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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCINCIAS DEPARTAMENTO DE BIOFSICA E FARMACOLOGIA DISCIPLINA DE BIOFSICA

ELETROFORESE

1. PROPRIEDADE ELTRICA DAS SUBSTNCIAS ORGNICAS As substancias orgnicas so em grande parte constitudas que apresentam propriedades eltricas e se comportam como eletrlitos quando presentes em uma soluo. Estas propriedades serviram de base para o desenvolvimento de um mtodo de separao de partculas em soluo sob a ao da corrente eltrica. O deslocamento de partculas eletricamente carregadas pela ao de um campo eltrico ficou conhecido como eletrocinese. Se as partculas que se movimentam so ons, o fenmeno chamado ionoforese e, se so micelas, eletroforese. Podendo neste caso ocorrer anaforese e cataforese, quando as micelas se dirigem para o nodo ou para o ctodo, respectivamente. 2. CONCEITO DE ELETROFOSESE Podemos conceituar ELETROFORESE como sendo a migrao de partculas ou molculas possuidoras de carga eltricas e presentes em um meio lquido, quando submetidas ao de um campo eltrico. Assim, possvel analisar os componentes de uma soluo conforme a manifestao se suas propriedades eltricas, como, por exemplo, as protenas do soro sanguneo e outros lquidos biolgicos que em dado pH podem apresentar cargas eltricas.
3. ELETROFORESE/MODELO SIMPLIFICADO Sabemos que em uma soluo esto presentes muitos componentes que so constitudos por partculas ou molculas com cargas eltricas. No entanto, para facilitar a compreenso dos princpios fsicos envolvidos no processo de eletroforese, utilizaremos a ilustrao de um modelo simplificado constitudo por uma nica partcula de forma esfrica possuidora de uma carga Q (negativa), num meio lquido, sob a ao de um campo eltrico de intensidade E (figura 1). E

-Q

(-)

(+)

Figura 1. Representao de foras que atuam sobre uma partcula eletricamente carregada (-Q) submetida a um campo eltrico. Nestas condies, a partcula ficar sujeita a ao de uma fora ( f ) de origem eltrica, cuja intensidade dada por : f=EQ (1)

Opondo-se ao movimento da partcula existe a fora de atrito viscoso ( R ) que, segundo STOKES, equivale a : R = 6 r n v (2) Em que n o coeficiente de viscosidade do meio lquido, r e v so, respectivamente, o raio da partcula e a velocidade com que ela se desloca. O valor mximo que R pode assumir igual ao de f, que quando atingido, a partcula entrar em equilbrio dinmico, isto , sua velocidade ser constante. Nestas condies, tem-se: 6 r n v = E.Q Sendo o valor de v determinado por: v= E.Q 6rnv (3)

A frmula (3) mostra que a velocidade de deslocamento da partcula diretamente proporcional a E e Q e inversamente proporcional a r e n.

4. O QUE PODEMOS DETERMINAR PELA ELETROFORESE Usualmente com uma corrida eletrofortica possvel obteno das seguintes informaes:

a) Determinao do nmero de componentes numa amostra; b) Determinao da quantidade de cada componente na amostra; c) Determinao da mobilidade de cada componente da amostra; d) Obteno de informaes da camada eltrica envoltria da partcula; c) Determinao do ponto isoeltrico das molculas. 5. TIPOS DE ELETROFORESE a. ELETROFORESE DE FRONTEIRA MVEL As primeiras pesquisas no sentido de separar os componentes de uma soluo foram realizadas pela chamada eletroforese de fronteira mvel ou eletroforese livre. Neste tipo de eletroforese as partculas migram no interior da massa liquida (soluo tampo), sob a ao da corrente eltrica existente entre os dois eletrodos. TISELIUS, em 1937, desenvolveu uma cuba que incorporava melhoria com relao s anteriormente utilizadas, pois permitia a aplicao desde 2 ml at 150 ml de soluo da amostra que se desejava separar por eletroforese. Esta cuba se constitua de um tubo em U, de seco cilndrica, dividido em 3 segmentos cujas extremidades se ajustam entre si pelas suas faces polidas e lubrificadas, permitindo o deslizamento lateral da parte central, conforme figura 2, abaixo: elet. seco superior elet

seco mdia ********** (a) seco inferior (b) (c)

FIGURA 2 . Representao esquemtica da cuba de Tiselius : a. Colocao da amostra. b. Deslocamento da seco inferior para colocao do tampo c. Conexo dos eletrodos em meio tamponado. Este equipamento de eletroforese apresenta diversos inconvenientes referentes s presenas de correntes hdricas e de um complicado sistema fotogrfico dos componentes separados. A temperatura desse sistema era controlada por um banho a temperatura constante e igual temperatura de mxima densidade do tampo (prxima de 4 o C), evitando assim, as correntes de conveco que originavam correntes hdricas que deformam as linhas limites de separao das fraes na corrida eletrofortica. Outra inovao da cuba de TISELIUS foi utilizao do sistema ptico SCHLIERREN, que permite a observao ou registro fotogrfico das linhas limites. No entanto, se tratava de

um complicado sistema de visualizao dos resultados, bem diferente das tcnicas que so atualmente usadas. A utilizao dessa tcnica no estudo das protenas presentes no soro sanguneo proporcionou ao qumico Arne Tiselius o premio Nobel de 1948. A instabilidade do equipamento comprometia de forma significante a eficincia do mtodo na separao dos compostos. Esta deficincia foi minimizada com a utilizao de meio suporte ( papel ou gel), onde ocorria a mobilizao das partculas pela ao da corrente eltrica. O que ficou conhecido como eletroforese de zona ou de meio estabilizado. b. ELETROFORESE DE ZONA OU DE MEIO ESTABILIZADO Este tipo de eletroforese atualmente em uso, utiliza um dispositivo conhecido como cuba eletrofortica que composta de dois compartimentos, um com eletrodo positivo e outro com o eletrodo negativo. Acima do nvel da soluo tampo colocado um suporte entre os dois compartimentos da cuba, no suporte se distende uma tira de papel de filtro ou fita de acetato de celulose, cujas extremidades a soluo tampo. Ao contrrio da eletroforese livre a de meio estabilizado exige um meio suporte poroso e estabilizado sob a forma de fibras, malhas ou gel, no qual as partculas devem migrar. Como instrumento analtico, sua grande vantagem est no fato de que apenas alguns microlitros da amostra o suficiente para uma completa separao eletrofortica, permitindo fazer avaliao tanto qualitativa como quantitativa dos componentes. b1. MEIOS DE SUPORTE SLIDOS PAPEL DE FILTRO O papel de filtro foi o meio de suporte poroso inicialmente utilizado , principalmente na separao de protenas sricas (como por exemplo, na anlise de rotina em laboratrios clnicos). de baixo custo, de fcil aplicao da amostra e localizao das fraes por colocao e posterior quantificao pela densitometria. Ao lado destas vantagens existe o inconveniente devido falta de uniformidade nos dimetros dos poros do papel de filtro, o que faz a distribuio do tampo no uniforme em toda extenso do papel. O tamanho da tira de papel de filtro usada de aproximadamente 3 x 30 cm, onde so suficientes alguns microlitros da amostra para uma completa separao dos componentes. A cuba de eletroforese pode ser horizontal ou vertical de acordo com a disposio do papel, conforme pode ser visto nos esquemas abaixo (figuras). Tanto na horizontal como na vertical, existe uma parede divisria central separando a cuba em dois compartimentos, que devem permanecer cheios com a soluo tampo (figura 3). Em cada compartimento h um eletrodo de platina, entre os quais aplicada a diferena de potencial. As solues nos compartimentos devem estar sempre no mesmo nvel, de modo a evitar o aparecimento de uma corrente lquida de um compartimento para o outro, atravs do papel que est mergulha no compartimento. Representaes esquemticas das cubas de eletroforese horizontal e vertical. horizontal vertical

8 4

1 e 3- eletrodos; 2- parede divisria 4- meio de suporte

5 e 7- eletrodos; 6- parede divisria 8- meio de suporte

A diferena de potencial que aplicada geralmente entre 180 a 200 volts para evitar um elevado aquecimento do sistema que prejudica a separao entre os componentes da amostra. Dentro da cuba onde est soluo tampo, encontram-se os eletrodos constitudos geralmente por um fio de platina. O dispositivo fechado por uma tampa de modo a impedir a evaporao do tampo e a corrida para protenas plasmticas tem durao de 2 horas. ACETATO DE CELULOSE O uso das fitas de acetato de celulose apresenta muitas vantagens sobre o papel, principalmente no que diz respeito pureza e transparncia. Os poros so de tamanhos regulares variando de 0,5 a 3, o que possibilita uma melhor uniformidade da distribuio do tampo. As protenas sricas so melhores separadas em acetato de celulose que em papel de filtro. Consegue-se boa separao, em baixa voltagem, com 0,1 microlitros de soro. Pode-se at mesmo separar as protenas sricas em tiras bem mais estreitas como o caso da microeletroforese.

b2. MEIOS DE SUPORTES SEMI-SLIDOS GEL DE AGAR Os gis so preparados com uma concentrao de 1 a 2 % de agar, no mesmo tampo a ser utilizado na eletroforese. A soluo aquecida em banho-maria at a completa dissoluo do agar, quando ento, colocada sobre uma placa de vidro de modo a fornecer a espessura desejada. A gelificao alcanada pelo resfriamento. A placa de vidro contendo o gel levada para uma cuba horizontal, na qual o contato entre o gel e a soluo tampo pode ser feito por dois pedaos de papel de filtro.

A amostra a ser aplicada misturada em igual volume, com uma soluo de agar (levemente aquecida para a liquefao) duas vezes mais concentrada do que a usada na placa. A mistura ento aplicada num orifcio feito no leito do agar, prximo ao ctodo. O gradiente de tenso usado de 5 a 6 V/cm. Consegue-se uma boa separao em menos de 50 minutos. So as seguintes as vantagens do agar como meio suporte : 1. Consegue separaes num tempo menor que no papel; 1. A adsoro das protenas menor; 2. Apresenta a vantagem de poder ser combinada com a imunodifuso no mesmo meio, obtendo-se desta forma a tcnica conhecida como imunoeletroforese. GEL DE POLIACRILAMIDA O gel de poliacrilamida um material sinttico que usado como meio suporte para a eletroforese desde 1959. O gel consiste de uma mistura de monmeros de acrilamida com n-metileno-bisacrilamida em solues de 3 a 10 % de concentrao do monmero, em presena de um catalizador como persulfato de amnio. Este gel de acrilamida se polimeriza por interligaes a intervalos regulares atravs de pontes de metileno. - CH2 CH (CONH) CH2 CH (CONH)2 CH2 - CH2 CH (CONH) CH2 (CONH)2 A poliacrilamida oferece as seguintes vantagens sobre os outros suportes: 1.Ausncia de eletrosmose; 2.A transparncia dos gis permite medidas diretas das bandas, por fotometria; 3.Os gis so quimicamente inertes, o que facilita a colorao diferencial; 4.O manuseio dos gis, bem como a preparao da poliacrilamida no Exige maiores cuidados que os demais meios suportes. 6. ESQUEMATIZAO DA MIGRAO ELETROFORTICA A migrao das cargas eltrica na eletroforese segue o estabelecido na Lei de Coulomb: Componentes de cargas negativas migram para o plo positivo, enquanto, as de cargas positivas se deslocam para o plo negativo. Este princpio aplicado a eletroforese est esquematizado abaixo:

7. MOBILIDADE ELETROFORTICA A frmula ( 3 ) que representa a mobilidade eletrofortica ( pgina 2) pode ser escrita como V / E = Q / 6 r n (4 ), onde se verificar que o segundo membro mostra-se independente de E, razo pela qual denominado mobilidade eletrofortica da partcula, que representada por . = V / E = Q / 6 r n (5) Fisicamente a mobilidade a relao entre a velocidade por unidade de campo eltrico. O modelo da figura 1(pgina 2) uma concepo puramente hipottica, tendo em vista que na prtica as partculas se encontram numa soluo eletroltica, cujo pH tem valor constante dado pela soluo tampo. Neste meio a partcula em questo atrai os ons com cargas de sinais contrrios, sendo deste modo envolvida por uma nuvem inica. No instante da aplicao do campo eltrico, as cargas envoltrias tendem a se deslocar em

sentido oposto ao da partcula, afetando assim sua mobilidade, o que nos leva a concluir que o referido modelo mostrado na figura 1 serve apenas para facilitar a compreenso do fenmeno, uma vez que a frmula 4 no deve ser aplicada com todo rigor.

8. FATORES DE AFETAM A MOBILIDADE ELETROFORTICA 1. FLUXO DE LQUIDO ATRAVS DO MEIO SUPORTE a.Potencial eletrocintico : Uma partcula carregada de eletricidade em soluo eletroltica (tampo) se envolve de ons de cargas opostas, formando uma camada fortemente aderente, o que provoca uma reduo no potencial eltrico (potencial eletrocintico da partcula). Quando se aplica campo eltrico ocorre um movimento de todos os ons existentes, consequentemente se desfaz parte da camada inica que envolve a partcula e o potencial desta se reduz a um valor denominado potencial zeta. Este potencial reduzido por um aumento na concentrao dos ons do tampo, e como conseqncia a diminui a mobilidade das partculas, assim como tambm diminuem os efeitos eletrocinticos. A partcula fica envolvida por uma delgada camada lquida, provocando um escoamento da fase lquida em sentido oposto ao movimento da partcula - eletrosmose. No caso da eletroforese de protenas em geral o pH do tampo normalmente alcalino, a migrao se dar em direo ao nodo, enquanto o fluxo de lquido (eletrosmose) se da em sentido oposto ao da eletroforese, ou seja, do nodo (polo positivo) para o ctodo (polo negativo). Alm da movimentao hdrica da eletrosmose, tambm existe o movimento da soluo tampo pelo fenmeno de endosmose. Uma discrio sumaria e ilustrativa desses fenmenos de movimentao hdricas no suporte mostrada abaixo: ENDOSMOSE Consiste no deslocamento do tampo a partir das extremidades do suporte em direo ao centro. ELETROSMOSE A dissociao do grupamento funcional COOH em COO - e H+, os radicais COOse fixa a textura do suporte (papel de filtro ou acetato de celulose), enquanto os radicais H+ ficam livres no sistema se juntando a H2O e formando o ons hidrnio, que se desloca em direo ao plo negativo quando ocorre a passagem da corrente. Observe na ilustrao abaixo que existe um ponto de equilbrio entre as foras de eletrosmose e endosmose, neste ponto que deve ser aplicada amostra a ser analisada.

* Endosmose

* Endosmose

* Eletrosmose

Ponto de Equilbrio: Endosmose e Eletrosmose

b.Efeito Joule A passagem da corrente eltrica atravs do meio suporte provoca o aquecimento do mesmo, devido converso da energia eltrica em calor pelo efeito joule. A potencia trmica dissipada P medida em Watts e dada por: P = V. i Sendo, V a diferena de potencial aplicada e i a intensidade de corrente. O equilbrio trmico do sistema ser alcanado quando a quantidade de calor dissipada for igual retirada do meio suporte pela evaporao da gua, isto : i = j m L, a massa de gua representada por: m = V. i / j L, sendo j a fora inica do tampo, L o calor de evaporao da gua, e m a massa de gua em gramas que se evapora por segundo no meio suporte. Para compensar esta perda por evaporao um fluxo de gua se escoar atravs do meio suporte, partindo dos compartimentos do tampo. De um lado ter o mesmo sentido que o fluxo eletrosmtico e do outro, sentido contrrio. 2. Adsoro

Resduos aninicos ou catinicos do meio suporte podem adsorver as partculas alterando a sua mobilidade. Isto frequentemente observado em eletroforese de protenas em papel de filtro e se manifesta pelo aparecimento de caudas nas regies onde se encontram as protenas, dificultando a separao entre as mesmas. Este fenmeno pode ser minimizado pelo tratamento prvio do papel com uma soluo diluda de cido clordrico e posterior lavagem em gua destilada. 3. Fora Inica A fora inica de uma soluo tampo j, corresponde concentrao dos eletrlitos e depende da dissociao inica das molculas de seus sais, definida pela expresso: j = C. Z 2/ 2, em que Z a valncia do on considerado e C, a concentrao que deve se manter nos menores valores possveis, que se situa entre 0,05 a 0,07 molar, para evitar a compresso da carga intrnseca da protena e tambm reduo da condutividade do meio. De forma que um acrscimo na concentrao dos sais do tampo provoca uma diminuio no potencial eletrocintico alterando a mobilidade da protena. 9. AS PROTENAS COMO PARTCULAS CARAREGADAS ELETRICAMENTE Uma molcula de protena, quando em soluo pode apresentar carga eltrica positiva, negativa ou nula dependendo do pH da soluo. O pH para o qual a carga nula conhecido como ponto isoeltrico (pI) da protena. Neste pH, as cargas positivas e negativas existentes nas molculas (NH3+ e COO -) provem dos grupamentos funcionais existentes nos aminocidos, que se encontra em equilbrio exibindo carga total nula. Nesta circunstancia o pH da soluo tampo igual ao pI da protena. Uma protena exibe carga negativa quando estiver em uma soluo tampo de pH menor que o seu ponto isoeltrico ( pH < pI). Caso a protena esteja em soluo bsica exibir carga positiva (pH > Pi), pois est em uma soluo tampo de pH > que o seu ponto isoeltrico. Esta esquematizao mostrada apenas simblica uma vez que na molcula de protena no encontraremos apenas os dois grupamentos NH3+ e COO-, mas sim um nmero relativamente grande deles distribudos principalmente pelas cadeias laterais da molcula.

NH 3+ Pr Pr

NH3+ Pr

NH2

COOH COO COO pH < pI pH = pI pH > pI 10. APLICAES BIOMDICAS DA ELETROFORESE Existe um vasto campo de aplicaes, entre os quais mais comuns esto o estudo clnico do plasma e lquidos presentes no organismo, resolues de misturas complexas de protenas, cidos nuclicos, aminocido, identificao de componentes, determinao da pureza e homogeneidade molecular, determinao do e aplicaes na gentica molecular. REGISTRO ELETROFORTICO NORMAL E DE ALGUMAS PATOLOGIAS