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Tcnicas Moleculares

Universidad Tcnica Particular de Loja.

Electroforesis, importante y fundamental en la Biologa Molecular. Iliana Ximena Pardo Rojas.

RESUMEN. Mediante la electroforesis es posible separar molculas biolgicas en dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo elctrico. En el presente ensayo se da una visin general de la electroforesis y sus tipos, se incorporan nuevos conocimientos tomados de la literatura reciente a los conceptos tradicionales de este mtodo y se reitera su importancia en los estudios moleculares en la Biologa. INTRODUCCIN La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del anlisis de los cidos nucleicos y protenas. Y as como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los cidos nucleicos y protenas al final del procedimiento (Berkelman et, 1996). El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas a travs de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de un campo elctrico, sern separadas de acuerdo a su tamao o peso molecular. Para controlar el avance de la separacin de las molculas en la matriz y establecer un patrn de fragmentos, las molculas debern ser teidas con diferentes colorantes. Estos paso s facilitan la visualizacin de las molculas a manera de simples bandas las cuales sern posteriormente analizadas e interpretadas. En biologa molecular, la mayora de los estudios bsicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. (Yabar, 2003). Hay diferentes tipos de electroforesis como son en gel de poliacrilamida en geles de agarosa, capilar, geles de gradientes, Isoelectroenfoque y bidimensional su correcta aplicacin depende del estudio que se vaya a realizar. (Garcia, 2000). Es importante sealar que la electroforesis en asociacin con otras tcnicas tales como PCR, e hibridacin, brinda una gran ayuda en el campo de la Biologa, gracias a esta tcnica podemos ayudarnos en estudios genticos, moleculares, taxonmicos, etc.

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DESARROLLO La electroforesis es una tcnica molecular que nos permite separar molculas biolgicas en base a su forma, peso y tamao bajo la influencia de un campo elctrico y que es empleada para molculas de bajo peso molecular. Fue empleado por primera vez por el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona. Es til adems para determinar otros parmetros como peso molecular, punto isoelctrico y nmero de cadenas poli peptdicas de las protenas. La electroforesis tiene como fundamento principal la carga elctrica de las molculas que permiten que estas migren hacia el polo opuesto, el carcter de estas molculas se determina por la velocidad de migracin en un campo elctrico al que es sometido en un lquido portador. Este campo elctrico generado permite que una fuerza (Garcia, 2000) Fundamento de la Electroforesis. Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). El movimiento de las molculas est gobernado tambin por dos fuerzas adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin. La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin. La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.

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Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las molculas empleando un medio que oponga ms resistencia a dicho movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las molculas ser ms lenta, pero el ensanchamiento del frente se ver reducido tambin. (Southern, 1975) Tipos de Electroforesis. Existen muchos tipos de electroforesis pero los ms importantes son:

De frente mvil: Aquella en la cual las partculas se mueven de forma libre en el medio en el que se encuentran dispersas. Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un tampn de pH y fuerza inica adecuados. Se colocan los electrodos en sendos brazos del dispositivo, entre los que se crea un campo elctrico, provocando que las molculas de la muestra (por ejemplo: protenas) cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. De zona: La disolucin a tratar se aplica como una mancha, o como una banda, y las partculas migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio soporte inerte y homogneo, tal como el papel o ciertos tipos de geles. Esta tcnica es utilizada para analizar mezclas, para determinar la pureza de una muestra, para detectar cambios de movilidad o de conformacin de sustancias. En este tipo de electroforesis podemos encontrar varios subtipos como es en papel y en gel.

Las electroforesis ms utilizadas en el campo de la Biologa son: a. Electroforesis en gel de poliacrilamida: Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de

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las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxicidad. b. Electroforesis en geles de agarosa: La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos c. Electroforesis capilar: La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separacin de pptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del lquido que contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin. La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea. d. Electroforesis en geles de gradientes: El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentracin de acrilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamao del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que

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resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija. e. Isoelectroenfoque: Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas amfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su punto isoelctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas amfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH. f. Electroforesis bidimensional: La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla segn sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El procedimiento ms usado se basa en la separacin en una primera dimensin mediante Isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida. En funcin del estado de las protenas a lo largo del proceso electrofortico, stas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes En una electroforesis desnaturalizante, es la que somete a las (prdida de la estructura tridimensional). En esta situacin la migracin es proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. En una electroforesis nativa a las protenas se les somete a una migracin sin desnaturalizacin. En esta situacin las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y de su forma. Adems

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se mantienen en ciertos casos las interacciones entre subunidades y entre protenas, separndose los complejos. (Southern, 1975) Fuentes de error en la electroforesis La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, estos se reflejan a continuacin. 1) 2) 3) 4) 5) Temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel. Velocidad de la polimerizacin. Niveles de catalizador. Pureza de los reactivos. Tiempo de corrida. Preparacin de las muestra (Yabar, 2003)

Conservacin de los geles de electroforesis. Se recomienda sumergir el gel despus de electroforesis en una solucin de sacridos, azcares, alcoholes de ms de 4 carbonos y polmeros solubles en agua; despus se introduce este entre 2 filmes de celofn transparentes y semipermeables colocado en forma de sndwich a ambos lados del gel o en uno y en el otro una lmina plstica. De esta forma los componentes acuosos del gel son reemplazados por los de la solucin. Esto permite que el gel se seque, sin causar su ruptura, deformacin, prdida de la transparencia y sin necesidad de emplear calor o presin reducida ni ningn aparato especial. No se han reportado variaciones en geles tratados con este mtodo despus de 2 aos. Se recomienda el empleo de un poliol como el glicerol como un agente hmedo cuya funcin es adems de actuar como un agente de restriccin de la difusin, impedir que el gel se seque por la evaporacin durante la conservacin, lo que evita la ruptura de este. (Notsu et, 1997)

CONCLUSIONES. La electroforesis con su principio fundamental es una tcnica muy importante y muy desarrollada a travs de los aos para responder a las inquietudes en el campo Biolgico y Molecular que se da a da a da, ayudando as a los diferentes estudios y proyectos en este campo.

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Los diferentes tipos de electroforesis nos dan una herramienta ms para ampliar nuestros conocimientos, y asi ayudarnos a una pregunta de investigacin que nos hiciramos ayudndonos de acuerdo al objetivo planteado en nuestro proyecto.

BiBLIOGRAFA.
Berkelman et, a. (1996). Molecular Epidemiology of Escherichia coli O157:H7 by Pulsed-Field Gel Electrophoresis and Comparison with That by Bacteriophage Typing. J.Clin. Microbiol, 959961. Garcia. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,actualidad e importancia. UNIV DIAG., 31-41. Notsu et, a. (1997). Method for drying polyacrylamide gel after. Daiichi Pure Chemicals, 046. Southern. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Buenos Aires.: Panamericana. Yabar. (2003). Manual de Procedimientos de Electroforesis para Protenas y ADN. Lima-Per: ARTES & DISEOS LASER S.R.LTDA.