Mtodos de Calibrao

Sinais obtidos por equipamentos e instrumentos devem ser calibrados para evitar erros nas medidas. Calibrao, de acordo com o INMETRO, o conjunto de operaes que estabelece, sob condies especificadas, a relao entre os valores indicados por um instrumento de medio ou sistemas de medio ou valores representados por uma medida materializada ou material de referncia, e os valores correspondentes das grandezas estabelecidas por padres. Modos de calibrao: a) Calibrao Pontual determina-se o valor de uma constante K com um nico padro, a qual expressa a relao entre a medida instrumental e a concentrao do analito de interesse. Esta hiptese deve ser testada experimentalmente. b) Calibrao Multipontual calibrao com mais de dois padres. O mtodo mais empregado consiste na calibrao multipontual com at 5 nveis de concentrao, podendo apresentar uma relao linear (sensibilidade constante na faixa de concentrao de trabalho) ou no-linear (sensibilidade funo da concentrao do analito).

Mtodos de Calibrao
1. 2. 3. Para muitos tipos de anlises qumicas, a resposta para o procedimento analtico deve ser avaliado para quantidades conhecidas de constituintes (chamados padres), de forma que a resposta para uma quantidade desconhecida possa ser interpretada. Curva de calibrao externa ou curva analtica Curva de adio de padro Padro interno

CURVA DE CALIBRAO OU CURVA ANALTICA

Uma curva de calibrao mostra a resposta de um mtodo analtico para quantidades conhecidas de constituinte. Solues contendo concentraes conhecidas de constituinte so chamadas de soluo padro. Solues contendo todos os reagentes e solventes usados na anlise, sem adio do constituinte que se deseja analisar, so chamadas de soluo em branco. O branco mede a resposta instrumental do procedimento analtico para impurezas ou espcies interferentes nos reagentes.

Branco
Os brancos indicam a interferncia de outras espcies na amostra e os traos de analito encontrados nos reagentes usados na preservao, preparao e anlise. Medidas frequentes de brancos tambm permitem detectar se analitos provenientes de amostras previamente analisadas esto contaminando as novas anlises, por estarem aderidos aos recipientes ou aos instrumentos. 1. Branco do mtodo 2. Branco para reagentes 3. Branco de campo Branco de mtodo: uma amostra que contm todos os constituintes exceto o analito, e deve ser usada durante todas as etapas do procedimento analtico. Branco para reagente: semelhante ao branco de mtodo, mas ele no foi submetido a todos os procedimentos de preparo de amostra. Branco de campo: semelhante a um branco de mtodo, mas ele foi exposto ao local de amostragem. Obs.: O branco de mtodo a estimativa mais completa da contribuio do branco para a resposta analtica, sendo que sua resposta deve ser subtrada da resposta de uma amostra real antes de calcularmos a quantidade de analito na amostra.

Calibrao Pontual
Determinao de cido ascrbico (vitamina C) em medicamento: Branco: ioxidao = 0,10 A Padro: [AA] = 2 mol/L; ioxidao = 2,39 A ioxidao = K [AA]padro (2,39-0,10) = K (2) K = 1,145 A.L/mol K = 1,145 A.L/mol Amostra: [AA] = x mol/L; ioxidao = 6,11 A ioxidao = K [AA]padro (6,11-0,10) = 1,145 [AA] [AA] = 5,24 mol/L

1 Etapa: Solues padro: Prepara-se solues de concentraes conhecidas e diferentes do constituinte em anlise. Geralmente estas solues so obtidas por conveniente diluio de uma soluo padro estoque. 2 Etapa: Medidas de sinal analtico: Medidas do sinal instrumental para as solues padro e branco (5 nveis de concentrao no mnimo). 3 Etapa: Construo do grfico do sinal obtido x concentrao do analito. Exemplo: Determinao amperomtrica de cido ascrbico (vitamina C) em medicamentos.
[AA], mol/L 0 1 2 4 6 8 10
16

Curva de Calibrao Externa

corrente de oxidao, A 0.08 0.1 0.12 1.51 1.45 1.52 2.44 2.37 2.35 6.12 6.13 6.08 9.92 9.91 9.97 12.61 12.59 12.98 15.74 15.67 15.6

faixa 0.04 0.07 0.09 0.05 0.06 0.39 0.14

corrente corrigida, A 0 0 0 1.41 1.35 1.42 2.34 2.27 2.25 6.02 6.03 5.98 9.82 9.81 9.87 12.51 12.49 sem dado 15.64 15.57 15.5

mdia 0 1.39 2.29 6.01 9.83 12.5 15.57

Corrente de oxidao, A

14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10

Q=

12,98 12,61

12,98 12,59 Qcalc > Qtab (0,94)

Concentrao de cido ascrbico, mol/L

= 0,95

Ajuste da curva de calibrao externa: Consiste em traar a melhor reta que se ajuste aos pontos experimentais que possuem algum erro e no descrevem exatamente uma reta. MTODO DOS MNIMOS QUADRADOS

Corrente de oxidao, A

16 12 8 4 0

ioxidao= a [AA] + b
ioxidao [AA]

a=

n xi y i xi y i n xi2 ( xi )
2

b = y ax
Corrente de oxidao, A 16 12 8 4 0 ioxidao= a [AA] + b ioxidao = 1.60 [AA] -0.29
ioxidao [AA]

desvio vertical 0 2 4 6 8 10

Concentrao de cido ascrbico, mol/L

Pressupe que os erros nos valores de y so muito maiores que os erros nos valores de x. As incertezas (desvios-padro) em todos os valores de y so semelhante.

desvio vertical 0 2 4 6 8 10

Concentrao de cido ascrbico, mol/L

Estimativa das incertezas para a inclinao, interseo e y

[AA] 0 1 2 4 6 8 10 31 iox 0 1.39 2.29 6.01 9.83 12.5 15.57 47.59 [AA].iox [AA].[AA] 0 0 1.39 1 4.58 4 24.04 16 58.98 36 100 64 155.7 100 344.69 221 d = iox - 1.60[AA] + 0.29 0.29 0.08 -0.62 -0.1 0.52 -0.01 -0.14 d.d 0.0841 0.0064 0.3844 0.01 0.2704 1.00E-04 0.0196 0.775

Desvio padro y:
sy =

d
s2 yn D
s
2 y

2 i

Y=b+a*X

D = 586

n2

= 0,39

Desvio padro a:

sa =

= 0,04

Parameter Value Error --------------------------------------------------------b -0.28669 0.24177 a 1.5999 0.04303 --------------------------------------------------------R SD N P --------------------------------------------------------0.9982 0.39369 7 <0.0001 ---------------------------------------------------------

Desvio padro b: sb =

x
D

2 i

= 0,24

Incerteza de x

sx =

sy a

yc y 1 1 + + k n a 2 xi x

Onde; k o nmero de vezes que a amostra desconhecida medida, n o nmero de pontos da curva de calibrao

Obs.: A primeira casa decimal do desvio-padro o ltimo algarismo significativo do coeficiente angular e do coeficiente linear.

COEFICIENTE DE CORRELAO
O coeficiente de correlao indica o grau de correlao entre as duas variveis, ou quanto a reta de regresso se ajusta aos pontos. Uma correlao de + 1,0 ou uma correlao de - 1,0 indica um perfeito ajuste. Correlao a medida da associao linear entre duas variveis.

r =

n xi yi xi yi
2 i 2 i

[n x ( x ) ][n y
2 i

( yi )
r = - 1.0

r = + 1.0

r = 0.0

r = 0.0

16

i (A) = (-0.07/0.07) + (1.56/0.01) * CAU(mol/L) R = 0.99984 sy = 0.1

Corrente, A

12

10

Concentrao de cido rico, mol/L

i = 0,07 + 1,56C AU 5,72 = 0,07 + 1,56C AU C AU = 3,71mol / L C AU = (3,71 0,04) mol / L
3s 3 x 0,07 = = 0,13mol / L a 1,56 10s 10 x0,07 LQ = = = 0,45mol / L a 1,56 LD =

sensibilidade _ analtica =

1,56 = 156AL / mol 0,01

ADIO DE PADRO
Na curva de adio de padro, quantidades conhecidas de constituintes so adicionadas amostra desconhecida. Do aumento do sinal instrumental, deduz-se quanto de constituinte estava na amostra original. Este mtodo requer uma resposta linear para o constituinte. Usamos o mtodo das adies de padro quando for difcil ou impossvel fazer uma cpia da matriz da amostra. Em geral, a amostra contaminada com uma quantidade ou quantidades conhecidas de uma soluo padro contendo o analito. Calibrao Pontual - duas pores da amostra so tomadas, uma poro medida como de costume, mas uma quantidade conhecida da soluo padro adicionada segunda poro. Assumi-se uma relao linear entre a resposta e a concentrao do analito.

[X ]i [S ] f + [X ] f

IX

IS+X

X = amostra S = padro

Para um volume inicial V0 da amostra desconhecida e para o volume adicionado Vs de padro com concentrao [S]i, o volume total V = V0 + Vs e as concentraes so:

V0 [ X ] f = [ X ]i V

Vs [ S ] f = [ S ]i V

Exemplo: Uma amostra de vitamina C apresentou uma corrente de oxidao de 6,11 A. Ento 5,00 mL de uma soluo 2 mol/L de um padro de vitamina C foi adicionados a 95 mL da amostra de vitamina C. Essa amostra reforada forneceu um sinal de 8,15 A. Encontre a concentrao original de vitamina C no medicamento.

6,11 = 5 95 8,15 2x 100 100 [AA]i = 0,075 + 0,7125[AA]i

[AA]i + [AA]i x

[AA]i = 0,26mol / L

Curva de adio de padro

So feitas as adies de quantidades conhecidas da soluo padro do analito a vrias pores da amostra e uma curva analtica com as mltiplas adies obtida. 3.0 Procedimento grfico para a adio de padro:
Sinal analtico

5,0 mL de amostra desconhecida em cada balo volumtrico Vfinal = 50,00 mL

2.5
Padro Adicionado

2.0

1.5

1.0

Amostra

Adiciona-se 0, 5, 10, 15 e 20 mL de padro 0,2 mol/L

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

Concentrao, mol/L
3.0

Complete o balo at a marca de aferio

Sinal analtico

2.5

2.0

Padro Adicionado

1.5

1.0 0 5 10 15

Amostra

20

Balo [S], mol/L

1 0,00

2 0,02

3 0,04

4 0,06

5 0,08

Volume de padro, mL

Curva de adio de padro usando concentraes das solues-padro:

3.0

Sinal analtico

2.5
Padro Adicionado

y = b + aX y = 0 = b + aX b X= a
Amostra

2.0

1.5

1.0 0.00 0.02 0.04 0.06

0.08

Concentrao, mol/L
X = concentrao do analito na amostra

b Vtotal X= x a Vamostra
sy a 1 y + n a 2 xi x

sc =

() ( )
2

Onde; n o nmero de pontos

Curva de adio de padro usando volume das solues-padro:

sanalito = s padro + samostra sanalito = K [ P]V padro Vtotal Vamostra [ X ] +K Vtotal

3.0

onde; a = K

[ P] Vtotal Vamostra [ X ] Vtotal

b=K

sanalito = aV padro + b
a K [ P] = b KVamostra [ X ] aVamostra [ X ] = b[ P] b[ P] [X ] = aVamostra
sv = sy a 1 yc + n a 2 xi x
Sinal analtico

2.5

2.0

Padro Adicionado

1.5

( ) ( )
2

1.0 0 5 10 15

Amostra

20

[P ] sc = sv V amostra

Volume de padro, mL

Determinao de cobre em cachaa:

7 6

rea de pico

5 4 3 2 1 0

[Cu], ppm 0 2 4 6 8

rea 2,52 3,59 4,66 5,73 6,80

Concentrao de cobre, ppm

Anlise pontual:

rea = 2,52 + 0,535 x[Cu ] rea = 0 = 2,52 + 0,535 x[Cu ]

[Cu ] = 4,71 ppm

[Cu ]i = 2,52 4 + [Cu ]i 4,66 4,66[Cu ]i = 10,08 + 2,52[Cu ]i [Cu ]i = 4,71 ppm

SENSIBILIDADE ANALTICA:

a capacidade de responder de forma confivel e mensurvel s variaes de concentrao do analito. Tambm expressa a capacidade tcnica em diferenciar dois valores de concentrao prximos, assim a sensibilidade do mtodo depende da inclinao da curva.
Exemplo: 10,1 g/L e 10,2 g/L

sinal analtico

C1

sinal analtico

C2

C1

C2

Concentrao

Concentrao

a sensibilidade analtica = sa sensibilidade _ da _ calibrao = a

SELETIVIDADE OU ESPECIFICIDADE: Depende de quanto o mtodo indiferente presena na amostra de espcies que poderiam interferir na determinao do analito. A espcie de interesse deve ter sinal analtico isento de interferncias que possam levar a confuso na identificao ou dar margem a no confiabilidade ao resultado final. LIMITE DE DETECO: O limite de deteco (LD) a menor concentrao que pode ser distinguida com um certo nvel de confiana. Toda tcnica analtica tem um limite de deteco. Para os mtodos que empregam uma curva analtica, o limite de deteco definido como a concentrao analtica que gera uma resposta com um fator de confiana k superior ao desvio padro do branco (amostra com concentrao de 1 a 5 vezes maior que o limite de deteco estimado), s.

ks LD = a
Sinal<LD

a a sensibilidade da calibrao (a) e k escolhido como 2 (92,1 %) ou 3 (98 %).

Espcie no detectada ao limite de deteco da concentrao x, porm h presena de sinal analtico no presente no branco.

LIMITE DE QUANTIFICAO OU DETERMINAO: O limite de quantificao (LQ) a menor concentrao que pode ser determinada em confiabilidade de preciso e exatido aceitveis, para aquela condio analtica. Para o limite de quantificao considera-se que no se atingiu o limite da tcnica/mtodo ou equipamento. Para os mtodos que empregam uma curva analtica, o limite de quantificao definido como a concentrao analtica que gera uma resposta com um fator de confiana igual a 10.

10s LQ = a
Sinal<LQ
Espcie no detectada ao limite de determinao ou quantificao da concentrao x, porm h presena de sinal analtico no presente no branco.

O clculo do desvio padro do branco pode ser feito com base na variao das medidas do branco analtico, da linha de base ou de um padro de concentrao muito baixa da(s) espcie(s) analisada(s). A escolha depende da tcnica e/ou instrumentao analtica, sendo funo do parmetro que est sendo medido.

RECUPERAO OU FORTIFICAO: Consiste na adio de uma quantidade conhecida de analito amostra para testar se a resposta da amostra corresponde ao esperado a partir da curva de calibrao. As amostras fortificadas so analisadas da mesma forma que as desconhecidas. Deve-se adicionar pequenos volumes de um padro concentrado para evitar mudana significativa no volume de amostra.

%recuperao =

Camostra _ fortificada Camostra _ no _ fortificada Cadicionada

x100

Exemplo: Sabe-se que em uma amostra desconhecida existem 10,0 g de um analito por litro. Uma adio intencional de 5,0 g/L foi feita numa poro idntica da amostra desconhecida. A anlise da amostra modificada forneceu uma concentrao de 14,6 g/L. Determine o percentual de recuperao da substncia intencionalmente adicionada.

REPETIBILIDADE OU REPETIVIDADE: Mxima diferena aceitvel entre duas repeties, vale dizer dois resultados independentes, do mesmo ensaio, no mesmo laboratrio e sob as mesmas condies. a) b) c) d) e) f) Mesma amostra; Mesmo analista; Mesmo equipamento; Mesmo momento; Mesmo ajuste; Mesma calibrao REPRODUTIVIDADE OU REPRODUTIBILIDADE: Mxima diferena aceitvel entre dois resultados individuais para um mesmo processo e com demais condies como especifcado. a) b) c) d) e) Amostras diferentes do mesmo ponto amostral, ou Diferentes analistas, ou Diferentes equipamentos, ou Diferentes tcnicas, ou Diferentes calibraes, ou ajustes.

EXATIDO: 1. Testes de calibrao: a cada dez anlises realizadas um padro de concentrao conhecida e diferentes dos usados para contruir a curva de calibrao deve ser analisado. 2. Recuperao da substncia fortificada. 3. Amostra de controle de qualidade: so medidas do controle de qualidade que ajuda a eliminar vcios introduzidos pelo analista, que sabe a concentrao das amostras de verificao de calibrao. Amostras de composio conhecida so fornecidas ao analista como se fossem desconhecida. 4. Brancos.

PRECISO: 1. Amostras repetidas (repetibilidade). 2. Pores repetidas da mesma amostra (reprodutibilidade).