Determinacin de la Actividad Enzimtica La velocidad de una reaccin catalizada por una determinada enzima es la medida de la llamada actividad enzimtica,

que puede ser equiparada en la prctica a la cantidad de enzima. La actividad de una enzima se determina por medicin de la velocidad de transformacin del correspondiente sustrato. Esto puede hacerse midiendo la disminucin de la concentracin del sustrato, o midiendo el incremento de la concentracin del producto de reaccin (Daz et al, 1997). Cada uno de los dos procedimientos permite, a su vez, otros dos procedimientos de medicin: 1. Medida en dos puntos, reaccin a punto final. En ella todos los participantes en la reaccin son incubados con el suero conteniendo las enzimas durante un periodo fijo, al cabo del cual se interrumpe la reaccin enzimtica, midindose bien la cantidad de sustrato no transformado, bien la cantidad de producto formado (Daz et al, 1997). 2. Medicin continua, mtodo cintico. La muestra conteniendo las enzimas se incuba con todos los participantes de la reaccin, midindose en intervalos de tiempo regulares la cantidad de sustrato no transformado o la cantidad de producto formado. En este caso la velocidad de reaccin se determina con diversas tcnicas y segn diversos principios (Daz et al, 1997). El curso de una reaccin enzimtica en funcin del tiempo se observa en la figura 1. La velocidad de reaccin (pendiente de la curva) va disminuyendo asintticamente y para las medidas de actividad enzimtica se toma la Figura 1. Curso de una reaccin enzimtica velocidad inicial o la media en un tiempo corto de reaccin (velocidad media inicial). En el primer caso hay que trazar la curva y en el segundo basta con tomar dos puntos. Para una cantidad de sustrato en exceso, la velocidad inicial es proporcional a la concentracin de la enzima (Primo, 1995). El pH influye decisivamente en la actividad enzimtica; hay un valor ptimo y a mayor o menor pH la actividad decrece rpidamente, puesto que la enzima se puede desnaturalizar. Por eso, en los ensayos de actividad, el medio debe tamponarse cuidadosamente al pH ptimo, mismo que vara mucho de unas protenas a otras (Primo, 1995). La temperatura influye de modo anlogo en la actividad enzimtica, y tambin hay una temperatura ptima. Esto se debe a que, en el tramo inferior, la velocidad de reaccin aumenta con la temperatura (rama ascendente) pero, a partir de cierto punto, la enzima comienza a desnaturalizarse (rama descendente) (Primo, 1995).

Para medir la actividad enzimtica se disuelve una cantidad conocida de la enzima pura, o de una preparacin enzimtica bruta en el tampn adecuado, junto con el sustrato en exceso y a pH y temperatura ptimas; el tiempo se empieza a contar cuando se juntan la enzima y los reactivos, y se termina en el momento en que se desnaturaliza aqulla por calentamiento rpido o por precipitacin con TCA. Ahora es necesario disponer de un mtodo analtico preciso para determinar el sustrato desaparecido o el producto formado; para ello hay tcnicas variadas que frecuentemente aprovechan una reaccin coloreada y una medida fotomtrica, o utilizan un reactivo marcado con un tomo radiactivo. En la tabla 1 se dan unos pocos ejemplos de los mtodos descritos (Primo, 1995).
Tabla 1. Ejemplos de mtodos para determinar actividades enzimticas

Bibliografa Daz, J., Fernndez, M. y Paredes, F. (1997). Aspectos bsicos de bioqumica clnica. Madrid: Daz de Santos. Primo, E. (1995). Qumica orgnica bsica y aplicada: de la molcula a la industria. Barcelona: Revert.