QUMICA BIOLGICA I

Trabajo Prctico N 3 CINTICA ENZIMTICA I Las enzimas son los catalizadores de las reacciones qumicas de los seres vivos. El estudio de la actividad de una enzima como catalizador en una reaccin es abordado por la Cintica Enzimtica. La CINETICA ENZIMATICA es el estudio de la velocidad de las reacciones qumicas catalizadas por enzimas, y de cmo diferentes parmetros experimentales pueden modificarla. Actualmente, los estudios clsicos de la actividad enzimtica son complementados con estudios de la estructura tridimensional de la protena, que pueden predecir algunos aspectos del mecanismo de unin entre enzima y sustrato. En tanto que los estudios de mutagnesis dirigida nos permiten conocer la importancia de determinados residuos de aminocidos en la actividad enzimtica. La integracin de estos conocimientos nos permitir conocer el rol de una determinada enzima en un proceso biolgico. La actividad de una enzima determinar la velocidad de una reaccin catalizada por ella. En la Prctica se determina midiendo la cantidad de Producto formado o Sustrato consumido en la unidad de tiempo. Si se analiza una reaccin enzimtica en funcin del tiempo, en un primer momento la formacin de producto aumenta en forma directamente proporcional al tiempo de incubacin, pero pasado un cierto tiempo se nota una disminucin de la formacin de producto por unidad de tiempo. Las principales causas de esta disminucin son: 1. Disminucin en la concentracin de sustrato. 2. Inhibicin de la enzima por los productos de la reaccin o por un cambio en las condiciones del medio. 3. Inactivacin de la enzima por la temperatura o pH de la reaccin 4. Acumulacin de producto que tiende a establecer el equilibrio de la reaccin. Estas son las razones porque no debemos trabajar en otras condiciones que no sean Vo Cuando se grafica el producto formado en funcin del tiempo de incubacin, la pendiente de la curva donde el producto aumenta en forma directamente proporcional al tiempo se considera velocidad inicial (Vo). Como se ve, en la zona donde la formacin de producto es directamente proporcional al tiempo (Figura 1A), la velocidad es constante (Figura 1B) y es la mayor velocidad que se puede conseguir en esas condiciones (Vo); a tiempos superiores la velocidad comienza a disminuir.

(A ) P V

(B )

Vo

10

20

30

40

50

10

20

30

40

50

tie m p o (m in .)

tie m p o (m in .)

F ig u r a 3 : S e g u im ie n to d e u n a r e a c c i n e n z im tic a e n e l tie m p o . ( A ) P ro d u c to e n fu n c i n d e l tie m p o , ( B ) v e lo c id a d e n f u n c i n d e l tie m p o .

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La metodologa general a seguir para determinar la velocidad inicial (Vo) es: Incubar una determinada cantidad de enzima fija, con una concentracin adecuada de sustrato, en condiciones constantes de pH y temperatura. Medir la cantidad de producto formado en distintos tiempos. Con los datos obtenidos, graficar producto en funcin del tiempo (Figura 1A). Dividir el valor del producto obtenido por el tiempo de incubacin empleado y as se obtendr la velocidad (cantidad de producto/unidad de tiempo). Graficar velocidad en funcin del tiempo. En esta grfica se visualizar claramente el rango de Vo (Figura 1B). En cualquier reaccin enzimtica siempre se debe trabajar en condiciones de Vo

La actividad de una enzima se puede expresar en trminos de unidades de enzima o unidades internacionales (UI). La UI (recomendada por la Unin Internacional de Bioqumica) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la conversin de un micromol de sustrato en un minuto (mol/min). La actividad especfica es el nmero de unidades internacionales de enzima por miligramo de protena (UI/mg de protena). Asimismo es til definir una constante de velocidad general, kcat, para describir la velocidad limitante de cualquier reaccin enzimtica a saturacin si se conoce la concentracin de enzima usada en el ensayo [Et]. En una reaccin michaeliana kcat= Vmx/[Et]. La kcat, denominada tambin nmero de recambio, es una constante de velocidad de primer orden con unidades de tiempos inversos y es equivalente al nmero de molculas de sustrato convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola molcula de enzima, cuando la misma est saturada de sustrato. Los factores ms importantes que modifican la velocidad de una reaccin enzimtica son: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Concentracin sustrato [S]. Concentracin de enzima: [E] pH Fuerza inica Temperatura Concentracin de otros ligandos: productos [P], cofactores, inhibidores[I] y activadores [A]

FACTORES QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN ENZIMATICA A) Dependencia de la concentracin de SUSTRATO Una reaccin general catalizada por una enzima se puede expresar como:

E + S [ES]

k1 k-1 P

k2 k
2

E +
-

(1 )

Analizando la ecuacin 1, se ve que la velocidad de la reaccin (formacin de producto en funcin del tiempo) es proporcional a la concentracin del complejo [ES]. Por lo tanto, la velocidad de la reaccin ser mayor cuanto mayor sea la concentracin de sustrato [S], si se mantiene constante la concentracin de enzima [E]. Del anlisis anterior deducimos entonces, que un factor clave en la velocidad de una reaccin enzimtica es la concentracin de sutrato [S].
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El estudio de la dependencia de la velocidad de la reaccin con la concentracin de sustrato es muy dificultoso, ya que la concentracin de sustrato va disminuyendo durante el transcurso de la misma. Una aproximacin experimental que simplifica el estudio cintico, es considerar que la [S] es constante en el transcurso de la reaccin. Esto se logra cuando la concentracin de sustrato [S] es mucho mayor que la concentracin de enzima [E] y el tiempo de reaccin es lo suficientemente corto como para que la concentracin de sustrato transformado en producto sea despreciable. La velocidad de la reaccin, medida en estas condiciones, se denomina VELOCIDAD INICIAL (v0). Velocidad inicial (v0 ) es la velocidad de reaccin cuando la [S] consumido o la [P] formado , en funcin del tiempo es lineal. Haciendo estas consideraciones, es posible determinar la vO de la reaccin a diferentes [S], las cuales sern fijadas por el investigador. La grfica de vo en funcin de la [S], responde a la ecuacin de una hiprbola rectangular que pasa por el origen y (Figura 2).

Vo Vmax 3 2

1 [S ]

Figura 2: Efecto del sustrato sobre la velocidad de una reaccin enzimtica

En esta representacin se pueden distinguir 3 zonas: la zona 1 (muy pequea) donde la vO es proporcional a la concentracin de sustrato (reaccin de orden 1 con respecto al sustrato), la zona 2 donde la reaccin es de orden mixto y la zona 3 donde la vO es independiente de la [S] (reaccin de orden 0 con respecto a la [S]). En esta ltima zona, la [S] es tan alta que toda la enzima presente esta formando el complejo ES. En este punto se dice que la enzima est saturada y se ha llegado a la velocidad mxima (Vmax), es decir la mxima velocidad posible para la concentracin de enzima presente. Michaelis y Menten derivaron la ecuacin de velocidad de la reaccin enzimtica en trminos de variables que pueden ser medidas experimentalmente.

V K

m ax m

[S ]

+ [S ]

(4 )

En ella aparecen dos constantes que son V max y Km (Figura 2). La Vmax es una constante que depende nicamente de la concentracin de enzima. Km es una constante independiente de la concentracin de enzima y de la concentracin de sustrato, y nos indica la afinidad de la enzima por un determinado sustrato.
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B) Dependencia del pH de reaccin Todas las enzimas poseen, en mayor o menor cantidad, grupos qumicos ionizables (carboxilo, amino, hidroxilo, tiol, imidazol) en las cadenas laterales de los aminocidos que las componen. Segn el pH del medio, estos grupos Pepsina Tripsina pueden tener carga elctrica positivas, negativas o neutra. Ya que la conformacin de las protenas depende en parte de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica (pH ptimo). As, por ejemplo, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo muy cido (2,0) mientras que la tripsina pancretica acta mejor a pH 2 moderadamente alcalino (7,8) (Figura 3). Cambios 4 6 8 pH importantes en el pH, pueden ocasionar la Figura 3 : Efecto del pH en la actividad enzimtica desnaturalizacin de la protena. Por otro lado, el sustrato tambin puede tener grupos ionizables y slo una de sus formas inicas puede ser reconocida por la enzima. C) Dependencia de la concentracin de ENZIMA Como vimos, de acuerdo a la ecuacin 1, la velocidad de la reaccin catalizada por una enzima depende de la concentracin del complejo enzima-sustrato [ES]. Ya analizamos la necesidad de trabajar en condiciones de v0 para medir las velocidades de reaccin y tambin que a muy altas [S], la v0 de la reaccin se hace independiente de la [S] (zona 3 de la curva de la Figura 1), es decir la enzima trabaja a su Vmax . En estas condiciones, si se varia ahora la concentracin de enzima [E], se obtendra una grfica como la de la Figura 4.
Vo
A c t i v i d a d

[Enzima] Figura 4: Efecto de la concentracin de enzima en una reaccin enzimtica

Si analizamos la grfica vemos que la v0 aumenta en forma proporcional a la [E], hasta que la concentracin de enzima es tal que deja de estar saturada con la concentracin de sustrato utilizada. En la regin lineal de esta grfica las v0 son Vmax ya que la enzima esta saturada de sustrato. Teniendo en cuenta este anlisis es que si se necesita conocer la cantidad de enzima presente en una muestra, se puede recurrir a la medicin de la velocidad de la reaccin enzimtica que cataliza, con la precaucin de trabajar siempre en condiciones saturantes de sustrato (Vmax).
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D) Dependencia de la temperatura de reaccin La mayora de las reacciones qumicas proceden a mayor velocidad a medida que aumenta la temperatura. Un incremento de la temperatura imparte mayor energa cintica a las molculas reactantes, dando lugar a mayor nmero de colisiones productivas por unidad de tiempo. Las reacciones catalizadas por enzimas se comportan, hasta cierto punto, en forma similar. La actividad cataltica de una enzima depende de su estructura terciaria altamente organizada y compleja, la cual es mantenida por un gran nmero de uniones no covalentes dbiles (por ej. puentes hidrgeno) y puentes disulfuro. Si la molcula absorbe demasiada energa en forma de calor, la estructura terciaria puede romperse y la enzima se desnaturaliza, perdiendo actividad. Por esto a medida que la temperatura aumenta el incremento esperado de la velocidad, que resultara de un mayor nmero de colisiones por unidad de tiempo, es frenado por la desnaturalizacin de la enzima. Si se grafica la actividad en funcin de la temperatura se observa un pico que es la temperatura ptima, ver Figura 5.
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Desnat urali zac in

tr m ica

ri c a
A cti vi d

d da vi i t Ac

al re

ad

te

Temperatura ptima

Temperatura

Figura5 : Efecto de la temperatura en la actividad enzimtica

OBJETIVOS DEL TRABAJO PRCTICO Integrar los conocimientos tericos para comprender porqu debemos trabajar en condiciones de velocidad inicial para determinar las constantes cinticas de una enzima Estudiar algunos factores que afectan la velocidad de la reaccin catalizada por la enzima UREASA, entre ellos temperatura, pH y concentracin de enzima. Establecer en base a los resultados obtenidos, las condiciones ptimas para trabajar con dicha enzima (en condiciones de v o), para determinar posteriormente las constantes cinticas que la caracterizan (Km y Vmax) en el siguiente trabajo prctico.

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EXPERIENCIAS DE LABORATORIO Reaccin catalizada por la enzima ureasa La enzima ureasa (urea amidohidrolasa EC 3.5.1.5) cataliza la hidrlisis de un mol de urea dando como producto de la reaccin un mol de CO2 y dos moles de NH3

H 2N H 2N

C = O

H 2O

U reasa

C O

+ 2N H

En este Trabajo Prctico se estudiar como los siguientes factores modifican la velocidad de la reaccin enzimtica: - Temperatura - pH - Concentracin de Enzima. Reactivos 1 Buffer fosfato-citrato a) Solucin madre 200 mM b) Solucin de trabajo 10 mM 2 Solucin de urea en buffer fosfato-citrato 10 mM a) Solucin madre: 150 mM. b) Solucin de trabajo: 5 mM 3 Ureasa: se estudiar esta actividad enzimtica presente en un extracto preparado a partir de semillas de soja (ver Apndice I) Curvas de tiempo Con el protocolo experimental mostrado en la tabla, se realizarn diversas curvas de tiempo (formacin de producto en funcin del tiempo), modificando en cada una de ellas una variable para determinar la influencia de este factor en la reaccin enzimtica: TUBO B 1 2 3 4 5 UREA 5 mM 0,1 ml " " " " " BUFFER pH: ---0,9 ml 0,7 ml " " " " ENZIMA dil ----------0,2 ml " " " " Incubar 37oC 20 ' 0' 5' 10 ' 15 ' 20 ' Reactivo A 2 ml " " " " " Reactivo B 2 ml " " " " " Incubar 37oC 10 ' " " " " " Abs. 540 nm

A) Concentracin de enzima - se variar la concentracin de enzima de acuerdo a la preparacin utilizada en el momento de realizar la prctica y se elegirn 4 5 concentraciones diferentes, para encontrar la dilucin adecuada para trabajar. Con cada una de ellas se realizar una curva de tiempo. B) Influencia del pH - se realizarn curvas de tiempo utilizando en cada una de ellas un
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buffer con un pH diferente (5, 6, 7 y 8). C) Influencia de la temperatura - se realizarn curvas de tiempo, en cada una de ellas se incubar la enzima con el sustrato a distintas temperaturas (0oC, 37oC, 60oC y 80oC). Con los valores de absorbancia obtenidos, para cada punto, se calculan los moles de producto formado usando la curva patrn para amonaco (ver Apndice II). Se realizarn grficas de moles de amonaco en funcin del tiempo. Por cada variable se realizar una grfica, agrupando en ella todas las curvas de tiempo (de esa variable). Se analizarn comparativamente todas las curvas y se elegir un tiempo dentro del rango en el cual la formacin de producto sea proporcional al tiempo. Se calcularn las V o dividiendo el producto de cada curva por el tiempo correspondiente y con los resultados de las V o se graficarn en cada caso Vo en funcin de [E], pH y T. Pudiendo determinar en cada grfica [E] adecuada, pH y T ptimos. Apndice I Preparacin del extracto de ureasa de soja Se pesan 60 gr de soja y se muelen finamente. A los granos triturados se les agregan 200 ml del buffer fosfato- citrato 10 mM pH 7, se agita 10 minutos a temperatura ambiente y se centrifuga a 10.000 rpm durante 10 minutos. La centrifugacin puede realizarse a temperatura ambiente. El sobrenadante es filtrado por papel de filtro para eliminar una capa blanquecina que se forma en la superficie. El lquido filtrado es fraccionado y se lo guarda congelado a 20C. Al momento de usar el extracto se realizan las diluciones ms adecuadas para cada determinacin. Apndice II Determinacin de amonaco Fundamento Reaccin de Berthelot El mtodo se basa en que el ion amonio (NH4+) en medio alcalino se transforma en NH3, el cual reacciona con el fenol e hipoclorito sdico en medio alcalino, para formar el indofenol de color azul. El nitroprusiato de sodio acta como catalizador.

N H N H

+ 4

+ +

H O

N H + F en ol

+
N aO H

H 2O In d o fe n o l (c o lo r a z u l)

N a C lO

N itro p ru sia to d e so d io

Reactivos 1 Solucin Patrn: (NH4)2SO4 0,4 mM. 2 Reactivo de color I) Solucin A: 10 g de fenol y 50 mg de nitroprusiato de sodio, se disuelven en aproximadamente 500 ml de H2O destilada y luego se completa a 1 litro como volumen final tambin con H2O destilada. Se puede preparar una solucin concentrada 5 veces y diluir al momento de usar II) Solucin B: 5 g de NaOH y 10 ml de NaClO concentrado se llevan a 1 litro con H 2O destilada. Se puede preparar una solucin concentrada 10 veces y diluir al momento de usar
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Protocolo Curva Calibracin Para determinar la cantidad de amonaco formado en cada reaccin empleada se deber realizar una curva de calibracin siguiendo el protocolo de la siguiente tabla: (NH4)2SO4 0,4 mM (ml) ---0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Tubos Blanco 1 2 3 4 5

H2O dest. (ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5

Sol. A (ml) 2

Sol. B (ml) 2

Incubar 37C 10

Abs 570 nm

(NH4)2SO4 (moles) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20

Con los valores obtenidos de la lectura se grafica la ecuacin de la recta determinado un factor para cada espectrofotmetro.

Consideraciones de BIOSEGURIDAD: Los reactivos A y B utilizados contienen fenol e hipoclorito de sodio, respectivamente. Estas sustancias por representar un riesgo qumico, debern ser manipuladas con precaucin. El fenol es txico por inhalacin, por ingestin y en contacto con la piel. Para la preparacin de los reactivos usar indumentaria, guantes adecuados y proteccin para los ojos/la cara y trabajar bajo campana. Las cantidades de las soluciones A y B indicadas en el protocolo experimental se agregarn empleando propipetas. En caso de exposicin al fenol, lavar la piel y el pelo expuestos repetidamente durante 20 minutos, como mnimo, con varias esponjas empapadas en polietilenglicol 300 400. Si no se dispone de polietilenglicol, lavar inmediatamente durante 20 minutos, como mnimo, la piel y el pelo expuestos con grandes cantidades de agua clara. Si el contacto fue con los ojos asegurarse que los ojos expuestos o irritados han sido irrigados con gran cantidad de agua clara o suero fisiolgico durante 20 minutos, como mnimo. Ms informacin:
http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB.htm http://www.ilo.org/public/english/protection/safework/cis/products/icsc/dtasht/_icsc00/icsc00 70.htm

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