Universidade Federal do Tringulo Mineiro Biologia Molecular

Reao em cadeia de polimerase

Anna Carolina Moraes Bruna Raphaela Gabriela Sanches Jacqueline Pdua Tauana Christina Dias

Uberaba-MG Maro de 2013

1. Introduo
A reao em cadeia de polimerase (PCR), desenvolvida por Kary Banks Mullis, permitiu o rpido desenvolvimento do estudo de sequncias de cidos nuclicos. A PCR consiste na sntese enzimtica de cpias de cidos nuclicos em laboratrio, na qual por meio de artifcios de variao de temperatura, o que o organismos realiza naturalmente, condies fisiolgicas A PCR encontra sua principal aplicao em situaes onde a quantidade de DNA disponvel reduzida. E utilizado tambm o mtodo de eletroforese em gel de agarose para analisar a PCR. Consistindo assim em um mtodo padro usado para separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. Ambas as tcnicas so usadas pela medicina forense, deteco de mutaes ou preparao de fragmentos de DNA para clonagem.

2. Objetivo
Aprender a realizar a tcnica de reao em cadeia de polimerases (PCR ), determinar a quantidade de primers necessrios para a sua realizao e aprender a proceder na tcnica de eletroforese de gel de agarose.

3. Materiais
Foram utilizados os seguintes materiais: Um molde de DNA; 4 tubos; Pipetas automticas; MIX: 2 L/ tubo de soluo tampo(10x); 3 L/ tubo de MgCl2 ( 5mM); 3 L/ tubo de dNTPs (2,5 mM cada); 4 L/ tubo de iniciadores; 1 L/ tubo de Taq DNA polimerase (1U/ L); 10 L de H2O; Soluo Tampo TBE 10X (1L): Tris-HCl (108g) + cido Brico (55 g) + EDTA (83 g); Agarose; Brometo de etdio; Tampo de amostra (500 L de glicerol + 200 L EDTA 0,5 M pH 8,0 + 50 L SDS 20% + azul de bromofenol + xileno cyanol)

4. Mtodos
1- Adicionou-se solues tampo ,MgCl2, dNTPs, Taq DNA polimerase, H2O, os iniciadores e o DNA molde em em um tubo; 2- Iniciao do ciclo de PCR com a desnaturao por por calor a 94 C ; 3- Depois da desnaturao por 4 min e 4 segundos; 4- Resfria-se a reao a uma temperatura de associao a 5; 5- Depois a temperatura para extenso do DNA que de 72C; 6- Novamente ocorrer o ciclo da PCR com 52C por 30 segundos, 72C por 30 segundos; 7- Repete-se esse processo por mais 30x com a temperatura da 72C por 10 minutos e finalizando com uma temperatura de 4C para manter a soluo estvel.

5. Resultados

Os resultados da PCR analisado atravs da eletroforese em gel, corando as bandas de DNA , devido ao utilizado gel de agarose. . Permitindo analisar uma determinada quantidade de DNA, e a quantidade da fluorescncia emitida proporcional a concentrao do DNA encontrado na amostra.

6. Concluso e Discusso
Para a preparao da soluo Mix de reao havia necessidade de calcular o volume correspondente para cada concentrao final, sendo que o Mix deveria ter o volume total de 23 L. A Reao em Cadeia da Polimerase dividida em 3 estgios: desnaturao, associao ou hibridizao e extenso. - Desnaturao: A temperatura elevada (geralmente >90C) separa a cadeia dupla de DNA em dois filamentos, sendo este processo conhecido como desnaturao. Os dois filamentos ou cadeias de DNA so mantidos juntos por ligaes de hidrognio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligaes entre as molculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligaes covalentes mais fortes, permanecem intactas. - Associao ou hibridizao: Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequncia alvo: estes iniciadores so curtas sequncias sintticas de nucleotdios, entre 20 e 30 bases. Numa reao de PCR so includos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturao. O incio da sequncia de DNA alvo marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequncia complementar. Temperatura de associao ou hibridizao: normalmente encontra-se entre 40 C e 65 C, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequncia. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequncias iniciadores se liguem sequncia alvo com elevada especificidade. - Extenso: Aps a ligao dos primers ou iniciadores s sequncias complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 C e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de ADN. A Taq polimerase uma polimerase de DNA termo-estvel recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrrio de outras polimerases, se mantm ativa a temperaturas elevadas. O processo de sntese iniciado numa zona com cadeia dupla (onde esto ligados os primers), incorporando os nucleotidios complementares sequncia alvo e utilizando os dNTPs em soluo. A extenso inicia-se sempre na extremidade 3 do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direo 5 para 3.

Aps 30 ciclos da PCR (nmero de ciclos utilizados para a maioria das reaes), um nico fragmento gnico apresentar mais de 1 000 000 000 de cpias. As cadeias de DNA amplificadas so denominadas Amplicons. Aps a realizao da PCR, os produtos da reao foram analisados por eletroforese. Uma PCR bem-sucedida revelou uma banda no gel de agarose. A localizao dos fragmentos no gel feita pela comparao com o DNA do Trypanossoma cruzi . Pela observao do gel da aula prtica percebe-se que houve amplificao, uma vez que a banda correspondente ao amplicon est presente.

7. Referncia bibliogrfica
[1]http://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_po limerase; [2]://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polim erase; [3] http://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/8577/tecnica-debiologia-molecular-pcr-reacao-em-cadeia-da-polimerase;