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Centro de Citometra y Citmica Dpto. de Bioqumica y Biologa Molecular Facultad de Medicina jose.e.oconnor@uv.es
DIAGNOSTICO MORFOLOGICO
DIAGNOSTICO FUNCIONAL
DIAGNOSTICO BIOQUIMICO
DIAGNOSTICO GENOMICO
Se necesita una tcnica de diagnstico e investigacin que permita: Integrar el nivel celular y molecular Resolver la heterogeneidad celular de los tejidos Detectar clulas muy infrecuentes
CITOMETRIA DE FLUJO!!!!
Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro
Mtodo analtico por el que se mide la emisin de mltiples fluorescencias y la dispersin de luz de clulas o partculas microscpicas, alineadas mediante una corriente lquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a una o mltiples fuentes de iluminacin.
Bacterias Hongos unicelulares Clulas humanas y animales Protoplastos vegetales Hibridomas y fusiones celulares Esferoides Cuerpos embrioides Larvas y embriones Organismos pluricelulares
Mtodo analtico que mide la emisin simultnea de mltiples fluorescencias y dispersin de luz
CITOMETRIA DE FLUJO
Alineadas de forma secuencial por un flujo laminar y presentadas de una en una a gran velocidad en un punto ptimo de iluminacin
Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro
Partculas en suspensin individual que fluyen secuencialmente a travs de un volumen iluminado donde dispersan luz y emiten fluorescencia que es dirigida y filtrada y convertida a valores digitales que se almacenan en un ordenador
SISTEMA DE FLUIDOS
SISTEMA DE FLUIDOS
La base de la aplicacin ms comn de la Citometra de Flujo es el uso de luz lser enfocada para iluminar clulas alineadas mediante un sistema de fluidos capaz de enfoque hidrodinmico
Lquido envolvente
Cmara de Flujo
Fluorescencia
Laser enfocado
SISTEMA DE FLUIDOS
Enfoque Hidrodinmico
SISTEMA OPTICO
Lmparas: Xenon, Mercurio Lser: Refrigerados por aire: Ar, He-Ne Refrigerados por agua: Ar, Kr, He-Cd Diodos
SISTEMA ELECTRONICO
SISTEMA ELECTRONICO
SISTEMA ELECTRONICO
Conversin Analgica-Digital
SISTEMA ELECTRONICO
Representacin Lineal
Representacin Logartmica
SISTEMA INFORMATICO
SISTEMA INFORMATICO
Anlisis Cintico
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LA LUZ ES ENERGIA
1
Un fotn de energa hnEX es absorbido por la molcula fluorescente, creando un estado excitado (S1)
2
El estado excitado tiene una duracin de 110 10-9 segundos
3
Un fotn de energa hnEM es emitido para devolver la molcula fluorescente a su estado basal (S0)
FLUORESCENCIA
LA LUZ ES COLOR
EL COLOR ES INFORMACION
FLUOROFORO
`PROPIEDAD BIOLOGICA
MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL INDICADORES Y QUELANTES DE IONES SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES
Excitacin
Longitud de onda
Estado Excitado
Estado Basal
Molcula Dadora PE Molcula Aceptora Texas Red/Cy5/Cy7
Fluorescencia
Energa
Molecule 1
Fluorescence
DONOR
Molecule 2
Fluorescence
ACCEPTOR
Absorbance Absorbance
Wavelength
488 nm Argon
Cy 5 Cy 5.5
675 nm
675 nm 575 nm
Cy 7
760 nm
<390
400-450
450-500
500-570
570-590 590-620
620-750
>750
ultravioleta
violeta
azul
verde
amarillo
naranja
rojo
infrarrojo
LASER 488
LASER 630
Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro
Parmetros Nucleares
Enzimas Proteinas
Pared celular
Molculas de superficie
Proteinas Enzimas
Molculas de superficie
Enzimas
Parmetros de Superficie
Parmetros Citoplasmticos
Proteinas secretadas
Parmetros Extracelulares
Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones clnicas de la citometria de flujo La citometra del futuro
INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES
Se realiza mediante el marcaje de antgenos de la membrana plasmtica con anticuerpos mono- o policlonales conjugados con fluorocromos. El proceso de preparacin de la muestra es mnimo en la mayora de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de: Concentracin celular: lquidos biolgicos (LCR, orina, etc.) Dispersin celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido Disgregacin mecnica: tejidos linfoides, tejidos mucosos Disgregacin enzimtica: tejidos slidos, cultivos en monocapa Estimulacin celular controlada: estudios de activacin
Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y tcnicas de anlisis permiten identificar subpoblaciones especficas de clulas y determinar:
Linaje celular
Grado de maduracin
Grado de activacin
Recuento absoluto de clulas CD34+ viables circulantes o en preparaciones celulares para el auto- o alotransplante de precursores hematopoyticos
Cuantificacin de receptores gpIIb/IIIa ocupados en la terapia antiagregante plaquetaria con antagonistas de gpIIb/IIIa
Determinar la presencia y cuantificar la expresin de protenas (antgenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la cara interna de la membrana plasmtica, citoplasma, vesculas o ncleo de las clulas de sangre, tejidos linfoides, lquidos biolgicos o cultivos celulares, utilizando combinaciones de anticuerpos fluorescentes.
El proceso de preparacin de la muestra requiere etapas de fijacin y permeabilizacin para hacer accesibles los epitopos intracelulares. El proceso de preparacin de la muestra es menor en la mayora de las determinaciones (sangre entera) o puede requerir etapas de: Concentracin celular: lquidos biolgicos (LCR, orina, etc.) Dispersin celular: lavado broncoalveolar, esputo inducido Disgregacin mecnica: tejidos linfoides, tejidos mucosos Disgregacin enzimtica: tejidos slidos, cultivos en monocapa Estimulacin celular controlada: estudios de activacin Bloqueo de la exportacin de protenas: protenas de secrecin (citoquinas)
Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y tcnicas de anlisis permiten identificar: Linaje celular Grado de maduracin Grado de activacin Expresin de enzimas intracelulares Activacin de enzimas intracelulares Expresin de protenas reguladoras del ciclo celular Expresin de antgenos relacionados con la apoptosis Expresin de protenas de fusin en translocaciones cromosmicas.
Determinar la presencia y cuantificar los niveles de cidos nucleicos (ADN y ARN) en clulas enteras, clulas permeabilizadas o suspensiones de ncleos aislados a partir de sangre perifrica, tejidos linfoides, lquidos biolgicos, biopsias y otras muestras de tejidos slidos y cultivos celulares, utilizando fluorocromos que se unen a los cidos nucleicos.
La determinacin de la ploida o el ciclo celular, requieren el acceso estequiomtrico del fluorocromo al ncleo celular, por lo que utilizan clulas fijadas y/o permeabilizadas, o suspensiones de ncleos aislados. Segn la aplicacin, el proceso de preparacin de la muestra puede ser mnimo o requerir etapas de fijacin y permeabilizacin. Los fluorocromos permeables de cidos nucleicos penetran en clulas en fresco y permiten distinguir las clulas nucleadas en sangre entera u otras muestras hematolgicas o detectar los cidos nucleicos residuales en eritrocitos y plaquetas inmaduras. Los fluorocromos impermeables de cidos nucleicos se usan para detectar cambios en la permeabilidad de membrana asociados con apoptosis y necrosis.
Pronstico de leucemias, linfomas y sndromes linfoproliferativos. Clculo de la ploida en tumores slidos y neoplasias hematolgicas. Identificacin de clulas en fases de proliferacin en tumores slidos y hematolgicos. Determinacin del ciclo celular en cultivos celulares in vitro. Determinacin de la activacin de linfocitos por mitgenos in vitro. Anlisis de la proliferacin de clulas tumorales en muestras complejas. Identificacin y cuantificacin de clulas tumorales circulantes Estudio de la regulacin del ciclo celular Identificacin de clulas en apoptosis temprana o tarda. Anlisis de los mecanismos reguladores y ejecutores de la apoptosis. Determinacin de la viabilidad celular. Cuantificacin de la actividad citotxica de clulas NK y linfocitos CD8 activados. Identificacin de reticulocitos y clculo del Indice de Madurez Reticulocitaria (RMI). Identificacin de plaquetas reticuladas y clculo del Indice de Madurez Plaquetaria (PMI).
Analizar, de forma cualitativa o cuantitativa, fenmenos dinmicos o transitorios de la Bioqumica intracelular, cuya alteracin sea causa, consecuencia o est relacionada con situaciones fisiopatolgicas de relevancia clnica.
+ADP
Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorognicos especficos o partculas fluorescentes cuyas propiedades varan en funcin de: Entorno celular: pH, iones, molculas oxidantes, reductoras Actividad de enzimas intracelulares especficos: oxidasas, peptidasas Transporte a travs de membrana plasmtica o de orgnulos Acumulacin selectiva en compartimentos intracelulares El proceso de preparacin de la muestra debe respetar la viabilidad y competencia funcional. En muchas aplicaciones en Inmuno-Hematologa, el anlisis funcional se puede realizar en muestras de sangre entera, con un grado de manipulacin mnima. En estudios de activacin, se puede requerir una etapa de estimulacin celular controlada.
Fluidez y permeabilidad de membrana Fagocitosis de microorganismos Transporte de partculas y molculas solubles al interior de la clula Retencin intracelular de molculas Extrusin de sustratos a travs de bombas de eflujo Potenciales de membrana plasmtica y mitocondrial pH intracelular y su regulacin dinmica
Movimientos de iones a travs de membrana o desde depsitos intracelulares, Generacin de especies reactivas de oxgeno y xido ntricoNiveles de gluttion Citoenzimologa de flujo Sntesis de ADN Niveles de depsitos de lpidos metablicos y estructurales
Identificacin de blastos en el diagnstico de leucemias. Seguimiento de la activacin de leucocitos o plaquetas. Anlisis del contenido en iones y la regulacin del equilibrio inico celular. Deteccin de la expresin de superficie procoagulante en plaquetas. Seguimiento y cuantificacin de fagocitosis de microbios o partculas sintticas. Anlisis de la respuesta oxidativa en fagocitos ("Burst oxidativo"). Anlisis de la actividad de proteasas intralisosomales en fagocitos. Anlisis de la actividad proteoltica intracelular en clulas tumorales invasivas. Determinacin del pH intracelular y su regulacin. Anlisis del estrs oxidativo inducido y de las defensas antioxidantes celulares. Identificacin y cuantificacin de clulas en apoptosis.
Concepto de citometra de flujo Funcionamiento de un citmetro de flujo Fluorescencia y marcadores fluorescentes Parmetros analizables por citometra de flujo Aplicaciones de la citometria de flujo La citometra del futuro
Aumento de complejidad tcnica y de informacin generada Demanda de mejor rendimiento y mayor capacidad de anlisis de datos Bsqueda de nuevos parmetros biolgicos y nuevas reas de aplicacin
NUEVA INSTRUMENTACION
Flow Cytometry
Confocal Microscopy
Laser Scanning Cytometry Mass-Spectrometry Flow Cytometry High Content Analysis by Automated Bioimage Analysis Multispectral Image-in-flow Cytometry
Acoustic focusing cytometry uses ultrasound waves (over 2 MHz) to position cells into a single focused line along the central axis of a flow channel without high velocity or high volumetric sheath fluid, which can damage cells. The acoustic focusing actually concentrates the cells in the center of the fluid with sound energy. This means considerable flexibility in the sample concentration. The end result is more accurate and precise data. Acoustic focusing separates the alignment of cells from the particle flow rate. This allows to increase or decrease flow without disrupting the focus of cells in the capillary.
Cells are hydrodinamically focused into a core stream and orthogonally illuminated for both darkfield and fluorescence imaging. The cells are simultaneously transilluminated via a spectrally limited source for brightfield imaging. Light is collected from the cells with an imaging objective lens and is projected on a charge coupled detector(CCD). Prior to projection on the CCD, the light is passed through a spectral descomposition optical system that directs different spectral bands to different lateral positions across the detector.
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http://www.uv.es/~oconnor/IES-JJ-2012