Imunologia Seminrio Teste Elisa 1.

. Definio Os mtodos imunolgicos desenvolvidos para quantificar a concentrao de antgenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade, tornaram-se tcnicas padronizadas para pesquisa e aplicaes clnicas. Entre esses mtodos, um dos mais usados o ELISA, do ingls Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsoro Ligado a Enzima). O Elisa se baseia na identificao de anticorpos e ou antgenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre um substrato e a reao faz com que o cromgeno (microrganismo que produz colorao no meio onde se encontra) mude de cor. O produto da reao, alm de colorido, insolvel para no difundir do local da formao. Foi inicialmente desenvolvido por Engvall & Perlman e por van Weeman & Schuurs e, posteriormente, muito utilizado como teste diagnstico em varias doenas. 2. O teste Quando o sistema imunolgico do corpo encontra um antgeno especfico (por exemplo, uma protena caracterstica na superfcie de um vrus ou bactria), os anticorpos que so especficos para o antgeno interceptam-no com uma ligao fsica a ele em uma "chave e fechadura", neutralizando assim o antgeno. O ELISA uma tcnica fundamental para avaliaes imunolgicas e bioqumicas, utilizada para detectar o antgeno ou anticorpo em uma amostra, com base em interaes anticorpo-antgeno. Se um antgeno (ou da mesma forma, um anticorpo) detectada, um sinal produzido na forma de uma mudana mensurvel. Para avaliar a presena de um antgeno especfico, em uma amostra, um "teste de ELISA" pode ser realizado da seguinte maneira: Uma soluo de anticorpo, que especfico (isto , tem reconhecimento exclusivo) ao antgeno putativo, imobilizado em uma superfcie slida em um poo de uma placa de microtitulao. aplicado em seguida amostra a ser analisada condies que permitam o antgeno ligar-se aos anticorpos imobilizados especficos. O material no ligado lavado, e o antgeno ligado reconhecida mais uma vez em condies de ligao com a adio de uma soluo de um segundo anticorpo especfico para o mesmo antgeno, que desta vez acoplado ou ligados a uma enzima que catalisa a converso de seu substrato a uma forma detectveis e possivelmente quantificvel. Esses anticorpos ligados a uma enzima que esto vinculados ao complexo antgeno-anticorpo imobilizado so resistentes a ciclos de

lavagem e, finalmente, o substrato adicionado e incubado de modo que a enzima pode catalisar a converso do substrato para o sinal de deteco do antgeno especfico . ELISAs costumam empregar qualquer um substrato cromognico ou um fluorognico, que produz uma cor ou fluorescncia, respectivamente, aps a converso pela enzima ligada ao segundo anticorpo. Converso do substrato convenientemente observada ou quantificada em um leitor de placas, por medidas de densidade ptica ou intensidade de fluorescncia. Em resumo, mudar a cor ou a fluorescncia sinaliza a atividade da enzima, que sinaliza a presena do segundo anticorpo, que sinaliza a presena do antgeno procurado. 3. Interpretao A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato proporcional a quantidade de anticorpos (especficos para o antgeno) presente no soro. A intensidade pode ser analisada por um espectrofotmetro (Leitores de Elisa), permitindo uma anlise quantitativa. 4. Equipamentos a) Placa de Elisa Onde a reao desenvolvida. So microplacas contendo vrios poos (wells) onde so depositados os reagentes. b) Pipetas Automticas Depositar os reagentes c) Leitor de Elisa Permite uma anlise quantitativa precisa dos resultados (espectrofotmetro) d) Lavador Automtico de Placas 5. Enzimas So elas que convertem um substrato sem cor em um produto de cor. A enzima mais comumente utilizada neste teste a peroxidase, que catalisa a reao de desdobramento da gua oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. 6. Tipos de Elisa Indireto

O mtodo indireto utilizado para deteco de anticorpos. Neste caso o antgeno fica aderido aos poos da microplaca. Em seguida coloca-se o soro problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage

com o substrato fazendo com que o cromgeno mude de cor. A presena de cor nos poos indica a presena do anticorpo, e os poos que no mudarem de cor indica a ausncia do anticorpo em questo.

Existem vrios modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples,chamada ELISA indireto, um antgeno aderido a um suporte slido (placa de ELISA) preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antgeno. Se houver anticorpos no soro em teste ocorrer a formao da ligao antgeno-anticorpo, que posteriormente detectada pela adio de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espcie onde se busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual ligada peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto , H2O2 dissolvida em uma substancia qumica que d uma reao colorida quando H2O2 desdobrada). Os orifcios onde ocorreu a reao antgeno-anticorpo apresentam uma colorao (varivel dependendo do substrato).

Direto ou sanduche
O mtodo de sanduche, ou captura, indicado para identificao de antgenos, e este antgeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo primrio especfico ao antgeno adsorvido no poo da microplaca. Em seguida o antgeno na soluo problema adicionado. Depois o segundo anticorpo especfico ao antgeno marcado com uma enzima adicionado. Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromgeno mude de cor. A presena de cor nos poos indica a presena do antgeno, e os poos que no mudarem de cor indica a ausncia do antgeno em questo. Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUCHE. Nesse mtodo, o anticorpo de um antgeno particular , inicialmente, adsorvido no well. Depois, o antgeno (soro, urina ou outra soluo contendo o antgeno) adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente anticorpo ligado enzima adicionado. Nesse caso, a intensidade da reao proporcional quantidade de antgeno presente. Logo, permite mensurar at pequenas quantidades de antgeno.

Competitivo O mtodo competitivo mais usado para identificao de antgenos, mas pode tambm ser empregado para a deteco de anticorpos. Neste mtodo primeiro se adsorve o anticorpo no poo da micro placa. Aps a adsoro do anticorpo, uma soluo que possivelmente contm o antgeno adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O prximo passo adicionar o antgeno marcado com

uma enzima. Os poos que no possuem o antgeno primrio (da soluo problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poos que possuem antgenos aderidos aos anticorpos no mudam de cor.

7. Curva Padro
Em geral, faz-se uma CURVA PADRO, preenchendo 8 poos de uma fileira com concentraes crescentes e conhecidas de antgeno. A curva serve como padro de comparao para deduzir as quantidades de antgenos nas solues-testes. O grfico fornecido por um programa prprio para a leitura de ELISA.

8. Diagnstico por ELISA Dermatoses bolhosas autoimunes so doenas cuja manifestao cutnea primria e fundamental consiste em vesculas e bolhas. Classificam-se conforme a localizao da bolha, em intraepidrmica e subepidrmica. Os pacientes produzem autoanticorpos contra estruturas especficas da pele detectveis por tcnicas de imunofluorescncia, immunobloting e Elisa. Os recentes avanos da biologia molecular e celular tm permitido conhecer esses autoantgenos, contra os quais os pacientes se sensibilizam e que esto localizadosna epiderme ou na juno dermoepidrmica. So doenas de baixa incidncia, porm de elevada morbidade e por vezes letais. O objetivo deste trabalho revisar e descrever os progressos nos conhecimentos de quatro doenas vsico-bolhosas autoimunes: pnfigo foliceo endmico (fogo selvagem), pnfigo vulgar, penfigide bolhoso e dermatite herpetiforme.

Fogo Selvagem
FS uma doena autoimune de causa desconhecida, provocada por autoanticorpos patognicos antiepiteliais e responsveis pelo fenmeno da acantlise. Os auto-anticorpos so do tipo imunoglobulina G (IgG), predominando o subtipo IgG4. Os auto-antgenos contra o qual os anticorpos antiepiteliais reagem e a desmogleina 1 (Dsg1), molcula, da famlia das caderinas, que compe os desmossomos, glicoproteina transmembranica com uma parte intracelular (endodominio) e vrios domnios extracelulares (ectodominio EC). Demonstrouse que os auto-anticorpos do FS em pacientes com doena em atividade reagem contra os ectodominios EC1 e EC2, que so os dominios extracelulares da Dsg1 mais afastados da membrana celular.

Elisa - Na atualidade, para o teste de Elisa, existem preparaes comerciais de

desmogleinas a ser testadas com os soros dos doentes.

Pnfigo vulgar (PV)

Doena bolhosa intra-epidrmicas que afeta pele e mucosas, potencialmente fatal.

Elisa - Os anticorpos circulantes IgG no PV podem ser detectados no teste de Elisa,

usando Dsg1 e Dsg3 recombinantes.

Penfigide bolhoso (PB)

Doena autoimune,crnica, limitada, com formao de bolhas, principalmente em indivduos idosos, de todas as raas. Alguns casos tm sido descritos na infncia. Os casos ocorrem esporadicamente, e no h evidnciasde que exista um componente gentico no desencadeamento da doena. Autoanticorpos da classe IgG so identificados e dirigem-se contra antgenos designados como BP 230 Ag1 e BP 180 Ag2 . O BP 230 localiza-se na placa hemidesmossmica intracelular, e o BP 180 glicoprotena transmembrnica, cujo domnio extracelular ultrapassa a lmina lcida da zona de membrana basal.

Elisa: Na atualidade j se dispe comercialmente do teste de Elisa para detectar os

anticorpos circulantes do PB, contra os antgenos BP180 e BP230. Trata-se de teste prtico e de fcil execuo, podendo ser til para prever recidivas da doena aps interrupo da terapia.

Dermatite herpetiforme
Dermatite herpetiforme (DH) doena clinicamente caracterizada por leses urticariformes e bolhas associada enteropatia sensvel ao glten (doena celaca). Nessa doena, h presena de IgA de forma granular, grumosa, pontilhada ou fibrilar ao longo da zona da membrana basal (ZMB).

Elisa: Anticorpos IgA contra transglutaminase tecidua atualmente so considerados

diagnstico sorolgico marcador de DH e doena celaca. A transglutaminase epidrmica considerada o autoantgeno das leses cutneas na DH, e ocorrem reaes cruzadas entre os anticorpos que reconhecem as transglutaminases epidrmica e intestinal.