1

Uso de Microorganismos a Nivel Industrial - Produccin de cido Pirvico

Len, Mauricio y Piedra, Javier Escuela de Qumica, Universidad Nacional, Laboratorio de Biotecnologa Heredia, Costa Rica. 24/08/2012
Abstracto: El anlisis cualitativo de la produccin de cido pirvico cuenta con una primera etapa en donde se estudian dos series de muestras con suspensiones de levadura en Na 2HPO4 y KH2PO4 al 10%, respectivamente; y que despus son puestas en contacto con glucosa en concentraciones distintas. Mediante una operacin de incubacin que involucra un bao mara a 37C se lleva a cabo el proceso de gluclisis, el desprendimiento de CO2 confirma la finalizacin de esta. La centrifugacin a 2500 revoluciones por 10 minutos despus de la adicin de cido tricloroactico produce un sobrenadante con el cido pirvico. La reaccin de este con nitroprusiato de sodio resulta en un anillo verde o azul y la reaccin con 2,4-dinitrofenil-hidracina crea un precipitado rojo y una coloracin amarilla en disolucin. El mtodo se realiza bajo condiciones alcalinas para inactivar la enzima piruvato descarboxilasa, la cual convierte en piruvato en acetaldehdo.

Introduccin La gluclisis es el proceso por el cual la glucosa se transforma en piruvato conformacin de ATP. En ausencia de oxgeno, luego de la gluclisis se lleva a cabo la fermentacin, donde se produce etanol y CO2, o cido lctico, dependiendo del organismo que lo efecte; en el primer caso las levaduras son las responsables. Ambas rutas de fermentacin (produccin de etanol y cido lctico) son similares hasta la formacin de piruvato, manteniendo similares las etapas de conservacin de energa que conducen a la formacin de ATP. La gluclisis no solo es la va principal para el metabolismo de la glucosa que conlleva a la produccin de acetil-CoA y a su subsiguiente oxidacin en el ciclo del cido ctrico, sino que tambin proporciona una va importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los alimentos. La gluclisis es la oxidacin de la glucosa para formar cido pirvico y en general representa el primer paso del catabolismo de los hidratos de carbono. La mayora de los microorganismos (en realidad, la mayora de las clulas vivas) utilizan esta va metablica.1 El trmino gluclisis significa ruptura del azcar y define el proceso con precisin. Las enzimas que participan en la gluclisis catalizan la escisin de la glucosa, un azcar de seis carbonos, en dos azcares de tres carbonos. Luego estos experimentan un proceso de oxidacin que libera energa y sus tomos se reordenan para formar dos

molculas de cido pirvico. La reduccin del NAD+ durante esta serie de reacciones forma NADH, con una produccin neta de dos ATP por fosforilacin a nivel de sustrato. La gluclisis no requiere oxgeno y puede tener lugar en presencia o en ausencia de este elemento. Esta va consiste en una secuencia de diez reacciones qumicas y cada una de ellas es catalizada por una enzima diferente. Las cinco primeras reacciones constan de un consumo de dos molculas de ATP, mientras que en las ltimas cinco etapas hay una produccin de cuatro ATP, lo que da una produccin neta de dos ATP. 1 Si hay suficiente suministro de oxgeno, el cido pirvico es descarboxilado en la matriz de la mitocondria por el complejo enzimtico piruvato deshidrogenasa rindiendo CO2 y acetil coenzima A que es el inicio de una serie de reacciones llamada ciclo de Krebs, seguida de la fosforilacin oxidativa. Si no hay suficiente cantidad de oxgeno disponible o el organismo es incapaz de continuar con el proceso oxidativo, el piruvato sigue una ruta anaerbica, la fermentacin. En esta va, el piruvato se reduce, permitiendo regenerar las molculas de NAD+ consumidas en los procesos anteriores. Los animales son capaces de realizar la fermentacin lctica cuyo producto es cido lctico. Las bacterias y levaduras son ms verstiles, y pueden realizar otras fermentaciones, como la fermentacin
1

Tortora, Funde, Case. 2007. Introduccin a la microbiologa.

2
alcohlica, cuyo producto es etanol. En la conversin en lactato, interviene la enzima lactato deshidrogenasa y la coenzima NADH; en la fermentacin alcohlica el piruvato es convertido primero en acetaldehdo y luego en etanol y dixido de carbono.2 En la va anaerbica llamada fermentacin alcohlica, las enzimas transforman cada molcula de piruvato de la gluclisis a una forma intermedia: el acetaldehdo. El NADH transfiere electrones e hidrgeno al acetaldehdo y as lo transforma en el producto final, el alcohol llamado etanol. Algunos hongos unicelulares llamados levaduras son famosos por su uso de esta va. Los del tipo Saccharomyces cerevisiae, se utilizan en la fabricacin de pan para que la masa se infle. Los panaderos mezclan la levadura con el azcar y despus mezclan ambas con la harina. Al efectuar la fermentacin, las clulas de la levadura liberan dixido de carbono. Las burbujas de este gas expanden la masa y hace que aumente. Gracias al calor del horno, el gas escapa de la masa y deja atrs un producto poroso. Los productores de vino y cerveza emplean levaduras salvajes como cepas cultivadas de S. ellipsoideus. Ambas son activas hasta que la concentracin de alcohol en los toneles de vino excede el 14%.3 Para conseguir la acumulacin de cido pirvico y poder detectarlo, la fermentacin se llevar a cabo en condiciones ligeramente alcalinas para inactivar a la enzima Piruvato Descarboxilasa. La identificacin se realiza mediante dos pruebas cualitativas coloreadas.4 El piruvato generado reacciona con 2,4.dinitrofenilhidrazina para formar dinitrofenilhidrazona, de color amarillo, con una absorbancia que puede ser medida a 505nm.5 La reaccin del piruvato con nitroprusiato de sodio da como resultado un anillo de coloracin verde o azul en la
2

interfase.4 El cido tricloroactico es anchamente utilizado en bioqumica para la precipitacin de macromolculas tal como protenas, ADN y RNA.5

Figura 1. Levadura Saccharomyces cerevisiae.

Procedimiento El mtodo cientfico empleado para el anlisis cualitativo de cido pirvico y la produccin del mismo fue el proporcionado segn la Ctedra de Qumica Orgnica, con las siguientes modificaciones: Por falta de los reactivos Na2HPO4 y KH2PO4 al 10% necesarios para la suspensin de la levadura, la incubacin de la misma con la glucosa se dio en forma dividida entre los compaeros de clase, posteriormente los resultados fueron compartidos.

Resultados Obtenidos Cuadro 1. Anlisis Cualitativo de la serie A, disoluciones de glucosa con levadura suspendida en Na2HPO4.
Serie A Reaccin nitroprusiato sodio + ++ +++ con de Reaccin con 2,4dinitrofenilhidracina + ++ +++ (+) = prueba positiva

Cody, Boctor, Filley, Hazen, Scott, Sharma, Yoder Jr., Master. Primordial Carbonylated Iron-Sulfur Compounds and the Synthesis of Pyruvate. 3 Starr, Taggart. Biologa, la unidad y la diversidad de la vida. 4 Melo V, Cuamatzi O. Bioqumica de los procesos metablicos. 5 Bennington. Diccionario Enciclopdico del Laboratorio Clnico.

Glucosa 0,5% Glucosa 1% Glucosa 2%

3
Cuadro 2. Anlisis Cualitativo de la serie B, disoluciones de glucosa con levadura suspendida en KH2PO4.
Serie B Reaccin nitroprusiato sodio + ++ +++ con de Reaccin con 2,4dinitrofenilhidracina + ++ +++ (+) = prueba positiva

Conclusiones La gluclisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a Etanol y CO 2, y/ a cido lctico dependiendo del organismo que lo efecte, como siendo en el primer caso las levaduras las responsables. Los metabolitos piruvato y acetaldehdo se encuentran presentes normalmente en muy baja concentracin, por lo tanto, para demostrar su existencia como intermediarios en el camino metablico, es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Esto se puede realizar bloqueando la enzima que cataliza la conversin del compuesto que se est investigando mediante inhibidores, Cambiando las condiciones fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad mxima o usando un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse. La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reaccin con nitroprusiato de sodio o 2,4 dinitrofenilhidrazina. Bibliografa (1) G.J. Tortora, B.R. Funde, C. L. Case. 2007. Introduccin a la microbiologa. 9 Edicin. Mdica Panamericana. Buenos aires; Argentina. pp. 127, 137. (2) G. D. Cody, N. Z. Boctor, T. R. Filley, R. M. Hazen, J. H. Scott, A. Sharma, H. S. Yoder Jr., D. Master. 2000. Primordial carbonylated iron-sulfur compounds and the synthesis of pyruvate. 2 Edicin. Science, 289. New York, Estados Unidos. pp. 1337-1340. (3) C. Starr, R.Taggart. 2007. Biologa, la unidad y la diversidad de la vida. 11 Edicin. Editorial Thomson. Mxico, D.F., Mxico. pp 542. (4) Melo V, Cuamatzi O. 2007. Bioqumica de los procesos metablicos. 2 Edicin. REVERT. Mxico. pp 147-166. (5) T. Bennington. 2000. Diccionario Enciclopdico del Laboratorio Clnico. Editorial Mdica Panamericana. Espaa. pp. 55, 78.

Glucosa 0,5% Glucosa 1% Glucosa 2%

Discusin de Resultados Se puede deducir, con las observaciones determinadas en clase, que se procedi adecuadamente la reaccin de fermentacin, debido a que se observ la presencia de burbujas durante el proceso, mostrando con esto la formacin de CO 2, un producto de la misma. Analizando los resultados obtenidos segn los cuadros 1 y 2, se destaca que todas las pruebas dieron positivas, generndose un color ms intenso conforme se aumenta la concentracin de glucosa en disolucin, esto para ambas reacciones cualitativas llevadas a cabo (ver anexos). Al aumentar la concentracin de glucosa en las muestras se da una mayor produccin de piruvato por parte de la levadura, arrojando resultados ms notorios en las reacciones cualitativas. Tambin algo a resaltar es que en la serie B, se gener una coloracin menos intensa que en la serie A, esto debido a que el fosfato cido de potasio es ms cido, que el sulfato cido de sodio, conllevando con esto, a que el medio de la disolucin de la serie A es un medio ms bsico que el de la serie B, y debido a que la enzima piruvato descarboxilasa se inhibe o inactiva su accin en medio bsico, esta se encuentra menos inactiva en la serie A, por lo que en esta serie habr una mayor concentracin y acumulacin de cido pirvico.

Anexos

Figura 2. Resultado experimental reacciones con nitroprusiato de sodio, y 2,4-dinitrofenilhidracina, para la serie A.

Figura 3. Resultado experimental reacciones con nitroprusiato de sodio, y 2,4-dinitrofenilhidracina, para la serie B.