RECUENTO DEL NMERO DE BACTERIAS T. de la Rubia y J.

Martnez
OBJETIVOS El alumno aprender a: 1. Utilizar correctamente pipetas y micropipetas decimales seriadas de una suspensin de bacterias preparando diluciones

2. Determinar la concentracin bacterias viables (entendidas como unidades vormadoras de colonias) en una muestra

Contenido: I INTRODUCCIN

II MTODOS III RESULTADOS IV AUTOEVALUACIN

I. INTRODUCCIN En diversos estudios microbiolgicos (como anlisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacuticos o del medioambiente entre otros), se requiere conocer el nmero de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante mtodos de medida de la masa total celular, que generalmente es directamente proporcional al nmero de clulas, (mtodos de determinacin del peso, de la actividad del cultivo o mtodos turbidimtricos) o por la determinacin del nmero de clulas. Encontrar informacin ms completa sobre medidas del crecimiento de bacterias en los apuntes on line del Profesor D. E. Iaez 1. Principales mtodos de El nmero de bacterias de una muestra puede recuento del determinarse directamente por recuento del nmero total nmero bacterias de clulas o indirectamente por la estimacin del nmero en una muestra ms probable, por filtracin o por el recuento de viables en placa (Clulas capaces de dividirse sobre o dentro de un medio slido, tambin se refieren como unidades formadoras de colonias UFC). 1.1.Recuento directo de bacterias al microscopio Es una tcnica para determinar o recontar el nmero total de organismos de una muestra: Se utilizan cmaras de recuento (Cmara de Petroff-Hauser) y visualizacin al microscopio. Es un mtodo rpido del nmero total de clulas de una muestra pero no distingue entre viables o no viables. Se utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de clulas suspendidas en un lquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente elctrica. Se puede determinar a su vez el tamao de las clulas pero tampoco distingue entre viables, muertas o partculas.

1.2.Recuento directo con contadores electrnicos

1.3. Recuento en filtros de membrana

2. Mtodos de recuento de bacterias viables en placa

En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un volumen de la muestra a travs de un filtro de membrana de tamao adecuado para retener a las bacterias (0.220.45 m). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca sobre un medio de cultivo slido y se incuba. El recuento del nmero de colonias formadas sobre el filtro determina el nmero total de bacterias en la muestra filtrada. Es un mtodo til cuando el nmero de bacterias presentes en la muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia para determinar el nmero de bacterias en agua. Estos mtodos ofrecen la ventaja de cuantificar solo a las bacterias viables presentes en una muestra. Implican la dilucin seriada de la muestra en agua, caldo o solucin salina, la inoculacin de la dilucin en medio de cultivo slido y la incubacin durante 24-48 horas a la temperatura apropiada y en placa son mtodos de estimacin de bacterias viables en trmino de unidades formadoras de colonias (UFCs). El nmero de unidades formadoras de colonias de una suspensin bacteriana puede determinarse mediante dos tcnicas:

2.1. Recuento en placa por siembra en profundidad.

Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50C sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un mtodo generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos. Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilucin de la muestra sobre la superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este mtodo todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta tcnica para el recuento de bacterias aerobias.

2.2.Recuento en placa por siembra en superficie

II. MTODOS

RECUENTO DEL NMERO DE BACTERIAS VIABLES MEDIANTE EL MTODO DE DILUCIN Y SIEMBRA EN PLACA
Cultivo de Escherichia coli de 24 horas en caldo de tripticasa soja (TSB) 6 placas de TSA 6 tubos de ensayo con 4.5 ml de solucin salina 0.9% estriles. Puntas de pipetas estriles de 1 ml acero Placa con alcohol Pipeta automtica de 1ml Esptula de Driglasky de

1.Material necesario

2. Tcnica de recuento en placa por siembra en superficie. 2.1. Obtencin de diluciones seriadas del cultivo. Marcar los 6 tubos de solucin salina con las diluciones 10-1, 10-2,.10-6

Utilizando la pipeta de 1 ml con punta estril, transferir aspticamente 0.5 ml del cultivo de E. coli a un primer tubo de solucin salina estril de 4.5 ml. (dilucin 10-1). Retirar la punta y echarla al contenedor.

Mezclar la suspensin durante unos segundos

con

un

vortex

Con una nueva punta de pipeta estril, transferir 0.5 ml al siguiente tubo de dilucin (dilucin 10-2). Retirar la punta y echarla al contenedor.

Repetir el paso anterior hasta obtener la dilucin 10-6. 2.2.Siembra en placa Marcar las placas con las tres ltimas diluciones 10-4, 10-5, 10-6 (2 placas por dilucin). Comprobar que la superficie de las placas est bien seca.

Cambiar el volumen de la pipeta a 0.1 ml. Tomar una punta de pipeta estril y transferir 0.1 ml de cada una de las tres ltimas diluciones a placas de TSA

Esterilizar la esptula de Driglasky impregnndola en alcohol, escurrir el exceso de alcohol y pasar por la llama del mechero.

Sembrar la dilucin sobre la superficie de la placa rotando y esparciendo la muestra en todas las direcciones.

Incubar las placas en posicin invertida a 37C durante 24-48 horas. III. RESULTADOS

2.3.Recuento de las colonias Tras la incubacin, se observan las colonias bacterianas sobre la superficie del agar. Cada colonia representa a una unidad formadora de colonia (UFC). Usualmente una UFC se corresponde con una clula viable.

Seleccionar las placas de la dilucin que haya producido un nmero de colonias comprendido entre 30-300 y contar el nmero de colonias presentes.

En el ejemplo: 125 colonias

UFC/ml= 125 x10 x10 = 125 x 10

El resultado debe expresarse como UFC/ml para ello se multiplica el promedio del n de colonias obtenido por el inverso de la dilucin final de la muestra.

2.4. Resultados

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

IV. AUTOEVALUACIN: 1. Si transferimos 0.1 ml de una muestra a 99.9 ml de solucin salina estril. Cul es la dilucin obtenida? a. 10-1 b. 10-2 c. 10-3 2. De un cultivo de Escherichia coli se hacen diluciones seriadas aadiendo 10 ml en 90 ml de solucin salina estril. Se siembran 0.1 ml de cada dilucin en placas de agar nutritivo que se incuban a 37C durante 24 horas. Tras la incubacin, los resultados del recuento de colonias fue el siguiente:

Dilucin 10-4 10-5 10-6 10-7

Promedio del N de colonias > 1000 660 250 3

Cul es el recuento de UFC/ml de la muestra? a. 2.5 x 106 b. 25 x 107 c. 25 x 108 3. Cual es el nmero de bacterias por ml del siguiente cultivo?

a. 480 x 10 5 b. 6.3 x 10 c. 63 x 10
8

Los nmeros corresponden a volmenes o a nmero de colonias crecidas en cada placa