TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR

Biotecnologa para no biotecnlogos. Agosto de 2012

Agenda
Avances histricos de la biologa molecular PCR. Electroforesis. Hibridacin de cidos nucleicos Secuenciacin. Clonacin.

AVANCES HISTRICOS DE BIOLOGA MOLECULAR

1975 Southern Blotting 1941 Genes 1944 ADN 1956: 23 pares 1978: se clona el 1953 Determinacin codifican las porta la 1983 PCR de1967 cromosomas gen de la insulina ligasa de estructura del ADN protenas informacin 1987 PGH humana. 1970 Hind III gentica

1982: se produce insulina utilizando tcnicas de ADN recombinante 1982 Tabaco,

2010 Cyntia 1997: Clonacin del primer 1988: 1 patente de un OMG. mamfero, "Dolly".

PCR Que proceso esta implcito?

Replicacin

Polimerasa Chain Reaction: Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en 1983. Gan el premio Nbel de Qumica en 1993 por su invento. Utiliz el PCR para amplificacin del gen de hemoglobina humana, y el diagnstico prenatal de anemia falciforme.

GENERALIDADES PCR

Mtodo de sntesis in vitro de mltiples copias de una porcin de ADN: Amplificacin.

Cada ciclo

Aumento exponencial de ADN blanco

Molde para la sntesis de nuevo ADN

QUE REQUIERE LA REACCIN PCR?

BUFFER Y MAGNESIO

ADN MOLDE

A REACTIVOS

dNTPs

Taq ADN polimerasa

INICIADORES

Reactivos necesarios para PCR:

Amortiguador (Buffer) MgCl2: Cofactor para la funcin de la polimerasa. dNTPs (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

Reactivos necesarios para PCR:

Cebadores primers:
Hebras de ADN de cadena sencilla sintticas 20-24

nt de longitud
Diseo: unin complementaria ADN blanco Anclaje de Taq ADN polimerasa

DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucletidos de longitud.

Polimerasa

En un principio, la polimerasa de DNA que se

utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta es sensible a las altas temperaturas, por lo que haba que aadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

Se

reemplaz la enzima por la de la bacteria Thermus aquaticus.

Parque Nacional de Yellowstone

Comprende mltiples ciclos de un proceso de tres pasos, cada uno realizado a diferente temperatura.
DESNATURALIZACIN 95-100C HIBRIDIZACION 40- 60C EXTENSIN 68 - 72C

CADA CICLO

1 copia de ADN se incrementa 2X copias despus de x nmero de ciclos.

30 ciclos: ms de un billn de copias a partir de una copia de ADN en menos de tres horas!

El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces o ms:

1. Denaturacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. -Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma-

2. Apareamiento o anneling: Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura.

3. Polimerizacin o Extensin. Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De esta forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde. Se efecta a 70C por 1 minutos.

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

Termociclador

La PCR se realiza en un Thermo Cycler Termociclador. Es una mquina que calienta y enfra la reaccin en periodos cortos de tiempo.

En el PCR hay una amplificacin exponencial

Ventajas del PCR

A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y anlisis. Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto. Sus aplicaciones son mltiples: diagnsticos, anlisis prenatales, etc. medicina forense,

Desventajas del PCR

Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb. Se necesitan primers especficos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN Puede contaminarse con otro ADN.

Aplicaciones
Criminalstica
Ejemplo de un caso de criminalstica resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se observan los patrones bandas podr comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero y pantaln del sospechoso (S) coinciden con el perfil gentico de la vctima (V)

Utilidad del PCR

PCR TODA UNA MELODIA!

http://www.youtube.com/watch?v=ROsueNRg-1M

Preparacin del corrido electrofortico

La deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico

Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que deseemos utilizaremos diferentes geles (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia.

Anlisis de la Muestra
La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecficos se pegan a varios sitios)

Southern blot
Secuencias especficas de DNA, mediante el uso electroforesis en gel y de hibridacin (sondas especificas). de
Los fragmentos se separan, de mayor a menor tamao mediante Previamente fragmentada. una electroforesis. Sin teir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa a una membrana de nylon El filtro se incuba con una sonda marcada, especfica para la secuencia que se desea identificar
http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio_g.swf::Southern%20Blot

Northern blot
Se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda.

El nombre de la tcnica deriva por analoga al Southern Blot.

Western Blot o Inmunoblot

Secuenciacin

La secuenciacin de ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. Qumica. Enzimtica.

Secuenciacin de Maxam-Gilbert (qumica)

En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un mtodo para secuenciar ADN basado en la modificacin qumica del ADN y posterior escisin en bases especficas. En resumen, el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de ADN que se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes qumicos utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G), Hidrazina (C+T) e hidrazina ms sales (C).

Mtodo enzimtico de Sanger

Este mtodo de secuenciacin de ADN fue diseado por Sanger, Nicklen y Coulson en 1977 y se conoce como mtodo de los terminadores de cadena o dideoxi. Para este mtodo resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador, cebador o "primer" complementario de una regin del ADN molde anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN.

Mtodo dideoxi de Sanger

Secuenciacin de DNA
Polimerizacin interrumpida de ADN. Se lleva a cabo la polimerizacin de ADN en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerizacin en diferente momento, obtenindose fragmentos de diferente tamao. Se examinan en electroforesis, se lee la secuencia directamente del gel.

Mtodo dideoxi de Sanger

Mtodo dideoxi de Sanger

Mtodo secuenciacin automtica

Electroferograma de la secuenciacin automtica

Geles de secuencia

Secuencia Manual

Secuencia automtica

Secuenciacin

CLONACIN
Tecnologa del DNA recombinante

Qu es la clonacin?
Proceso por el que se consiguen copias semejantes de un organismo, clula o molcula ya desarrollado de forma asexual. .

MODOS DE CLONACIN

CLONACIN MOLECULAR CLONACIN CELULAR CLONACIN DE ORGANISMOS DE MANERA NATURAL

CLONACIN MOLECULAR
La clonacin molecular se refiere al proceso de aislar una secuencia de ADN de inters, insertarlo en un plsmido y obtener mltiples copias de ella en un organismo por accin de la DNA polimerasa. La clonacin se emplea frecuentemente para amplificar fragmentos de ADN que contienen genes.

La clonacin de cualquier secuencia de ADN incluye los siguientes pasos:

Fragmentacin: Inicialmente, el ADN de inters necesita ser fragmentado para proveer un segmento relevante de ADN de un buen tamao. Ligacin: Un procedimiento de ligacin se emplea cuando el fragmento amplificado se inserta en un vector. Transfeccin: Despus de la ligacin, el vector con el gen de inters se transfecta a una clula. Seleccin: Las clulas transfectadas se cultivan.

La maravilla de cortar y pegar

Endonucleasas de restriccin
Pueden reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos dentro de una molcula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, los sitios de restriccin cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos.

Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith 1978

http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio37.swf::Restriction%20Endonucleases

Ligasas

Clonacin molecular

Vector de clonacin
Plsmido. Bacterifago. Csmido: Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, adems contienen secuencias plasmdicas necesarias para la replicacin y genes de resistencia a antibiticos. Los csmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado. YAC son cromosomas artificiales de levadura. 00 a 1000 kb. BAC es un cromosoma artificial bacteriano, hasta 300kb.

Tipos de clula anfitriona

Procariotas Eucariotas

Ingeniera Gentica SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENTICA

1. Agrobacterium. Uso de la bacteria Como "Ingeniero Gentico". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las clulas de la planta produciendo la recombinacin gentica.

2. Acelerador de Partculas (Gene Gun). Un can artificial bombardea micropartculas con el inserto, sobre la clula. 3. Electroporacin. Uso de carga elctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposicin de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las molculas de ADN. 5. Silicon Wiskers. Inyeccin con fibras microscpicas, que atraviesan las membranas con los insertos.

Tcnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENTICA 6. Microinyeccin. Una clula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN forneo es inyectado directamente en el ncleo usando una micropipeta muy fina. 7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeas vesculas de membrana para introducir el ADN in vivo en la clula.

Tipos de clonacin segn el mtodo:

Particin o fisin gemelar: consiste en dividir un embrin, en el estadio de una clula en las primeras fases de su desarrollo, cada mitad o trozo desgajado del embrin se introduce en una zona pelcida de otro vulo, o en una cubierta artificial, y se implanta. El resultado son individuos prcticamente idnticos entre s (salvo mutaciones somticas), pero diferentes a sus padres. Seran equivalentes a gemelos monozigticos. No se debe considerar como clonacin en sentido estricto. Tetra naci a partir de una fisin embrionaria.

 Paraclonacin: transferencia de ncleos procedentes de blastmeros embrionarios o de clulas fetales en cultivo a vulos no fecundados enucleados y a veces, a zigotos enucleados. El progenitor de los clones es el embrin o feto.

Clonacin verdadera: transferencia de ncleos de clulas de individuos ya nacidos a vulos o zigotos enucleados. Se originan individuos casi idnticos entre s (salvo mutaciones somticas) y muy parecidos al donante (del que se diferencian en mutaciones somticas y en el genoma mitocondrial, que procede del vulo receptor).

TIPOS DE CLONACIN
Clonacin de organismos de manera artificial Clonacin de organismos congelados Clonacin humana

CLONACIN DE ORGANISMOS DE MANERA ARTIFICIAL

Tcnica basada en la transferencia nuclear, en la que participan dos clulas; la que dona su material gentico y la que lo acepta.

CLONACIN DE ORGANISMOS CONGELADOS

El principal problema de la congelacin es la degradacin del ADN. Cuando se necesita mantener clulas de un organismo, es necesario utilizar un criopreservante Cuando se congela una clula directamente, se producen daos en la estructura celular debido a la cristalizacin del agua. El ADN adems se daa irreparablemente Un equipo de investigacin japons ha clonado un ratn que ha permanecido 16 aos congelado a -20 C. Utilizando clulas del cerebro, las cuales mantienen en su citoplasma una mayor cantidad de glucosa, que funcion como criopreservante, lo que permiti mantener el ADN y las clulas nerviosas intactas durante todo ese tiempo.

CLONACIN HUMANA
La investigacin tiene como objetivo obtener clulas madre para curar enfermedades.

CLONACIN CELULAR
Clonar una clula significa derivar una poblacin celular a partir de una sola clula. Ese es un importante procedimiento in Vitro cuando se desea la expansin de una sola clula con ciertas caractersticas.

CLONACIN DE ORGANISMOS DE FORMA NATURAL

Es crear un nuevo organismo con la misma informacin gentica que una clula existente. Es un mtodo de reproduccin asexual, donde la fertilizacin no ocurre. En trminos generales, slo hay un progenitor involucrado. Esta forma de reproduccin es muy comn en organismos como las amebas y otros seres unicelulares, aunque la mayora de las plantas y hongos tambin se reproducen asexualmente.

LA CLONACIN DESDE EL PUNTO DE VISTA TICO

Los problemas ticos surgen de la transformacin que sufre la reproduccin ya que en la clonacin por trasplante nuclear -hay un solo progenitor gentico, a diferencia de la reproduccin sexual. Actualmente, se enfrentan dos posturas principales acerca de este tema: Algunas cosas que no slo no deberamos hacer sino que ni siquiera deberamos saber cmo hacerlas. No puede congelarse el desarrollo de la ciencia y la tecnologa pues se privara a la sociedad de bienes desconocidos pero imaginables.

LA CLONACIN DESDE EL PUNTO DE VISTA RELIGIOSO

Con frecuencia se cree que la fe y la ciencia son fuerzas opuestas, luchando para prevalecer una sobre otra. En realidad, la religin es una gua para vivir, mientras que la ciencia es una herramienta que nos muestra el esplendor de esa misma Creacin, y que nos permite mejorar nuestras vidas de acuerdo a nuestra fe. Como herramienta, la ciencia, nos corresponde a todos decidir cmo usarla. Como toda herramienta puede ser usada para beneficio de la humanidad, pero tambin, puede prestarse para abusos. La clonacin abre muchas posibilidades para aliviar el sufrimiento humano, pero tambin presenta graves peligros. Por ejemplo, no sera moralmente aceptable experimentar o descartar embriones humanos en la investigacin.

Material de consulta
http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072437316/student_view0/chapter14/ani mations.html#

La oveja Dolly
(5 de julio de 1996 - 14 de febrero de 2003) Dolly fue en realidad una oveja resultado de una transferencia nuclear desde una clula donante diferenciada a un vulo no fecundado y anucleado Cinco meses despus naco Dolly, que fue el nico cordero resultante de 277 fusiones de vulos enucleados con ncleos de clulas mamarias. Su nacimiento no fue anunciado hasta siete meses despus, el 23 de febrero de 1997 . El 14 de febrero de 2003 (7 aos), Dolly fue sacrificada debido a una enfermedad progresiva pulmonar

Los restos disecados de Dolly son exhibidos en el Museo Real de Escocia.). Sus creadores fueron los cientficos del Instituto Roslin de Edimburgo (Escocia), Ian Wilmut y Keith Campbell.

Estrategia de clonacin

El hombre fue creado a imagen y semejanza de Dios, - Est llamado a ser Dios, a crear y modificar la vida........... En la primera clonacin humana De la costilla del hombre Dios hizo la mujer, Dios invent la clonacin, El hombre al estar llamado a ser Dios, debera clonar incluso al mismo hombre como lo hizo Dios.......

Para que clonar animales? - Modelos animales - Factoras farmacuticas - Evitar extinciones - Aprender - Humanizarlos (Transplantes) - !Mascotas

CLONACIN HUMANA
CLONACION DE ORGANOS

El mundo de las clulas madre CLONACION NO REPRODUCTIVA

-Infertilidad (gentica, tratamiento enfermedad). - revivir personas queridas, genios. - Tener hijos sin hombres. - Experimentacin - Ganarle la batalla a muerte?

Influencia del ambiente Herencia extra nuclear / proteica

Al clonar seres vivos, no se camina en contra de la experiencia de la naturaleza, que invirti miles de aos para lograr la reproduccin sexual, asegurando que los individuos que nazcan sean siempre diferentes.?

Ingeniera Gentica: MODELOS VEGETALES Las plantas que se usan como modelos de aprendizaje en Ingeniera Gentica Vegetal son: Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum (tabaco), Orizae sativa (arroz) y Solanum tuberosum (papa).

Estos modelos son tiles para aprender haciendo y ayudar a resolver problemas identificados por los agricultores nacionales, mientras se capacitan los miembros de los Centros o Unidades de Investigacin que se quieran preparar.

Ingeniera Gentica NUEVOS ANIMALES

1987 secrecin de Beta-lactoglobulina en leche de ratn. Produccin de protena C humana en leche de cerdos, para desrdenes como hemofilia.

Hormonas de crecimiento humano en tejido de cerdo. Antitrombina humana III, anticoagulante sanguneo secretada en leche de cabras transgnicas. Cabras transgnicas para producir BioSteel fibra hecha por el hombre con propiedades de tela de araa.

Ingeniera Gentica NUEVOS ALIMENTOS Salmn transgnico por

hormona de crecimiento. Crece de 4 a 6 veces ms rpido que un salmn no transgnico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversin del alimento.

ARROZ DORADO con beta caroteno de

genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en provitamina A al ser ingeridos. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.

(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

ARROZ con aa esenciales.

Ciencias dominantes emergentes

Genmica Qu podra pasar ? Transcriptmica

Qu esta pasando?

Protemica

(Dhingra et al. 2005)

La complejidad de un organismo no est determinada por la complejidad de su genoma sino por la complejidad de su PROTEOMA

Un mismo genoma

Diferente proteoma

INTRODUCCIN
PROTEMICA

PROTEOMA

Corresponde a la totalidad de las protenas codificadas por un genoma

Se ocupa del estudio de las protenas producidas en una condicin determinada

(Dhingra et al. 2005)

INTRODUCCIN
Aproximaciones..

Protemica de expresin

Protemica estructural Protemica Funcional

INTRODUCCIN

(Dhingra et al. 2005)

Electroforesis en dos dimensiones

(Tomado de Cuervo 2010)

Electroforesis en dos dimensiones

(Tomado de Cuervo 2010)

Anlisis de los geles bidimensionales

a) Electroforesis en condiciones denaturantes (gel de poliacrilamida al 12%), de extractos provenientes de las fases exponencial y de latencia de la cepa nativa Clostridium sp. IBUN 158B. b) Electroforesis bidimensional de protenas intracelulares (fase de latencia). Protenas (300 g) extradas con ultrasonido, en buffer fosfato con Pefabloc 10 mM. Primera dimensin: tiras pH 4-7 (18 cm). Tincin con Blue Silver.

Espectometra de masas: Ionizacin

INTRODUCCIN

INTRODUCCIN
Espectrograma de masas

(Chen & Yates 2007)