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Revista da Sociedade Brasileira de Qumica - Substncias Volteis de macho Anastrepha fraterculus Wied. (Diptera: Tephritidae): atividade de identifi

Revista da Sociedade Brasileira de Qumica


Verso impressa ISSN 0103-5053

Servios on Demand Artigo pdf em Ingls Artigo em formato XML Referncias do artigo Como citar este artigo

J. Braz. Chem. Soe. vol.12 no.2 So Paulo, maro / abril 2001


http://dx.doi.org/10.1590/S0103-50532001000200012

Artigo

Substncias volteis de Male Anastrepha fraterculus Wied. (Diptera: Tephritidae): Identificao e Comportamental Atividade
Ivanildo S. Lima a * , Philip E. Casa b e Ruth R. do Nascimento c
um

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Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade, Universidade Federal de Alagoas, Campus Delza Gitai, BR 104 Norte Km 85, 57120-000, Rio Largo - AL, Brasil
b

Departamento de Biologia, Universidade de Southampton, Bassett Crescent Mdio, Southampton, SO16 7PX - UK

Departamento de Qumica, Universidade Federal de Alagoas, BR 104 Norte Km 14, 57072970, Macei - AL, Brasil

Substancias volteis produzidas POR machos fazem Gnero Anastrepha FORAM isoladas Previamente de A. ludens e A. SUSPENSA . Ambas as Espcies acasalam no PERODO da Tarde, liberam Compostos Similares los Diferentes propores e apenas diferem na Produo de monoterpenos. When estao los Chamamento, Os machos de A. fraterculus liberam Dois ismeros fazer sesquiterpeno a -farneseno, Trs lactonas (anastrefin, epianastrefin e ( E, E )-suspensoldeo) e Dois monoterpenos (limoneno e ( Z ) - b -ocimeno). Como glndulas salivares dimrficas DOS MACHOS produzem E / OU armazenam smio mesmos ismeros fazer a -farneseno e suspensoldeo, e Quatro pirazinas. Dois Desses Compostos FORAM Previamente Isolados de machos de A. ludens e A. SUSPENSA . Em Bioensaios, como glndulas salivares de machos de A. fraterculus atraram como Fmeas virgens e Sexualmente Ativas. No entanto, como Fmeas Sexualmente imaturas Localidade: No mostraram ATIVIDADE comportamental.

Compostos volteis produzidos por machos de Anastrepha espcies foram anteriormente relatados de A. ludens e A. SUSPENSA . Ambas as espcies
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acasalam no perodo da tarde, dispensar um intervalo semelhante de compostos em diferentes propores, e diferem apenas na produo de monoterpenos. Ao ligar, masculino A. fraterculus liberam dois ismeros do sesquiterpeno a farneseno, trs lactonas (anastrefin, epianastrefin e ( E, E )-suspensoldeo), e dois monoterpenos (limoneno e ( Z ) - b -ocimeno). As glndulas salivares dimrficas dos machos produzem e / ou armazenar os mesmos ismeros do a farneseno e suspensoldeo, e quatro pirazinas. Dois destes compostos foram previamente isolados de machos A. ludens e A. SUSPENSA . Glndulas salivares de virgem chamada masculino A. fraterculus mostraram atividade comportamental quando bioensaio com moscas fmeas virgens maduras, mas as fmeas imaturas no foram atrados. Palavras-chave: Anastrepha , mosca da fruta, volteis, comportamento, terpenos, lactonas

Introduo
Moscas de frutas do gnero Anastrepha (Diptera: Tephritidae) inclui 150 a 200 espcies nativas para o Caribe, Mxico e Amrica Latina. Devido ao seu alto potencial bitico, grande nmero de plantas hospedeiras, o estabelecimento rpido e desenvolvimento, moscas de frutas tornaram-se pragas srias de muitas rvores frutferas e vegetais em reas de clima temperado, subtropical e tropical. Os danos s culturas causadas por moscas da fruta pode ser direta, por meio de oviposio em frutas e tecidos de partes vegetativas de plantas e alimentao pelas larvas, ou indireto, atravs da decomposio dos tecidos vegetais por microorganismos invasores e restries de quarentena 1 . Durante chamando os machos de vrias atividades de Anastrepha espcies produzem e liberam substncias volteis. Esses compostos volteis so liberados pela boca e nus e, possivelmente, por evaporao a partir da superfcie do corpo cuticular 1 . Os compostos volteis produzidos por machos foram previamente identificados apenas de A. ludens e A. SUSPENSA . Componentes do feromnio de moscas machos das duas espcies foram obtidos a partir de extratos de corpo inteiro, extratos abdominais e por aerao 2-7 . Os machos A. ludens e A. SUSPENSA libertao diferentes propores dos mesmos trs hidrocarbonetos sesquiterpeno: um -farneseno, b -bisaboleno e um - trans -bergamoteno. A composio qumica da mistura libertada por machos de ambas as espcies demonstrou ser especfica da espcie; macho A. SUSPENSA produzir a mono-terpeno ( Z ) - b -ocimeno enquanto masculino A. ludens produzir limoneno 5 . Depois de bioensaios de extratos abdominais masculinos de A. ludens , Robacker 8 e Garcia sugerido que (Z)-3-nonenol, (Z, Z) -3,6-nona-dienol, (-) - (S, S) - epianastrefin, e (-) - (S, S)-anastrefin so todos os componentes da feromona sexual. Chuman 4 e colegas de trabalho isolado de um macroldeo masculino A. SUSPENSA o qual foi identificado como (E, E) -4,8-dimetil-3 ,8decadien-10-olide. A presena de (E, E) -3,8-suspensoldeo como um componente principal da mistura voltil emitido pelo macho A. ludens foi primeiramente relatada por Rocca 5 e colegas de trabalho. Sob as bolsas abdominais laterais de muitos tefritdeos h duas glndulas especficas do homem, as glndulas pleurais e as glndulas salivares dimrficas dos machos. Masculino glndulas salivares de vrios Anastrepha espcies, incluindo a Amrica do Sul mosca da fruta A. fraterculus , surgem a partir de uma conduta comum em que a cabea bifurca-se em dois tubos laterais que se estendem para baixo de cada lado do abdmen e no final como uma grande bola de enrolada tbulos 9 . Ao ligar, masculino A. fraterculus inflar as bolsas pleurais em que o reservatrio das glndulas salivares, que so acreditados para a produo de feromnio sexual, est localizado. A tcnica de aerao considerado o melhor mtodo para a recolha de feromnio de insetos vivos, pois evita a extrao das impurezas presentes nos extratos de glndulas e tecidos 10 . No entanto, h evidncias de estudos sobre as glndulas macho isolado e anlise de tecidos, ou compostos qumicos, tais como lactonas e sesquiterpenos so produzidos ou armazenados nas glndulas
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salivares de machos de vrias espcies de moscas da fruta tefritdeos. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar compostos volteis de machos de A. fraterculus e para estudar as respostas das moscas fmeas sexualmente imaturas e maduras a diferentes concentraes de glndulas salivares do sexo masculino.

Experimental
Insetos A cultura de A. fraterculus foi estabelecido como pupas de CPACT / EMBRAPA, sul do Brasil. Adulto voa A. fraterculus foram obtidos a partir de uma colnia de laboratrio na Universidade de Southampton, de onde tinham sido na cultura durante trs geraes. Moscas macho foram segregados no dia em que surgiu, alimentados com acar mascavo e gua. A criao ea sala experimental foram mantidos a 26 2 o C, 60 10% UR e 13:11 h LD fotoperodo em 1600 lux com 1 h de 15 lux amanhecer e anoitecer. Glndulas salivares As glndulas salivares de machos vinte chamada virgens, com idades entre 18 a 25 dias, foram removidos e colocados em um frasco de vidro contendo diclorometano durante a anlise da amostra de lquido. A amostra foi, ento, concentrada at um volume de cerca de 100 m l, e armazenadas at anlise qumica. Glndulas salivares de machos chamando tambm foram dissecados e selado em grupos de 3 ou 5 equivalentes do sexo masculino (ME), em suave capilares de vidro para anlise de amostras slidas 11 . As amostras foram armazenadas num congelador at que a cromatografia. Coleo de volteis de moscas macho Volteis emitidos por virgens chamadas moscas macho foram coletados por meio de um aparelho de arrastamento de ar conforme descrito por Golub 12 e Weatherson. A corrente de ar umidificado e purificado foi preterido homens vivos em uma cmara de vidro (43 centmetros de comprimento x 6 cm, od). Os compostos volteis emitidos pelos insectos foram capturados sobre 150 mg de Tenax (60-80 mesh), o qual foi usado como adsorvente para aprisionar as feromonas. O carvo activado (4-14 de malha) foi utilizado para a purificao da corrente de ar. O filtro de entrada de ar foi activada por aquecimento com um queimador de Bunsen enquanto gs azoto fluiu atravs dele (cerca de 25 ml / min). A coleo armadilha de feromnio foi feita por lavagem primeiro com hexano para remover a contaminao no-polar e, posteriormente, com metanol para remover a contaminao polar. Depois de utilizar o solvente de cada armadilha Tenax foi deixada a secar temperatura ambiente, num cromatgrafo de forno com azoto que flui atravs dele gs (CG). A armadilha foi ento aquecido por 3 horas num forno de GC a 280 o C por meio de fluxo de gs de azoto para evitar a dessecao. O fluxo de volume ou massa foi ca. 1 L.min -1 , fluindo constantemente e medido com um medidor de fluxo de ar (ELE International Ltd EL 503-070). Toda a vidraria foi usado previamente lavadas em 5% "Decon 90", lavado com gua destilada e secou-se num forno. Moscas macho Virgin foram transferidos da sala de cultura para a sala experimental um dia antes do arejamento, e colocado na cmara de arejamento de vidro imediatamente antes anoitecer. O arejamento foi realizado a partir do incio do perodo de madrugada, utilizando 80 homens com idades compreendidas entre 15 e 30 dias, e prolongou-se durante 3,5 h. Aps arejamento, os compostos volteis presos no tenax foram extrados com dessoro por solvente com 10 ml de hexano destilada. O extracto foi, em seguida, concentrou-se para cerca de 100 m l, passando azoto gasoso sobre ele e armazenadas num congelador at anlise. Aerao para anlise trmica-dessoro Aps diluio em glndulas solvente, ou quando se concentrar at um volume muito pequeno, substncias volteis, pode ser perdido ou pode ser inferior ao limite de deteco 11 . Para minimizar este problema, o arejamento foi realizado utilizando, como armadilha de recolha voltil, um tubo de vidro (40 cm de comprimento x 1,0 cm OD) para permitir a sua colocao no interior de um forno aquecido electricamente fornecida com uma gama de
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temperatura controlvel, e directamente ligada com a coluna de GC. 100 mg de tenax (6080 mesh) foi utilizado como o adsorvente para aprisionar os produtos volteis. Aps aerao da cmara de reteno inseto foi cuidadosamente lavado com hexano destilada para recolher as substncias menos volteis, que poderiam permanecer impregnados na superfcie do vidro no interior da cmara. Este extracto foi ento concentrada para 100 ul por passagem de azoto gasoso sobre ele e armazenado num congelador.

Instrumentao
Cromatografia gasosa-espectrometria de massa Hexano extratos de glndulas salivares de virgem masculino A. fraterculus e glndulas salivares puras foram analisadas em um Hewlett-Packard 5890 cromatgrafo de gs acoplado a um detector selectivo de massa B 5970 (MSD) utilizando sistema 70 eV da ionizao por impacto de electres com uma coluna capilar de GC ligado directamente aos parmetros de funcionamento source.The ies foram controladas 300 por um computador HP com 59.970 C ChemStation HP. A cromatografia foi realizada em uma fase imobilizada polidimetilsiloxano (equivalente a OV-1) em uma coluna de slica fundida (12 m de comprimento x 0,22 milmetros ID x 0,33 mm de espessura de filme). Hlio foi utilizado como gs transportador, a um caudal linear de 1 ml / min. As amostras foram aquecidas na porta de injeco a 150 o C. A temperatura do forno foi programada de 30 o C durante 2 min, depois deixou-se subir a uma taxa de 8 o C / min a 150 o C. Thermal-dessoro Depois de aerao na armadilha coleo foi colocada dentro de um forno aquecido eletricamente conectada diretamente com o porto de injeo GC. O tubo de adsoro foi aquecida a 250 o C durante 20 min enquanto se um gs hlio a uma taxa de fluxo linear de 15 ml / min, foi passado atravs da armadilha. A sada foi ligada a um tubo de ao revestido com vidro (SGE, Milton Keynes, Reino Unido), dobrada para formar um tubo em U e arrefeceu-se a poro por imerso em azoto lquido num frasco de Dewar. A partir do tubo em U, o metal revestido com vidro foi inserido atravs de um buraco na porta de injeco de CG, terminando na zona aquecida do bloco de injeco. Quando todos os materiais volteis foram dessorvido da Tenax e recolhido no tubo em U, o tubo de vidro foi revestido flash-aquecido a 250 o C por passagem de uma corrente contnua atravs do revestimento de metal e a ficha de compostos orgnicos foi varrida sobre a a coluna cromatogrfica. A temperatura do forno do GC foi programada de 30 o C e mantida a esta temperatura durante 2 minutos, depois foi deixada subir a uma taxa de 8 o C / min a 280 o C. Identificao qumica A maioria dos produtos qumicos foram identificados por comparao dos tempos de reteno de GC e padres de fragmentao de espectro de massa com os padres autnticos sintticos. Para confirmaes espectrais, os compostos comerciais foram coinjected na coluna de GC. No entanto, onde os compostos padro no estavam disponveis a identificao foi efectuada por comparao com os espectros de referncia, tais como o registo de dados de espectrometria de massa 13 e as dada por Rocca 5 e colaboradores. Atividade comportamental A fim de testar a atratividade de glndulas salivares do sexo masculino para virgem maduro (25 a 30 dias de idade) e imaturo (de 1 a 10 dias de idade) do sexo feminino A. fraterculus , uma caixa de poliestireno (28x10x 15 cm) foi usada como uma cmara de bioensaio. Para cada rplica, 20 fmeas virgens foram introduzidos na cmara de ensaio biolgico, um dia antes da experincia e utilizada apenas uma vez por cada repetio. Datas originais foram transformados por log (resposta + 1) e um one-way ANOVA seguido pelo teste de comparaes mltiplas de Tukey foi aplicado para identificar diferenas significativas. As glndulas salivares foram obtidos por dissecao macho virgem voa com idades entre 25 a 30 dias durante o perodo de amanhecer. Frescas glndulas salivares
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dissecados foram colocados num papel de filtro, introduzido na cmara de ensaio biolgico, e colocado sobre um outro papel de filtro posicionada a meio caminho para baixo de um lado da cmara. Um papel de filtro com uma gota de gua filtrada foi colocada numa posio semelhante no lado oposto da cmara, para actuar como um controlo. Duas doses replicado 11 vezes foram testados: 1 ME e 5 ME. Student pareado t teste foi utilizado para identificar diferenas significativas.

Resultados
A. fraterculus volteis A Figura 1 mostra a identificao parcial dos compostos volteis presentes na amostra lquida de glndulas salivares de machos A. . fraterculus picos marcados 1, 2 e 3 , representa o sesquiterpeno ( E, Z ) - um -farneseno, a lactona ( E, E ) - um -suspensoldeo, e sesquiterpeno ( Z, E ) - um -farneseno, respectivamente. Os volteis recolhidos por lavagem da cmara de reteno insectos com hexano, depois de arejamento apresentado na Figura 2 . Peak 1 representa o sesquiterpene ( E, Z ) - a -farneseno e pico de 2 a sesquiterpene ( Z, E ) - a -farneseno. Os padres de fragmentao do pico 3 e 4 foram comparados com os espectros publicados 14 , e identificado como anastrefin e epianastrefin. Ambas as lactonas tambm foram identificados por comparao dos tempos de reteno e padres de fragmentao com aqueles obtidos a partir de uma amostra de extrato de aerado masculino A. SUSPENSA , que foi gentilmente cedido pelo Dr. JL Nao. A lactona ( E, E )-suspensoldeo foi identificado por comparao do padro de fragmentao do espectro de massa com aquela apresentada por Rocca 5 e colaboradores, que encontraram suspensoldeo na mistura de produtos volteis emitidos pelos machos A. ludens . Os ismeros do sesquiterpeno um -farneseno foram identificados por comparao com padres autnticos sintticos.

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A anlise qumica da amostra slido revelaram a presena de vrios pirazinas em quantidades muito pequenas, o que no puderam ser identificados atravs da anlise de amostras de lquidos ou dessoro trmica ( Figura 3 ). Picos marcados 1 , 2 , 3 , e 4 , representa 2,5-dimetilpirazina, 2,3,5-trimethylpyra-zina, 3-etil-2 ,5-dimetilpirazina, e 3butil-2 ,5-dimetilpirazina. Os picos 5 e 6 representam ( E, Z ) e ( Z, E ) - um -farneseno, respectivamente. As pirazinas foram identificados por comparao com padres autnticos sintticos. Os compostos volteis aprisionados para tenax, sem a utilizao de solvente, mostrou a presena de dois compostos anteriormente no registadas, as quais foram identificadas como o limoneno e cis --ocimeno, os picos 1 e 2 na Figura 4 . Estes compostos tambm foram identificados por comparao com padres autnticos sintticos.

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Atividade comportamental Glndulas salivares de moscas machos eram atraentes e agiu como um arrestantes para fmeas virgens maduras. As respostas de log mdio de fmeas adultas virgens para duas doses de glndulas salivares machos so apresentados na Figura 5 . O tempo mdio para o sexo feminino primeiro a chegar, e o tempo mdio gasto na sondagem da fonte foram significativamente maiores para a dose de 5-ME = equivalentes do sexo masculino do que os registados para a dose de 1 ME ( Figura 6 ). Como as fmeas imaturas virgens no foram atradas para as glndulas salivares do sexo masculino, outro bioensaio foi realizado a fim de determinar o limiar de resposta a idade das mulheres para as glndulas salivares do sexo masculino. Dois grupos de 20 mulheres foram continuamente bioensaio com um ME e 5 ME, a partir do terceiro dia aps a emergncia dos adultos, at o dia em que foi observado o comportamento primeira sondagem. Os resultados dessas observaes levaram-nos a crer que as moscas fmeas foram atradas para as glndulas salivares de machos de chamadas somente quando eles alcanaram a maturao sexual, que , em mdia, 16 dias de idade 15 .

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Discusso
Quando a concentrao at um volume muito pequeno, as substncias volteis pode ser perdido ou pode ser inferior ao limite de deteco 11 . Dois outros fatores tm sido relatadas como as principais razes para a perda de substncias muito volteis. Ao utilizar como adsorvente tenax 7 , 25% de suspensoldeo foi perdido e as temperaturas elevadas de GC detector, vulgarmente utilizados com injeces split-splitless, resultou em uma perda adicional de aproximadamente 75% do mesmo composto. Apesar de vrias tentativas infrutferas para volteis de captura de macho A. fraterculus , foi possvel identificar o limoneno monoterpenos, que s foi descrito para A. ludens , e cis --ocimeno relatado apenas para A. SUSPENSA . Ambos lactonas (anastrefin e epianastrefin) aqui relatado para A. fraterculus tambm esto presentes em A. ludens e A. SUSPENSA 3,6,14 . Anlise do espectro de massa da amostra de lquido de glndulas salivares de machos A. fraterculus levou identificao de dois ismeros de um hidrocarboneto e uma sesquiterpeno-lactona, ( Z, E ) - um -farneseno, ( E, Z ) - um -farneseno e ( E, E ) suspensoldeo respectivamente. Estes materiais volteis so reportados aqui pela primeira vez para A. fraterculus , mas foram relatados na literatura como componentes volteis de A. ludens e A. SUSPENSA 4,5 . Em ambos os mtodos de anlise (ie amostra lquida e slida), o principal composto que se encontra na glndula salivar do sexo masculino foi de farneseno. Alguns dos compostos liberados pelo masculino A. ludens e A. SUSPENSA esto presentes nas glndulas salivares de machos de A. fraterculus . No entanto, um - trans bergamoteno, que um componente secundrio para a A. ludens e tambm presentes no A. SUSPENSA 5 , no foram encontradas nas glndulas salivares de machos de A. fraterculus . Nem o sesquiterpene -bisaboleno foi detectado, nem os dois nonenols relatados por Nation 2 de A. ludens . Epianastrefin, que um componente importante de A. ludens e A. SUSPENSA e anastrefin, classificado como sendo um componente menor, em ambas as espcies, foram detectados em A. fraterculus, s quando a cmara de aerao inseto foi lavado com hexano. Anlise das amostras de slidos, no entanto, revelou a presena de vrios pirazinas que no foram relatados como componentes volteis de quaisquer outros Anastrepha espcies. Pirazinas foram detectados em produtos volteis a partir de hidrolisado de protena de 16 , em alarme formiga e feromonas fuga 17,18 , e tambm como componentes volteis de outras moscas da fruta tefrtidos que ocorrem, incluindo Ceratitis capitata, Bactrocera curcubitae, B. dorsalis e Toxotrypana curvicauda 19-21 . O Pirazinas aqui relatados podem ser componentes essenciais da mistura de feromnio, ou at mesmo importantes precursores de outros compostos volteis liberados durante atividade de vocalizao. A semelhana dos volteis produzidos pelos machos do gnero Anastrepha eo comportamento de corte correspondente semelhante exibido durante a liberao de
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feromnio sugere uma relao evolutiva interessante e fechar. Rocca 5 e colaboradores sugeriram que A. ludens e A. SUSPENSA pode ter tido um ancestral comum que se tornou fragmentado devido s mudanas ambientais. Uma vez que tanto as espcies acasalam no perodo da tarde, as diferenas nas suas terpenos (limoneno e ocimeno) pode ser um mecanismo de isolamento reprodutivo. A gama completa e propores relativas dos compostos volteis produzidos e liberados por machos A. fraterculus ainda no foi determinada, mas os resultados aqui relatados mostrou a presena de limoneno e ocimeno. Portanto, ele s poderia ser especulado que A. fraterculus tambm tiveram o mesmo ancestral do A. ludens e A. SUSPENSA , e como iniciao de acoplamento ocorre nas primeiras horas do dia, do sexo masculino A. fraterculus continuam produzindo tanto terpenos durante atividade de vocalizao. Informaes adicionais a partir de experimentos de laboratrio e de campo poderia fornecer um significado evolutivo mais razovel dos volteis aqui relatados. Masculino glndulas salivares foram altamente atraente em bioensaios de laboratrio para fmeas maduras virgens. Nossos experimentos indicam que estas glndulas no so apenas atrativos de perto, mas tambm tem um efeito arrestantes em fmeas. Fmeas gasto at 12 minutos (mximo) de sondagem sobre a fonte. Sondagem s foi interrompida quando uma mulher tentou repelir a outra mulher que se aproxima. Mesmo quando eles estavam sondando em grupos de trs ou quatro, as moscas no parar de lutar entre si.

Concluso
Ao ligar, masculino A. fraterculus liberam dois ismeros do sesquiterpeno a -farneseno, o lactonas anastrefin, epianastrefin e suspensoldeo e dois monoterpenos, limoneno e ocimeno. Em ambos os mtodos de anlise o principal composto que se encontra na glndula salivar do sexo masculino foi de -farneseno. Masculino glndulas salivares produzem e / ou armazenamento de pelo menos quatro pirazinas. Anastrefin e epianastrefin foram obtidos apenas lavando a cmara de reteno inseto com hexano aps aerao. Esta constatao sugere que ambas as lactonas no so muito volteis. As pirazinas podem ser componentes essenciais da mistura de feromona do sexo, ou at mesmo importantes precursores de outros compostos volteis libertados durante a actividade de chamada. Pelo menos trs observaes nos levaram a acreditar que as glndulas salivares do sexo masculino no agir como um atrativo alimentar: a) em todas as rplicas das moscas experimentais foram fornecidos com uma fonte separada de alimentos; b) fmeas imaturas no foram atrados para as glndulas salivares, e c) Estudos anteriores mostraram que as moscas no exibir comportamento territorial na fonte de alimento. Os dados sobre a idade mdia de fmea A. fraterculus que respondeu s glndulas salivares masculinos confirmou que as fmeas s sexualmente maduros foram atrados.

Agradecimentos
Agradecemos o apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq / RHAE-Brasil), conceder nenhuma. 260087/90.4. Este trabalho foi realizado sob MAFF licena n. PHF 1157/705/83 emitida sob a Importao e Exportao (Fitossanidade) (Gr-Bretanha) Order 1908 e as pragas de plantas (Gr-Bretanha) Order 1980.

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Recebido: 24 de maio de 2000 Publicado na web: 19 de fevereiro de 2001

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