AISLAMIENTO, EVALUACIN Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS TOLERANTES A ETANOL Pontificia Universidad Javeriana Departamento de Microbiologa Facultad de ciencias Laboratorio Biotecnologa

a Industrial 06 de Marzo del 2013

Objetivo. Aislar cepas microbianas que puedan representar una alternativa, en la tolerancia a diferentes concentraciones de etanol y diferentes concentraciones de glucosa. Materiales y mtodos. Al desarrollar la prctica se tomaron 10g de la muestra a analizar (uvas), esto se adiciono a un frasco que contena 90mL de agua peptonada que corresponda a la dilucin 10 -1, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas 10-2 y 10-3 adicionando 0.5mL a tubos que contenan 4.5mL de agua peptonada. De las diluciones 10 -2 y 10-3 se realizaron siembras en superficie en el medio YPG y se llevo a incubacin a 30C por 48 horas. De la dilucin 10 -2 se tomo 0.1mL y sembr en medio YPG a diferentes concentraciones de etanol y de la dilucin 10-3 se sembr en glucosa (4%, 8% y 12%) luego se llevo a incubar 30C por 48 horas. Resultados. Los resultados obtenidos fueron divididos, en resistentes a concentraciones de etanol y resistentes concentraciones de glucosa, obteniendo diversidad de microorganismos como levaduras, bacilos Gram negativos, bacilos Gram positivos y cocos Gram positivos. Conclusiones. La presencia de levaduras, bacilos y cocos presentes en las bebidas fermentadas masato, chicha, guarapo, uvas y miel de plaza tiene la capacidad de resistir dichas concentraciones de etanol y de glucosa, permitiendo su crecimiento y as su aislamiento. Palabras claves: tolerancia, fermentacin, glucosa y etanol INTRODUCCIN En la enologa, o ciencia y arte de la produccin de vinos, un microorganismo resistente a las altas concentraciones de etanol es esencial. Esto debido a que el microorganismo fermentador, quien es el productor del alcohol, tiene que soportar estas condiciones, buscando una mayor produccin o en trminos econmicos optimizacin de los procesos industriales, se ha generado toda una gama de investigaciones, para encontrar un microorganismo ms apto, tolerante y resistente a diferentes concentraciones de etanol y de glucosa. (1)

La composicin de la membrana del microorganismo es el principal elemento de interaccin entre este y el etanol, la membrana compuesta de glucanos, azucares, cidos grasos y compuestos derivados del ergosterol; para el caso especifico de Saccharomyces cerevisiae, el ergosterol y los hopanoides son compuestos que le dan rigidez a la membrana y son los que directamente interactan con los alcoholes como el etanol debido a su naturaleza qumica, el alcohol es un metabolito secundario que sale de la membrana de la levadura por difusin simple (2). En esta prctica se usaron muestras fermentadas de (masato, chicha, guarapo, miel de plaza y uvas), para aislar microorganismos resistentes a diferentes concentraciones de sustratos (glucosa y etanol). En bebidas como el masato este es un concepto bastante importante, ya que esta bebida es de alta produccin suramericana; su preparacin es a base de altas cantidades de panela y la produccin de etanol en esta bebida de tipo casero es significante (2).

(masato, chicha, guarapo, miel) y frutas (uvas). Se pesaron 10g de las muestras anteriores y se adicionaron a 90mL de agua peptonada 0.1% (p/v) la cual correspondera a la dilucin 10-1, a partir de esta se realizaron diluciones seriadas tomando 0.5mL y adicionndolos a tubos que contenan 4.5mL de agua peptonada 0.1% (p/v) 10-2 y 10-3 luego se tomaron 0.1mL y se realizo la siembra por superficie en agar YPG y se llevaron a incubar por 48 horas a 30C. (3) Luego para evaluar la tolerancia a etanol y a glucosa de los microorganismos se sembr de manera homognea en superficie a partir de la dilucin 10-2 en medio YPG con diferentes concentraciones: Tolerancia a etanol. Agar YPG con 4% de etanol. Agar YPG con 8% de etanol. Agar YPG can 12% de etanol. Tolerancia a glucosa. Agar YPG 4% de glucosa. Agar YPG 8% de glucosa. Agar YPG 12% de glucosa.

MATERIALES Y MTODOS Para el aislamiento e identificacin de microorganismos tolerantes al etanol y a glucosa se evaluaron muestras de bebidas fermentadas

Estas siembras se llevaron a incubar por 48 horas a 30C y finalmente se realizo coloracin de gram para identificar los microorganismos presentes en las muestras analizadas. (3)

RESULTADOS Los resultados obtenidos en la prctica de laboratorio se presentan a continuacin en la tabla 1 en la que se muestran el nmero de colonias presentes de cada muestra con su respectiva dilucin, para las diferentes concentraciones de glucosa como para las de etanol. En la coloracin de gram se observaron diferentes morfologas de los microorganismos presentes en las

muestras (masato, guarapo, chicha, miel y uvas) tales como levaduras, bacilos Gram positivos, bacilos Gram negativos y cocos Gram positivos. En el recuento de UFC/g o mL Anexo 1 en las diferentes concentraciones de etanol al igual que en las de glucosa el resultado obtenido fue >104 ya que eran incontables.

Determinacin y nmero de colonias de microorganismos tolerantes a diferentes concentraciones de etanol y de glucosa

4% DIL 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 ETANOL/GLUCOSA 8% N DIL GRAM 10/10 0/0 10/10 0/0 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 Bacilos Gram positivos Levaduras 12% DIL 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10

N 0/0 UVAS 0/0 84/195 incont/inco nt 0/0 incont/inco nt

GRAM

N 0/0 0/0 0/130

GRAM

Cocos Gram 0/206 Negativos Levaduras / Bacilos 0/incon Gram t positivos 0/0 Levaduras / Bacilos 0/incon Gram t positivos Levaduras Levaduras / Bacilos Gram positivos Levaduras / Cocos Gram positivos Levaduras / Cocos Gram positivos Levaduras 0/216

Levaduras Levaduras / Bacilos Gram positivos Cocos Gram positivos Levaduras / Bacilos Gram positivos Levaduras / Cocos Gram positivos Levaduras / Bacilos Gram positivos Levaduras / Bacilos Gram positivos Levaduras / Cocos Gram positivos Levaduras

Levaduras / Bacilos 0/incon Gram t positivos 0/0 Levaduras / Bacilos 0/incon Gram t positivos Levaduras / Cocos 0/269 Gram positivos 0/193

CHICHA

incont/161

336/367

0/253

incont/inco nt MASATO incont/inco nt MIEL 131/102

0/0

0/incon t

0/0 0/119

0/269 0/192

 GUARAP O incont/inco nt 10/10 Levaduras / Cocos 0/incon yBacilos t Gram positivos

10/10 Levaduras / Cocos 0/incon yBacilos t Gram positivos

10/10 Levaduras / Cocos Gram positivos

Tabla 1. Determinacin

y nmero de colonias de microorganismos tolerantes a etanol y a glucosa (elaboracin propia)

Discusin En la actualidad es de gran importancia la identificacin de microorganismos resistentes y productores de etanol, ya que como el bioetanol muchos compuestos son producidos por fermentacin alcohlica de los azcares presentes en materiales renovables. Dicha fermentacin est influenciada por factores como la concentracin de azcares del sustrato y el microorganismo fermentador que se emplee. De acuerdo con reportes previos cuando S. cerevisiae se encuentra cultivada a altas concentraciones de azcar (menores a 30 40%), bajo condiciones de
alta concentracin de oxgeno disuelto, ya que la levadura convierte su metabolismo oxidativo a oxidoreductivo o fermentativo y

productoras de etanol crecen en las concentraciones de glucosa (4%, 8% y 12%) y resisten las concentraciones de etanol (4%, 8% y 12%) al igual que los bacilos, sin embargo en unas muestras no se present ningn tipo de crecimiento ver (tabla 1). En cuanto a la las muestras de masato, chicha y guarapo se observ crecimiento de levaduras salvajes las cuales en los procesos de fermentacin sirven para la elaboracin del vino iniciando dicho proceso, lo cual muestra que soportan diferentes concentraciones de etanol, los bacilos Gram negativos, bacilos Gram positivos y cocos Gram positivos posiblemente son pertenecientes al grupo de bacterias acido lcticas o contaminantes ya que ellos no realizan procesos de fermentacin que den como resultado etanol, simplemente aprovecharon las concentraciones de glucosa para desarrollarse. La conservacin de alimentos fermentados naturalmente como el masato constituye parte importante de la alimentacin de los pobladores de

se incrementa la produccin de etanol

(4)

En las bebidas fermentadas como en las uvas y la miel se observ crecimiento tanto en glucosa como en etanol, tambin se pudo observar como su crecimiento disminua con respeto a la dilucin lo cual indica que fue correcta la metodologa. En las muestras tanto las levaduras

Ilustracin 1. Adaptacin de la Membrana: Aumento de cidos grasos de cadena larga

la Amazona peruana. El masato es una bebida tradicional, constituye el substrato principal para el establecimiento de una microflora mixta ambiental, incluyendo las bacterias lcticas como responsables de la fermentacin malolctica, lctica y otras propiedades de inters industrial, (5) Entre las bacterias acidolacticas encontramos los lactobacilos que son productores de sustancias inhibitorias contra microorganismos indeseables, lo que permite una mayor preservacin natural del producto. En particular especies de Lactobacillus productoras de sustancias antimicrobianas y tolerantes al etanol, se convierten por lo tanto en una alternativa viable para el desarrollo de un producto inocuo de alta calidad que pueda cumplir con los estndares ms exigentes. (5) La composicin lipdica de la membrana de las levaduras donde se puede encontrar concentraciones de entre 40%-80% de esteroles y fosfolpidos insaturados segn la especie de la levadura, generan una alta rigidez y disminucin de la permeabilidad de la membrana favorecindose de esta manera el paso de la glucosa al interior de la clula; as mismo, los esteroles evitan la cristalizacin de las cadenas de cidos grasos, lo cual es un factor de adaptacin de las levaduras al etanol por composicin lipdica de la membran en esteroles y cidos

grasos de cadena larga. (Ilustracin 1)

Conclusin Al trabajar con muestras (masato, chicha, guarapo, miel y uvas) se observo que la presencia de levaduras, bacilos, cocos presentes tanto en las bebidas fermentadas como en las uvas, tiene la capacidad de resistir dichas concentraciones de etanol y de glucosa, permitiendo su aislamiento.

Bibliografa 1. Mesas, J. M; Alegre, M. T. El papel de los microorganismos en la elaboracin del vino. Universidad de Santiago de Compostela. 2. Charles W. Bamforth. Alimentos, fermentacin y microorganismos. Editorial. Acribia, S.A. Pag 31-34. 3. Pedroza A., Matiz A., Quevedo B., Rodrguez A., Manual de introduccin a la microbiologa. Editorial Pontificia Universidad Javeriana.2007. Bogot. 4. Pea C, Arango R. EVALUACIN DE LA PRODUCCIN DE ETANOL UTILIZANDO CEPAS RECOMBINANTES DE Saccharomyces cerevisiae A

PARTIR DE MELAZA DE CAA DE AZCAR. Dyna rev.fac.nac.minas vol.76 no.159 Medelln Sept./Dec. 2009 5. Sedano J, Seleccin de cepas nativas de lactobacillus con actividad inhibitoria y tolerantes al etanol aisladas de masato. Universidad nacional mayor de San Marcos, Facultad de ciencias biolgicas, Lima Peru 2006 http://www.utu.edu.uy/Escuelas/depar tamentos/canelones/vitivinicultura/Bio quimica %20Enologica/Teoricos/Tolerancia %20al%20etanol.pdf