Erika Sendra Tavares

Relaes filogenticas, biogeografia histrica e evoluo da organizao de genes mitocondriais dos psitacdeos neotropicais (tribo Arini: Psittacidae: Psittaciformes)

So Paulo 2005

ATUALIDADES ORNITOLGICAS N.128 NOVEMBRO/DEZEMBRO DE 2005 P. 5

Erika Sendra Tavares

Relaes filogenticas, biogeografia histrica e evoluo da organizao de genes mitocondriais dos psitacdeos neotropicais (tribo Arini: Psittacidae: Psittaciformes)

Tese apresentada ao Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo, para a obteno de Ttulo de Doutor em Cincias, na rea de Biologia/ Gentica. Orientadora: Profa. Dra. Cristina Yumi Miyaki

So Paulo 2005

Tavares, Erika Sendra Relaes filogenticas, biogeografia histrica e evoluo da organizao de genes mitocondriais dos psitacdeos neotropicais (tribo Arini: Psittacidae: Psittaciformes) 86 pginas

Tese (Doutorado) - Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo. Departamento de Biologia. 1. Psitacdeos neotropicais 2. Filogenia molecular 3. tribo Arini 4. Organizao dos genes mitocondriais I. Universidade de So Paulo. Instituto de Biocincias. Departamento de Gentica e Biologia Evolutiva.

Comisso Julgadora:

__________________________ Prof. (a) Dr. (a)

__________________________ Prof. (a) Dr. (a)

__________________________ Prof. (a) Dr. (a)

__________________________ Prof. (a) Dr. (a)

__________________________ Profa. Dra. Cristina Yumi Miyaki

Ao Rafinha, Tio e Ilka, com muito amor

Strange fascination, fascinating me, Changes are taking the pace I am going through, David Bowie (Changes, Hunk Dory, 1971)

Agradecimentos

Dra. Cristina Yumi Miyaki pela orientao com muita dedicao e carinho, pelo incentivo e encorajamento de sempre e pelo muito que me ensinou. Ao Dr. Allan Baker pela oportunidade de estgio e orientao em seu laboratrio no Royal Ontario Museum em Toronto, pela empolgao cientfica contagiante, por todo carinho, apoio pessoal e pelas vrias explicaes sobre muitos assuntos. Ao Srgio Luiz Pereira pela orientao tcnica e sugestes cientficas oferecida sempre com grande disposio e pacincia, pelo companheirismo e dicas de sobrevivncia em terras distantes. Ao Renato Gaban-Lima pela ajuda incondicional, discusses e sugestes sobre os psitacdeos. Dra. Anita Wajntal e Dra. Elizabeth Hfling pelo interesse e sugestes. Camila Ribas pelos conselhos prestimosos durante todo o desenvolvimento da tese, companheirismo e discusses cientficas. Melina Baumgarten pelas conversas confortantes, incentivo e apoio em muitos momentos. Ao Rogrio Loureno por obter as seqncias de Graydidascalus e Triclaria como parte do seu projeto de iniciao cientfica, que foram utilizadas no terceiro captulo dessa tese. Ao Renato Caparroz pelo emprstimo de livros, materiais e por apresentar grandes amigos no Canad. Aos amigos de laboratrio Adriana Oliveira-Marques, Celina Yoshihara, Cibele Biondo, Erwin Grau, Fbio Raposo, Fernando dHorta, Fernando Nodari, Flvia Presti, Gustavo Cabanne, Gustavo Ybazeta, Jacqueline Miller, Jos Patan, Juliana Oliveira, Maryann Burbidge, Mark Pack, Nadia de Moraes-Barros, Nicola Wade, Oliver Haddrath, Polyana Andrioni, Ricardo Yassaka, Rodrigo Pessoa, Sarah Nasser, Tania Matsumoto, Tara Paton, entre outros pela troca de experincias e pelos momentos agradveis. Ao Luis Fbio Silveira pela ajuda prestativa no Museu de Zoologia. Dra. Marie Anne Van Sluys e Mariana Cabral de Oliveira.do departamento de Botnica por permitir o uso do sequenciador automtico. Elisngela Quedas e Silvia Blanco pela grande ajuda com o seqnciamento automtico. Ao Dr. Carlos Frederico Martins Menck do Instituto de Biocincias pelo emprstimo da chave do programa de computador. s amigas Helenice Hirata, Lucilene da Silva, Maria Andrade, por toda ajuda prestativa, oferecida sempre com muita disposio. Aos amigos e colegas de instituio no Brasil e no Canad Adriana (Adri), Andria Ramirez, Antnia Cerqueira (Toninha), Bill, Carla DAngelo, Cludia Fbris, Clber Costa, Cibele Masotti, Cristiane Iughetti, Ftima, Gisele, Ilana Kohl, Mnica Varela, Patrcia Faria, Roseli Zanelato, Silvia Geurgas entre tantos outros pela convivncia e por compartilhar momentos alegres. Aos professores do Departamento de Gentica e Biologia Evolutiva do Instituto de Biocincias (USP), pela ajuda e sugestes. Aos funcionrios do Departamento de Gentica e Biologia Evolutiva e da ps-graduao do Instituto de Biocincias (USP) e do Royal Ontario Museum pelo suporte.

s pessoas e instituies que cederam o material biolgico utilizado nessa tese: African Safari Zoo, Parque Ecolgico do Tiet, UNESP, Zoolgico de Sorocaba, Zoolgico de Americana, Zoolgico Cyro-Gevaerd, Fundao Crax, Museu Paraense Emlio Goeldi, Field Museum of Natural History e aviculturistas. Fundao de Amparo a Pesquisa no Estado de So Paulo pelo financiamento da pesquisa, pela concesso da bolsa de doutorado e pelo financiamento do estgio no Royal Ontario Museum. Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), ao Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e ao National Science Foundation (AToL) pelo financiamento da pesquisa. Lynx Edicins pela permisso de uso das figuras do Handbook of the Birds of the World volume 4. Ao Rafinha (Rafael Corra) pelo grande apoio, participao e incentivo e por ter tornado todos esses anos extremamente felizes. Aos meus pais Sebastio Tavares e Ilka Tavares e aos meus sogros Valmir Corra e Lcia Corra por tudo que me ensinaram, pelo amor, dedicao e prontido em ajudar. Maria Ins Ribeiro Salsa pelo grande suporte, por todo carinho e amor. Aos meus irmos Katia Tavares, Leonardo Tavares e Tiago Corra pelos perodos alegres, pelo incentivo e por toda ajuda. todos os demais membros da minha famlia e aos meus amigos pelo apoio nos perodos difceis e por compartilharem os momentos felizes.

ndice

Resumo

Abstract

Captulo 1: Introduo geral

Captulo 2: Relaes filogenticas e biogeografia histrica dos psitacdeos neotropicais (tribo Arini) com base em seqncias de DNA mitocondrial e nuclear 28

Captulo 3: Evoluo da organzao dos genes mitocondriais ao redor da regio controladora em psitacdeos Neotropicais 61

Captulo 4: Consideraes finais

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Resumo
Com a finalidade de entender melhor as relaes filogenticas entre os psitacdeos neotropicais (tribo Arini), foram seqenciados 6416 pares de bases de genes nuclear (RAG-1) e mitocondriais (citocromo b, NADH2, ATPase 6, ATPase 8, COIII, DNAr 12S e DNAr 16S) de 29 espcies pertencentes a 25 dos 30 gneros reconhecidos atualmente. As anlises filogenticas utilizando os mtodos de mxima verossimilhana e anlise bayesiana evidenciaram que, dentre os psitacdeos neotropicais, o clado formado por Nannopsittaca e Bolborhynchus grupo irmo de todos os outros gneros, que por sua vez so agrupados em dois clados. Esses clados compreendem: um grupo de papagaios, caturritas, curicas e afins e outro grupo que inclui as araras, marianinhas, tiriba e afins. A datao molecular utilizando uma calibrao geolgica (separao da Nova Zelndia h 82-85 milhes de anos, ma) sugere que os psitacdeos neotropicais compartilharam ancestral comum com um grupo de psitacdeos Australianos no final do Cretceo (65 ma), portanto a divergncia dessas linhagens poderia ser atribuda ou intensificada pela separao dos continentes. Os ancestrais dos psitacdeos neotropicais atuais poderiam estar distribudos na Amrica do Sul e Antrtica ou somente no primeiro continente. Hipteses da diversificao no grupo foram levantadas relacionando fatores histricos com os padres de cladognese encontrados. Seqncias mitocondriais da regio controladora e regies flanqueadoras determinadas para vrios txons de psitacdeos neotropicais evidenciaram a existncia de dois arranjos gnicos. Nannopsittaca dachilleae, Bolborhynchus lineola, Myiopsitta monachus, Brotogeris chiriri, A r a ararauna, Anodorhynchus hyacinthinus, Cyanoliseus patagonus, Cyanopsitta spixii, Diopsittaca nobilis, Enicognathus lepthorhynchus, Guarouba guarouba, Orthopsittaca manilata, Primolius auricollis, Pyrrhura picta e Rhynchopsitta pachyryncha apresentam a ordem dos genes descrita inicialmente em Gallus gallus e posteriormente sugerida como o arranjo mais freqente em aves. Graydidascalus brachyurus, Pionopsitta pileata, Pionopsitta barrabandi, Triclaria malachitacea, Deroptyus accipitrinus, Pionites leucogaster e Forpus crassirostris revelaram um rearranjo de genes com duplicao da regio controladora, como descrito inicialmente para psitacdeos neotropicais dos gneros Amazona e Pionus. Em Deroptyus e Pionites tambm foram encontrados pseudogenes exclusivos. Com base no mapeamento dessas duas organizaes gnicas na filogenia proposta para o grupo (manuscrito 1, anexo) propusemos dois mecanismos para explicar a distribuio da ordem gnica no grupo. No primeiro, poderia ter ocorrido trs eventos de duplicao de genes seguido de trs eventos de deleo que poderiam levar ao arranjo com a duplicao da regio controladora. Alternativamente, teria ocorrido um nico evento de duplicao de genes seguido de cinco eventos independentes de deleo de genes, dois reverteriam para a organizao original e trs dariam origem ordem alternativa. Ambos os cenrios assumem convergncia e seis eventos envolvendo duplicao ou deleo de genes.

Abstract
To clarify the phylogenetic relationships among the genera of Neotropical parrots we analyzed 6416 base pairs of nuclear (RAG-1) and mitochondrial DNA sequences (cytochrome b, NADH2, ATPase 6, ATPase 8, COIII, 12S rDNA, and 16S rDNA) from 29 species belonging to 25 out of the 30 genera. Phylogenetic analyses using maximum likelihood and Bayesian methods showed that within Neotropical parrots, Nannopsittaca and Bolborhynchus form the sister clade to all other genera, which in turn are grouped in two distinctive clades. These two derived clades partition amazons and their allies from macaws, conures, and related taxa. Molecular dating with a geological calibration for the separation of New Zealand (82-85 million years, Myr) suggests that the Neotropical parrots shared a common ancestor with Australian parrots around the end of the Cretaceous (65 Myr), and thus, their divergence could be explained by vicariance. The three Neotropical clades may have diverged while they were in the Antarctica-South America block, or in South America only. Hypothesis of the diversification in these groups relating historical factors and cladogenesis pattern in were proposed. Sequences of the mitochondrial control region and flanking genes of Ara ararauna, Anodorhynchus hyacinthinus, Bolborhynchus lineola, Brotogeris chiriri, Cyanoliseus patagonus, Cyanopsitta spixii, Diopsittaca nobilis, Enicognathus leptorhynchus, Guarouba guarouba, Myiopsitta monachus, Nanopsittaca dachilleae, Orthopsittaca manilata, Primolius auricollis, Pyrrhura picta, and Rhynchopsitta pachiryncha show the same gene arrangement first described in Gallus gallus, (which is the most common mitochondrial genome arrangement in birds). Sequences of the same region in Amazona xanthops, Deroptyus accipitrinus, Forpus crassirostris, Graydidascalus brachyurus, Pionopsitta pileata, Pionopsitta barrabandi, Pionites melanocephala, and Triclaria malachitacea revealed an arrangement of genes with a duplication of the control region, as previously reported in Neotropical parrots from the genera Amazona and Pionus. Exclusive pseudogenes occur in Deroptyus and Pionites. The mapping of these characters in a phylogenetic proposal for the group suggests ambiguity on the inference of the ancestral states of the clades. Two models were proposed and compared, considering six events of duplication and deletion of genes.

Captulo 1

Introduo

Captulo 1

1.1. Apresentao Geral Na presente tese as relaes evolutivas entre psitacdeos neotropicais foram estudadas pela anlise de seqncias de DNA nuclear e mitocondrial. Os resultados foram comparados com classificaes e propostas sistemticas prvias. Foram realizadas estimativas dos tempos de divergncia entre as linhagens, a partir das quais foram levantadas hipteses biogeogrficas. Adicionalmente, a evoluo da ordem dos genes mitocondriais ao redor da regio controladora foi estudada. A tese est organizada em captulos. O presente captulo 1 uma introduo geral que descreve o contexto no qual o trabalho se insere, com nfase nos organismos estudados e mtodos de anlise utilizados. J nos captulos 2 e 3 so apresentados os dados obtidos em forma de manuscritos a serem submetidos para publicao. O ltimo captulo se refere s consideraes finais referentes aos manuscritos.

1.2. Psitacdeos 1.2.1. Informaes sistemticas e filogenticas A ordem Psittaciformes inclui as araras, papagaios, periquitos, maracans e cacatuas. A principal caracterstica compartilhada pelos txons pertencentes ao grupo a forma do bico, cuja maxila superior curva e envolve a maxila inferior (Smith, 1975; Forshaw, 1989; Sibley e Alquist, 1990). Propostas filogenticas recentes com base em evidncias moleculares e morfolgicas (Sibley e Alquist, 1990; Cooper e Penny, 1997; Cracraft, 2001; Livezey e Zusi, 2001; Mayr e Clarke, 2003; Garca-Moreno e col., 2003; Harrison e col., 2004) sugerem que o grupo faz parte das Neoaves de Neognathae, porm sua posio filogentica em relao s demais ordens de Neoaves ainda no bem resolvida (Figura 1.1).

Figura 1.1. Relaes filogenticas entre os grandes grupos de aves (modificado de Garca-Moreno e col., 2003).
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Captulo 1

Os Psittaciformes so uma das ordens de aves mais abundantes em nmero de espcies, incluindo cerca de 350 espcies (distribudas em 84 gneros). Ocorrem no neotrpico, regio africana, sul asitica e australiana (Forshaw, 1989, Collar, 1997; Rowley, 1997) (Figura 1.2).

30 gneros

4 gneros

50 gneros

Figura 1.2. Distribuio dos gneros da ordem Psittaciformes (del Hoyo e col., 1997).

Atualmente so reconhecidas duas famlias na ordem, Cacatuidae (inclui as subfamlias Calyptohynchinae, Cacatuinae e Nymphicinae) e Psittacidae (Loriinae e Psittacinae) (Forshaw, 1989, Collar, 1997; Rowley, 1997). No entanto, estudos filogenticos recentes evidenciaram que a famlia Psittacidae como reconhecida atualmente no monofiltica. Anlises filogenticas do gene nuclear RAG-1 e de ntrons localizados nos cromossomos sexuais de um grande nmero de gneros da ordem Psittaciformes sugerem que os gneros Strigops (tribo Strigopini: Psittacinae: Psittacidae) e Nestor (Nestorini: Psittacinae: Psittacidae) exclusivos da Nova Zelndia so grupo irmo de todos os demais gneros de psitacdeos atuais (Barrowclough e col., 2004; de Kloet e de Kloet, 2005), Cacatuidae o prximo clado monofiltico e grupo irmo das demais tribos da famlia Psittacidae (Barrowclough e col., 2004). Os psitacdeos neotropicais formam o grupo de espcies mais numeroso da ordem (com cerca 150 espcies) e atualmente inclui 30 gneros (Collar, 1997). Apresentam uma grande variao de tamanho, preferncia de hbitat, distribuio geogrfica e comportamento (Forshaw, 1989). A
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Captulo 1

sistemtica dos gneros neotropicais sofreu diversas modificaes ao longo do tempo (ex. Salvadori, 1891; Miranda-Ribeiro, 1920; Peters, 1937; Pinto, 1937, 1978; Forshaw, 1989; Sick, 1997; Collar, 1997). Alguns sistematas, com base em morfologia externa, anatomia e comportamento (Salvadori, 1891; Boetticher, 1943, 1959; Verheyen, 1956; Brereton, 1963) distribuam os gneros neotropicais em dois grupos de composio varivel, em alguns casos incluindo txons de outras regies geogrficas (Tabela 1.1).

Tabela 1.1. Grupos de gneros de psitacdeos neotropicais (em alguns casos incluindo gneros africanos, sublinhados). Os nomes dos gneros correspondem Collar (1997), exceto Propyrrhura para o qual foi adotado Primolius (Penhallurick, 2001). Autores Grupos Conurinae : Anodorhynchus, Ara, Aratinga, Bolborhynchus, Cyanoliseus, Cyanopsitta, P i o n i n a e : Amazona, Deroptyus Diopsittaca, Enicognathus, Forpus, Guarouba, Graydidascalus, Hapalopsittaca Leptosittaca, Myiopsitta, Nandayus, Pionites, Pionus, Pionopsitta, Nannopsittaca, Ognorhynchus, Orthopsittaca, Triclaria, Touit, Poicephalus Primolius, Psilopsiagon, Pyrrhura, Rhynchopsitta A r i n a e : Anodorhynchus, Ara, Aratinga, Amazoninae : Amazona, Deroptyus Bolborhynchus, Brotogeris, Cyanoliseus, Graydidascalus, Pionites, Pionus, Cyanopsitta, Diopsittaca, Enicognathus, Forpus, Guarouba, Leptosittaca, Myiopsitta, Pionopsitta, Triclaria, Touit. Nandayus, Nannopsittaca, Ognorhynchus, Orthopsittaca, Primolius, Psilopsiagon, Pyrrhura, Rhynchopsitta A r a i n i : Anodorhynchus, Ara, Aratinga, P s i t t a c i n i : Amazona, Deroptyus Bolborhynchus, Cyanoliseus, Cyanopsitta, Graydidascalus, Hapalopsittaca Diopsittaca, Enicognathus, Forpus, Guarouba, Pionites, Pionus, Pionopsitta, L e p t o s i t t a c a , M y i o p s i t t a , Nandayus, Triclaria, Touit, Poicephalus, Nannopsittaca, Ognorhynchus, Orthopsittaca, Psittacus, Coracopsis Primolius, Psilopsiagon, Pyrrhura, Rhynchopsitta Amazonidae: Anodorhynchus, Ara, Aratinga, Forpidae : Forpus, Bolborhynchus, Pionites, Pyrrhura, Pionopsitta, Deroptyus, Psilopsiagon Amazona, Brotogeris, Pionus A r i n i : Amazona, Anodorhynchus, Ara, Aratinga, Bolborhynchus, Brotogeris, Cyanoliseus, Cyanopsitta, Deroptyus, Diopsittaca, Enicognathus, Forpus, Graydidascalus, Guarouba, Hapalopsittaca, Leptosittaca, Myiopsitta, Nandayus, Nannopsittaca, Ognorhynchus, Orthopsittaca, Pionites, Pionopsitta, Pionus, Primolius, Psilopsiagon, Pyrrhura, Rhynchopsitta, Triclaria, Touit Cauda longa: Anodorhynchus , Ara, Aratinga Cauda curta: Amazona, Pionus Cyanopsitta, Deroptyus, Diopsittaca, Guarouba, Pyrrhura Amazona, Forpus, Anodorhynchus, Ara, Aratinga, Cyanoliseus, Myiopsitta, Graydidascalus, Deroptyus, Guarouba, Pionites, Pyrrhura, Brotogeris Pionus, Triclaria Rhynchopsitta

Salvadori (1891)

Verheyen (1956)

Boetticher (1943, 1959)

Brereton (1963)

Smith (1975)

Miyaki e col. (1998) de Kloet e de Kloet (2005)

Verheyen (1956) agrupou exclusivamente txons neotropicais nas famlias Amazoninae e Arinae e sugeriu que esses grupos compartilham caractersticas morfolgicas (presena de quatro
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tribo

Captulo 1

vrtebras dorsais, uma nica cartida dorsal, entre outras) que os distinguem dos psitacdeos das demais regies geogrficas, mas no sugeriu uma categoria para agrup-los. Em uma reviso abrangente da sistemtica da ordem Psittaciformes, Smith (1975) agrupou todos os txons neotropicais na tribo Arini (famlia Psittacidae) com base em dois caracteres exclusivos (ecloso dos filhotes com canal auditivo imperfurado e postura copulatria em uma perna) e outros caracteres
d
d

comuns, porm no exclusivos (frmula cartida do tipo A-2-s, bicos marrons, pretos ou brancos, sistema de colorao das penas com padro Dyck-texture que inclui cor verde, com azul e/ ou vermelho) e considerou artificiais os agrupamentos internos at ento propostos na tribo (Tabela 1.1). Na falta de

de
d

Captulo 1

Esse conjunto de dados foi ampliado para um total de 3.245 pb com a adio dos genes mitocondriais citocromo oxidase I e regio controladora e um total de 13 espcies de psitacdeos neotropicais (Tavares, 2001; Tavares e col. 2004), com a finalidade de entender melhor as relaes filogenticas entre os gneros pertencentes a um dos grupos obtidos anteriormente (Miyaki e col., 1998). Entre os resultados obtidos nessas novas anlises, Myiopsitta monachus no agrupa com os demais txons de cauda longa (Tavares, 2001), algumas espcies de mesmo gnero formam clados monofilticos e um agrupamento nunca mencionado entre os gneros monoespecficos Guarouba guarouba e Diopsittaca nobilis foi recuperado (Figura 1.4). No estudo filogentico de ntrons localizado nos cromossomos sexuais Z e W trs grupos de gneros neotropicais foram recuperados (Tabela 1.1; de Kloet e de Kloet, 2005), sendo que dois dos mesmos apresentaram composio semelhante aos grupos obtidos nas anlises filogenticas anteriores (Miyaki e col., 1998; Tavares e col. 2004). No entanto, as relaes entre os grupos e entre os gneros pertencentes a cada um desses grupos permaneceram desconhecidas. Adicionalmente, filogenias dos nveis taxonmicos de gnero e espcie sugeriram a ausncia de monofiletismo nos gneros Aratinga, Amazona e Pionopsitta (Tavares, 2001; Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004; Ribas e col., 2005).

a)

b)

Figura 1.4. Relaes filogenticas entre gneros de psitacdeos neotropicais com base em seqncias de DNA mitocondrial. a) por mxima verossimilhana com base em 2.332 pb, nmeros correspondem ao suporte por quartet puzzle (Tavares, 2001); b) por mxima verossimilhana com base em 3.246 pb, nmeros correspondem ao suporte por bootstrap: mxima parcimnia/ mxima verossimilhana (Tavares e col., 2004).

Captulo 1

1.2.2. Importncia da tribo Arini para a biologia evolutiva O estudo das relaes evolutivas entre as linhagens de psitacdeos neotropicais necessrio para entender vrios aspectos evolutivos, j que alm de numeroso (inclui cerca de 150 espcies), um grupo relativamente heterogneo. Esto distribudos por toda a regio neotropical, onde apresentam padres de explorao de hbitats muito variveis. Algumas espcies so endmicas a regies muito particulares, como Cyanopsitta spixii em mata ciliar aberta na regio de Cura e Guarouba guarouba em floresta de terra firme ao norte do Maranho e Par, enquanto outras se distribuem em amplas reas, como Ara ararauna que ocorre em buritizais, babauais e beira de mata da Amrica Central ao sul do Brasil e Aratinga leucophthalmus em orlas de mata das Guianas Argentina (Collar, 1997; Sick, 1997; Forshaw, 1989). Existe uma grande variao de tamanho, colorao de plumagem e comportamento entre as linhagens. Por exemplo, as menores espcies, pertencentes ao gnero Forpus, pesam 25 gramas, enquanto a arara-azul grande, Anodorhynchus hyacinthinus, pesa cerca de 1500 gramas (Sick, 1997; Forshaw, 1989). Quanto colorao, algumas espcies so predominantemente verdes (ex. espcies dos gneros Amazona , Pionus, Pyrrhura e Enicognathus), outras so vermelhas (ex. Ara macao e Ara chloroptera), azuis (ex. Anodorhynchus e Cyanopsitta ) ou amarelas (ex. complexo Aratinga solstitiais e Guarouba guarouba). Nidificam em paredes rochosos (ex. Anodorhynchus leari), ocos (ex. Cyanopsitta, Nandayus), cupinzeiros (ex. Aratinga aurea) ou constrem ninho de gravetos (exclusivamente Myiopsitta monachus) (Collar, 1997). Alguns gneros como Pionopsitta, Aratinga, Pyrrhura, Pionites, Touit, Forpus, Brotogeris e Amazona incluem espcies e subespcies com distribuies restritas, sendo bons modelos para estudos de padres biogeogrficos (vide Ribas, 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004; Ribas e col. 2005). No entanto, a falta de conhecimento das relaes entre gneros, dificulta a escolha de bons grupos externos. Alm disso, alguns gneros monotpicos, so representantes nicos de algumas das linhagens atuais que esto seriamente ameaados de extino, por exemplo, Cyanopsitta spixii e Guarouba guarouba, o que torna urgente a necessidade de estudar vrios aspectos dessas espcies, inclusive suas posies filogenticas, afim de se obter mais informao a respeito dos mesmos antes que sejam extintos. Muitas espcies de psitacdeos neotropicais so vulnerveis ou ameaadas de extino e o conhecimento de suas relaes evolutivas pode auxiliar trabalhos mais especficos voltados aos planos de conservao e manejo (Collar e col., 1992; Beissinger, 2000; Owens e Bennet, 2000).

Captulo 1

1.2.3. Biogeografia Com base na atual distribuio das espcies (Figura 1.2) e no registro fssil, Glenny (1954) sugeriu que a ordem Psittaciformes se originou no continente antrtico aps o limite entre o CretceoTercirio, a partir do qual as espcies dispersaram para os continentes sul-americano, Austrlia e Nova Zelndia e a colonizao africana teria ocorrido por migraes transocenicas. Tambm com base na distribuio dos gneros atuais, porm assumindo uma idade mais antiga para a origem do grupo, Cracraft (1973, 2001) sugeriu que a ordem Psittaciformes, entre outras ordens de aves com distribuio semelhante, possivelmente se originou no antigo continente da Gondwana e que a separao dos blocos desse grande continente teve uma funo importante na diversificao das primeiras linhagens desses grupos. Algumas evidncias recentes vm corroborando a hiptese de origem na Gondwana para o grupo. Estudos de datao molecular sugerem que a diversificao de Neoaves e Galloanserae (Figura 1.1), ocorreu entre 80-110 milhes de anos (ma; Hedges e col., 1996; Cooper e Peny, 1997; van Tuinen e Hedges, 2001; Paton e col., 2002). Corroborando essa idia, foi reanalisado recentemente um fssil de ave (Vegavis iaai), posicionado filogeneticamente na ordem Anseriformes e datado de 66-68 ma, o que sugere que pelo menos a ordem atual Anseriformes j estaria diferenciada antes do limite entre o Cretcio-Tercirio (Clarke e col., 2005). Adicionalmente, os dados recentes de filogenia molecular de psitacdeos sugerem que os gneros da Nova Zelndia so grupo irmo dos demais txons atuais e o padro de diversificao dos demais grupos seguindo um padro coincidente com a separao dos continentes tambm reforam uma possvel origem na Gondwana (Barrowclough, 2004; de Kloet e de Kloet, 2005). Um padro semelhante descrito em Passeriformes (Ericson e col. 2003). O registro fssil de Psittaciformes no contribui para elucidar essa e outras questes. O fssil mais antigo descrito como psitacdeo uma mandbula inferior encontrado na regio de Wyoming nos EUA e data de mais de 65 ma (Stidham, 1998). Apesar disso, a identificao morfolgica das estruturas do fssil como sendo uma mandbula de psitacdeo foi fortemente questionada (Dyke e Mayr, 1999). Outros fsseis de Psittaciformes, porm sem posio filogentica conhecida, foram descritos na Frana (stio arqueolgico La Bouffie), no perodo Eoceno superior (por volta de 50 ma). Devido a diferenas osteolgicas em relao aos demais psitacdeos atuais, foram considerados pertencentes a uma famlia parte, Quercypsittidae, atualmente extinta (Chauvir, 1992). Um outro fssil de psitacdeo, tambm encontrado na Frana, o Archaeopsittacus verreauxi, datado entre o Oligoceno Superior e o Mioceno Inferior (Forshaw, 1989). Alm destes, existem fsseis de gneros
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atuais mais recentes que datam dos perodos Tercirio (Boles, 1993; Boles, 1998) e Quaternrio (Collar, 1997). Dataes moleculares sugerem que a separao entre o periquito australiano (Melopsittacus undulatus) e alguns txons neotropicais ocorreu por volta de 76 ma (Miyaki e col., 1998) o que tambm estaria de acordo com a hiptese de que a separao dos continentes teve um papel importante na diversificao desses grupos. A divergncia entre os gneros de psitacdeos neotropicais foi estimada entre o Eoceno-Oligoceno e durante o Mioceno (16-27 ma) e foi associada a mudanas ambientais em consequncia de mudanas no nvel do mar, orogenia dos Andes e expanso de ambientes de floresta e de reas secas (Miyaki e col., 1998; Tavares e col., 2004). J o intervalo de divergncias entre espcies do mesmo gnero de psitacdeos foi estimado entre 0,5 e 1,3 ma (Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Ribas e col., 2005).

1.3. Inferncias filogenticas baseadas em seqncias de DNA 1.3.1.Aspectos gerais Filogenias so baseadas no princpio de que todos os organismos atuais e extintos so interligados por relaes de ancestralidade comum. A principal meta dos estudos filogenticos levantar as hipteses mais provveis sobre histria evolutiva entre os organismos. Com base no princpio de ancestralidade comum, a evoluo ocorre por processos de ramificao, onde uma linhagem se divide em duas ou mais, portanto, as hipteses sobre as relaes evolutivas entre os organismos so ilustradas em grficos chamados de rvores filogenticas. O padro de ramificao de uma rvore chamado de topologia (Graur e Li, 2000). Muitas so as aplicaes dos estudos filogenticos, entre elas, estabelecer sistemas de classificao biolgica que refletem a evoluo dos organismos e permitir interpretaes de diversos processos evolutivos morfolgicos, moleculares e biogeogrficos. Com o desenvolvimento das tcnicas moleculares, surgiu a filogenia molecular, ou seja, o estudo das relaes evolutivas entre os organismos pelo uso de marcadores moleculares (Moritz e Hillis, 1996; Graur e Li, 2000). Sibley e Alquist (1990) realizaram um dos primeiros trabalhos de maior impacto na rea molecular de aves. Esses autores utilizaram a tcnica de hibridao DNA-DNA entre pares de txons representantes de praticamente todas as ordens de aves a fim de tentar entender as relaes entre esses grupos. Apesar dos vrios resultados significativos que eles obtiveram, problemas metodolgicos e empricos permaneceram sem soluo e muitas das relaes ainda no foram resolvidas (Garcia-Moreno e col., 2003). Recentemente, seqncias de DNA mitocondriais e nucleares
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tm sido muito empregadas em reconstrues filogenticas em diferentes nveis taxonmicos de aves (ex. Miyaki e col., 1998, Haddrath e Baker, 2001; Pereira e col., 2002, Paton e col., 2002; Nahum e col., 2003; Harrison e col., 2004).

1.3.2. Heterogeneidade de taxas de substituio de nucleotdeos e modelagem O princpio bsico das inferncias filogenticas com base em seqncias de DNA, que a partir da divergncia entre dois txons, o nmero de diferenas nas suas seqncias homlogas de DNA aumentaria proporcionalmente ao longo do tempo. No entanto, a comparao de seqncias homlogas entre os txons revelou que cada stio evolui sob condies muito particulares. Em alguns casos essas diferenas podem ser associadas a uma presso seletiva devido sua funo. Por exemplo, em genes codificadores de protenas, os stios correspondentes terceira posio do cdon esto mais sujeitos variao do que os correspondentes primeira e segunda posio, porque mutaes na terceira posio alteram menos frequentemente o aminocido correspondente devido natureza degenerada do cdigo gentico (Graur e Li, 2000; Nei e Kumar, 2000). Essa heterogeneidade faz com que em alguns conjuntos de dados existam stios to conservados que no apresentam substituies entre txons distantemente relacionados, enquanto em outros stios a variao muito grande, a ponto de mascarar o sinal filogentico devido presena de substituies mltiplas mesmo entre linhagens prximas taxonomicamente. Esse problema ainda maior nas inferncias filogenticas entre grupos taxonmicos mais distantemente relacionados (Swofford, 1996; Holder e Lewis, 2003; Felsenstein, 2004). Alm disso, alguns tipos de substituies entre os stios ocorrem com maior freqncia do que outros e as substituies tambm esto sujeitas freqncia de bases que ocorre no segmento estudado. Todos esses fatores mencionados podem interferir nas inferncias filogenticas aumentando o nmero de substituies paralelas ou reverses de estado, que no podem ser detectados pela simples comparao das seqncias dos txons atuais. No entanto, foram desenvolvidos diversos modelos evolutivos que descrevem o padro de substituio de nucleotdeos no DNA em diferentes conjuntos de dados. Existem diferentes testes e critrios para escolher o modelo evolutivo mais adequado para um conjunto de dados, como o teste de razo de verossimilhana (likelihood ratio test, Felsenstein, 1988; Posada, 2003) e o critrio de informao Akaike (Posada e Crandall, 1998; Posada, 2003) e, em geral, os valores dos parmetros so estimados a partir dos dados (Swofford e col., 1996). Na presente tese, foram empregados os mtodos de mxima verossimilhana e anlise

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bayesiana (descritos a seguir) que incorporam modelos evolutivos explcitos (Swofford, 1996; Holder e Lewis, 2003; Felsenstein, 2004) .

1.3.3. Mxima verossimilhana O mtodo da mxima verossimilhana busca a hiptese filogentica com maior probabilidade de explicar a distribuio dos estados de carter nos txons atuais, com base em um modelo evolutivo previamente definido e estados de caracteres observados nos terminais da rvore filogentica (Swofford e col., 1996). Dessa forma, para uma dada hiptese, representada na forma de uma topologia, a probabilidade para as combinaes considerando cada possvel ancestral de cada n interno devem ser calculadas com base no modelo evolutivo. Por esse mtodo, diversas hipteses so testadas pela multiplicao das suas probabilidades para cada carter, que em estudos moleculares so cada stio de DNA. Por ser um critrio de otimizao, para se escolher a melhor topologia pela mxima verossimilhana, em princpio todas as topologias possveis para explicar a histria evolutiva dos txons devem ser testadas. No entanto, dependendo do nmero de txons na anlise, o clculo da probabilidade para todas as possveis topologias pode ser extremamente demorado computacionalmente. Por causa disso, foram desenvolvidas diferentes estratgias de buscas heursticas, que visam encontrar a melhor topologia, sem necessariamente amostrar todas as topologias possveis, tornando o mtodo aplicvel para grandes conjuntos de dados, apesar de aumentar o risco de a melhor topologia no ser amostrada (Swofford e col., 1996; Holder e Lewis, 2003; Felsenstein, 2004). Uma das formas mais utilizadas para avaliar o quanto os dados sustentam cada clado da melhor topologia obtida por mxima verossimilhana o bootstrap no paramtrico. Pelo bootstrap a matriz de dados originais re-amostrada com reposio para gerar vrias pseudo-rplicas, a partir das quais a melhor topologia para cada uma encontrada. Uma topologia consenso dessas rvores gerada e o nmero de vezes que cada clado aparece nessas topologias representado probabilisticamente. Dessa forma, esse algoritmo permite availar que partes da topologia so menos suportadas pelo conjunto de dados (Holder e Lewis, 2003).

1.3.4. Anlise Bayesiana A inferncia filogentica por anlise bayesiana baseada no conceito de probabilidade posterior das hipteses filogenticas. A probabilidade posterior de uma topologia pode ser interpretada
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como a sua probabilidade de ser a que representa a verdadeira histria evolutiva do grupo de organismos estudados, portanto por esse mtodo a topologia com a maior probabilidade posterior deve ser a melhor estimativa da evoluo do grupo. Para calcular a probabilidade posterior usado o teorema de Bayes que combina a probabilidade a priori da topologia, com sua probabilidade de explicar a distribuio dos estados de carter nos txons atuais com base em um modelo evolutivo (verossimilhana). A probabilidade a priori de uma topologia definida como sua probabilidade com base em dados independentes dos dados que sero usados na anlise, por exemplo, pode ser gerada a partir da taxonomia vigente do grupo (Holder e Lewis, 2003). Diferentemente da verossimilhana, onde os valores de parmetro do modelo evolutivo so pr definidos, em um contexto bayesiano, a escolha da melhor topologia implica em calcular a probabilidade posterior para todas as hipteses, assim como sua integrao com todas as possveis combinaes de tamanho de ramos e valores dos parmetros dos modelos de substituio de nucleotdeos (Huelsenbeck e col., 2001; Holder e Lewis, 2003; Felsenstein, 2004). Mesmo com a utilizao de buscas heursticas, impossvel realizar todo esse clculo analiticamente, portanto a aproximao das probabilidades posteriores das topologias realizada atravs da cadeia Markov de Monte Carlo (Markov chain Monte Carlo- MCMC) (Felsenstein, 2004). O algortmo MCMC gera uma cadeia conceitual no espao de parmetros (que so as topologias possveis, com todas as combinaes de parmetros do modelo evolutivo) atravs de uma seqncia de passos. A partir de uma topologia inicial qualquer do espao, gerada uma nova topologia pela perturbao de alguns parmetros do modelo evolutivo. Essa nova topologia aceita ou no em comparao com a anterior, de acordo com um teste estatstico descrito por Metropolis e col. (1953). Cada comparao entre topologias corresponde a uma gerao da cadeia. Na maior parte das vezes so aceitas as topologias com maior probabilidade, porm esse procedimento intercalado pela escolha de topologias com menor probabilidades em algumas geraes, para favorecer a mudana de localizao no espao de parmetros. Repetindo esse processo milhes de vezes, uma grande cadeia de localizaes no espao de parmetros criada. Ao atingir regies de alta probabilidade posterior, dificilmente so aceitos movimentos para regies de probabilidade mais baixa no espao de parmetros. A proporo de vezes que uma topologia visitada, aps a cadeia atingir o equilbrio, uma aproximao vlida da sua probabilidade posterior. O mesmo vale para cada valor de parmetro do modelo evolutivo e para as diferentes combinaes de tamanho de ramo (Holder e Lewis, 2003; Felsenstein, 2004).

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Em geral, mais de uma topologia e valores de parmetros apresentam probabilidades altas e muito prximas, portanto, obtida uma amostragem de hipteses mais provveis ao invs de uma nica topologia. As pores congruentes das vrias topologias podem ser sumarizadas em uma topologia consenso onde a probabilidade posterior aproximada de cada clado pode ser representada e uma forma de avaliar seu suporte. Utilizando um nmero muito grande de geraes, possvel amostrar as regies com maior probabilidade do espao de parmetros, o que torna o algoritmo bem acurado (Holder e Lewis, 2003). No entanto, no possvel saber se a MCMC atuou tempo suficiente para prover estimativas confiveis das probabilidades posteriores. Uma estratgia recomendada a gerao independente de vrias MCMC, com nmeros altos de geraes para verificar se independentemente as mesmas hipteses so recuperadas no equilbrio de cada uma delas (Shoemaker e col., 1999; Huelsenbeck e col., 2001; Felsenstein, 2004).

1.4. Mapeamento de caracteres em uma hiptese filogentica 1.4.1. Aspectos gerais Para entender vrios aspectos dos processos evolutivos, no basta conhecer os estados dos caracteres dos organismos atuais, mas tambm precisamos saber como eram os estados nos seus ancestrais. Embora o registro fssil fornea informaes a respeito de vrias caractersticas fsicas e comportamentais dos organismos ancestrais, em diversos casos, os fsseis no esto disponveis ou no esto suficientemente preservados para obter a informao necessria. A fim de preencher essa lacuna, uma alternativa que vem sendo empregada amplamente a inferncia do estado dos organismos ancestrais, a partir do mapeamento dos estados de caracteres presentes nos organismos atuais em uma hiptese filogentica. Vrios erros esto associados a esse tipo de anlise, entre eles o da hiptese filogentica e o da reconstruo dos estados ancestrais do carter. Apesar disso, essa ferramenta tem se revelado til nas mais diversas reas do conhecimento evolutivo, por exemplo, na reconstruo de receptores de estrgeno ancestrais (Thornton e col., 2003), na inferncia de comportamentos ancestrais de abelhas (Schwarz, e col., 2003) e na identificao de padres de disperso de grupos (Waters e Roy, 2004). As inferncias dos estados nos ancestrais podem ser realizadas pelos mtodos de mxima parcimnia ou mxima verossimilhana (Maddison e Maddison, 2004).

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1.4.2. Mapeamento de caracteres por mxima parcimnia O mapeamento por mxima parcimnia infere os estados ancestrais que minimizam o nmero de passos de mudana do carter na hiptese filogentica a partir da distribuio dos estados nos organismos atuais. Consideremos um exemplo hipottico, onde um carter com dois estados, preto (0) e branco (1) apresentam a mesma probabilidade de sofrer mudana entre os dois estados (modificado de Ronquist, 2004). A partir de uma dada hiptese filogentica e distribuio dos estados nos terminais (Figura 1.4), a reconstruo mais parcimoniosa da evoluo do carter sugere dois eventos de mudana de estado e tambm que os ancestrais A e B apresentavam o estado de carter preto, enquanto os os ancestrais C, D, E e F apresentavam estado ancestral do carter branco (Figura 1.4a). A anlise por mxima parcimnia permite considerar caracteres no-ordenados, ordenados e pesagem diferencial nas diferentes mudanas de estado (Maddison e Maddison, 2004; Ronquist, 2004). 1.4.3. Mapeamento de caracteres por mxima verossimillahana No mapeamento por verossimilhana a probabilidade de mudana entre os estados de carter observados nos terminais estimada. A partir dessas probabilidades e dos comprimentos de ramo da topologia, em questo, as probabilidades dos estados nos ancestrais so estimadas. Nesse caso, considerando o mesmo exemplo para explicar o mapeamento por parcimnia e assumindo a mesma probabilidade de mudana entre os estados preto e branco (0,5), o estado de carter dos ancestrais A, B e F no so tidos como certos, mas uma probabilidade dada para cada estado. Por exemplo, o n ancestral C apresenta maior probabilidade de que o estado tenha sido branco. Uma vantagem do mapeamento por verossimilhana em comparao ao mapeamento por pascimnia que a probabilidade de estado em um ancestral no depende dos estados estimados em outros ancestrais (Figura 1.4b) (Ronquist, 2004).

a)

b)

Figura 1.4. Mapeamento de caracteres em uma hiptese filogentica. a) por mxima parcimnia; b) por mxima verossimilhana, tamanhos de ramo proporcionais rgua, p - probabilidade de mudana entre os estados (modificado de Ronquist, 2004).
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1.5. Datao molecular 1.5.1. Fundamentos A hiptese do relgio molecular prope que os genes e seus produtos evoluem sob uma taxa constante ao longo do tempo e das linhagens (Zuckerkandl e Pauling, 1965). Essa hiptese recebeu popularidade imediata por diversas razes. A principal vantagem que a teoria ofereceu foi a possibilidade de inferir o tempo de divergncia entre duas linhagens a partir do nmero de substituies entre as suas seqncias de DNA, independentemente de informaes fsseis. Isso rapidamente se tornou uma aplicao comum, sendo propostos vrios relgios moleculares universais, que foram empregados em uma ampla gama de trabalhos buscando entender diversos aspectos evolutivos e biogeogrficos (Bermingham e col., 1992; Doolittle e col., 1996; Hedges e col., 1996; Wang e col., 1999). Um dos relgios moleculares gerais mais amplamente utilizados foi a taxa de 2% de substituio de nucleotdeos por milho de anos para o genoma mitocondrial, proposto inicialmente para mamferos (Brown e col., 1979) e estendido para outros grupos de vertebrados, como aves (Shields e Wilson, 1987) e aplicado em diversos estudos (ex., Klicka e Zink, 1997; Ribas e Miyaki, 2004). No entanto, apesar do impacto do relgio molecular nos estudos evolutivos, com o acmulo de dados gerados ficou evidente a existncia de uma heterogeneidade muito maior do que se acreditava inicialmente nas taxas de substituio entre diferentes linhagens. Como resultado disso, foi proposta a idia de relgios moleculares locais. Por essa proposta, se a taxa de substituio for constante entre grupos taxonomicamente prximos, possvel estimar o tempo de divergncia dentre os mesmos aplicando um ponto de calibrao especfico para o grupo (Swofford e col., 1996; Fleischer e col., 1998; Yoder e Yang, 2000). A fim de verificar se um conjunto de txons est evoluindo sob uma mesma taxa, duas estratgias so amplamente utilizadas: o teste de taxa relativa (relative rate test; Takezaki e col., 1995; Margoliash, 1963; Sarich e Wilson, 1967; Graur e Li, 2000) e o teste de razo de verossimilhana (likelihood ratio test; Felsenstein, 1988). O teste de taxa relativa compara estatisticamente o nmero de substituies entre cada dois txons com o nmero de substituies de cada uma em relao ao grupo externo mais prximo. Se a diferena no nmero de substituies em cada linhagem for estatisticamente diferente ao nvel de significncia de 5% comparado ao grupo externo, o teste considera que as linhagens no esto evoluindo sob uma taxa constante (Takezaki e col., 1995). Pelo teste de razo de verossimilhana, so comparadas por c as probabilidades da topologia estimada sem a hiptese do relgio molecular e da mesma topologia forando os
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comprimentos dos tamanhos de ramo a apresentarem taxa constante (topologia linearizada). Para esse teste o nmero de graus de liberdade definido pelo nmero de txons menos dois. Caso as topologias apresentem probabilidades significantemente diferentes, a hiptese de taxa constante no aceita (Felsenstein, 1988; Posada e Crandall, 1998). Quando a heterogeneidade de taxas de substituio entre os txons identificada, uma das estratgias utilizadas a excluso dos txons ou dos genes que apresentam desvio significativo em relao aos demais da anlise. A divergncia entre os demais pode ser calculada atravs dos tamanhos de ramo da topologia linearizada (Takezaki e col., 1995). No entanto, essa estratgia faz uso ineficiente da informao obtida pelas seqncias de DNA porque em alguns casos, muitos txons devem ser excludos antes de se estimar as datas de divergncia (Arbobast e col., 2002). Alm disso, em alguns casos, os testes de identificao de variao de taxa podem ser ineficientes, como por exemplo, quando a seqncia curta ou os genes apresentam baixas taxas de substituio. Falha na deteco de variao de taxas pode levar a um erro sistemtico nas estimativas de tempo de divergncia, j que pode superestimar algumas datas (Bromham e Penny, 2003). A fim de evitar esses problemas, mtodos mais recentes de datao molecular, como o non-parametric rate smoothing (nprs; Sanderson, 1997), penalized likelihood (PL; Sanderson, 2002) e o mtodo bayesiano (Thorne e col., 1998, Kishino e col., 2001) acomodam a variao nas taxas de substituio de nucleotdeos entre as linhagens.

1.5.2. Mtodos NPRS e PL O princpio bsico do mtodo NPRS assumir taxas evolutivas locais para cada n da topologia e minimizar a variao entre essas taxas ao longo da topologia pela aplicao de uma penalidade noparamtrica. Essa penalidade de mudana abrupta (roughness penality) determinada pelo quadrado mnimo da diferena entre as taxas dos ramos ancestrais e descendentes e a varincia nas taxas entre os ramos descendentes e a raz (Sanderson, 1997). O mtodo PL utiliza o mesmo principio bsico que o NPRS, mas utiliza uma aproximao semi paramtrica para encontrar um valor timo de um parmetro de suavizao (smoothing parameter), que pode variar entre dois extremos, para a penalidade de mudana abrupta. Em um extremo, existe o modelo do relgio molecular, onde as taxas no variam (para o qual o parmetro de suavizao tende ao infinito), e no outro, existe o modelo saturado, onde cada ramo apresenta uma taxa independente (para o qual o parmetro de suavizao tende a zero). O teste de validao cruzada (crossvalidation) empregado para encontrar o valor ideal do parmetro de suavizao para o conjunto de
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dados. Por esse mtodo, ramos terminais so independentemente excludos da topologia. O tamanho de ramo desse terminal ento estimado com base na taxa dos demais ramos e na penalidade de mudana abrupta, considerando diversos valores do parmetro de suavizao. Os valores estimados so ento comparados com os valores observados. Esse processo repetido at que o valor escolhido para o parmetro de suavizao aquele que melhor aproxima os valores estimados dos tamanhos de ramo aos valores observados. O PL se revelou superior aos mtodos que assumem linearizao e ao NPRS, porque o teste de validao cruzada permite avaliar se para um conjunto de dados melhor assumir um modelo onde as taxas so constantes ao longo das linhagens (relgio molecular), ou mais variveis, ou ainda qualquer categoria intermediria entre esses dois extremos (Sanderson, 2002).

1.5.3. Mtodo bayesiano O mtodo bayesiano de datao usa um modelo probabilstico para descrever a mudana das taxas de evoluo ao longo dos ramos e utiliza uma cadeia Markov de Monte Carlo para aproximar as probabilidades posteriores das taxas e dos tempos (Thorne e col., 1998; Kishino e col., 2001). Esse mtodo, assim como o NPRS e o PL tambm assume que cada ramo apresenta uma taxa independente, mas constante ao longo do ramo e existe uma autocorrelao entre as taxas dos diferentes ramos ao longo do tempo evolutivo. O mtodo parte de uma topologia pr definida e o intervalo de tempo para pelo menos um dos ns, mas ao contrrio dos dois outros mtodos (NPRS e PL), no assume os valores fixos de tamanho de ramo. Os parmetros para o modelo evolutivo podem ser estimados para cada partio de dados a partir da topologia e das seqncias. Com base no modelo evolutivo, na topologia e na matriz de dados, so estimados os tamanhos de ramo e seus respectivos valores de varincia e covarincia. Como o clculo analtico das taxas evolutivas para cada ramo leva em conta todos os valores dos parmetros do modelo evolutivo, a variao dos tamanhos de ramo e a prpria incerteza dos tempos de divergncia levaria muito tempo computacional, esses valores so aproximados pela MCMC. Para essa MCMC so definidos como parmetros iniciais a taxa de evoluo molecular da raiz do grupo interno, a mdia da data da raiz do grupo interno e seus respectivos desvios padres. O resultado final aproxima as estimativas de tempo de divergncia das linhagens e fornece os valores do intervalo de credibilidade de cada n (Thorne e col., 1998; Kishino e col., 2001; Thorne e Kishino, 2002).

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1.5.4. Pontos de calibrao Alm da heterogeneidade de taxa evolutiva ao longo das linhagens, outra questo amplamente debatida no emprego da datao molecular envolve a escolha de pontos de calibrao adequados. Com a adoo de relgios moleculares locais, devido evidente variabilidade nas taxas evolutivas em diferentes linhagens, a utilizao de uma taxa geral se revelou inadequada (Lovette, 2004). Portanto, para obter estimativas de tempo de divergncia mais confiveis, pontos de calibrao especficos devem ser adotados para cada linhagem (Bromham e Penny, 2003). Um dos mtodos mais confiveis de calibrao a utilizao de evidncias fsseis que sustentem limites para a diversificao entre duas ou mais linhagens includas na topologia que se pretende utilizar para estimar os tempos de divergncia. No entanto, mesmo quando h disponibilidade do fssil em questo, trs principais fontes de erros devem ser consideradas nesse caso: a) erro na inferncia filogentica do grupo em questo; b) erro na identificao e posicionamento filogentico do fssil em questo; c) erro na identificao da data do fssil. Em aves, o registro fssil muito incompleto devido em grande parte prpria natureza dos ossos pneumticos, que dificultam a fossilizao (Arbobast e col., 2002; Bromham e Penny, 2003; Lovette, 2004). Uma outra maneira de escolher pontos de calibrao a utilizao de eventos geolgicos associados diversificao de um dos grupos em questo. Por exemplo, a origem de ilhas ocenicas cujas datas de emergncia so conhecidas (Fleischer e col., 1998). Porm, da mesma forma, existem erros que podem estar associados a essa calibrao, como por exemplo: a) a preciso do intervalo de tempo para a formao da ilha; b) tempo de colonizao das populaes aps a formao de cada ilha; c) possibilidade de migrao entre as ilhas no caso de aves com grande capacidade de disperso; d) erro na inferncia filogentica do grupo em questo (Bromham e Penny, 2003). Por causa dos erros que podem estar associados a um particular ponto de calibrao e o aumento do erro da prpria estimativa de tempo a medida em que os ns distanciam-se dessa regio da topologia, o ideal usar uma abordagem mltipla, onde vrios pontos de calibrao so empregados (ex. van Tuinen e Hedges, 2001).

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1.6. Objetivos A presente tese tem por objetivos:

Inferir as relaes filogenticas entre os gneros da tribo Arini por meio de dados moleculares a partir de um grande nmero de seqncias dos genomas mitocondrial e nuclear.

Estimar o tempo de divergncia entre as linhagens e comparar essas estimativas com eventos histricos paleogeogrficos descritos para a regio neotropical que possam ter influenciado a diversificao dos psitacdeos neotropicais.

Determinar a organizao dos genes mitocondriais ao redor da regio controladora atravs do sequenciamento de pores entre o final do gene citocromo b e o incio do DNA ribossomal 12S de representantes das linhagens de psitacdeos neotropicais. A anlise dessas seqncias em conjunto com a filogenia e a datao da divergncia entre as linhagens visa compreender melhor a evoluo do genoma mitocondrial no grupo.

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1.7. Referncias Arbobast, B.S, Edwards, S.V., Wakeley, J., Beerli, P. ,Slowinski, J.B., 2002. Estimating divergence times from molecular data on phylogenetic and population genetic timescales. Annu. Rev. Ecol. Syst. 33, 707740. Barrowclough, G.F., Groth, J.G., Mertz, L.A., 2004. Phylogenetic relationships among parrots. One Hundred and Twenty-Second Stated Meeting of the American Ornithologists Union. 16 21 August, Laval, Quebec. Beissinger, S.R., 2000. Ecological mechanisms of extinction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1168811689. Bermingham, E., Rohwer, S., Freeman, S., Wood, C., 1992. Vicariance biogeography in the Pleistocene and speciation in North American wood warblers: a test of Mengels model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 662428. Boetticher, H.von, 1943. Gedanken uber die systematic Stellung einiger Papagaien. Zool. Anz. 143, 191-200. Boetticher, H.von, 1959. Papagaien. Wittenberg Lutherstadt, A. Ziemsen. Boles, W.E., 1993. A new cockatoo (Psittaciformes: Cacatuidae) from the Tertiary of Rivers Leigh, northwestern Queensland, and an evaluation of rostral characters in the systematics of parrots. Ibis 135, 8-18. Boles, W.E., 1998. A budgerigar Melopsittacus undulatus from the Pliocene of Rivers Leigh, northwestern Queensland. EMU 98, 32-35. Brereton, J.L., 1963. Evolution within the Psittaciformes. Proc. Internatl. Ornitol. Congr. 13, 499-517. Bromham, L., Penny, D., 2003. The modern molecular clock. Nature 4, 216-224. Brown, W.M., George, M.J., Wilson, A.C., 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 361, 119-134. Chauvir, C.M., 1992. Une nouvelle famille de Perroquetes (Aves, Psittaciformes) dans l`Eocene suprieour des phosphorites du Qherci, France. Geobios 14, 169-177. Clarke, J.A., Tambussi, C.P., Noriega, J.I., Erickson, G.M, Ketcham, R.A., 2005. Definitive fossil evidence for the exant avian radiation in the Cretaceous. Nature 433, 305-308. Collar, N.J., 1997. Family Psittacidae (Parrots). In: del Hoyo, J., Elliot, A.E., Sargatal, J.(Eds.) Handbook of the Birds of the World, vol. 4. Sandgrouse to Coockos. Lynx Edicins, Barcelona. Pp. 679.

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Relaes filogenticas e biogeografia histrica dos psitacdeos neotropicais (tribo Arini) com base em seqncias de DNA mitocondrial e nuclear

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2.1. Introduo Os psitacdeos neotropicais formam o grupo de espcies mais numeroso da ordem Psittaciformes (150 das 330 espcies reconhecidas) e inclui 30 gneros (Collar, 1997, Rowley, 1997). Apresentam uma grande variao de tamanho, preferncia de hbitat, distribuio geogrfica e comportamento (Forshaw, 1989). A sistemtica do grupo tem sido discutida h muito tempo. Os sistematas mais antigos, com base em morfologia externa e anatomia (Salvadori, 1891; Boetticher, 1943, 1959; Verheyen, 1956), e comportamento (Brereton, 1963) distribuam os gneros neotropicais em dois grupos de composio varivel, em alguns casos incluindo txons de outras regies geogrficas. Verheyen (1956) agrupou exclusivamente txons neotropicais nas famlias Amazoninae e Arinae e sugeriu que esses grupos compartilham caractersticas morfolgicas (presena de quatro vrtebras dorsais, uma nica cartida dorsal, entre outras) que os distinguem dos psitacdeos das demais regies geogrficas, mas no sugeriu uma categoria para agrup-los. Em uma reviso abrangente da sistemtica da ordem Psitaciformes, Smith (1975) agrupou todos os txons neotropicais na tribo Arini (famlia Psittacidae) com base em dois caracteres exclusivos (ecloso dos filhotes com canal auditivo imperfurado e postura copulatria em uma perna) e considerou artificial os agrupamentos internos at ento propostos na tribo. Na falta de estudos mais abrangentes, essa proposta foi aceita em todas as classificaes posteriores (por exemplo, Forshaw, 1989; Collar, 1997). Atualmente, o monofiletismo da tribo Arini vem sendo corroborado por estudos de filogenia molecular incluindo diversos gneros representantes da ordem (Barrowclough e col., 2004; de Kloet e de Kloet, 2005). Em uma anlise de 1.771 pares de bases (pb) de genes mitocondriais realizados com representantes de nove gneros da tribo Arini dois grupos monofilticos foram recuperados e referidos pelos autores como psitacdeos de cauda longa e psitacdeos de cauda curta (Miyaki e col. 1998), o que estaria de acordo com uma chave de identificao proposta por Sick (1997). Exceto para o monofiletismo

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2005). Alm disso, alguns estudos tambm apontaram ausncia de monofiletismo nos gneros neotropicais Aratinga, Amazona e Pionopsitta (Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004; Ribas e col., 2005). Apesar de ser muito questionado, dados moleculares podem ser usados para estimar datas de divergncia entre os txons (Arbobast e col., 2002). Tendo tais estimativas, pode-se tentar associ-las a eventos paleogeoclimticos registrados no perodo de diversificao das linhagens. Em relao aos psitacdeos, a data estimada de separao entre o periquito australiano (Melopsittacus undulatus) e alguns txons neotropicais por volta de 76 milhes de anos atrs (ma; Miyaki e col., 1998) estaria de acordo com a hiptese de que a separao dos continentes teve um papel importante na diversificao desses grupos. Alm disso, a divergncia entre os gneros de psitacdeos neotropicais foi estimada entre o Eoceno-Oligoceno e durante o Mioceno (16-27 ma) e poderia estar associada a mudanas ambientais em consequncia de mudanas no nvel do mar, orogenia dos Andes e expanso de ambientes de floresta e de reas secas (Miyaki e col., 1998; Tavares e col., 2004). J o intervalo de divergncias entre espcies do mesmo gnero de psitacdeos foi (Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Ribas e col., 2005). No presente trabalho foram estudadas as relaes filogenticas da maioria dos gneros da tribo Arini, incluindo representantes de diferentes linhagens de gneros no-monofilticos. Foi utilizado um grande conjunto de seqncias de DNA nuclear e mitocondrial totalizando 6.461 pb. A informao filogentica de alguns caracteres morfolgicos, comportamentais e gentico tambm foi analisada com base na filogenia obtida. Alm disso, o tempo de divergncia entre as linhagens de psitacdeos neotropicais foi estimado por mtodos que levam em conta a taxa de variao nas substituies de nucleotdeos entre as linhagens e hipteses biogeogrficas sobre a diversificao do grupo foram propostas com base nesses resultados. estimado entre 0,5 e 1,3 ma

2.2. Material e Mtodos 2.2.1. Amostragem Foram obtidas amostras de 29 espcies representantes de 25 dos 30 gneros da tribo Arini (Tabela 2.1). Como estudos filogenticos anteriores sugerem a ausncia de monofiletismo dos gneros Aratinga, Amazona e Pionopsitta (Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004; Ribas e col., 2005), foram amostrados dois ou trs txons de cada um desses gneros, representando as diferentes linhagens apontadas por esses trabalhos.

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Tabela 2.1. Txons amostrados. Razo entre comprimento da asa e comprimento da cauda, espcimen analisado e estados da forma da cauda, narinas e anel perioftlmico. Espcies Amazona farinosa Amazona xanthops Anodorhynchus hyacinthinus Ara ararauna Aratinga aurea Aratinga leucophthalmus Aratinga solstitialis Bolborhynchus lineola Brotogeris chiriri Cacatua goffini Cyanoliseus patagonus Cyanopsitta spixii Deroptyus accipitrinus Diopsittaca nobilis Enicognathus leptorhynchus Forpus crassirostris Graydidascalus brachyurus Guarouba guarouba Melopsittacus undulatus Myiopsitta monachus Nandayus nenday Nanopsittaca dachilleae Orthopsittaca manilata Pionites leucogaster Pionopsitta pileata Pionopsitta barrabandi Pionus maximiliani Primolius auricollis Pyrrhura leucotis Rynchopsitta pachyryncha Triclaria malachitacea
a

Amostra 3683 1876 5281 13 346 2090 2042 4393 5486 4582 4967 409 395 973 5173 501 1624 69 4999 2821 143 5495 1852 2377 3467 389693 1219 1742 3921 5237 415

asa/ cauda 1,9 2,6 0,8 0,8 1,2 1,2 1,1 1,9 1,3 1,0 0,8 1,4 1,2 1,2 2,1 2,9 1,4 1,1 1,2 2,3 1,1 2,1 2,1 2,4 2,2 1,1 1,0 1,6 1,4
b

Voucher MZUSP 6731 4330 32290 13992 14893 10653 6490 13080 74601 2272 76154 44059 15897 21754 39569 22573 43982 2277 13083 38318 12226 69441 3501 14015 44077 34495 28102
c

Forma cauda A A C C C C C C C C C A C C A A C C C A
e d

Narinas E E C E E E E E E E E E E C E E E C E E E E E E E E E
e

Anel perioftlmico N N N N N N N C N C N N N C C C N C N C N N N N N N N
e g

C C A A A C C C A
e

C E

N N

Registro na coleo do Laboratrio de Gentica e Evoluo Molecular de Aves (LGEMA), b Universidade de So Paulo, exceto 389693 registrado no Field Museum of Natural History; Razo c obtida a partir de espcimens machos, (Forshaw, 1989); Museu de Zoologia da Universidade de So d e Paulo; A- arredondada, C acuneada; Dados obtidos de literatura (Salvadori, 1890; Forshaw, 1989; f g Collar, 1997); E - expostas, C- cobertas por penas; N- nu e evidente, C- coberto por penas.

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Para compor o grupo externo mais prximo foram selecionados os psitacdeos australianos Melopsittacus undulatus (tribo Platycercini) e Cacatua goffini (famlia Cacatuidae) e o psitacdeo da Nova Zelndia Strigos habroptilus (tribo Strigopini, famlia Psittacidae, NC_005931; Harrison e col., 2004). Falco peregrinus (NC_000878; Mindell e col., 1998; AY461399, Griffiths e col., 2004), Aburria aburri (AF165466, AY143680, AY140740, AY140768, AY165454, AF165442; Pereira e col., 2002) e Gallus gallus (X52392, Desjardins e Morais, 1990; AF143730, Groth e Barrowclough, 1999) foram selecionados como grupos externos mais distantes para enraizar a topologia. A classificao dos psitacdeos adotada nesse trabalho segue Collar (1997), exceto por Propyrrhura, para o qual adotamos Primolius de acordo com Penhallurick (2001).

2.2.2. Extrao de DNA e sequenciamento O DNA foi extrado a partir de tecido sangneo em soluo contendo 0,1% de SDS, Tris-HCl 100mM (pH 8.0), EDTA 10 mM e 10 mg/mL de proteinase K mantido a 55 C por aproximadamente 4 horas. O DNA foi purificado por procedimento padro com fenol: clorofrmio: lcool isoamlico (Bruford e col., 1992). A amplificao dos segmentos de DNA foi realizada por Polymerase Chain Reaction (PCR) em 25 L de reao com soluo tampo 1x (Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl2 2,5mM, gelatina a 0,01%, 160 g/ mL de BSA), 2 M de cada dNTP, 1M de cada primer, 1 U de Taq polimerase (Pharmacia) e 25-50 ng de DNA. As condies da reao de PCR foram: desnaturao inicial a 95C por 5 minutos (min.), seguido de 30 ciclos de 95 C por 60 segundos (seg.), 50 C por 25 seg., 72 C por 80 seg., e uma extenso final de 72 C por 7 min. Os segmentos amplificados foram purificados por corte de banda do gel de agarose e centrifugao atravs de uma ponteira com filtro. As seqncias foram obtidas nos seqenciadores automticos Li-Cor 4200 bi-direcional e ABI3100 de acordo com protocolo sugerido pelos fabricantes. Foram obtidas as seqncias de DNA do gene nuclear RAG-1, e dos genes mitocondriais citocromo b, NADH2, ATPase 6, ATPase 8, COIII, DNAr 12S e DNAr 16S. Os primers usados foram R1 (5- GACAAACATCATCTCAGGAAGAAGAT -3), R11 (5- GGACCAGTAGATGATGAAACTCCT -3), R13 (5- TCTGAATGGAAATTCAAGATGTT -3), R14 (5- TTCCTGTGGATACTCCAGCA -3), R17 (5- CCCTCCTGCTGGTATCCTTGCTT -3), R18 (5GATGCTGCCTCGGTCGGCCACCTTT -3), R19 (5- GTCACTGGGAGGCAGATCTTCCA -3), R21 (5GGATCTTTGAGGAAGTAAAGCCCAA -3), R20 (5- CCATCTATAATTCCCACTTCTGT -3), R22 (5GAATGTTCTCAGGATGCCTCCCAT -3), R24 (5- GCCTCTACTGTCTCTTTGGACAT -3) e R2B (5GAGGTATATAGCCAGTGATGCTT -3) para o RAG-1 (Groth e Barrowclough, 1999); b1 (5- CCATCC ACCATCTCAGGATGATGAAA - 3), b52 (5- GNAAATCYCACCCNCTWCTHAAAAT -3) e b6 (5- GTC
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o o o o o

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TTCAGTTTTGGTTTACAAGAC -3) para o citocromo b (Kocher e col., 1989); MetL (5- AAGCTATCG GGCCCATACCCG 3), ND2H (5- CCTTGAAGCACTTCTGGGAATCAGA -3), ND2-54H (5- GGG GTGGTGAGATTTTGCGA- 3) e ASNH (5- GATCRAGGCCCATCTGTCTAG -3) para o NADH2; LysL (5- CAGCACTAGCCTTTTAAGCT -3), COIIIRH (5- ATTATTCCGTATCGNAGNCCYTTTTG -3), A5 (5- TAGGAGTGTGCTTGGTGTGCCATT- 3) e ATP6L (5- AAAYATYTAATGGCACACCAAGC- 3) para os genes ATPase 6, ATPase 8 e COIII; L1537 (5- AATCTTGTGCCAGCCACCGCGG -3) e 12Send (5- GTGCACCTTCCGGTACACTTACC -3) para o DNAr 12S; 16Sa (5- AAGCCWANCGAG CYGGGTGATAGCTGG -3), 16Sb (5- CATAGATAGAAACCGACCTGG -3), 16Sc (5- TTCTTCAAG GTCGCCCCAACC -3) e 16Se (5- GCACGGTTAGGATACCGCGGCCG -3) para o RNAr 16S (Oliver Haddrath, comunicao pessoal). As seqncias de DNA foram depositadas no GenBank com os nmeros de acesso: DQ143281-DQ143297 para citocromo b; DQ143298-DQ143324 para NADH2; DQ143250-DQ143280 para os genes ATPase 6, ATPase 8 e COIII; DQ143208-DQ143228 para 12S rDNA; e DQ143229-DQ143249 para o 16S rDNA. Foram obtidas do GenBank as seqncias de citocromo b para Diopsittaca nobilis (AF370769, Tavares e col., 2004), Pionopsitta barrabandi, Pionopsitta pileata e Triclaria malachitacea (AY669424, AY669437 e AY669439; Ribas e col., 2005) e de NADH2 para Amazona farinosa (AY194461; Eberhard e Bermingham, 2004), Pionopsitta barrabandi, Pionopsitta pileata e Triclaria malachitacea (AY669468, AY669481 e AY669486; Ribas e col., 2005).

2.2.3. Anlise das seqncias de DNA As ambigidades nas fitas complementares de DNA foram verificadas com o Sequencher 4.1.2 (GeneCodes Corp., Ann Arbor, Michigan). O alinhamento dos genes foi verificado visualmente no MacClade 4.0 (Maddison e Maddison, 2000). As lacunas de alinhamento, as regies com alinhamento ambguo e as regies de sobreposio entre as ATPases 8 e 6, e a ATPase 6 e o COIII foram excludas da matriz de dados. A composio de bases, as taxas de transio e transverso e a distncia gentica entre seqncias de nucleotdeos foram calculadas no PAUP* 4.0b10 (Swofford, 2002). O grau de saturao das seqncias foi avaliado para cada gene pela relao entre o nmero de transies e o nmero de transverses pelas distncias par a par corrigidas entre os txons. Diferenas de composio de base entre txons no so corrigidos pela maior parte dos mtodos de reconstruo filogentica e topologias inadequadas podem ser escolhidas quando as diferenas de composio so expressivas (Penny e col., 1990; Lockhart e col., 1994; Foster e Hickey, 1999; Chang e Champbell, 2000; Haddrath e Baker, 2001; Paton e col., 2002). Por isso, os stios
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variveis de cada gene foram avaliados quanto ao desvio de composio de bases usando o Treepuzzle 5.0 (Schmidt e col., 2002). Nessa anlise, os stios invariveis foram excludos j que podem mascarar a deteco de desvio composicional entre os txons (Foster e Hickey, 1990). A presso de mutao simtrica direcional atuando nos genes que codificam para protenas foi estimada com o programa DMP 2.0 (Jermin e col., 1996).

2.2.4. Anlises filogenticas O modelo mais adequado para cada partio de dados foi selecionado pelo teste de razo de verossimilhana (hierarchical likelihood ratio tests- LRT) implementado no Modeltest 3.6 (Posada e Crandall, 1998). As anlises bayesianas foram realizadas no MrBayes 3.0 (Ronquist e Huelsenbeck, 2003), utilizando a amostragem pela Markov Chain Monte Carlo (MCMC), inicialmente para cada gene em separado, para a partio nuclear, para a partio mitocondrial e para a matriz total concatenada, para verificar se as diferentes parties suportam resultados incongruentes e para verificar se a adoo de modelos independentes para cada partio mais adequada. A anlise bayesiana final foi realizada para a matriz combinada dos genes, assumindo diferentes modelos e respectivos parmetros para cada gene considerado. Foram executadas quatro buscas independentes, cada uma com 2 milhes de geraes, uma cadeia fria e quatro quentes, uma topologia amostrada a cada 1000 geraes e o descarte (burnin) determinado pela convergncia nos valores de verossimilhana das topologias. As probabilidades posteriores dos ramos foram computadas para todas as anlises bayesianas descartando-se as topologias amostradas antes da convergncia dos valores de verossimilhana na cadeia de Marcov. O modelo evolutivo e seus respectivos parmetros estimados por LRT no Modeltest 3.6 (Posada e Crandall, 1998) foram usados como estimativas iniciais na busca por mxima verossimilhana (MV) realizada no PAUP* 4.0 b10 (Swofford, 2002), por busca heurstica a partir de 5 rvores iniciais geradas por adio aleatria de txons (stepwise addition) e algoritmo tree bisection and reconnection (TBR) para gerar diferentes topologias. O suporte dos ns da busca por MV foi estimado por bootstrap no paramtrico (Effron, 1979; Felsenstein, 1985) com 100 rplicas, cada uma iniciada por uma topologia gerada por adio aleatria de txons no programa PAUP* 4.0b10 (Swofford, 2002), usando o mesmo modelo e valores de parmetros assumidos na busca por MV. Adicionalmente, foi realizada uma busca por MV utilizando um modelo no-homogneo de substituio de nucleotdeos no programa NHML 3.0 (Galtier e Gouy, 1998), utilizando a correo para taxa de substituio entre os stios HKY+G (Hasegawa e col., 1985). Devido ao grande nmero de
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terminais (n=32), o tempo computacional para realizao de uma busca mais abrangente seria muito grande, portanto os ns que apresentaram valores de bootstrap superiores a 90% na busca por MV foram fixados.

2.2.5. Comparao das diferentes topologias Para comparar as topologias obtidas pelos diferentes mtodos foi utilizado o teste aproximadamente no enviesado (AU, approximately unbiased; Shimodaira, 2002) implementado no programa CONSEL (Shimodaira e Hasegawa, 2001). O teste AU utiliza uma tcnica de bootstrap multi-escalonado, na qual vrios conjuntos de rplicas da matriz de dados inicial so gerados, podendo ter alterao no tamanho da matriz. O nmero de vezes que a hiptese suportada pelas rplicas calculado para cada conjunto de dados para obter valores de bootstrap a partir das matrizes de tamanho varivel (Shimodaira, 2002).

2.2.6. Mapeamento de caracteres morfolgicos, comportamentais e gentico na filogenia molecular Oito caracteres que foram utilizados para agrupar ou diagnosticar gneros de psitacdeos neotropicais em classificaes (Salvadori, 1891; Brereton e Immelmann, 1961; Forshaw, 1989), que foram considerados em estudos sistemticos (Smith, 1975), ou que foram apontados como exclusivos de um grupo (Miyaki e col., 1997) foram mapeados na topologia consenso da anlise bayesiana no programa Mesquite 1.05 (Maddison e Maddison, 2004), para avaliar a informao filogentica dos mesmos. O mapeamento foi realizado por verossimilhana assumindo a mesma probabilidade de mudana entre os estados. Os caracteres e seus respectivos estados so: 1) o tamanho da cauda (Salvadori, 1891); como a definio original desse estado no clara e envolvia a forma da cauda tambm, separamos o tamanho e a forma da cauda e redefinimos os estados do tamanho da seguinte forma: longa (razo entre comprimento da asa e comprimento da cauda menor que 1,7) ou curta (razo entre comprimento da asa e comprimento da cauda maior do que 1,8); 2) forma da cauda (Salvadori, 1891, redefinido como caracter independente do tamanho da cauda no presente trabalho): acuneada (penas gradualmente maiores das bordas em direo ao centro), ou arredondada (todas as penas com aproximadamente o mesmo tamanho) (Salvadori, 1891); 3) dimorfismo sexual aparente: presente ou ausente (Smith, 1975); 4) ris bi-colorida: presente ou ausente (Smith, 1975); 5) coar a cabea com o p: colocando a perna diretamente para frente por baixo da asa, ou passando o p indiretamente sobre a asa (Brereton e Immelmann, 1961); 6) narinas: expostas ou no expostas
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(Salvadori, 1891); 7) anel perioftlmico: nu e evidente, ou coberto por penas (Forshaw, 1989); 8) minissatlites ligados ao cromossomo W: presente ou ausente (Miyaki e col., 1997). A inferncia dos estados ancestrais no foi realizada para o carter 8, j que o mesmo no foi estudado para alguns dos txons considerados na presente hiptese filogentica. Os comprimentos da cauda e da asa foram obtidos de Forshaw (1989). Os estados para forma da cauda, narinas e anel perioftlmico foram obtidos da literatura (Salvadori, 1891; Forshaw, 1989) e confirmados em peles de museu (Tabela 2.1).

2.2.7. Tempos de divergncia A hiptese de existncia de relgio molecular entre as linhagens de psitacdeos neotropicais foi testada atravs do teste de razo de verossimilhana (LRT, likelihood ratio test; Posada e Crandall, 1998) comparando os valores de verossimilhana, da topologia assumindo e no assumindo o relgio molecular (valores obtidos no PAUP* 4.0b10; Swofford, 2002). Para verificar se as diferenas nos valores de MV nas diferentes situaes significativa, foi utilizado o teste c , onde o nmero de grau de liberdade foi definido como o nmero de txons menos 2. As estimativas dos tempos de divergncia foram obtidas pelos mtodos penalized likelihood (PL; Sanderson, 2002) e bayesiano (Thorne e col., 1998; Kishino e col., 2001), que no pressupem a existncia de taxa de evoluo constante ao longo das linhagens. O PL est implementado no programa r8s 1.5 (Sanderson, 2003) e assume um modelo paramtrico que permite a existncia de diferentes taxas de substituio em cada ramo e uma penalidade no paramtrica (roughness penality) que aumenta o custo da taxa de mudana se as taxas variarem de forma abrupta entre os ramos (Sanderson, 2002). Antes de estimar os tempos de divergncia, uma anlise de validao cruzada (Sanderson, 2002) foi realizada no r8s 1.5 (Sanderson, 2003) para determinar o melhor valor do parmetro de suavizao (smoothing) para a penalidade. Os tamanhos de ramo usados foram da topologia obtida pela anlise bayesiana, computada apenas com os genes mitocondriais, pois a seqncia de RAG-1 para Strigops no est disponvel. A estimativa de tempo de divergncia por inferncia bayesiana foi realizada no multidivtime (pacote multidistribute, http:// statgen.ncsu.edu/thorne/multidivtime.html), que usa um modelo probabilstico para descrever as mudanas de taxa de evoluo ao longo do tempo e usa a aproximao MCMC para obter as distribuies posteriores das taxas e tempos (Thorne e col., 1998; Kishino e col., 2001). Esse mtodo permite que cada gene seja analisado com um modelo evolutivo independente (Thorne e Kishino, 2002). Inicialmente o programa baseml no pacote PAML 2.0 (Yang, 1997) foi usado para obter as taxas de transio/ transverso, valores dos parmetros de substituio pelo modelo evolutivo HKY85g (Hasegawa e col., 1985), e valores do parmetro a para distribuio
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2

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gama de cada gene. Esses dados foram convertidos pelo paml2modelinf do pacote multidistribute para um formato reconhecido pelo estbranches do pacote multidistribute, que estima os tamanhos de ramo e seus respectivos valores de varincia-covarincia. Anlises de MCMC foram realizadas no multidivtime para aproximar os valores de distribuio posterior das taxas de substituio e tempos de divergncia. Os parmetros iniciais da distribuio a priori foram 9,0 e 0,2 para rttm (mdia a priori da data da raiz do grupo interno) e rttmsd (desvio padro da rttm), respectivamente e 0,094 para rtrate (mdia a priori da distribuio da taxa de evoluo molecular na raiz do grupo interno, aqui estimada pelo valor da mediana dos tamanhos de ramo de cada terminal at a raiz sobre o valor da rttm) e rtratesd (desvio padro da rtrate). Um grande valor de desvio padro (rttmsd e rtrates) foi escolhido para permitir que os genes apresentem uma grande variao nas taxas ao longo do tempo, j que a informao das taxas a priori desconhecida (Thorne e Kishino, 2002). Vrias simulaes foram realizadas para verificar a convergncia do algoritmo MCMC comparando os valores de distribuio posterior dos tempos de divergncia, tamanho de ramo e proporo de mudanas das diferentes corridas. Esse mtodo aceita amostragem incompleta dos txons para os diferentes genes, por isso RAG-1 foi includo na anlise mesmo sem a seqncia de Strigops habroptilus. Diversos estudos independentes de datao molecular em linhagens de aves apontam a origem de vrias ordens de Neoaves

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2.3. Resultados 2.3.1. Anlise das seqncias As amplificaes para cada gene resultaram em segmentos de bandas nicas em gel de agarose, de tamanhos entre 800 a 1.300 pares de bases (pb), que so maiores que a maioria das possveis cpias de genes mitocondriais incorporados no ncleo encontrados no genoma de Gallus gallus (Pereira e Baker, 2004). Alm disso, a anlise das seqncias codificadoras de protenas no indicou cdons de parada de leitura dentro dos genes, ou mutaes que alterassem o cdigo de leitura dos aminocidos. Dada a baixa ocorrncia de NUMTs em aves, improvvel que pseudogenes foram amplificados nesse estudo. As seqncias concatenadas totalizaram 6.416 pb de comprimento, sendo 2.703 pb de DNA nuclear e 3.713 pb de DNA mitocondrial (DNAmt). Substituies acumularam de modo proporcional s distncias corrigidas nas matrizes dos genes RAG-1, DNAr 12S e DNAr 16S. Ocorre saturao em genes mitocondriais nas comparaes entre psitacdeos e grupos externos de outras ordens de aves e nas transies dos genes codificadores mitocondriais entre os psitacdeos. A mdia entre as distncias par a par no corrigidas (distncia-p) calculadas separadamente para cada regio, sugere que RAG-1 apresenta a taxa de evoluo mais lenta (distncia-p entre psitacdeos neotropicais entre 0,04-4%), o que esperado para um xon de um gene nuclear codificador de protena. Entre os genes mitocondriais, os genes que apresentaram taxa de evoluo mais lenta foram os DNAr 12S (457 pb) e DNAr 16S (518 pb), nos quais a variao foi em torno de 1,1 a 9,2%; seguido dos genes codificadores de protenas citocromo oxidase III (191 pb) e citocromo b (888 pb), os quais variaram entre 3,1 a 16,3%; e NADH 2 (892 pb), com variao entre 5 a 20%. Os genes cujas taxas de substituio foram mais rpidas dentre os estudados so a ATPase 6 (673 pb) e a ATPase 8 (92 pb), cuja variao foi de 4,3 a 26,1%. As taxas de transio e transverso para os txons do grupo interno foram 3,15, 4,33 e 4,26 para o RAG-1, os genes mitocondriais e ambos concatenados, respectivamente. A composio de bases de RAG-1 de psitacdeos neotropicais foi: A=31,6-31,9; C=19,7-20,2; T=24,4-24,9 e G=23,5-23,8. Para a matriz de genes mitocondriais combinados a composio de bases foi: A=29,8-32,5; C=31,2-34,6; T=21,2-24,5 e G=12,3-14,2. Esses valores esto de acordo com as porcentagens encontradas para genes nucleares e mitocondriais de outras aves. Dentre os genes mitocondriais codificadores de protenas foi detectado um desvio significativo (p < 0,05) na composio de bases da terceira posio do cdon em 14 txons includos na anlise
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(Tabela 2.2), enquanto as seqncias de RAG-1 no apresentam desvio na composio de bases para nenhum txon. A presso de mutao simtrica

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Tabela 2.2. Presso de mutao direcional simtrica (mD) para os genes mitocondriais codificadores de protenas. m D < 0,5 e mD > 0,5 representam maior quantidade de A+T e maior quantidade de G+C, respectivamente. Os valores representam as % de GC observada na seqncia total (Pobs), nos stios no sinnimos (Pnon), nos sinnimos (Psin) e na terceira posio do cdon (P3) . Txons que apresentam variao na composio de bases esto representados em negrito. Txon Ara
a

mD 0,519 0,523 0,540 0,539 0,508

b

Pobs 0,460 0,460 0,472 0,466 0,452 0,447 0,467 0,460 0,454 0, 458 0,448 0,462 0,468 0,444 0,481 0,473 0,475 0,455 0,465 0,467 0,474 0,473 0,457 0,460 0,463 0,434 0,475 0,469 0,466 0,470 0,455 0,454
e

Pnon 0,412 0,410 0,418 0,409 0,406 0,402 0,414 0,408 0,400 0,406 0,403 0,408 0,410 0,406 0,413 0,410 0,409 0,406 0,407 0,412 0,406 0,413 0,407 0,412 0,411 0,402 0,408 0,412 0,411 0,414 0,409 0,415

Psin 0,534 0,537 0,554 0,553 0,524 0,517 0,548 0,540 0,535 0,537 0,517 0,543 0,559 0,500 0,585 0,570 0,577 0,529 0,555 0,549 0,576 0,565 0,534 0,535 0,543 0,483 0,578 0,555 0,551 0,555 0,526 0,515

P3 0,474 0,479 0,489 0,491 0,463 0,459

Primolius Orthopsittaca Cyanopsitta Nandayus Aratinga solstitialis

0,502 0,533 0,525 0,519 0,522

Aratinga leucophthalmus Aratinga aurea Guarouba Diopsittaca Cyanoliseus

b c

0,493
0,475 0,467 0,470 0,462 0,479 0,489 0,435 0,523 0,501 0,513 0,458 0,487 0,480 0,512 0,491 0,478 0,466 0,479 0,417 0,513 0,486 0,477 0,486 0,457 0,455

0,502 0,529 0,541

a, b

Anodorhynchus Enicognathus Rhynchopsitta Pyrrhura

a

0,485 0,572** 0,556** 0,563***

Deroptyus Pionites Forpus

d a

0,514 0,540 0,535 0,563*** 0,551** 0,519 0,520 0,528 0,470** 0,565*** 0,541 0,537 0,540
d a b b

Graydidascalus
b

Amazona xanthops Amazona Pionus Pionopsitta barrabandi Triclaria

Pionopsitta pileata Myiopsitta Brotogeris

Bolborhynchus Nannopsittaca Cacatua

e

Melopsittacus Falco
a b

0,511 0,500
c d

ATP 6, citocromo b, ATP 8, NADH2, COIII, * p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001.
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A anlise bayesiana das regies nuclear e mitocondrial concatenadas, assumindo cada gene como uma partio independente, resultou em uma topologia consenso muito parecida com a obtida apenas com os genes mitocondriais. Em ambas as topologias trs grandes clados foram recuperados dentre os psitacdeos da regio neotropical (Figura 2.2): clado A periquitos pequenos (Bolborhynchus e Nannopsittaca), clado B- papagaios, caturritas, curicas e afins (Amazona, Pionus, Graydidascalus, Pionopsitta, Triclaria, Myiopsitta e Brotogeris) e clado C araras, marianinhas, tiribas e afins (Ara, Primolius, Orthopsittaca, Cyanopsitta, Diopsittaca, Guarouba, Nandayus, Aratinga, Anodorhynchus, Cyanoliseus, Enicognathus, Rhynchopsitta, Pyrrhura, Deroptyus, Pionites e Forpus). A nica diferena foi observada nas relaes entre Ara, Primolius e Orthopsittaca. Os primeiros dois gneros parecem ser mais proximamente relacionados na matriz combinada, enquanto considerando apenas a partio de DNAmt, Ara e Orthopsittaca aparecem como grupos irmos e Primolius agrupa com esse clado. No entanto, como esperado, o suporte dos ns aumenta significantemente com a incluso de RAG-1. A busca por MV recuperou uma topologia muito semelhante topologia consenso obtida a partir da anlise bayesiana (Figura 2.2), diferindo somente na posio de Pyrrhura que ficou como grupo irmo de um clado que inclui Rhynchopsitta, Enicognathus, Cyanolyseus, Anodorhynchus, Guarouba, Diopsittaca, Aratinga, Nandayus, Cyanopsitta, Orthopsittaca, Primolius e Ara e as relaes entre Enicognathus , Rhynchopsitta , Cyanoliseus e Pyrrhura . Ambos bootstrap e probabilidades posteriores apresentaram suporte alto para a maioria dos clados. No entanto, alguns ns com baixos valores de suporte por bootstrap nas anlises de MV apresentam altos valores de probabilidade posterior na anlise bayesiana. Por exemplo, o clado que une Forpus s demais linhagens do grupos das araras, marianinhas e afins apresenta suporte por bootstrap de 61% e probabilidade posterior de 100%. Anlises de MV homognea e no-homognea recuperaram a mesma rvore, apenas diferindo nas relaes entre Primolius, Ara e Orthopsittaca. No entanto, as diferenas nas topologias obtidas pelos trs mtodos no so significativas ao nvel 5% de acordo com o teste AU.

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a)

b)

Figura 2.1. Reconstruo filogentica por anlise bayesiana de psitacdeos neotropicais com base em: a) 2703 pb do gene nuclear RAG-1; b) 3713 pb dos genes mitocondriais; txons com desvio significativo na composio de bases dos genes codificadores mitocondriais esto sublinhados. As probabilidades posteriores esto indicadas nos ns.
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Figura 2.2. Reconstruo filogentica por anlise bayesiana de psitacdeos neotropicais com base em 6416 pares de bases de seqncias de DNA nuclear e mitocondrial. Os nmeros nos ns correspondem aos valores de porcentagem de bootstrap de MV acima de 50 % e aos valores de probabilidade posterior dos ns na anlise bayesiana, respectivamente. Clados: A- pequenos periquitos; B- papagaios, caturritas curicas e afins; C- araras, marianinhas, tiribas e afins. Ilustraes dos psitacdeos de del Hoyo e colaboradores (1997).
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2.3.3. Mapeamento de caracteres morfolgicos, comportamentais e gentico na filogenia molecular Os caracteres morfolgicos e comportamentais selecionados apresentam homoplasia quando mapeados na hiptese filogentica apresentada no presente trabalho (Tabela 2.1; Figura 2.3). A cauda curta presente nos txons do clado A, em muitos do clado B e em Forpus e Pionites do clado C, e a cauda longa presente em Myiopsitta , Brotogeris e Triclaria (clado B) e em muitos txons do clado C, so convergentes quando mapeadas na filogenia molecular (Figura 2.3a). A forma arredondada da cauda (presente em Deroptyus e Pionites) e o dimorfismo sexual (presente em Pionopsitta, Triclaria e Forpus) provavelmente surgiram independentemente por paralelismo em mais de uma linhagem (Figuras 2.3b e 2.3c). A inferncia para o estado ancestral da ris bi-colorida ambgua e ambos estados ocorrem em diferentes grupos ao longo da topologia, de forma que esse carter por si s apresenta pouco valor sistemtico (Figura 2.3d). O estado comportamental de coar a cabea passando o p indiretamente sobre a asa parece ter surgido em paralelo em Bolborhynchus , Pionopsitta pileata e Forpus (Figura 2.3e). O estado aparentemente derivado das narinas cobertas por penas surgiu convergentemente, uma vez no clado B e vrias vezes independentemente no clado C (Figura 2.3f). O mapeamento sugere que o anel perioftlmico nu parece ser o estado ancestral do carter nos clados, mas o estado coberto por penas parece ter surgido em paralelo nos trs principais clados (Figura 2.3g). Os minissatlites ligados ao cromossomo W esto presentes nos txons do grupo das araras, marianinhas e afins com exceo dos txons mais basais Pionites, Deroptyus e Pyrrhura e esto ausentes nos txons estudados no grupo dos papagaios e afins (Figura 2.3h). No entanto, o estado desse caracter no conhecido no grupo mais basal (clado A), em dois txons do grupo de papagaios e afins (clado B) e quatro txons do grupo das araras, marianinhas e afins (clado C).

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a)

b)

b)

d)

Figura 2.3. Mapeamento dos caracteres morfolgicos, comportamentais e genticos na hiptese filogentica obtida no presente trabalho: a) comprimento da cauda; b) forma da cauda; c) dimorfismo sexual aparente; d) ris bi-colorida; e) posio da perna ao coar a cabea; f) narinas; g) anel perioftlmico; e h) minissatlites ligados ao cromossomo W. Os crculos coloridos nos ns representam a probabilidade do estado ancestral (Figuras a-g). Os crculos coloridos nos terminais representam os estados do carter nos txons atuais.

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e)

f)

g)

h)

Figura 2.3. continuao.

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Captulo 2

2.3.4. Tempos de divergncia A hiptese de existncia de relgio molecular entre os psitacdeos neotropicais foi rejeitada pelo teste LRT das topologias assumindo e no assumindo taxa constante entre as linhagens, incluindo os grupos externos Falco, Aburria e Gallus (log da verossimilhana da topologia com relgio= -39016,92; log da verossimilhana da topologia sem relgio molecular= -38962,05; 2 = 109,73, gl=33; p < 0,001) e excluindo os grupos externos (log da verossimilhana da topologia com relgio= -33714,15; log da verossimilhana da topologia sem relgio molecular= 33664,22; 2 = 99,88; gl= 30; p < 0,001). O teste de validao cruzada resultou em um valor timo de penalidade 3,16 para estimar o tempo de divergncia pelo mtodo PL. Os tempos de divergncia estimados pelo mtodo PL e mtodo bayesiano foram congruentes (Tabela 2.3) e a comparao com os eventos paleogeoclimticos foi realizada com base no mtodo bayesiano, j que esse mtodo leva em conta a incerteza nos tamanhos de ramo e nos tempos de coeparem 33.(ia se diverirm 335((peia smparao 3.((iinciloodoclmad ados p qurnos

3.(pe

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Tabela 2.3. Tempos de divergncia estimado entre as linhagens de psitacdeos neotropicais (em milhes de anos, ma). Dados obtidos com o mtodo PL (com n 1 fixado em 82 e 85 ma) e os respectivos intervalos de confiana (IC); e com o mtodo bayesiano e os respectivos intervalos de credibilidade (ICr). Os ns esto indicados na figura 2.4. PL N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Data 82 69,8 62,1 52,6 20,3 50,9 49,4 36,7 40,1 37,4 35,7 28,9 24,9 19,7 48,3 30,4 23,1 25,4 25,1 23,3 22,1 20,2 9,4 18,7 16,2 17,8 4,9 16,3 13,9 12,8 IC 95% fixado (66,9; 72,3) (59,0; 65,1) (49,3; 59,0) (17,7; 23,2) (47,7; 54,1) (16,2; 52,7) (33,3; 40,0) (36,7; 43,6) (34,0; 40,9) (32,4; 39,2) (25,4; 32,4) (21,6; 28,4) (16,8; 22,9) (45,1; 51,6) (27,6; 33,3) (20,1; 26,1) (22,7; 28,3) (22,4; 28,1) (20,9; 26,7) (19,8; 24,6) (17,9; 22,6) (7,7; 11,3) (16,7; 21,1) (14,3; 18,4) (15,9; 20,1) (4,2; 5,8) (14,4; 18,4) (12,1; 15,9) (11,1; 14,8) Data 85 72,3 64,3 54,5 21,0 52,7 51,2 37,9 41,5 38,7 37,0 29,9 25,8 20,4 50,0 31,4 23,9 26,3 26,0 24,1 22,8 20,9 9,7 19,4 16,7 18,4 5,1 16,7 14,4 13,3 PL IC 95% fixado (69,3; 75,0) (60,8; 68,5) (51,0; 57,8) (18,1; 24,0) (49,3; 56,0) (47,7; 54,6) (34,5; 41,4) (36,8; 45,1) (35,2; 42,3) (33,4; 40,6) (26,3; 33,6) (22,4; 29,4) (17,4; 24,2) (46,6; 53,4) (28,6; 34,5) (20,0; 27,0) (23,5; 29,3) (23,1; 29,1) (21,7; 26,9) (21,0; 25,6) (18,7; 23,3) (7,9; 11,8) (17,3; 21,8) (14,7; 19,0) (16,3; 20,7) (4,3; 6,0) (14,9; 19,0) (12,5; 18,6) (11,4; 15,3) bayesiano Data 82,9 67,6 59,0 49,7 18,4 48,3 46,1 32,5 39,2 36,2 33,2 24,9 22,4 16,6 46,2 28,2 22,3 25,2 23,4 23,4 22,1 20,6 8,9 19,9 18,3 19,0 5,5 17,2 15,0 13,6 ICr 95% (82,0; 84,6) (60,4; 74,8) (51,5; 66,8) (42,5; 57,3) (13,4; 24,2) (41,2; 55,9) (39,0; 53,8) (25,5; 40,2) (32,2; 46,6) (29,7; 43,4) (26,8; 40,2) (19,4; 31,1) (17,0; 28,7) (11,7; 22,1) (39,0; 53,8) (22,5; 34,8) (16,6; 28,7) (20,0; 31,2) (18,1; 29,6) (19,0; 29,2) (17,3; 27,5) (16,1; 25,7) (6,1; 12,3) (15,5; 24,9) (13,9; 23,2) (14,8; 24,0) (3,6; 7,7) (13,0; 22,0) (11,2; 19,5) (9,9; 18,0)

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Figura 2.4. Cronograma mostrando os tempos de divergncia entre linhagens de psitacdeos estimados pelo mtodo bayesiano. As letras correspondem aos ns indicados na tabela 2.3 e seus respectivos intervalos de credibilidade esto indicados pelas barras horizontais. As barras verticais indicam eventos paleogeoclimticos registrados nos respectivos perodos. A- pequenos periquitos; B- papagaios, caturritas, curicas e afins; C- araras, marianinhas, tiribas e afins.

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Os resultados sugerem que essa estratgia melhorou a resoluo da topologia e aumentou o suporte dos ramos, como foi sugerido em outros trabalhos (Poe e Swofford, 1999; Haddrath e Baker, 2001; Slowinski, 2001; Paton e col., 2002). Alm disso, a combinao de parties nuclear e mitocondrial, que oferecem resoluo em diferentes partes da topologia, resultou em uma topologia mais robusta, como sugerido em uma filogenia de gneros de cracdeos (Pereira e col., 2002). A presente anlise apontou trs grandes clados dentre os psitacdeos neotropicais: pequenos periquitos dos gneros Nannopsittaca e Bolborhynchus (clado A); papagaios, caturritas, curicas e afins dos gneros Amazona, Pionus, Graydidascalus, Pionopsitta, Triclaria, Myiopsitta e Brotogeris (clado B) e araras, marianinhas, tiricas e afins dos gneros Ara, Primolius, Orthopsittaca, Cyanopsitta, Diopsittaca, Guarouba, Nandayus, Aratinga , Anodorhynchus , Cyanoliseus , Enicognathus, Rhynchopsitta, Pyrrhura, Deroptyus , Pionites e Forpus (clado C). Apenas cinco gneros no puderam ser includos, pois o DNA extrado de pele dos gneros Touit e Ognorhynchus no resultaram em amplificaes de boa qualidade e as amostras dos gneros Hapalopsittaca, Leptosittaca e Psilopsiagon no estavam disponveis. Embora os clados B e C so semelhantes aos obtidos em estudos filogenticos anteriores empregando amostragem de txons mais incompleta (Miyaki e col., 1998, Tavares e col., 2004, de Kloet e de Kloet, 2005), os resultados apresentados no presente trabalho sugerem que os pequenos periquitos so grupo irmo de todos os demais txons. Adicionalmente, a ausncia de monofiletismo de Aratinga , Amazona e Pionopsitta, apontada em estudos anteriores, foi corroborada no presente estudo (Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004; Russello e Amato, 2004; Ottens-Wainright e col., 2004; Ribas e col., 2005). Em comparao com propostas de classificao mais antigas, que assumiam agrupamentos entre gneros de psitacdeos neotropicais, incluindo ou no txons de outras regies geogrficas, nossos resultados no sustentam a proposta de classificao de Brereton (1963) que agrupa na famlia Forpidae Bolborhynchus, Nannopsittaca, Forpus e Psilopsiagon, porque na presente reconstruo, Forpus agrupa com txons do clado C, que por sua vez agrupam com o clado B. Os clados B e C apresentam algumas similaridades e diferenas com os grupos Pioninae/ Conurinae (Salvadori, 1891) e Amazoninae/ Arinae (Verheyen, 1956). Os grupos Pioninae (Salvadori, 1891) e Amazoninae (Verheyen, 1956) possuem composio semelhante e ambos incluem os txons do clado dos papagaios e afins (clado B) com exceo de Myiopsitta e Brotogeris. Alm disso, tais grupos incluem os txons Pionites, Deroptyus (includos no clado C), Touit e Hapalopsittaca (no amostrados no presente trabalho). Pioninae (Salvadori, 1891) tambm inclui o gnero africano Poicephalus. Conurinae (Salvadori, 1891) e Arinae (Verheyen, 1956) tambm so grupos de composio semelhante e ambos incluem os txons do clado C, exceto Deroptyus
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e Pionites. Alm disso, Conurinae (Salvadori, 1891) e Arinae (Verheyen, 1956) incluem Nannopsittaca, Bolborhynchus (pertencentes ao clado A no presente trabalho), Psilopsiagon , Leptossitaca e Ognorhynchus (no amostrados no presente trabalho). Smith (1975) considerou que as sugestes de grupos de gneros neotropicais propostos nas classificaes anteriores (Salvadori 1890; Verheyeyen, 1956; Brereton, 1963) no refletiam a evoluo do grupo, e por falta de evidncias, preferiu no aceitar agrupamentos dentre os gneros da tribo Arini. Um dos argumentos citados pelo autor (Smith, 1975) foi o fato de Deroptyus e Pionites (famlia Pioninae e Amazoninae) apresentarem similaridades em

comportamento com Pyrrhura e Aratinga (famlia Conurinae e Arinae). Apesar de tais similaridades comportamentais no terem sido detalhadamente descritas e comparadas com os demais txons, na presente reconstruo filogentica, Deroptyus e Piontes pertencem ao clado C, o qual inclui Pyrrhura e Aratinga. O clado fomado por Deroptyus e Pionites, proposto no presente trabalho, est de acordo com observaes de campo que sugerem que ambos os gneros apresentam o canto keeya e compartilham aspectos no comportamento reprodutivo (McLoughlin e Burton, 1976), porm, esses caracteres ainda no foram estudados por uma abordagem cladstica.

2.4.2. Mapeamento de caracteres morfolgicos, comportamentais e genticos na hiptese filogentica Nenhum dos caracteres morfolgicos mapeados na hiptese filogentica proposta no presente trabalho apresentou estados exclusivos para um nico grupo. O tamanho e a forma da cauda foram os principais caracteres adotados para definir grupos de gneros dentre os psitacdeos neotropicais em classificaes mais antigas (Salvadori, 1890; Verheyen, 1990). Propostas mais recentes (Smith, 1975; Forshaw, 1989; Collar, 1997) no consideram os agrupamentos com base nesses caracteres. No entanto, a importncia do tamanho e forma da cauda foram levantados novamente em um estudo molecular, onde a variao dos estados de carter da cauda concordaram com as relaes filogenticas inferidas com base em txons de nove gneros amostrados (Miyaki e col., 1998). Quando esses caracteres foram mapeados na presente hiptese filogentica, que possui uma amostragem mais completa de txons, eles apresentaram convergncia (Figura 2.3a e 2.3b). Dessa forma, o uso desses caracteres na diagnose de grupos monofilticos dentre os psitacdeos neotropicais deve ser descontinuado. Os minissatlites ligados ao cromossomo W podem ser informativos, uma vez que podem estar presentes em um sub-clado do clado C, excluindo os txons mais basais Forpus, Deroptyus, Pionites e Pyrrhura (Figura 2.3h). No entanto, como o caracter no foi estudado para alguns dos txons pertencentes tribo Arini, qualquer concluso pode ser prematura.
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2.4.3. Tempos de divergncia e biogeografia histrica A maneira mais adequada de estimar os tempos de divergncia por dados moleculares utilizando uma calibrao fundamentada em fsseis posicionados filru.84 mene (van Tuinena eDyke,e2.00).o

fsseissd econ

um

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florestas tropicais na Amrica do Sul (Burnham e Johnson, 2004; Rull, 1999; Jaramillo e Dilcher, 2000; Wilf e col., 2003). Alm disso, muitas das linhagens atuais desse clado esto associadas com ambientes florestais. Portanto, os papagaios e afins podem ter evoludo exclusivamente na Amrica do Sul, associados a esses ambientes. No incio do Oligoceno, uma expanso de reas abertas e savanas pode ter acontecido na Amrica dos Sul. As evidncias dessa aridificao so o registro de diversificao de plantas de ambientes secos nesse perodo (Pennington e col., 2004) e o registro fssil animal com uma fauna de mamferos dominada por herbvoros hipsodontes, que em geral so associados a ambientes de savana (Flynn e Wyss, 1997). A aridificao da Amrica do Sul foi atribuda ao soerguimento da poro central dos Andes, que impediu a passagem das correntes midas do Pacfico para o interior do continente (Hooghiemstra e van der Hammer, 1998). Possivelmente, a grande diversificao (entre 22-34 ma) do grupo das araras, maracans e afins (clado C), ocorreu em resposta a essa diversificao de ambientes secos, uma vez que muitas linhagens atuais desse grupo ocupam ambientes com caractersticas semelhantes. Apesar de no haver evidncias a partir dos dados apresentados aqui, ou a partir de outras fontes, membros dos clados dos pequenos periquitos (clado A) e do clado das araras, maracans e afins (clado C) poderiam estar ocupando o sul da Amrica do Sul e no dispersaram para a poro norte do continente at o Oligoceno, devido presena de um mar transcontinental formado no sul da Argentina e do Chile (Romero, 1986; Smith e col., 1994), que poderia ter atuado como uma barreira para a sua disperso. Alternativamente, os ancestrais desses dois grupos poderiam ser remanescentes de linhagens que inicialmente ocorriam na Antrtica e que teriam sido impulsionados para a Amrica do Sul, medida que a Antrtica migrou mais para o sul e se tornou um continente incrustrado por gelo (Shevenall e col., 2004; Dingle e Lavelle, 1998). Uma reduo drstica do nvel do mar aconteceu em conseqncia da formao da calota polar Antrtica, o que poderia ter facilitado a invaso da Amrica do Sul, como foi sugerido para alguns grupos de mamferos (Flynn e Wyss, 1997). Um padro muito semelhante de cladognese diferenciada entre dois grupos tambm foi descrito para Passeriformes neotropicais suboscines (Ericson e col., 2003). A famlia Furnariidae apresenta uma filogenia bem resolvida, enquanto os interns em Tyrannidae so muito curtos, indicando indicando uma rpida radiao (Ericson e col., 2003). Apesar de no ter sido possvel incluir amostras de psitacdeos africanos no presente estudo, a sua posio filogentica no afeta a interpretao biogeogrfica da evoluo dos psitacdeos neotropicais. Estudos anteriores sugeriram que os psitacdeos africanos no so monofilticos e podem ter invadido a frica duas vezes, uma via sudoeste da sia e outra, via Amrica do Sul (de Kloet, de Kloet, 2005). O grupo que teria dispersado para a frica a partir da Amrica do Sul seria grupo irmo dos psitacdeos
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neotropicais (Barrowclough e col., 2004; de Kloet, de Kloet, 2005). Como estimamos a separao de um gnero do clado australasitico (Melopsittacus undulatus) dos neotropicais entre 51-66 ma e primeira cladognese dentre os neotropicais entre 42-57 ma (Tabela 2.3), a invaso da frica pelas linhagens da Amrica do Sul pode ter ocorrido entre 42-66 ma, perodo no qual a frica j se encontrava isolada do supercontinente formado pela Antrtica-Austrlia-Amrica do Sul. Alm disso, reforaria a hiptese de que linhagens dos psitacdeos encontravam-se distribudos ao longo do supercontinente, antes da primeira diversificao do grupo neotropical. As estimativas de tempo de divergncia entre psitacdeos neotropicais realizadas anteriormente empregavam mtodos que no levam em conta a taxa de variao entre as linhagens. Por exemplo, Miyaki e colaboradores (1998) e Tavares e colaboradores (2004) utilizaram o mtodo de linearizao de rvore (Takezaki e col., 1995), que avalia a presena de txons que evoluem sob uma taxa significantemente diferente da mdia da amostra sendo estudada e exclui esses txons da anlise. A calibrao utilizada para o relgio molecular nesses estudos foi a separao entre Galliformes e Anseriformes dos demais neognatos, estimada em 100 ma. Tavares e colaboradores (2004) tambm empregaram a taxa padro estimada para o genoma mitocondrial de aves, de 2% de substituio de nucleotdeos/ ma. O mesmo processo foi utilizado para estimar tempos de divergncia entre espcies de psitacdeos, porm aplicando taxas de 1,6-2,0% de substituio de nucleotdeos/ ma (Ribas e Miyaki, 2004; Ribas e col., 2005). Em geral, essas estimativas resultaram em tempos de divergncia mais recentes do que os tempos estimados no presente estudo. Acreditamos que a aproximao realizada no presente trabalho mais adequada do que as realizadas anteriormente (Miyaki e col., 1998; Tavares e col., 2004) porque no assume a hiptese de existncia de um relgio molecular estrito, permitindo haver variao de taxa ao longo das linhagens. Alm disso, incorpora na anlise a incerteza nos tamanhos de ramo e tempos estimados e foi realizada com base em uma hiptese filogentica cujos ns so melhor resolvidos. A utilizao de um ponto de calibrao geolgico independente (a separao da Nova Zelndia dos demais continentes da Gondwana) permite que as taxas sejam estimadas a partir dos dados, ao invs de assumir taxas estimadas a partir de outras linhagens de aves (Lovette, 2004).

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Captulo 3

Evoluo da organizao dos genes mitocondriais ao redor da regio controladora em psitacdeos neotropicais (tribo Arini)

Captulo 3

3.1. Introduo A maioria dos genomas mitocondriais de vertebrados inclui 22 genes para RNA transportadores (RNAt), 13 genes codificadores de protenas, dois genes para RNA ribossomal (RNAr) e uma regio no codificadora (regio controladora, RC) e inicialmente se acreditava que a organizao desses genes (Figura 3.1a) era extremamente conservada (Quinn, 1997; Boore, 1999). No entanto, o aumento do nmero de genomas sequenciados revelou variaes dessa organizao em vrias linhagens de vertebrados, principalmente envolvendo RNAt, como por exemplo, em marsupiais, cobras cegas, rs e lagartos (Pbo e col., 1991; Kumazawa e Nishida, 1995; Macey e col., 1997; Saccone e col, 1999; Boore e col., 1995; Boore, 1999). O primeiro genoma mitocondrial de uma ave a ser completamente sequenciado (Gallus gallus; Desjardins e Morais, 1990) revelou um arranjo nico dentre os vertebrados (Figura 3.1b). Com o aumento no nmero de seqncias determinadas, esse arranjo de genes (aqui denominado comum) foi evidenciado ser muito freqente em aves (Marshall e Baker, 1997; Mindell e col. 1998; Hrlid e col., 1998; Haddrath e Baker 2001; Paton e col., 2002; Slake e col., 2003). No entanto, um outro arranjo gnico (aqui denominado alternativo; Figura 3.1c) foi descrito em alguns txons (Mindell e col., 1998; Bensch e Hrlid, 2000). Mecanismos distintos podem explicar diferentes processos de rearranjo gnico. Por exemplo, em insetos Hymenoptera alguns rearranjos de genes so melhor explicados por recombinao (Dowton e col., 2003), para vrios rearranjos em vertebrados foi proposto um mecanismo de duplicao e deleo aleatria de genes (Moritz e col., 1986, 1987; Macey e col. 1997; Holt e col., 1997). Posteriormente, para dois gneros de Diplopoda foi proposto um mecanismo de duplicao e deleo no aleatria de genes (Lavrov e col., 2002). O mecanismo pelo qual a organizao dos genes comum em aves sugiu a partir da ordem tpica em vertebrados no foi eluciado, mas dois modelos foram propostos. O arranjo comum em aves (Figura 3.1b), poderia ter surgido a partir do arranjo de genes comum em vertebrados (Figura 3.1a) pelo mecanismo de RNAt atuando como primer ilcito na recombinao, onde o RNAt
Glu

ou o RNAt

Pro

ligaria-se

na origem da replicao da molcula e no seria isolado na nova fita de DNA sintetizada no processo, junto com os genes adjacentes. O segmento NADH6/ RNAt
Glu

ou o citocromo b/ RNAt / RNAt

Thr

Pro

, seria

incorporado no prximo ciclo de replicao em uma posio diferente (Desjardins e Morais, 1990).

62

Captulo 3

Figura 3.1. Ordem dos genes ao redor da regio controladora (fora de escala). a) ordem comum em vertebrados (Boore, 1999) ; b) ordem comum em aves (Desjardins e Morais, 1990); c) ordem alternativa em aves (Mindell e col. 1998); d) ordem nos gneros de psitacdeos Amazona e Pionus (Eberhard e col., 2001); e e) possvel ordem nos gneros de psitacdeos Deroptyus e Pionites. Os primers usados para amplificao esto indicados nos mapas da ordem gnica correspondente. Os segmentos numerados correspondem a regies amplificadas nos txons indicados na Tabela 2.1. NADH5- nicotinamida adenina dinucleotdeo desidrogenase subunidade 5; NADH6- nicotinamida adenina dinucleotdeo desidrogenase Glu Thr Pro subunidade 6; GLU- RNAt ; cit. b citocromo b, THR- RNAt , PRO- RNAt , RC regio controladora; Phe nc regio no codificadora, PHE - RNAt , nc- regio no-codificadora; ND6- pseudo NADH6, GLUGlu Pro pseudo RNAt ; PRO- pseudo RNAt .

Alternativamente, pelo modelo de duplicao e perda subseqente de genes, o segmento NADH6/ RNAt
Glu

/ citocromo b/ RNAt / RNAt

Thr

Pro

da ordem tpica em vertebrados seria duplicado durante a

replicao, por formao de estrutura secundria na nova fita sintetizada durante o processo, ou por erro de pareamento no incio ou final da replicao. Essa duplicao seria ento incorporada na molcula por um novo ciclo de replicao. A deleo de um segmento NADH6/ RNAt
Glu

entre os genes NADH5 e

63

Captulo 3

citocromo b e um segmento de citocromo b/ RNAt

Thr

/ RNAt

Pro

antes da RC geraria a ordem comum em

aves (Figura 3.1b; Desjardins e Morais, 1990; Quinn, 1997). A organizao alternativa em aves (Figura 3.1c) poderia ter se originado a partir da organizao mais comum de aves pela duplicao em tandem do segmento RNAt perdas subsequentes de uma das cpias dos genes tRNA
Pro Pro

/ NADH6/ tRNA
Glu

Glu

/ RC, seguido de

/ NADH6/ e RNAt

e, na maioria dos casos,

da RC ou parte da mesma (Mindell e col., 1998; Boore e col., 1999; Bensch e Hrlid, 2000). A presena de uma regio no codificadora que apresenta grande similaridade com a RC (Figura 3.1c), sugere que esse evento deve ser relativamente recente, reforando a hiptese de que essa organizao de genes em aves teria origem a partir de eventos de duplicao e subsequente perda de segmentos duplicados (Mindell e col., 1998; Bensch e Hrlid, 2000). Essa idia foi ainda mais reforada com a caracterizao dessa mesma regio em psitacdeos neotropicais dos gneros Amazona e Pionus (Eberhard e col., 2001). Esses txons tambm apresentam a ordem alternativa em aves, mas nesse caso, ambas as RC sequenciadas apresentam as regies conservadas como os blocos F, D, C e CBS-1, e antes da primeira RC, apresentam pseudogenes que so similares s seqncias de RNAt
Glu

e NADH6 (Figura 3.1d).

Assumir que organizao alternativa se originou a partir de um nico evento de rearranjo de genes implicaria em aceitar a existncia de um grupo monofiltico de aves formado por Falconiformes, Cuculidae (Cuculiformes), Picidae (Piciformes) e Suboscines (Passeriformes), excluindo desse grupo outras famlias dessas mesmas ordens como Musophagidae (Cuculiformes), Bucerotidae (Piciformes) e Oscines (Passeriformes), o que estaria em desacordo com reconstrues filogenticas bem sustentadas obtidas com dados morfolgicos e moleculares diversos (Mindell e col., 1998). Assim, foi proposto que o arranjo gnico alternativo (Figuras 3.1c e 3.1d) se originou por vrios eventos em linhagens independentes (Mindell e col., 1998). A princpio, acreditou-se que a ordem gnica poderia ser um carter diagnstico em nveis taxonmicos como subordens ou famlias, por exemplo, para as subordens Oscines (ordem comum) e Suboscines de Passeriformes (Mindell e col., 1998). No entanto, dados mais recentes evidenciaram a existncia do arranjo alternativo em vrias espcies gnero Phylloscopus (Oscines), sugerindo que esses eventos tambm acontecem em nveis taxonmicos mais baixos e portanto, a validade do carcter para inferncia filogentica questionvel (Bensch e Hrlid, 2000). Em Phylloscopus a similaridade entre a RC e a regio no-codificadora de cada espcie menor que a similaridade das RC entre espcies prximas, o que corrobora a hiptese de ter ocorrido um nico evento de rearranjo gnico em um ancestral comum do grupo (Bensch e Hrlid, 2000). A similaridade entre ambas as RC do mesmo txon em espcies e subespcies do gnero Amazona e no txon Pionus chalcopterus, em geral, foi maior do que entre as regies homlogas de txons diferentes, com exceo de trs subespcies de Amazona ochrocephala.
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Captulo 3

Nesse caso, tambm foi sugerido que houve um nico evento de rearranjo gnico no ancestral desses grupos, porm, as RCs de cada txon estariam evoluindo em concerto (Eberhard e col., 2001). No presente trabalho, determinamos a ordem dos genes mitocondriais em diversos gneros de psitacdeos neotropicais e evidenciamos a convergncia desse carter no grupo. Propomos modelos para explicar a origem dos eventos independentes e testamos essas hipteses atravs de elementos exclusivos identificados nas seqncias de cada linhagem. Com base em uma estimativa de tempo de divergncia entre as linhagens, estimamos perodos de tempo nos quais teriam acontecido eventos de duplicao e perda de genes ao longo das linhagens estudadas.

3.2. Material e mtodos 3.2.1. Amostragem e sequenciamento Foram estudados 34 indivduos de 25 dos 30 gneros de psitacdeos neotropicais (Tabela 3.1). Amostras de DNA foram extradas a partir de sangue por digesto padro com proteinase K e purificadas com fenol: clorofrmio: lcool isoamlico na proporo 25:24:1 (Bruford e col., 1992). Os primers utilizados nas amplificaes e sequenciamento foram: CBL15637 (5-AACCTCCTA GGAGACCCAGAAAACTTC-3; Miyaki e col., 1998), LThr (5-TGGTCTTGTAAACCAAAAGA-3; Eberhard e col., 2001), H16065 (5-AACTGCAGTCATCTCCGGTTTACAAGAC-3; Kornegay e col. 1993), Tpro16150 (5-ATCACCAACTCCCAAAGCTGG -3, presente trabalho), ND6H16252 (5-TTRTGAYTGTTTGTTGT -3, presente trabalho), ND6L16384 (5-CACCYCACCCYCAAACAA -3, presente trabalho), ND6L 852 (5- CCA TAAAGAGTACTAGCGACA C-3, presente trabalho), ND6H16522 (5-GGGATGTTGGTGGTTTTTGT-3, presente trabalho), LGlu (5-GCCCTGAAAARCCATCGTTG-3; Eberhard e col., 2001), HgluRev (5-GCG TTCTTATAGTTGAGATACC-3; Eberhard e col., 2001), CRL380 (5-GCCCATAAYTGGCCCGGGAACTT3; Tavares e col. 2004), CRL456 (5- CACGAGAGATCAYCAACCCGGTGT-3, Tavares e col., 2004), CR522Rb (5-TGGCCCTGACYTAGGAACCAG-3; Eberhard e col., 2001), CRL827 (5-TCATTTTMRCAC TGATGCACTTG-3; Tavares e col. 2004), CRH1028 (5- AGGTGTAAAACAAAGTGCATCAGGGT-3; Tavares e col. 2004), Hphe1248 (5-TCTTGGCAKCTTCAGTACCATGCTTT-3, Eberhard, com. pess.), 12SH1357 (5-GCGGATACTTGCATGTATATG-3, presente trabalho).

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Captulo 3

Tabela 3.1. Txons analisados, nmero de registro, segmentos amplificados de acordo com a numerao correspondente indicada na Figura 3.1. Espcie Amazona xanthops Anodorhynchus hyacinthinus Anodorhynchus hyacinthinus Ara ararauna Aratinga aurea Aratinga leucophthalmus Aratinga solstitialis Bolborhynchus lineola Brotogeris chiriri Cyanolyseus patagonus Cyanopsitta spixii Cyanopsitta spixii Deroptyus accipitrinus Deroptyus accipitrinus Diopsittaca nobilis Diopsittaca nobilis Enicognathus leptorhynchus Forpus crassirostris Guarouba guarouba Guarouba guarouba Graydidascalus brachyurus Graydidascalus brachyurus Myiopsitta monachus Nandayus nenday Nannopsittaca dachileae Orthopsittaca manilata Pionites leucogaster Pionopsitta barrabandi Pionopsitta pileata Primolius auricollis Pyrrhura picta Rhynchopsitta pachyryncha Triclaria malachitacea Triclaria malachitacea
a

LGEMA 1876 114 117 13 346 2090 2042 4393 5486 1837 409 498 395 396 973 1126 5173 501 4 69 1623 1624 1737 143 5495 2383 2377 5006 3467 2345 397 5237 415 416

Segmentos amplificados 7 1, 3, 4, 5, 6 1, 3, 4, 5, 6 1, 3, 4, 5, 6 3 3 3 3 3 3 3, 4, 5 2, 3, 4, 5 14, 15 14, 15 2, 3, 4, 5 2, 3, 4, 5 3 7, 13 2, 3, 4, 5 2, 3, 4, 5 7, 9, 10, 11, 12 7, 9, 10, 11, 12 1, 3, 4 1, 3, 4 3 3 15, 16 7, 8, 13 7, 13 3 3 3 7, 8, 12, 13 7, 8, 12, 13

Registro na coleo do Laboratrio de Gentica e Evoluo Molecular de Aves (LGEMA), Universidade de

So Paulo.

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Captulo 3

A primeira amplificao realizada para cada txon foi entre os primers LThr e CR522Rb (segmentos 3, 7 e 15 da Figura 3.1; Tabela 3.1). A seqncia obtida a partir do segmento amplificado por esse conjunto de primers diagnstica da organizao gnica em psitacdeos (Figura 3.1). Foram amplificados segmentos adicionais para vrios txons, em geral com sobreposio, sempre levando em conta a sua organizao gnica (Figura 3.1; Tabela 3.1). As amplificaes foram realizadas em 10 L, com tampo 1x (Pharmacia ou Biotools), 2 M de de cada dNTP, 1M de cada primer, 0,5 U de Taq polimerase (Pharmacia) e 20-50 ng de DNA, ou alternativamente, em 25 L, com tampo 1x (Biotools), 2 M de cada dNTP, 1M de cada primer, 1 U de Taq polimerase (Pharmacia) e 25-50 ng de DNA. As condies da reao de PCR foram: desnaturao inicial a 95C por 5 minutos (min.), seguido de 30 ciclos de 95 C por 60 segundos (seg.), 50-54 C por 25 seg. e 65 C por 40 80 seg., e uma extenso final de 65 C por 5 min. Uma alquota (2 L) dos produtos foi aplicada em gel de agarose para verificar a qualidade e tamanho dos produtos. Os produtos de PCR foram purificados com exonuclease I (5 U, USB) e fosfatase alcalina de camaro (0,5 U, USB). Alternativamente, a banda foi recuperada de gel de agarose e o produto foi isolado por centrifugao do fragmento de gel em ponteira com filtro. A reao de sequenciamento foi preparada com Big Dye Terminator (Perkin Elmer) de acordo com protocolo sugerido pelo fabricante. As seqncias foram obtidas em sequenciadores automticos (ABI 377 ou ABI 3100, Applied Biosystems).
o o o o

3.2.2. Alinhamento e anlise das seqncias Ambiguidades entre fitas complementares e regies de sobreposio foram verificadas e corrigidas usando os programas Sequence Navigator (Applied Biosystems) e Sequencher 4.1.2 (GeneCodes Corp.). Os arranjos e seqncias foram comparados com as seqncias homlogas dos genomas mitocondriais completos de galinha (Gallus gallus; GenBank NC_001323; Desjardins e Morais, 1990) e de um psitacdeo da Nova Zelndia (Strigops habropptilus; NC_005931; Harrison e col., 2004), com a seqncia de 4709 pb entre o final do citocromo b e incio do RNAr 12S do psitacdeo neotropical Amazona farinosa (GenBank AF338821; Eberhard e col., 2001) e duas seqncias de tamanhos 735 e 574 pb correspondentes respectivamente aos segmentos 7 e 13 (Figura 3.1) do psitacdeo neotropical Pionus chalcopterus (AF338317 e AF338318; Eberhard e col., 2001). As seqncias obtidas das extremidades 3 do citocromo b foram comparadas com as seqncias praticamente completas do gene descritas em trabalhos anteriores e obtidas a partir da amplificao de segmentos diferentes (Figura 3.2; U70761, U70763, U70764, U70766, AY286205, AY286206, AY286209, AF370769 e AF370778; Miyaki e col. 1998; Tavares e col., 2004; Tavares e col. in prep.). As seqncias
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Captulo 3

obtidas da poro 5 da regio controladora foram comparadas, ou complementadas com seqncias obtidas em trabalhos anteriores (Figuras 3.2 e 3.3; AF430809, AF430810, AF430811, AF430813, AF430814, AF430816, AF430817, AF430818, AF430822, AF430825, AF430826, AF430828, AF430830, AF430833, AF430836, AF430837 e AY208250; Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004). Alinhamentos automticos foram gerados no Clustal X 1.81 (Thompson, 1997) e corrigidos manualmente no MacClade 4.0 (Maddison e Maddison, 2000). O alinhamento das seqncias de DNA de genes codificadores de protenas foi confirmado com a seqncia de aminocidos correspondente, simulada no MacClade 4.0 (Maddison e Maddison, 2000). Composio de bases, valores de distncia e demais dados estatsticos foram obtidos nos programas PAUP* 4.0 (Swofford e col., 2002) e MEGA 2.1 (Kumar e col., 2001). A simulao da estrutura secundria dos RNAt foi realizada no tRNAscan-SE (Lowe e Eddy, 1997). A caracterizao da regio controladora (RC), foi realizada por comparao com outras seqncias de RC de aves (Desjardins e Morais, 1989; Mindell e col., 1998; Marshall e Baker, 1999; Eberhard e col., 2001; Delport e col., 2002). O incio dos domnios foi definido pela posio dos blocos conservados (Sbis e col., 1997; Marshaw e Baker, 1999) como definido por Pereira e col. (2004).

3.2.3. Mapeamento de hipteses Os diferentes estados de organizao gnica em aves (comum ou alternativa) foram mapeados em uma proposta filogentica das relaes entre os gneros de psitacdeos neotropicais (topologia com tamanho de ramos, Tavares e col., in prep.) no programa Mesquite 1.05 (Maddison e Maddison, 2004) utilizando o mtodo de Mxima Verossimilhana. A partir da organizao alternativa com duplicao da RC (Figura 3.1d) possvel recuperar a organizao comum dos genes em aves (Figura 3.1b), caso os pseudogenes e a RC 1 sejam deletados, e a partir da ordem comum possvel resultar na ordem alternativa por duplicao e deleo posterior de genes, portanto, consideramos que a mudana entre esses dois estados (ordem comum e ordem alternativa) possui a mesma probabilidade.

3.3. Resultados Apesar de o DNA ter sido extrado a partir de sangue, tecido relativamente pobre em mitocndrias, acreditamos que as seqncias so de origem mitocondrial com base nos seguintes resultados: (1) alguns dos segmentos amplificados so maiores que o tamanho da maioria das possveis cpias de genes mitocondriais incorporados no genoma nuclear de Gallus gallus e na maioria dos genomas de vertebrados sequenciados at o momento (Pereira e Baker, 2004); (2) os segmentos com sobreposio parcial amplificados com diferentes combinaes de primers so congruentes; (3) as seqncias dos genes
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Captulo 3

codificadores no apresentam cdons de parada inesperados ou alterao no quadro de leitura e alinharam com as correspondentes dos mesmos indivduos amplificadas previamente com diferente combinao de primers (Miyaki e col. 1998, Tavares e col., 2004, Tavares e col., in prep.); e (4) a simulao da estrutura secundria dos DNAt sugere que os mesmos devem ser funcionais. As seqncias obtidas no presente trabalho (nmeros de acesso em processo de submisso ao GenBank), assim como o conjunto analisado incluindo seqncias de trabalhos anteriores esto representados nas figuras 3.2 e 3.3. A amplificao com o par de primers CBL15637 e ND6H16522 resultou em mais de uma banda (de aproximadamente 600 e 900 pb) para os txons Diopsittaca nobilis, Guarouba guarouba e Cyanopsitta spixii. Portanto, para esses txons, os primers CBL15637 e CR522Rb foram usados para obter cerca de 2 kb de produto. As amplificaes com os primers Lthr16064 e CR522Rb em amostras de Amazona xanthops e Graydidascalus brachyurus, sempre resultou em seqncias ambguas e ilegveis, portanto, no foi possvel comparar essa regio com as homlogas nos demais grupos. No entanto, em ambos os txons o segmento amplificado de 700 pb entre esses primers possui tamanho incompatvel com a ordem comum, cujo tamanho esperado seria em torno de 1300 pb, j que inclui todo o gene NADH6 e uma poro de 500 pb da RC, sugerindo que esses txons apresentam a ordem alternativa (Figura 3.1d). Alm disso, outras seqncias de Graydidascalus brachyurus foram obtidas (Figuras 3.1 e 3.3), confimando a existncia da ordem de genes alternativa nesse txon. Em casos onde mais de um indivduo da mesma espcie foi seqenciado, a variao encontrada entre os indivduos da mesma espcie foi menor do que aquela encontrada na comparao entre gneros. Portanto, nas anlises subseqentes, foi utilizada a seqncia consenso para cada gnero, exceto para Aratinga , cujas espcies amostradas so representantes de linhagens independentes (Tavares e col., 2004; Ribas e Miyaki, 2004). Os resultados obtidos sugerem que os txons que apresentam a organizao comum dos genes ao redor da regio controladora so: Anodorhynchus hyacinthinus, Ara ararauna, Aratinga aurea, Aratinga leucophthalmus, Aratinga solstitialis, Bolborhynchus lineola, Brotogeris chiriri, Cyanoliseus patagonus, Cyanopsitta spixii, Diopsittaca nobilis, Enicognathus leptorhynchus, Guarouba guarouba, Myiopsitta monachus , Nandayus nenday, Nannopsittaca dachileae, Orthopsittaca manilata, Primolius auricollis, Pyrrhura picta e Rhynchopsitta pachyryncha (Figuras 3.1b e 3.2). Os txons que apresentam a organizao alternativa dos genes ao redor da regio controladora so: Amazona xanthops, Deroptyus accipitrinus, Forpus crassirostris, Graydidascalus brachyurus, Pionites leucogaster, Pionopsitta barrabandi, Pionopsitta pileata e Triclaria malachitacea (Figuras 3.1d, 3.1e e 3.3).

69

Captulo 3

Figura 3.2. Seqncias obtidas (representadas por linhas e seus tamanhos) para cada txon de psitacdeo neotropical com a ordem comum em aves e seqncias de trabalhos anteriores (em cinza; nmero de acesso no GenBank e tamanho abaixo dos segmentos; Miyaki e col., 1998; Tavares e col. 2004; Ribas e Miyaki, 2004). As posies dos primers usados nas reaes de sequenciamento esto representadas no mapa.

Figura 3.3. Seqncias obtidas (representadas por linhas e seus tamanhos) para cada txon de psitacdeo neotropical com a ordem alternativa em aves, seqncias obtidas de outro trabalho (em cinza; nmero de acesso no GenBank e tamanho abaixo do segmento; Tavares e col. 2004). a) mapa da ordem alternativa de Amazona e Pionus (Eberhard e col. 2001); b) mapa da ordem alternativa de Deroptyus e Pionites. A posio dos primers usados nas reaes de sequenciamento esto representadas nos mapas.
70

Captulo 3

No foram identificados pseudogenes nas seqncias dos txons que apresentam a organizao comum dos genes. Para esses txons, em geral a seqncia obtida inclui parte do RNAt gene NADH6, o RNAt
Glu Thr

, o RNAt

Pro

, o

e parte da RC. Para nove indivduos foi obtida a seqncia entre o final do

citocromo b e o incio do RNAr 12S (Figura 3.2). Para a maioria dos txons estudados que apresentam a organizao alternativa foram obtidas as seqncias do incio da RC 1 e da RC 2, alm do RNAt e de psedogenes anteriores poro 5 da RC 1. Deroptyus accipitrinus e Pionites leucogaster apresentam um pseudogene com cerca de 65 pb cuja seqncia se assemelha muito a do tRNA
Pro

e uma outra poro com

230 e 264 pb, respectivamente, que apresenta alguma similaridade com NADH6 (Figuras 3.3b e 3.4), sugerindo que podem apresentar a organizao dos genes semelhante ordem alternativa (Figura 3.1e). Pionopsitta pileata, Pionopsitta barrabandi e Triclaria malachitacea apresentam um pseudogene que varia de 40 a 92 pb cuja seqncia se assemelha a parte do NADH6 e uma outra poro entre 59 a 64 pb que se assemelha ao RNAt
Glu

(Figuras 3.3a e 3.5) e ambos so correspondentes aos pseudogenes descritos

em espcies de Amazona e Pionus (Eberhard e col. 2001). Forpus crassirostris apresenta pseudogenes desses mesmos genes com 68 e 43 pb, respectivamente (Figura 3.3a e 3.5).

Pseudo RNAt
Deroptyus Pionites A.farinosa

Pro

TCAGAAAAAGAGGACTAAACCTCTATCACCAACTCCCAAAGCTGGCATTTTACATTAAACTATTCTCT CCAGAAAAAGAGGACCAAACCTC---CACCAACCCCCCAAAC-AACACCCCACATTAACCCCCCCCCC TCAGAAAAAGAGGACTAAACCTCCATCACCAGCTCCCAAAGCTGGCGTTTTAAATTAAACTATTTCCT

Pseudo NADH6
Deroptyus ------------------------GCC-CACAAACAACCCCAACAAGACCCCCGTCTCCCACAGCCCCAGCACAACAGACAAAGCCAAC Pionites CCAACAGCAAACAACCYTTAAAATGCACCTCACAATGCACCAACCTTCTCCCRTTCAATAAGTAGAGGAATAAAGGCTATAGAGAGGAA Deroptyus AACAGCCCCTACTCAGCATAACAGTAA-AAAGGGG-GGGAGGGGG-GAAGGGGAAAAAGAAAACACCCCACCAACTG---CACTAAGAC Pionites GATGTGTCGGGGGGAGGAGGTAGGGGG-AAAGGAA--GGTGGGGAAGGGGGGAAGAAAAAACAAACCCTACCAACAGTAACACTAAAGT Deroptyus CAACCCAAATAAACCGCCACAAAACCAACCT-CAAACCTCCACCCTACC-AATCCCGATTCAACTCCCTAATAAGCCACCACTCA---Pionites TAACCCTTAAAAAC-ACCACACAACCAACCT-TAGACCCTTACTCAACT-AATCATAAACCCACGGCCTAAAACCTCTATCCTCCCCTA

Figura 3.4. Seqncia do pseudo RNAt , comparada com a seqncia funcional de RNAt em Amazona farinosa (Eberhard e col. 2001), e do pseudo NADH6 antes da RC 1 de Deroptyus accipitrinus e Pionites leucogaster. Regies de maior homologia entre os txons esto indicadas em negrito.

pro

Pro

71

Captulo 3

Pseudo NADH6
Amazona Forpus P.barrabandi P.pileata Pionus triclaria Amazona Forpus P.barrabandi P.pileata Pionus triclaria ---CCCACCCAAAAACCCTCACCCTACAACCAATGAAGCCCCCAACACAACAACACCA-------------AGGCGCAAA -AAC----CCAAAATTTCCCCAATAAACAACAGTAAACCCTAATTAC-AAATAAAACAC----------------CCAAA TACCACCAACCCCCAAAA-CCACCCCAACCACCCC-ATTAAACCCACAAAGCACCCCA----------CAACACCAAAAC CACC------AGAAAGCT-AACCCCCAACAACACCCCATCAGCCCACCTAAAGCAAT------------------ACAAA TCTCACCCCAAACTCCCCACCACAATAAGCAAGCCTAAACACAACAACACCACCAAATATTAACCCACCCCAAAAGCAAA TCCC----GCTAAAAACACCACCC------------------------------------------------GACACAAA ATAGGCCATAAG --AGGCCATAGA AAAGGCCATAAG ACAGGCCATAAG ATAGGCCATAAG ACAGGCCATAAG
Glu

Pseudo RNAt
Amazona Forpus P.barrabandi P.pileata Pionus Triclaria

TTTCTCAGATCAAA--CCATCCAAAGCTTATGGCCTATTAACCGCCTC--AGCACATCAACCA-TAA GTCC-CACCCAGA-C---CCCCTCACTCTATGGCCTAAAAGTCCACTC------------------CCTC-TACCCAAAAA-TCATCAAAGGCTTATGGCCAAAAAAGC-CAACCCAGCATTTAAACCA-C-TCCC-CACTCAAAAA-TGACTGGGGACTTATGGCCTACAAACCACCACTATGTACTTCAACCA-TAC CTTT-CAGAGTCGCGTCTGTCCAAAGCTTATGGCCTAAACCATACCTA-GTGTACCTACCATAATAA CTTC-TACCC--AAA-CTATCTAAAGCTTATGGCCTA-AAACTTCC-CTTAGTACTCTTAACA-TGG

Figura 3.5. Seqncia de pseudogenes dos txons Amazona farinosa (Eberhard e col. 2001), Forpus crassirostris, Pionopsitta barrabandi, Pionopsitta pileata, Pionus chalcopteris (Eberhard e col. 2001) e Triclaria malachitacea. Regies de maior homologia entre os txons esto indicadas em negrito.

3.3.1. Mapeamento de hipteses O mapeamento das ordens gnicas de psitacdeos neotropicais em uma hiptese filogentica (Tavares e col., in prep.) sugere que h ambiguidade quanto ao estado ancestral de alguns grupos (Figura 3.6a). A partir desse resultado e dos pseudogenes presentes nos grupos, dois modelos de evoluo foram levantados: a) Duplicaes independentes do segmento dos genes RNAt
Pro

/ NADH6/ RNAt

Glu

/ RC teriam ocorrido

nas linhagens ancestrais dos clados B, D e F. Essas duplicaes seriam seguidas de delees dos genes RNAt
Pro

/ parte do NADH6 e do RNAt

Pro

Glu

nos clados B e D. No clado F teria ocorrido a

Glu

deleo parcial dos genes RNAt

/ NADH6 e total do gene RNAt

. Esse modelo presupe a

existncia de pelo menos seis eventos, sendo trs de duplicao de genes e trs de delees de genes (Figura 3.6b). b) Um nico evento de duplicao gnica teria ocorrido no ancestral dos clados B, C, D, E e F e cinco eventos de deleo de genes, sendo dois eventos convergentes. Nos clados C e E, a deleo levaria organizao comum em aves e nos clados C e D, a deleo resultaria em pseudogenes de RNAtGlu e NADH6. Um evento distinto de deleo de genes resultaria no padro descrito em Pionites e Deroptyus (Figura 3.6c).

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Captulo 3

a)

b)

c)

Figura 3.6. a) Mapeamento dos estados da ordem gnica na inferncia filogentica de Tavares e col. (in prep.); b) modelo considerando trs eventos independentes de duplicao; c) modelo considerando um evento de duplicao. O perodo estimado para os eventos esto representados em milhes de anos, ma.

73

Captulo 3

3.3.2. Caracterizao dos genes Foram obtidas seqncias completas de NADH6 de A n o d o r h y n c h u s , Ara , Aratinga leucophthalmus, Aratinga solstitialis, Bolborhynchus, Brotogeris, Cyanolyseus, Cyanopsitta, Diopsittaca, Enicognathus, Graydidascalus, Guarouba, Nannopsittaca, Orthopsittaca, Primolius e Rhynchopsitta. Seqncias parciais do mesmo gene (incompletas na poro 3) foram obtidas de Aratinga aurea, Myiopsitta, Nandayus e Pyrrhura. Quando comparadas com as as seqncias homlogas de Amazona farinosa, Pionus chalcopteris (Eberhard e col., 2001), Strigops habroptilus (Harrison e col., 2004) e Gallus gallus (Desjardins e Morais, 1990), verificamos uma variao no cdon de parada, sendo esse TAA em G a l l u s e Orthopsittaca , AGG em Bolborhynchus , Brotogeris e Nannopsittaca , e TAG nos demais psitacdeos comparados. As lacunas de alinhamento ocorrem em trincas, de forma que no foi identificada alterao no quadro de leitura em nenhum txon. O alinhamento dessas seqncias sugere que em relao Gallus gallus, o nmero a menos de trincas de: uma em Amazona farinosa, duas nos gneros Strigops, Bolborhynchus, Nannopsittaca e Graydidascalus, trs nos gneros Anodorhynchus, Ara, Aratinga, Cyanopsitta , Cyanoliseus , Diopsittaca , Enicognathus , Guarouba , Nandayus , Orthopsittaca , Primolius, Pyrrhura e Rhynchopsitta, e seis nos gneros Brotogeris e Myiopsitta. Foram obtidas as seqncias completas da RC para Anodorhynchus , Ara , Cyanopsitta, Diopsittaca, Graydidascalus (RC2) e Guarouba, e as seqncias parciais da RC, RC1 e RC2 para os demais txons (Figuras 3.2 e 3.3). Essas seqncias foram alinhadas com a RC1 e RC2 de Amazona farinosa e Pionus chalcopterus (Eberhard e col., 2001). Em alguns trechos do primeiro domnio ocorre grande variabilidade entre gneros menos relacionados taxonomicamente, o que torna o alinhamento bastante incerto, principalmente nas comparaes com os txons Bolborhynchus, Nannopsittaca, Myiopsitta, Brotogeris e Forpus em relao aos demais e entre si. Apesar disso, para a maioria das seqncias comparadas foi identificado o goose hairpin, uma regio repetitiva de composio C7TAC7, exceto em Amazona farinosa e Deroptyus accipitrinus cuja composio C8TAC7 (Eberhard e col., 2001) e ATC3TAC7, respectivamente. O goose hairpin s no presente no RC2 do txon Graydidascalus brachyurus (seqncia dessa poro na RC1 no disponvel). Comparaes de distncia-p sugerem que, em geral, nos txons onde ocorrem duas cpias da RC (RC1 e RC2), elas so mais semelhantes entre si do que as cpias homlogas de txons distintos, com exceo de Pionopsitta barrabandi. Como esperado, o segundo domnio mais conservado, sendo possvel identificar os blocos F, E, D e C para a maioria dos txons compadados e tambm o bird box e o CSB-1 para os txons que apresentavam a RC completa (Figura 3.7).

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Captulo 3

Bloco F

Bloco E

Nannopsittaca P.pileata rc1 P.pileata rc2 Triclaria rc1 Triclaria rc2 P.barrabandi rc1 P.barrabandi rc2 Graydidascalus rc2 A.farinosa rc2 Pionus rc1 Pionus rc2 Myiopsitta Brotogeris Forpus rc1 Enicognathus Cyanolyseus Anodorhynchus Guarouba Diopsittaca A.solstitialis A.aurea Cyanopsitta Orthopsittaca Ara Primolius Nandayus Rhynchopsitta Pyrrhura Deroptyus Pionites rc1 Pionites rc2

GGGCTACTCACGAGAAATCATCTACCCG GGGCTACTCACGTGAAACCATCTACCCG GGGCTACTCACGTGAAACCATCTACCCG GGGCTACTCACGTGAAACCATCTACCCG GGGCTACTCACGTGAAACCATCTACCCG GGGCYACTCACGTGAAACCATCTACCCG GGACTTCTCACGAGAAATCAGCAACCTG TTACATCTCACGAGAAATCACCAACCCG GGTCATCTCACGTGAAATCATCTACCCG GGGCTACTCACGTGAAATCATCAACCCG GGGCTACTCACGTGAAATCATCAACCCG GAACCACTCACGAGAAACCATCAACCCG GGGCAACTCACGAGAAATCACCTACCCC GGGCAACTCACGTGAAACCATCTACCCG TGGCTACTC------------------TGGTTACTCGCGAGAGATCA-------TGACTACTCACGAGAGATCACCAACCCG TGACAACTCACGAGAGATCATCAACCCG TGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCG TGGCTACTCACGAGAGATCACCAATCCG TGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCG TGACTACTCACGAGAGATCACCAACCCG TGGCTACTCACGAGAGATCATCAACCCG TGGCTACTCACGAGAGATCATCAACCCG TGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCG TGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCG TGGCAACTCT-----------------TGACTACTCACGAGAGATCATCAACCCG TGGCTTCTCACGAGAAATCAGCAACCCA TGGCTATTCGCGAGAAATCAGCA-CC-TGTCTATTCGCGAGAAATCAGCAACCGG

Nannopsittaca P.pileata rc2 P.pileata rc2 Triclaria rc1 Triclaria rc2 P.barrabandi rc1 Graydidascalus rc2 A.farinosa rc2 Pionus rc1 Pionus rc2 Myiopsitta Brotogeris Forpus rc1 Anodorhynchus Guarouba Diopsittaca A.aurea Cyanopsitta Orthopsittaca Ara Primolius Nandayus Pyrrhura Pionites rc2

CACGACTAGCTTCAGGATCAT CGTTCCTAGCTTCAGGTCCTT CGTTCCTAGCTTCAGGTCCTT CGTTCCTAGCTTCAAGTCCTT CGTTCCTAGCTTCAAGTCCTT CATGACTAGGTTCAGGCCCTT CGTTACTAGTTTCAGGCCCAT CGTTCCTAGCTTCAGGTCCAT CACGCCCAGCGTCAGGTCCAT CACGCCCAGCGTCAGGTCCAT CGTTACTAGCTTCAGGATCAT TGCTACTAGCGTCAGGAGCAT CATTCCTAGCTTCAGGTCCAT CCTTCCCAGCGTCAGGTCCAT CCTTCCCAGCGTCAGGTCCAT CCTTCCCAGCGTCAGGTCCAT CCCTCCCAGCGTCAGGTCCAT CCTTCCCAGCGTCAGGTCCAT TCTTCCCAGCGTCAGGTCCAT CGTTCCCAGCGTCAGGTCCAT TATTCCCAGCGTCAGGTCCAT CGTTCCCAGCGTCAGGTCCAT CGTTCCTAGCGTCAGGTCCTT CGTTCCTAGCGTCAAGTCCAT

Bloco D

Bloco C

Nannopsittaca P.pileata rc1 P.pileata rc2 Triclaria rc1 Triclaria rc2 P.barrabandi rc1 Graydidascalus rc2 A.farinosa rc2 Myiopsitta Brotogeris Forpus rc1 Anodorhynchus Guarouba Diopsittaca A.aurea Cyanopsitta Orthopsittaca Ara Primolius Nandayus Pyrrhura Pionites rc2

CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTC--------------CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTAG-----------------CATTTGGTTAGTAGGTCAGGGACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTAGATTA------CCTCTGGTTCCTAGG---------CCTCTGGT----------------CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTAGGTCAGGG---CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAC CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT CCTCTGGTTCCTCGGTCAGGCACAT

Nannopsittaca CCTTCACAGAGCCATCTCTGCTAGTCTG P.pileata rc2 TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTAATAT Triclaria rc1 TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTG Triclaria rc2 TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTG Graydidascalus rc2 TCACA-GAGACA--TTTCTCGTGGTTTG A.farinosa rc2 TCACT-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTG Anodorhynchus CTATC-GGGTCATCTGGTTCGCTATCCT Guarouba CCATC-TGGCCATCTGGTTCGCTATTTG Diopsittaca CCATC-TGGCCATCTGGTTCGCTATTTG A.aurea CTATC-AAGCCATCTGGTTCGCTATATG Cyanopsitta CTATC-TGGCCATCTGGTTCGCTATTTG Ara CCATC-TGGTCATATGGTTCGCTATTAT Primolius CCATC-TGGCCATATGGTTCGCTATTTG Nandayus CCATC-TGGCCATCTGGTTCGCTATTTG Pyrrhura TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTA Pionites rc2 TCACA-GAGTCATCTGGTTCGCTATTTG
Bloco de Aves

Graydidascalus rc2 CACTAATGTACTCCA A.farinosa rc2 CACTGATGCACTTTG Anodorhynchus CCCTGATGCACTTTG Guarouba CCCTGATGCACTTTG Diopsittaca CCCTGATGCACTTTG Cyanopsitta CCCTGATGCACTTTG Ara CCCTGATGCACTTTG

Figura 3.7. Blocos conservados no segundo domnio da regio controladora. A ordem dos txons corresponde ordem dos clados da Figura 3.6. Como no foi possvel obter seqncias completas para todos os blocos de todos os txons, o sinal - representa o final da seqncia.

75

Captulo 3

A alta variabilidade apresentada no terceiro domnio dos txons com a RC completa, inviabilizou o alinhamento dessa regio entre grupos menos relacionados taxonomicamente, como entre representantes do clado B e do clado E (Figura 3.6). Nessa regio os txons Amazona e Triclaria do clado B compartilham um bloco formado por TA2CA3CA4CA3CA3CCACA3CA3 que no presente em Graydidascalus brachyurus. Os txons Anodorhynchus hyacinthinus, Ara ararauna, Cyanopsitta spixii, Diopsittaca nobilis e Guarouba guarouba compartilham similaridades nessa regio, apesar de no apresentarem regies repetitivas.

3.4. Discusso As organizaes gnicas ao redor da regio controladora descritas para os gneros de psitacdeos neotropicais sugere que durante a evoluo do grupo, ocorreram convergncias ao longo das linhagens, j que txons de clados diferentes apresentam a mesma organizao (Figura 3.6). Apesar de eventos de rearranjo dos genes serem considerados pouco freqentes e nicos em algumas linhagens animais (Boore e Brown, 1998; Morrison e col., 2001), a convergncia mltipla na organizao dos genes mitocondriais ao redor da regio controladora foi evidenciada anteriormente em aves (Mindell e col., 1998; Bensch e Hrlid, 2000). O mecanismo de duplicao e posterior deleo de genes duplicados (Moritz e col., 1986, 1987; Macey e col., 1997; Holt e col., 1997) o que melhor explica a mudana da ordem comum para a ordem gnica descrita dentre os grupos de aves, porque a mudana de ordem aconteceu entre genes fisicamente prximos, alm disso foram encontradas regies duplicadas e pseudogenes em Falco peregrinus (Mindell e col. 1998), Phylloscopus (Bensch e Hrlid, 2000), Amazona e Pionus (Eberhard e col., 2001) que apresentam a organizao alternativa. Assumindo esse mecanismo, duas possveis maneiras para explicar as diferentes organizaes gnicas nos psitacdeos neotropicais foram testadas. Em ambas, consideramos que o ancestral dos psitacdeos neotropicais apresentava a organizao comum dos genes em aves, porque no existe nenhuma evidncia que sugere o contrrio. Se a ordem alternativa fosse o estado ancestral, isso implicaria na necessidade de haver mais eventos de mudana de ordem gnica no grupo, j que os representantes da linhagem de psitacdeos neotropicais que se separou inicialmente das demais linhagens (Bolborhynchus e Nannopsittaca ) apresentam a organizao comum. Alm disso, Strigops habroptilus, representante atual do primeiro clado da ordem Psittaciformes a se separar dos demais (Barrowclough e col. 2004; de Kloet e de Kloet, 2005) tambm apresenta a organizao comum em aves. Finalmente, a inferncia dos estados ancestrais por

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Captulo 3

mxima verossimilhana sugere maior probabilidade do ancestral dos neotropicais de apresentar a organizao comum (Figura 3.4a). A princpio, as duas hipteses consideradas so igualmente provveis para explicar a evoluo do carter no grupo, no entanto, o modelo que assume trs eventos independentes de duplicao de genes e deleo posterior de cpias duplicadas (Figura 3.4b) parece mais provvel, j que nenhuma das linhagens de psitacdeos neotropicais que apresentam a organizao comum dos genes em aves apresenta vestgio de genes duplicados, como acontece nas trs linhagens que apresentam a organizao alternativa. Como os eventos de perda de genes em todas as linhagens teriam acontecido em perodos prximos considerando o modelo apresentado na Figura 3.6c, seria esperado encontrar resqucios de genes duplicados nas linhagens C e E. Hipoteticamente, possvel imaginar a reverso para a ordem comum de aves a partir de uma duplicao de genes, ou mesmo a partir de uma ordem alternativa onde as duas cpias da RC so potencialmente funcionais, como ocorre em Amazona e Pionus (Eberhard e col. 2001). No entanto, at o momento no foi descrito em nenhum dos grupos de aves que apresentam a ordem de genes comum (ex. Desjardins e Morais, 1990; Boore, 1999) vestgios de genes duplicados, como acontece em alguns txons que apresentam a ordem alternativa, portanto, no existe nenhuma evidncia mais concreta em psitacdeos ou mesmo em aves sugerindo que a ordem comum pode ser revertida a partir de um processo de duplicao, ou mesmo a partir da ordem alternativa. De qualquer forma, o modelo no pode ser desconsiderado. Forpus e txons da linhagem de papagaios, curicas e afins (clado C), apresentam pseudogenes com alguma similaridade com as regies de NADH6 e RNAt
Glu

. O interessante que os pseudogenes

encontrados em ambos os clados apresentam alguma similaridade, o que tornou possvel seu alinhamento. No entanto, em ambos os modelos considerados, a deleo de genes nos dois grupos teria ocorrido independentemente, ou seja por convergncia. Alternativamente, poderiamos considerar um cenrio onde esses txons compartilhassem um nico evento de deleo. Isso sugeriria que a posio filogentica desses grupos seria um pouco diferente da proposta filogentica que estamos considerando (Tavares e col., in prep.). O suporte de bootstrap das anlises de mxima verossimilhana dos ramos que definem a posio filogentica de Forpus no clado que inclui as araras, marianinhas e afins no muito alto, apesar de a probabilidade posterior da anlise bayesiana ser relativamente elevada (Tavares e col., in prep.). No entanto, um cenrio alternativo onde Forpus seria grupo irmo dos txons da linhagem B (Figura 3.6) no foi recuperado por nenhum dos mtodos de inferncia filogentica testados (Tavares e col, in prep.), sustentando a possibilidade de convergncia nos eventos de deleo de genes. Isso poderia indicar que

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Captulo 3

um mecanismo de deleo no aleatria dos genes duplicados poderia atuar em aves, como proposto inicialmente para artrpodes dos gneros Narceus e Thyropygus (Lavrov e col., 2002). Apesar de tal mecanismo no ter sido testado em aves, a deleo no aleatria dos genes duplicados poderia explicar a convergncia para a ordem alternativa em vrias linhagens independentes de aves (Mindell e col., 1998, Bensch e Hrlid, 2000, Eberhard e col., 2001) a partir de uma duplicao hipottica que poderia levar a outros arranjos gnicos nunca descritos, como por exemplo o posicionamento do gene NADH6 entre o RNAt
Thr

e RNAt

Pro

Seria esperado supor que, se o rearranjo gnico ocorreu em uma linhagem ancestral comum entre alguns txons, cada uma de suas regies controladoras deveria apresentar mais similaridade com as regies controladoras homlogas das demais linhagens (cpias ortlogas) do que com a segunda RC presente no mesmo txon (cpias parlogas). Nesse sentido, se assumirmos um nico evento de duplicao e deleo na linhagem ancestral comum aos txons do clado B, as RC 1 desses gneros deveriam ser mais prximas entre si, do que as RC 1 e RC 2 de cada um desses grupos. No entanto, isso no acontece, as RC parlogas so mais prximas entre si. O mesmo acontece no clado F. Apesar de no ter sido obtida seqncia da segunda RC para Deroptyus, a distncia entre RC 1 desse txon e de Pionites maior do que a distncia entre RCs de Pionites . A princpio, isso sugere que em cada txon dessa linhagem aconteceu um nico evento de duplicao de genes, seguido de um nico evento de deleo de genes. Entretando, isso no acontece apenas ao nvel genrico. Entre espcies do gnero Amazona isso tambm foi descrito (Eberhard e col., 2001). Portando, a existncia de eventos independentes para cada um desses casos, seria pouco provvel. RCs duplicadas e que apresentam baixa taxa de divergncia entre as cpias tambm foram descritas em pepinos do mar (Arndt e Smith, 1998), cobras (Kumazawa e col., 1998) e outros grupos (Black e Roehrdanz, 1998; Campbell e Barker, 1999; Kumazawa e col., 1995). Eberhard e col. (2001) levantaram trs hipteses pelas quais um ou mais mecanismos de converso gnica poderiam estar atuando nas RCs parlogas, de forma a mant-las semelhantes: 1) um mecanismo de converso gnica envolvendo apenas as pores convergentes; 2) um mecanismo de converso gnica envolvendo a regio controladora inteira com evoluo extremamente rpida das pores no- funcionais; e 3) seleo paralela para manter a funcionalidade de ambas as regies. Nenhuma das hipteses por si s explica os dados obtidos e os elementos para descartar qualquer uma delas so insuficientes. Portanto, seria interessante comparar a seqncia completa das regies parlogas de cada txon a fim de melhor entender o mecanismo que melhor explicaria os eventos de convergncia de RC nos psitacdeos neotropicais. As regies comuns presentes no terceiro domnio da RC de Amazona e Triclaria poderiam

78

Captulo 3

estar presentes no ancestral do clado que une esses grupos e ter sido perdido em Graydidascalus, j que esse clado estaria mais relacionado taxonomicamente a Amazona do que a Triclaria. Os dados apresentados aqui contribuem para o melhor entendimento da evoluo do genoma mitocondrial em aves. Os resultados obtidos so compatveis com o modelo de mudana da ordem comum em aves para a ordem alternativa por duplicao seguida de deleo de genes. Alm disso, os dados sugerem que vrios eventos de rearranjo gnico podem ter ocorrido entre txons filogeneticamente prximos e que de algum modo pode haver convergncia na maneira como os genes duplicados so perdidos em aves, o que torna ainda mais discutvel o contedo filogentico desse carter para estudar a evoluo de aves. Algum mecanismo de evoluo em concerto tambm parece operar entre as regies controladoras, como foi sugerido inicialmente para Amazona e Pionus (Eberhard e col., 2001).

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Consideraes finais

Captulo 4

A presente tese se insere no contexto da biologia evolutiva que busca inferir a histria da evoluo e elucidar seus mecanismos. A filogenia tem por objetivo entender as relaes de parentesco entre os organismos pelo princpio da ancestralidade comum. O estudo dessas relaes fornece subsdios gerais para interpretar vrios outros aspectos das da evoluo, por exemplo, como ocorrem as modificaes fisiolgicas, ecolgicas, etolgicas, morfolgias, moleculares, dentre outras. Alm disso, com base nas filogenias, pode-se inferir o tempo de divergncia entre as linhagens e levantar ou testar hipteses biogeogrficas. Na presente tese, vrios aspectos da biologia evolutiva dos psitacdeos neotropicais foram estudados. Inicialmente foi realizada uma filogenia abrangente dos gneros do grupo com base em 6.461 pb de seqncias de DNA nuclear e mitocondrial. Essa anlise recuperou: Um clado de pequenos periquitos (Bolborhynchus e Nannopsittaca) como grupo irmo dos demais psitacdeos neotropicais, que por sua vez se dividem em dois grupos, um formado por papagaios, caturritas, curicas e afins (Amazona , Pionus, Graydidascalus, Pionopsitta, Triclaria, Myiopsitta e Brotogeris) e outro formado por araras, marianinhas, tiribas e afins (Ara, Primolius, Orthopsittaca, Cyanopsitta , Diopsittaca , G u a r o u b a , N a n d a y u s , Aratinga , Anodorhynchus , Cyanoliseus , Enicognathus, Rhynchopsitta, Pyrrhura, Deroptyus, Pionites e Forpus). No clado que inclui papagaios, caturritas, curicas e afins as relaes internas so bem resolvidas, enquanto no clado formado por araras, marianinhas tiribas e afins, a maior parte das relaes foram bem resolvidas, mas algumas relaes permanecem pouco suportadas ou no resolvidas, padro possivelmente decorrente de uma rpida radiao que se reflete nos curtos tamanhos de ramo entre essas linhagens nas topologias obtidas. Os resultados descritos na presente tese aumentou muito o conhecimento das relaes sistemticas e filogenticas ao nvel de gneros dentre os psitacdeos da tribo Arini A histria da evoluo de alguns caracteres morfolgicos, comportamental e gentico foi estudada pelo mapeamento dos estados atuais na inferncia filogentica proposta. O resultado dessas anlises, sugere que: Os caracteres morfolgicos, (comprimento da cauda, forma da cauda, dimorfismo sexual aparente, ris bi-colorida, narinas expostas e anel perioftalmico nu) e comportamental (posio da perna ao coar a cabea) apresentaram convergncia e portanto, no podem isoladamente ser usados para a diagnose dos clados obtidos na presente inferncia filogentica. O carter gentico (minissatlites ligados ao cromossomo sexual W) pode apresentar sinal filogentico, mas ainda no foi estudado para todos os txons includos na inferncia filogentica proposta nessa tese, portanto essa concluso seria prematura.
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Captulo 4

Foram realizadas estimativas dos tempos de divergncia dos clados obtidos na inferncia filogentica. As divergncias foram comparadas com fatores histricos que poderiam ter influenciado na diversificao dos grupos: O ancestral dos psitacdeos neotropicais se separou do ancestral australasitico entre 51-67 milhes de anos (ma), portanto a separao da Austrlia e Antrtica possivelmente teve um papel importante na separao ou isolamento desses grupos. As linhagens mais antigas de psitacdeos neotropicais se diversificaram no incio do Eoceno (entre 42-57 ma), perodo no qual a Amrica do Sul e a Antrtica eram conectadas. Padres de cladognese bem distintos foram observados em dois grandes clados de psitacdeos neotropicais. Os gneros de papagaios e afins diversificaram de forma contnua de 12-54 ma, com a maioria dos eventos acontecendo entre 20-46 ma. No entanto, no clado das araras e afins, uma linhagem que deu origem ao atual gnero Forpus divergiu das demais entre 39-54 ma, isso foi seguido de um perodo de cerca de 20 ma onde no registrada diversificao no clado das araras e afins, at que entre 4-34 ma ocorreu cladognese de forma expressiva em uma das linhagens. Os papagaios e afins podem ter evoludo associados a ambientes florestais na Amrica do Sul, j que a cladognese do grupo coincide com a reposio de flora e o aumento da distribuio das florestas tropicais dessa regio. Alm disso, muitas das linhagens atuais desse clado ocorrem nesses ambientes. A grande diversificao (entre 22-34 ma) do grupo das araras, maracans e afins, pode ter ocorrido em resposta a uma grande diversificao de ambientes secos ocorrida no Mioceno, uma vez que muitas linhagens atuais desse grupo ocupam ambientes com caractersticas semelhantes. A falta de registro de diversificao antes desse perodo poderia ser explicada por uma extino das linhagens que teriam se diversificado. Outras possibilidades envolvem a existncia de uma barreira isolando membros dos clados dos pequenos periquitos e do clado das araras, maracans e afins e aps a barreira ter desaparecido, houve uma disperso do grupo para ambientes antes pouco explorados. Duas possveis barreiras seriam: um mar transcontinental formado no sul da Argentina e do Chile durante o Oligoceno; ou algumas linhagens poderiam estar evoluindo na Antrtica e teriam sido impulsionados para a Amrica do Sul, medida que a Antrtica migrou mais para o sul e se tornou um continente incrustrado por gelo.

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Captulo 4

A organizao dos genes mitocondriais ao redor da regio controladora foi determinada para a maioria dos gneros de psitacdeos neotropicais. Esses resultados associados a outros obtidos em trabalhos anteriores foram mapeados na inferncia filogentica e alguns aspectos da evoluo desse carter no grupo estudados esto apresentados a seguir: Apresentam a ordem de genes comum de aves txons do clado de pequenos periquitos (Bolborhynchus e Nannopsittaca), as primeiras linhagens a se diferenciar no grupo dos papagaios e afins (Myiopsitta e Brotogeris ) e espcies do clado das araras e afins (Ara , Primolius, Orthopsittaca, Cyanopsitta, D i o p s i t t a c a , Guarouba , Nandayus, Aratinga , Anodorhynchus , Cyanoliseus, Enicognathus, Rhynchopsitta e Pyrrhura). A ordem de genes alternativa est presente na maior parte dos representantes do clado dos papagaios e afins (Pionopsitta, Graydidascalus,Triclaria, Amazona e Pionus) e em trs gneros do clado das araras e afins (Deroptyus, Pionites e Forpus). O mapeamento sugere convergncia na mudana de ordem dos genes e a inferncia dos estados desse carter em alguns ancestrais foi ambgua, sugerindo mais de uma possibilidade para explicar a origem desses eventos. Duas hipteses foram levantadas: 1. A primeira hiptese assume seis eventos independentes, sendo trs de duplicao, seguido de trs de deleo de genes, que teriam ocorrido aps 54 ma, entre 32-54 ma e aps 29 ma, respectivamente, levando trs linhagens a apresentar a ordem alternativa. 2. A segunda hiptese, assume um nico evento de duplicao (entre 41-56 ma) seguido de cinco eventos independentes de deleo posterior de genes, sendo que dois reverteriam para a ordem comum em aves (entre 26-54 ma e 20-35 ma) e trs dariam origem ordem alternativa (aps 54 ma, entre 32-54 ma e aps 29 ma). Como no dispomos de elementos para identificar se duplicaes ou delees de genes so mais provveis de acontecer, no pudemos concluir qual o mecanismo mais provvel para explicar os diferentes arranjos nessa linhagem. A presena de pseudogenes que representam resqucios dos eventos de duplicao somente nos txons que apresentam o arranjo alternativo, no favorece nenhuma das hipteses, mas evidencia elementos exclusivos de alguns clados e outros convergentes.

Sugerimos que a mudana de ordem gnica em Aves poderia envolver um mecanismo de duplicao e deleo no aleatria dos genes duplicados, modelo que foi proposto para explicar alterao de ordem gnica em Diplopoda.

ATUALIDADES ORNITOLGICAS N.128 NOVEMBRO/DEZEMBRO DE 2005 P. 5

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