacin se puede observar que no coinciden el
nmero de espinas obtenidas por conteo manual y el conteo automtico. Como se indic,
anteriormente, la mquina tiene una etapa de entrenamiento que consiste en darle una
configuracin que no debe ser cambiada en los test de validacin dndose las mismas
caractersticas indicadas en el entrenamiento.
Analizando los resultados estadsticos en la Tabla 4-5 que pertenece al grupo de validacin,
se tiene que el Error2 (Exp1, Exp2, Exp3) es mejor que el Error1 (Exp1, Exp2) , debido a que
tiene un promedio de error menor 15,30 y desviacin estndar 11,38, con un rango de
variacin del error de 2,33 a 35,00.
De lo anterior se puede intuir que la mquina presenta una estimacin del nmero de
espinas dendrticas de la CP, as como lo realizara un experto pero con una mejor precisin
ya que su rendimiento en la bsqueda depende solo del entrenamiento para conseguir los
hiperparametros ptimos y no estara sujeta a las limitaciones subjetiva humanas como en el
caso del expertos en la bsqueda de los marcadores.
Inmediatamente se realiz una prueba de diagnostico, que consiste en comparar en
nmero y posicin las espinas dendrticas en imgenes de CP del conteo manual y conteo
112
automtico en los grupos entrenamiento (Tabla 4-7) y validacin (Tabla 4-8). La prueba
consisti en cotejar el conteo manual y automtico para encontrar las espinas dendrticas que
coincidan segn su posicin. Adicionalmente, se cuenta el nmero de espinas dendrticas que
no coinciden segn su posicin en imgenes de CP. Las variables utilizadas fueron las
siguientes:
VP: verdaderos positivos esto indica el nmero de espinas dendrticas que coincidieron en
nmero y posicin espacial en las imgenes del conteo manual versus automtico.
FN: falsos negativos son el nmero de espinas dendrticas en el conteo manual que no
coincidieron espacialmente en las imgenes del conteo automtico.
Calculando el promedio en la sensibilidad en el grupo de entrenamiento, se puede afirmar
que la capacidad de la LSSVM para detectar espinas dendrticas a medida que se utilicen
nuevas imgenes, tiene una probabilidad del 72% de detectarlas en cada imagen segn el test
de sensibilidad.
Tabla 4-7. Resultados de la prueba de diagnstico en las imgenes de CP del grupo de entrenamiento
113
Imagen
N
Coincidieron VP Conteo manual
No coincidieron FN
Sensibilidad
(Segn la frmula de
la ecuacin 4-11)
1 24 21 0,53
2 33 9 0,79
3 23 17 0,58
4 41 21 0,66
5 29 6 0,83
6 23 10 0,70
7 25 11 0,69
8 16 4 0,80
9 16 3 0,84
10 16 4 0,80
11 18 6 0,75
12 15 9 0,63
13 13 7 0,65
14 22 7 0,76
15 14 4 0,78
Probabilidad 72%
Tabla 4-8. Resultados de la prueba de diagnstico en las imgenes de CP del grupo de validacin
Imagen
N
Coincidieron VP Conteo manual No
coincidieron FN
Sensibilidad
(Segn la frmula de
la ecuacin 4-11)
1 10 10 0,50
2 16 11 0,59
3 24 6 0,80
4 25 18 0,58
5 27 12 0,69
6 23 11 0,68
7 31 8 0,79
8 35 8 0,81
9 27 4 0,87
10 41 10 0,80
Promedio 79%
Calculando un promedio en la sensibilidad en el grupo de validacin (Tabla 4-8), se puede
afirmar que la capacidad de la LSSVM para detectar espinas dendrticas a medida que se
utilizan nuevas imgenes, tiene una probabilidad del 79% de detectarlas en cada imagen
segn el test de sensibilidad.
Para poder discernir si las probabilidades conseguidas en la sensibilidad son buenas o
malas, se compararon las sensibilidades del grupo de validacin contra la del grupo de
entrenamiento, donde se observa, que la sensibilidad en el grupo de validacin est por
encima de la sensibilidad del grupo de entrenamiento, esto podra ser un ndice para
cuestionar los resultados ya que la maquina se entrena con el grupo de entrenamiento y la data
del grupo de validacin es desconocida. Se selecciona el indicador de esta manera, ya que no
tenemos casos de datas de CP con algn otro sistema de clasificacin automtico.
4.2.3.2.2 Discusin acerca de los resultados de la LSSVM aplicados a
imgenes de CP
En el Centro de Microscopa Electrnica Ernesto Palacios Pru, se sigue un
procedimiento manual subjetivo en el que se invierte mucho tiempo para realizar el conteo de
espinas dendrticas de CP. En la identificacin de espinas dendrticas en una imagen de CP el
investigador debe tener experticia para identificar las espinas dendrticas, debido que estn
114
presentes en la imagen con diferente densitometra o nivel de grises, se citarn artculos
desarrollados en el Centro de Microscopa electrnica Ernesto Palacios Pru, donde se
realiza el conteo de espinas dendrticas, por ende vesculas sinpticas ya que estas se
concentran en las espinas dendrticas.
Palacios-Pru y otros [6] indican que largos periodos de ejercicios produce severos cambios
morfolgicos en las uniones neuromusculares de los telesteos, los cambios consisten en la
disminucin progresiva de las vesculas sinpticas y ramificaciones laminares del las
terminaciones nerviosas. Se mantuvieron los peces nadando durante 1 hora, en contra de la
corriente de agua a un flujo de 3,5 lts/min se observa que el numero de vesculas se reduce en
un 70% despus de 10 minutos de ejercicio. Esta observacin indica que la formacin de las
vesculas no puede restaurarse a su nmero original y por lo tanto, bajo tales circunstancias, el
lanzamiento del transmisor puede ocurrir por un diverso mecanismo.
Para realizar el conteo de las espinas dendrticas, se utiliza una lamina de plstico trasparente
(acetatos) que contiene cuadriculas de dimensin 1x1 cm, esta lmina se sobrepone a la
imagen para sectorizar la fotografa de CP, con un lpiz se van seleccionando las espinas
dendrticas segn la experticia del investigador. Cuando en algunas imgenes el conteo de
espinas es realizado por ms de un investigador independiente con respecto a la misma imagen
de CP, los resultados obtenidos corresponden al promedio de los conteos realizados por los
expertos. Inmediatamente al realizar el conteo de espinas dendrticas, es necesario encontrar
una relacin de rea en la imagen de CP con respecto al nmero de espinas cuantificado en la
imagen de CP. En el clculo del rea es necesario un factor de escala de aumento de las
imgenes, este es obtenido en la calibracin del microscopio con una lmina graduada que
contiene una cierta cantidad de lneas separadas una de otra a una distancia dada en micras, la
imagen del factor de escala se imprime en papel para tomar de la imagen la medida
correspondiente en centmetros, la cual tiene su equivalente en micras con respecto a la
medida real (5 cm en la imagen de calibraciones es equivalente a 2 micras en la escala real de
calibracin). Con esta informacin se puede medir el rea de la imagen de CP y as encontrar
la relacin de las espinas dendrticas por rea. En este trabajo como el objetivo es evaluar el
funcionamiento de las mquinas de soporte vectorial en el conteo de espinas dendrticas y
115
adicionalmente trabajar con regiones de inters con un tamao pre-establecido nico, se est
ignorando dicho factor.
El conteo de espinas dendrticas permite estudiar los efectos de sustancias nocivas en los
individuos, midiendo el grado en que se afecta la estructura del rbol dendrtico y a su vez el
nmero de espinas dendrticas. Los estudios en el laboratorio son realizados con ratones en sus
diferentes etapas de desarrollo, tales como, prenatales, postnatal y adulto. Se estudian ratones
debido a que su estructura cerebral es muy parecida a la estructura del cerebro en el hombre.
Algunos autores escriben cmo realizar medidas en las estructuras nerviosas de imgenes
adquiridas por microscopa, entre ellos se tiene a Palay y otros [6]. El nmero de clulas
granulosas es grande y esta empaquetadas mostrndose como densidades en la corteza
cerebelosa de los vertebrados, estimando en el cerebelo humano una densidad de 3 a
6
7*10
celulares granulosas por
3
mm , con una relacin de una clulas granulosa con 1600 de CP.
Dichos autores, realizan la representacin de histogramas donde muestran la distribucin,
medida en intervalos de varices sinpticas de fibras paralelas. Tambin muestran
distribuciones grandes y pequeas varicosidades en las fibras paralelas, que se ubican de
acuerdo a su posicin en la capa molecular y su relacin con el rea.
4.2.3.2 Conclusiones
El conteo de espinas dendrticas en imgenes de CP, utilizando modelos de aprendizaje,
como las LSSVM constituye un enfoque de muy reciente aplicacin. Los resultados obtenidos
sugieren que la tcnica estudiada podra ser una importante herramienta de clasificacin para
este tipo de imgenes adquiridas por microscopa. En cuanto a los resultados, la LSSVM
pudo detectar mayor cantidad de espinas que las identificadas por el experto que realiz el
conteo manualmente, tanto para las imgenes de entrenamiento como para las imgenes de
validacin. Segn expertos la mayor cantidad de espinas dendrticas detectadas en el conteo
automtico por la LSSVM son espinas dendrticas de la CP.
Las tcnicas de clasificacin propuestas resultan tiles para clasificar adecuadamente las
espinas en CP, lo cual contribuye a mejorar el procedimiento de clasificacin de espinas
116
dendrticas que, normalmente, se realiza de forma manual en el referido Centro de
Microscopa Electrnica.
La clasificacin de las espinas dendrticas utilizando las LSSVM, se constituye en una
herramienta muy importante en estudios de clasificacin de espinas dendrticas, pero el tiempo
computacional para un ciclo en el test de entrenamiento para encontrar los hiperparmetros
ptimos es demasiado elevado, lo mismo pasa con el tiempo computacional en el test de
validacin y vectorizacin de las imgenes, esto indica que se debe seguir trabajando para
optimizar dichos tiempos operativos en el computador utilizando una mejor parametrizacin
de los Marcadores, No Marcadores y vectorizacin de las imgenes.
117
5. Conclusiones generales
Las neuronas de los diferentes centros de integracin del sistema nervioso central se
caracterizan por presentar una morfologa determinada, conocida como fenotpia, la cual
depende de la funcin que debe cumplir la neurona y permite distinguir un tipo de neurona de
otra. El objetivo de este trabajo fue proponer un esquema de procesamiento de imgenes
neurales, que permiti realzar, restaurar y cuantificar imgenes de microscopa de clulas
neurales, en este caso las clulas de Purkinje de la corteza cerebelosa de ratn. En este
estudio se utilizaron diversas tcnicas de procesamiento de imgenes, tales como: tcnicas de
restauracin y un sistema de reconocimiento de patrones. Como resultado de la aplicacin
sistemtica de tales tcnicas, se logr realzar la imagen, facilitando as el anlisis en forma
ms rpida, exhaustiva y precisa, en comparacin con el simple conteo manual de este tipo de
imgenes.
En el procesamiento de imgenes de clulas de Purkinje, inicialmente, se les realiz un
realce, con tcnicas bsicas de procesamiento digital de imgenes, tales como las operaciones
de procesamiento pxel a pxel y filtrado espacial o por vecindades. Es importante sealar que
dichas tcnicas no generaron cambios relevantes en las imgenes de clulas de Purkinje.
Debido a que los filtros anteriores no generaron resultados satisfactorios en las imgenes
de clulas de Purkinje, se utiliz el filtro de mediana con sus respectivas variaciones y la
transformada wavelet. En cuanto a los resultados del filtro de mediana el ponderado realiz
cambios en el realce de la imagen de clulas de Purkinje gerando un suavizado en la imagen,
presentando mejores resultados que los filtros anteriores y por su parte, la transformada
wavelet resalt la imagen ofreciendo informacin importante relativa a los bordes de las
clulas de Purkinje, permitiendo una mejor definicin de aquellos sitios donde las espinas
dendrticas aparecen borrosas, contribuyendo as a mejorar el procedimiento de cuantificacin
de espinas dendrticas que, normalmente, se realiza en forma manual.
Se aplicaron tambin a las imgenes de las clulas de Purkinje mtodos numricos de
deconvolucin (Regularizacin, Wiener y Lucy-Richardson) debido al desenfoque que se
118
produce en la adquisicin de las imgenes mediante un microscopio, los mtodos iterativos
generaron resultados muy novedosos en el realce de las imgenes, pero el que aporto un nivel
muy significativo en el realce de las mismas fue el algoritmo de Lucy-Richardson,
permitiendo el uso de herramientas de clasificacin supervisada como las mquinas de soporte
vectorial para realizar el conteo de espinas dendrticas.
En el conteo de espinas dendrticas de clulas de Purkinje, se sigue un procedimiento
manual subjetivo, en el que se invierte mucho tiempo por parte de los expertos, por esa razn
se desarroll un sistema de conteo automtico, utilizando como herramienta las mquinas de
soporte vectorial. El sistema automtico present resultados muy convincentes con respecto al
conteo manual, ya que estos resultados se pudieron cotejar entre cada una de las imgenes de
clulas de Purkinje procesadas. Tambin, se realiz la prueba de desempeo, para lo cual se
utiliz la sensibilidad dando como resultado promedio de 75%, indicando una elevada
probabilidad de seleccionar en una imagen, de clulas de Purkinje, una espina dendrtica.
En la validacin de la herramienta automtica de clasificacin, se utiliz un conjunto de
imgenes sintticas de 8 bits de profundidad y los resultados obtenidos, al procesar las
imgenes con la herramienta de clasificacin, fueron analizados a travs de la prueba de
desempeo, en la cual se midi la sensibilidad, especificidad y se gener la curva ROC
obtenindose resultados satisfactorios.
En la realizacin del trabajo se pudieron evaluar algunas tcnicas y herramientas para
procesamiento de imgenes, como alternativas distintas a otras metodologas que implican
gran costo y esfuerzo computacional. Las tcnicas elegidas son bastante sencillas y presentan
resultados satisfactorios.
En particular con la deconvolucin se apreciaron ciertas caractersticas de las imgenes
tratadas, especialmente, en sitios donde las espinas dendrticas aparecen borrosas en la
imagen, lo que permiti mejorar la visualizacin de bordes.
El procesamiento de imgenes de CP con las diferentes tcnicas propuestas,
proporcion una ayuda til para optimizar los anlisis manuales de conteo de espinas
dendrticas, al permitir mejorar el realce de la imagen.
La clasificacin con las mquinas de vector soporte de mnimos cuadrados para
realizar el conteo automtico de las espinas en la CP, di resultados satisfactorios.
119
Con los resultados obtenidos se puede afirmar que se cuenta con un procedimiento
adecuando para la clasificacin de CP, y se puede plantear, como trabajo futuro, la
implementacin en cdigo C de la tcnica desarrollada y adicionalmente se debe aplicar
tcnicas de minera de datos para extraer atributos de las imgenes y as poder minimizar los
tiempos de computo empleados por las tcnicas de clasificacin, as como tambin se podra
emplear otras tcnicas de clasificacin como redes neurales, clasificadores bayesianos, entre
otros.
Este estudio indico la importancia de realizar estudios de investigacin de procesamiento de
imgenes en el rea del microanlisis de imgenes adquiridas por microscopa, en el Centro de
Microscopa Electrnica, permitiendo obtener en las imgenes informacin que sin un
procesamiento metdico, sera imposible de generar.
120
6. Referencias
1. Williams, Warwick. GRAY ANATOMIA. Salvat Editors, S. A. Mallorca. Barcelona
(Espaa). Tomo II, pp1011-1021, 1985.
2. Palacios E. Two useful variations of the Golgi silver-chromate method. Acta Cientfica
Venezolana, 21: 105-106. 1970.
3. Gonzlez G, Fleuret F, Fua P. Automated Delineation of Dendritic Networks in Noisy
Image Stacks. Energy Minimization Methods in Computer Vision and Pattern
Recognition 6th International Conference, EMMCVPR 2007, Ezhou, China. pp 214 -227.
2007.
4. Shmulevich, L., & Arce, G., Generalized mallows optimization forweighted median
filters admitting negative weights. Tampere, Finland. Newark, Delaware, USA, 2002.
5. Yamada R, Ushiba J, Tomita Y, Masako Y. Decomposition of electromyographic signal
by principal component analysis of Wavelet Coefficient. IEEE EMBS Asian-Pacific
Conference on Biomedical Engineering, Keshena, Japan. 10.1109/APBME.1302612:
118-119, 2003.
6. Fleureau J, Garreau M, Hernndez A, Simn A, Boulmier D. Multi- object and N-D
segmentation of cardiac MSCT data using SVM classifiers and a connectivity
algorithm. In Computers in Cardiology.33:817820. 2006
7. Sancesario G, Morello M, Reiner A, Giacomini P, Massa R, Schoen S, Bernardi G.
Nitrergic neurons make synapses on dual-input dendritic spines of neurons in the cerebral
cortex and the striatum of the rat: implication for a postsynaptic action of nitric oxide. .
Neuroscience. 99(4): 627-42. 2000.
8. Palacios E, Mendoza R. Synaptogenetic mechanisms during chick cerebellar cortex
development. J. Submicroscopic Cytology. 13 (2): 145-167. 1981.
9. Parnass Z, Tashiro A, Yuste R. Analysis of spine morphological plasticity in developing
hippocampal pyramidal neurons. Hippocampus. 10: 561-568. 5618. 2000.
10. Morest D. The differentiation of cerebral dendrites: A study of the postmigratory
neuroblast in the medial nucleus of the trapezoid body. Z Anat Entwicklungsgesch. 128:
271-289. 1969.
11. Abramowitz M. Microscope Basis and Beyond Series. New York: Olympus America Inc.
1. 2003.
121
12. Pascual M, Calderon V. Microbiologa Alimentaria: Metodologa analtica para
alimentos y bebidas. Edita Daz de Santos S.A.28226 Madrid (Espaa). 1(1): 191-193.
2000.
13. Mikula S, Trotts I, Stone J, Jones E. Internet-enabled high-resolution brain mapping and
virtual microscopy. NeuroImage. 35: 9-15. 2007.
14. Aberraciones. Seminario de Ingeniera ptica. Departamento de Ingeniera Electrnica y
comunicaciones. Universidad de Zaragoza. Espaa. Recuperado en Noviembre 30, 2007,
de laWorld Wide Web: http://diec.unizar.es/asignaturas/defaultWebs/15719/Seminario1.pdf
15. Mannstein H, Gesell G. Deconvolution of AVHRR data. Proccedings of 5
th
AVHRR
data users meeting. Tromso, Norway. EUM P 09 (DarmstadtEberstadt: EUMETSAT).
pp. 53-58. 1991.
16. Maierhofer

C, Gangnus

R, Diebold

J, Speicher MR. Multicolor Deconvolution
Microscopy of Thick Biological Specimens. American Journal of Pathology. 162(2):
373-9. 2003.
17. Gonzalez R, Woods R. Digital Imagen Processing. Second Edition. Prentice Hall. pp
204. 2002.
18. Fleuret F, Pascal F. Dendrite tracking in microscopic images using minimum spanning
trees and localized E-M. CVLAB-EPFL, 2006.
19. Young P, Coleman C, Garvey W. Semiautomatic tracing of neural processes. Computer
Analysis of Neuronal Structures. pp 91109. 1977.
20. Bai W, Zhou X, Ji L, Cheng J, Wong S. Automatic dendritic spine analysis in two-
photon laser scanning microscopy images. Cytometry A. 71 (10): 18-26. 2007
21. Srinivasan E, Ebenezer D. A technique for improving the performance of median
smoothers at the corners characterized by low order polynomials. International Journal of
Electronics, Circuits and Systems, 1(3): 189-196. 2007.
22. Shmulevich I, Gonzalo R, Arce G. Spectral Design of Weighted Median Filters
Admitting Negative Weights. IEEE SIGNAL PROCESSING LETTERS. 8 (12): 313-
316, 2001.
23. Gonzalo R. A General Weighted Median Filter Structure Admitting Negative Weights.
IEEE Transactions on Signal Processing. 46(12). pp 348.1998.
24. Sidney C, Gopinath R. Guo H. Introduction to Wavelets and Wavelet Transforms.
Electrica and Computer Engineering Department and Computer and Information
Technology Institute Rice University. Houston Texas. Prentice Hall. pp 266.1998.
122
25. Yamada R, Ushiba J, Tomita Y, Masako Y. Decomposition of electromyographic signal
by principal component analysis of Wavelet Coefficient. IEEE EMBS Asian-Pacific
Conference on Biomedical Engineering, Keshena, Japan. 10.1109/APBME.1302612:
118-119. 2003.
26. Gonzalez R, Woods R, Eddins S. Digital Image Processing Using MATLAB (DIPUM).
Gatesmark Publishing. pp 827, 2009.
27. The MathWorks. Image Processing Toolbox Users Guide. Version 2.1. The MathWorks.
Inc. CRC Press. Boca Raton. USA. 1998.
28. Cecilia J, Moreno F, Garca J. Acelerando algoritmos de deconvolucin para imgenes de
microscopa usando GPUs. Proc. of II Workshop en Aplicaciones de Nuevas
Arquitecturas de Consumo y altas prestaciones. I.S.B.N: 978-84-692-7320-3. Madrid
(Spain). 2009.
29. Poindexter B. Wounds J. Immunofluorescence Deconvolution Microscopy and Image
Reconstruction of Human Defensins in Normal and Burned Skin. Journal of Burns and
Wounds. 4(7): 101-111. 2005.
30. Park J, Kihm K. Three-dimensional micro-PTV using deconvolution microscopy.
Experiments in Fluids. 40(3): 491-499.2006.
31. Pratt W. Point and spatial image restoration techniques. pp 319-371. En: Digital Image
Processing. PIKS Inside. Third Edition. John Wiley & Sons. 2001.
32. Qi S, Jiaya J. High-quality Motion Deblurring from a Single Image. ACM Transactions
on Graphics, 27(3): Article 73, 1-10. 2008.
33. Isaacson E. Keller H. Analysis of Numerical Methods. John Willy and Sons. New York.
pp 721 1996.
34. Richardson W. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. JOURNAL OF
THE OPTICAL SOCIETY OF AMERICA. 62(1). 1972.
35. Vera M, Medina R, Bravo A. Deteccin del corazn utilizando mquinas de soporte
vectorial de mnimos cuadrados, Memorias del X Congreso Internacional de Mtodos
Numricos en Ingeniera y Ciencias Aplicadas (CIMENICS 2010), Mrida, Venezuela,
Marzo, PS31-PS36, 2010.
36. Garca J, Vidal C, Bonmat L, Galant J, Robles M. Soft tissue tumours pattern
classification techniques using MR and epidemilogy data. Magnetic Resonance Materials
in Physics, Biology and Medicine 15: 274275. 2002.
123
37. Snchez L, Alegre E, Fernndez R, Alegre B, Domnguez J. Comparison of texture
descriptors in automatic classification of boar semen. Reproduction in Domestic
Animals. 40(4). 377-391. 2005.
38. Huang W, Lee C. Automatic Classification for Pathological Prostate Images Based on
Fractal Analysis.Medical Imaging, IEEE Transactions on In Medical Imaging, IEEE
Transactions on, 28(7). 1037-1050. 2009.
39. Vapnik, V. The Nature of Statistical Learning Theory. Springer Verlag, New York,
1995.
40. Hearst M, Dumais S, Osman E, Platt J, Scholkopf B. Support vector machines.
Intelligent Systems and Their Applications, IEEE. 13 (4). 18-28. 1998.
41. Suykens J, Gestel T, Brabanter J, Moor B, J. Vandewalle, Least Squares Support Vector
Machines, World Scientific, Singapore, 2002.
42. Palacios E , Mendoza R, Palacios L, Colasante C. Morphological changes in
neuromuscular junctions during exercise. J Neurosci Res. 9(4):371-80.1983.
43. Palay S, Chan V. Cerebellar Cortex. Springer-Verlag. Berlin.Heidelberg. Neww York.
1994.
124

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