Universidad Tecnolgica Metropolitana Departamento de Biotecnologa Ingeniera en Biotecnologa

Taller de Bioqumica
Prof. Gustavo Faundez
1. MATERIALES QUE DEBE TRAER EL ALUMNO Delantal blanco obligatorio para todos. Los alumnos deben ponerse su delantal antes de entrar al laboratorio. Cuaderno para registrar las observaciones y resultados del prctico Lpiz marcador de vidrio (por mesn o grupo) 2. EVALUACION Controles de entrada: Se realizarn en cada clase durante los 15 primeros minutos. Se evaluar la actividad prctica de la clase anterior y el contenido terico de la gua que corresponde en ese momento. Informes: Los informes de laboratorio deben incluir: Introduccin: breve, 1 pgina mximo Procedimientos: Aspectos o etapas principales, sin detalles Resultados: todos los resultados obtenidos en el prctico Discusin y Conclusiones Respuesta al cuestionario o pregunta de investigacin Se deben entregar 2 semanas despus de realizado el prctico correspondiente Ponderacin: Controles de entrada Informes Discusin de artculos y/o trabajo de investigacin Prueba final

30 % 25 % 20 % 25 %

La asistencia a los laboratorios es de 100%. Se aceptar slo una inasistencia debidamente justificada. Una inasistencia superior ser motivo de reprobacin

Universidad Tecnolgica Metropolitana Departamento de Biotecnologa

Laboratorio de Bioqumica
Preparacin de buffers (soluciones amortiguadoras)
Casi todos los procesos biolgicos son dependientes de pH, un pequeo cambio en el pH puede producir un cambio significativo en el proceso. Las protenas contienen grupos ionizables cada uno con un pKa caracterstico. Los grupos amino y carboxilo de aminocidos funcionan como cidos dbiles y su estado inico depende del pH del medio. Las clulas mantienen un pH citoslico constante, normalmente cercano a la neutralidad. En organismos multicelulares, el pH de fluidos extracelulares est tambin estrechamente regulado. Esta constancia en el pH est mantenida por sistemas de buffers. Los buffers (soluciones tampones, soluciones amortiguadoras) son mezclas de un cido dbil con su base conjugada en solucin acuosa, que tienden a resistir cambios en pH cuando cantidades (relativamente pequeas) de cido (H+) o base (OH-) son aadidas. Un buffer consiste en un cido dbil (donador de protn) y su base conjugada (aceptor de protn) y tiene su zona de amortiguacin o tamponamiento caracterstica en la cual es efectivo

La ecuacin de Henderson-Hasselbalch permite: i) Calcular el pKa ii) Calcular el pH iii) Calcular la razn molar base conjugada / cido dbil conociendo los otros dos parmetros de la ecuacin respectivamente

La mayora de los experimentos bioqumicos in vitro involucrando molculas purificadas, extractos celulares o clulas intactas son realizados en presencia de un buffer apropiado para asegurar un pH estable Un nmero de compuestos naturales o sintticos con una variedad de valores de pKa son usados para preparar soluciones tamponadas

Buffers comnmente usados en laboratorios de bioqumica

Tomada de Biochemistry. Campbell & Farrell 2006 5a Ed. Thompson Ed .

Actividades
1. Preparacin de buffer fosfato El buffer fosfato est compuesto por el dihidrgeno fosfato H2PO4- (NaH2PO4) y el hidrgeno fosfato HPO4-2 (Na2 HPO4) pKa = 6,86 Realizar los clculos y preparar 250 ml de buffer fosfato 0,1 M pH 7,0

2. Preparacin de buffer acetato (cido actico / acetato de sodio) El buffer acetato est compuesto por cido actico y acetato de sodio (pK. = 4.76) Realizar los clculos y preparar 250 ml de buffer acetato 0,1 M pH 5,0

3. Preparacin de buffer Tris Tris es el nombre abreviado del compuesto orgnico conocido como tris (hidroximetil) aminometano, de frmula (HOCH2)3CNH2. Se utiliza en laboratorios de bioqumica y biologa molecular, para preparar buffers. El buffer Tris est compuesto por la forma acida, Tris-HCl: (HOCH2)3CNH2-HCl y la forma bsica Tris (base): (HOCH2)3CNH2 El buffer Tris tiene un pKa de 8,06 Tris (base) PM: 121,1 g/mol Tris-HCl PM: 157,6 g/mol Realizar los clculos y preparar 250 ml de buffer Tris 0,1 M pH 8,5

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Laboratorio de Bioqumica Centrifugacin

Introduccin
La clula es la unidad estructural y fisiolgica de todos los organismos y puede ser visualizada a travs de los microscopios pticos y electrnicos. Estas clulas estn compuestas de pequeos organelos cuya estructura puede ser definida por microscopa. Sin embargo, para estudiar la funcin de los organelos es necesario aislarlos en fracciones puras. Cada organelo tiene caractersticas (tamao, forma y densidad, por ejemplo) que lo hacen diferente de otros organelos dentro de la misma clula. Si la clula es rota por algn procedimiento suave, cada uno de sus organelos puede ser separado posteriormente. El proceso de abrir las clulas es la homogenizacin y el posterior aislamiento de los organelos es el fraccionamiento. El aislamiento de los organelos requiere el uso de tcnicas fsico-qumicas y stas pueden consistir en simples filtros, sedimentacin por gravedad o precipitacin diferencial, a ultracentrifugacin de organelos marcados por fluorescencia en gradientes de densidad. Centrifugacin La tcnica de centrifugacin es un procedimiento poderoso y de aplicacin general para separar y analizar clulas, organelos, y macromolculas biolgicas. Una partcula movindose en un crculo de radio r a una velocidad angular queda sujeta a una aceleracin o campo centrifugo de magnitud 2r. La fuerza centrfuga sobre la partcula queda definida por la expresin

Fc = m(1-v) 2r
(1-v) es el factor de flotacin, que toma en cuenta el hecho de que el fluido que es desplazado por la partcula ejerce una fuerza opositora; v es el volumen de la partcula y la densidad de la solucin. Adems, el movimiento de la partcula encuentra la resistencia producida por la viscosidad del medio, que viene dada por

Fr = fv
En un campo centrfugo:

donde f es el coeficiente de roce y v la velocidad de la partcula

Fc = F r

por l tanto

m(1-v) 2r = fv

Despejando v

v = m(1-v) 2r/ f

As, durante una centrifugacin, una partcula o molcula se mueve con una velocidad constante, la velocidad de sedimentacin v Se puede apreciar de esta expresin que la velocidad de sedimentacin v depende directamente de la masa de la partcula (m), el volumen de la partcula (v), la densidad de la solucin (), el coeficiente de roce (f) y de la aceleracin o campo centrifugo de magnitud 2r (es decir de la velocidad de rotacin ). Se ha definido tambin un parmetro de sedimentacin que depende de las propiedades de la partcula, pero que es independiente de la velocidad de centrifugacin. As, se define el coeficiente de sedimentacin (S) como la velocidad de la partcula dividida por la intensidad del campo centrfugo:

S = v / 2r
Este parmetro tiene unidades de segundos y los valores tpicos para las molculas son del orden de 10-13 seg, por lo que esta cantidad se ha designado como 1 unidad Svedberg (1S = 10-13 seg). Por ejemplo, la hemoglobina tiene un coeficiente de sedimentacin de 4x 10 13 seg, o 4S. Las partculas y organelos celulares tienen valores de S mayores, y algunas se las identifica con su valor (los ribosomas 70S y 80S). S aumenta con la masa de la partcula, pero la relacin no es lineal y solo se puede utilizar el valor de S como una medida estimativa del peso molecular. Existen diversas tipos de centrifugacin que se utilizan de acuerdo a lo que se desee separar, empleando distintos rotores, velocidades, tiempos, y medios. As por ejemplo, la centrifugacin diferencial y la centrifugacin en gradiente de sacarosa, permiten separar por diferencias en coeficientes de sedimentacin, componentes celulares y molculas respectivamente, a partir de un homogenizado celular. La centrifugacin en equilibrio en gradiente de cloruro de cesio permite separar y purificar cidos nucleicos. En el estudio de los organelos celulares, diferentes fracciones de las partculas subcelulares pueden ser separados rutinariamente con una centrfuga. En un esquema tpico de separacin, se mezcla una solucin isotnica 0.25 0.35 M de sucrosa con clulas o un trozo de algn tejido animal o vegetal. La mezcla es colocada en un homogenizador, un disruptor celular ultrasnico, o simplemente un mortero y las membranas celulares sern rotas para liberar el contenido celular. La mezcla resultante de organelos subcelulares puede ser colocada en una centrfuga a 100g por 10 minutos.

Clulas intactas y ncleos sedimentarn en el fondo del tubo de centrfuga como pellet. Despus el sobrenadante es centrifugado a 10.000g por 20 minutos y partculas subcelulares de velocidades terminales intermedias tales como mitocondrias, lisosomas y microcuerpos pueden ser colectados como pellet. Las partculas ms pequeas y livianas (ribosomas, fragmentos de retculo endoplasmtico membranas celulares y microsomas) pueden ser separados desde el sobrenadante del procedimiento anterior por centrifugacin a 100.000g por 60 minutos. El sobrenadante final puede ser considerado como la porcin soluble de citoplasma celular. La ltima velocidad se consigue en una ultracentrfuga. Este modo de separacin se conoce como centrifugacin diferencial. Cada fraccin obtenida a travs de la centrifugacin diferencial contiene diferentes tipos de organelos con velocidades de sedimentacin semejantes. Las fracciones obtenidas a travs de la centrifugacin diferencial pueden ser llevadas a una segunda tcnica de centrifugacin que se basa slo en la densidad de las partculas, la centrifugacin en gradiente de densidad. La gradiente de densidad puede formarse utilizando un formador de gradientes, o bien en forma manual, colocando en capas volmenes de soluciones de diferentes concentraciones, de manera que en un tubo estarn las ms densas en el fondo y las ms livianas en el tope. La fraccin a ser separada es colocada en la superficie de la capa menos densa (arriba). Si se est separando fracciones de un extracto celular, los componentes subcelulares migraran a travs de la gradiente durante la centrifugacin hasta llegar a un punto donde la densidad de la gradiente es igual al de la partcula, lugar donde permanecern. Esto permite la separacin de partculas y molculas en base a sus distintas densidades Tamao y densidad de algunos organelos tpicos -----------------------------------------------------------------------------------Organelo Dimetro (m) Densidad (g/cm3) -----------------------------------------------------------------------------------Ncleos 5 10 1.4 Mitocondria 1 2 1.1 Ribosomas 0.02 1.6 Lisosomas 1- 2 1.1 ------------------------------------------------------------------------------------

Objetivos
Entender el principio y los aspectos bsicos de la separacin por centrifugacin Conocer diferentes aplicaciones de la centrifugacin Aplicar los principios de la centrifugacin en el fraccionamiento celular en una gradiente de sacarosa Medir la concentracin de sacarosa de cada fraccin y asociar con densidad de los organelos presentes en el fraccionamiento celular.

Materiales
Hojas frescas de Espinacas Soluciones de sacarosa: 33%, 44%, 50%, 57%, 60% (w/v) Medio para Homogenizar: 0.4 M Sacarosa; 0.165 M Tris-HCl buffer, pH 7,5; 0,01 M KCl; 0,01M MgCl2 0,01M EDTA ajustado a pH 7.5; 0,01M ditiotreitol Mortero, gasa para filtrar Centrifuga Sigma Ultracentrfuga Beckman con rotor swinging bucket SW 28.1 Refractmetros de 0 a 30% y de 28 a 60%

Procedimiento
1. Pesar 15 g de hojas frescas y jvenes de espinacas y cortarlas en trozos pequeos (1 cm2) descartando las nervaduras. Molerlas en un mortero en bao de hielo por 30 seg. Despus continuar vigorosamente mientras agrega lentamente 30 ml de medio homogenizante fro. Rpidamente filtrar la pulpa a travs de gasa. Apriete suavemente la pulpa para extraer lquido residual. Transferir de 15 ml del filtrado a tubos de centrfuga y centrifugue a 4 C por 5 minutos a 800 r/min para remover clulas enteras y otros restos de tejidos vegetales. Utilizar la centrfuga Sigma. 2. Retirar el sobrenadante de la primera centrifugacin en dos tubos de centrfuga limpios y fros y volver a centrifugar a 4C por 10 minutos a 12.000 g en la centrfuga Sigma. 3. Preparar dos tubos de centrfuga para la gradiente de sacarosa. Colocar las siguientes soluciones lentamente y en orden, escurriendo el lquido por las paredes del tubo: 1.5 ml de sucrosa 60% 3.0 ml de sucrosa 57% 4.5 ml de sucrosa 50% 4.5 ml de sucrosa 44% 1.5 ml de sucrosa 33% 4. Retirar y guardar el sobrenadante de la segunda centrifugacin y resuspender el pellet en 1 ml de medio homogenizante. Cuidadosamente colocar 1 ml de pellet resuspendido sobre la gradiente de sacarosa de los dos tubos de centrfuga que habr preparado previamente. Balancear el peso de ambos tubos agregando de manera de obtener el mismo peso en ambos tubos. Sea cuidadoso al respecto. 5. Centrifugar los tubos a 4C por 1 hora a 25.000 rpm en un rotor SW 28.1 en la ultracentrfuga Beckman 6. Despus de completada la centrifugacin, observar las zonas formadas y fraccionar el contenido del tubo. Para esto utilizar una micropipeta de 1000 l, tomando volmenes de 1,0 ml, colocndolos en tubos eppendorf.

7. Mediante un refractmetro determinar el % de sacarosa en cada fraccin y su correspondiente densidad segn Tabla 1. Indicar en qu fraccin es posible encontrar los diferentes organelos segn la Tabla 2

CUESTIONARIO 1.- Cul es el objetivo de mantener temperaturas bajas (4C) durante el procedimiento? 2.- Que aplicaciones tiene esta tcnica en laboratorios o industria?

Tabla 1 Concentracin (g/100 ml) y densidad de soluciones de sacarosa

Porcentaje Densidad (g/cm ) g /100 ml 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0.9982 1.0021 1.0060 1.0099 1.0139 1.0179 1.0219 1.0259 1.0299 1.0340 1.0381 1.0423 1.0465 1.0507 1.0549 1.0592 1.0635 1.0678 1.0721 1.0765 1.0810 1.0854 1.0899 1.0944 1.0990 1.1036 1.1082 1.1128 1.1175 g /100 ml 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 50 55 60 65 1.1222 1.1270 1.1318 1.1366 1.1415 1.1463 1.1513 1.1562 1.1612 1.1663 1.1713 1.1764 1.1816 1.1868 1.1920 1.1972 1.2025 1.2296 1.2575 1.2865 1.3163 Porcentaje Densidad (g/cm )

Tabla 2 Densidades de estructuras celulares

Estructura Aparato de Golgi Membrana plasmticas Retculo endoplasmico liso Mitocondrias Lisosomas Peroxisomas Virus de plantas Protenas solubles Rhino- y enterovirus Ribosomas y cidos, nucleicos Glicgeno Densidad (g/cm3) 1.06-1.10 1.16 1.16 1.19 1.21 1.23 1.30-1.45 1.30 1.30-1.45 1.60-1.75 1.70