Manual de Bacteriologia

NDICE CAPTULO I INTRODUCCIN ................................................................................................... 2 CAPTULO II REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA ................................ 3 CAPTULO III PRCTICAS DE LABORATORIO.
1 SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS ..................................................... 4 2 FLORA NORMAL.............................................................................................. 10 3 BIOFILMS. OBSERVACIN IN VIVO Y FORMACIN IN VITRO. ................... 15 4 GNERO STAPHYLOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN. ........... 19 5 GENERO STREPTOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN .............. 26 6 CULTIVO DE EXUDADO FARNGEO. ............................................................. 37 7 UROCULTIVOS. ............................................................................................... 40 8 COPROCULTIVOS. .......................................................................................... 47 9 GENERO PSEUDOMONAS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN .................. 55 10TINCIN DE ZIEHL NEELSEN......................................................................... 61 11EXUDADOS GENITALES. OBSERVACIN DE PREPARACIONES ............... 66 12CANDIDA ALBICANS. IDENTIFICACIN. ....................................................... 73 ANEXO 1. TABLA DE SEPARACIN Y ELIMINACIN DE RPBI
MANUAL DE PRCTICAS DE BACTERIOLOGA CLNICA 2010
CAPTULO I
INTRODUCCIN. Los experimentos de este manual se han seleccionado para dar al estudiante de Bacteriologa Cnica el conocimiento de las tcnicas bsicas sus caractersticas. Se le usadas en el laboratorio clnico. Estos ejercicios familiarizarn al estudiante con algunos microorganismos comunes as como de padecimientos infecciosos ms comunes. Cabe hacer notar que con el contenido de este manual no se espera cubrir todas las tcnicas que se llevan a cabo en un laboratorio de bacteriologa clnica sino solo aquellas ms comunes permitidos por los recursos e infraestructura de la facultad. presentan tambin algunos procedimientos de rutina utilizados en el diagnostico
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CAPTULO II REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA. 1. El uso de bata con manga larga y hasta la rodilla es obligatoria para todo trabajo en el laboratorio. 2. El uso de guantes y cubre bocas es requerido para algunas prcticas y en todo caso se debern usar de acuerdo a las instrucciones de uso provistas por el maestro. 3. Fumar, comer o tomar cualquier alimento, no est permitido en el laboratorio. 4. Mantenga sus dedos, lpices y papeles fuera de su boca (no corte el masking- tape con los dientes). 5. No deben aplicarse cosmticos dentro del laboratorio. 6. Las mesas de trabajo deben limpiarse antes y despus de cada sesin con fenol al 5 %. 7. Todo residuo peligroso y no peligroso debe eliminarse en el lugar indicado de acuerdo a la tabla de RPBI (ver anexo). 8. No se debe lavar material sin antes preguntar al maestro. 9. Es indispensable lavarse las manos antes de salir del laboratorio. 10. Todos los cultivos deben marcarse como mnimo con: Nmero de equipo, Gnero y especie del microorganismo sembrado. 11. Los accidentes de laboratorio como son: quemaduras, cortadas o derramar un medio de cultivo inoculado deben reportase inmediatamente al maestro. De todos los errores posibles, no reportar cualquier accidente al maestro es el ms serio.
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CAPTULO III. PRCTICAS 1 SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
OBJETIVO: Al finalizar esta prctica el alumno ser capaz de realizar e interpretar la prueba de difusin en placa para evaluar la sensibilidad bacteriana in Vitro. GENERALIDADES: Los antimicrobianos para ser utilizados en la conceptos como son: Concentracin mnima inhibitoria (CMI), es la concentracin ms baja en la que un frmaco inhibe el crecimiento bacteriano visible. (Levinson, 2004) Concentracin mnima bactericida (CMB) que ser la concentracin del frmaco que va a eliminar el microorganismo en un 99.9 %. (Levinson, 2004) Algunas de las caractersticas de los frmacos radican en que existen de forma natural, sinttica semisinttica, poseen eficacia antibacteriana, algunos producen toxicidad si estn en exceso, y otros tienen actividad bactericida ms que bacteriosttica por lo siguiente: los bactericidas matan las bacterias que estn en fase activa, Cuando fase de reposo y algunas veces inhiben el crecimiento CMI . microbiano por lo tanto tienen una CMB igual similar a la terapia
necesitan ser sometidos a un antibiograma, por ello es preciso entender diversos
son exclusivamente bacteriostticos logran la destruccin bacteriana
finalmente con la ayuda de las defensas del hospedero por que tienen una CMB superior a la CMI. (Libana, Allen y Janda, 2002) En el momento en que un microorganismo no es inhibido por el antibitico es porque tiene la capacidad para modificar su estructura gentica como una barrera para evitar el dao que le puedan causar, y lo hacen disminuyendo su permeabilidad celular para impedir que penetre el antibitico, inactivan las enzimas (por ejemplo los Beta lactmicos) y a la vez fabrican otras que cambien la configuracin molecular de el agresor, modifican el sitio de interaccin de ste para que se pierda afinidad frmaco/bacteria. (Brooks, Butel y Morse., 2002)
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La metodologa ms utilizada para la valoracin in vitro de los antimicrobianos es Difusin en agar por el mtodo de Kirby Bauer que adems de ser rpida es muy sencilla y especfica, es aplicable a una amplia variedad de bacterias aerobias no exigentes de crecimiento rpido como Enterobacteriaceae y Pseudomonas sp, entre otras. Fundamento: Un disco de papel filtro que contiene una cantidad precuantificada de un frmaco se coloca en la superficie del medio, hace contacto con la humedad de ste y absorbe el agua, difundiendo en el agar formado un gradiente de concentracin, despus del periodo de incubacin los discos aparecen rodeados por una zona clara, que es la potencia de inhibicin. La concentracin de antibitico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentracin crtica y se aproxima a la CMI obtenida por mtodos de dilucin. (Picazo, 2000). La actividad in vitro puede variar por diversos factores de acuerdo a las siguientes tablas:
CAUSAS DE LA VARIACIN Bajo inculo Volumen insuficiente de medio de cultivo Sobrecarga del disco Alto inculo Volumen excesivo del medio de cultivo Inactivacin de la droga en los discos Discos vencidos Exceso de timina y timidina en el medio de Trimetroprim-sulfametoxazol: Disminucin del cultivo. Se corrige con el agregado (5 % tamao de la zona y/o aparicin de colonias v/v) de sangre lisada de caballo, rica en internas. timina fosforilasa. Disminucin general de las zonas de inhibicin. inhibicin. EFECTO OBSERVADO Agrandamiento general de las zonas de
(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI, 2004)
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CAUSAS DE LA VARIACIN Exceso de contenido
++
EFECTO OBSERVADO Tetraciclinas, quinolonas fluoradas, colistina o aminoglucsidos: Disminucin de las zonas, especialmente aeruginosa. frente a Pseudomonas
de
cationes
divalentes: Ca
y Mg
++
Escaso contenido de cationes divalentes pH menor a 7.2 pH menor a 7.2
Aumento de las zonas de inhibicin. Aminoglucsidos, macrlidos: Disminucin de las zonas de inhibicin. Penicilinas y Tetraciclinas: Aumento de las zonas de inhibicin.
(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI, 2004) Sensible indica que la infeccin ocasionada por la cepa para la que se ha determinado el halo de inhibicin puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en funcin del tipo de infeccin y de la especie considerada. (Picazo, 2000) Intermedio indica que el halo de inhibicin traducido en valores de CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clnica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (por ejemplo: orina) o cuando se emplean dosis ms elevadas de lo habitual. Tambin incluye en esta categora aquellos casos de antimicrobianos con mrgenes de toxicidad estrechos en los que pequeos errores tcnicos podran suponer cambios de interpretacin en la categora clnica. (Picazo, 2000) Resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de resistencias especficos para el agente estudiado en los que no ha habido una adecuada ha usado respuesta como clnica cuando se el tratamiento
correspondiente antimicrobiano. (Picazo, 2000)
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Existen otras tcnicas para determinar susceptibilidad como las pruebas de macro y microdiluciones (agar caldo), cada una de las cuales utilizan diluciones del antibitico en el agar sobre la cepa problema y tras subcultivar se determinan cuantitativamente las concentraciones antes mencionadas. (Libana et al. 2002) La prueba Epsilon E-Test tiene buena reproducibilidad, ya que despus de inocular la bacteria e incubar, se formar una elipse en el agar por accin de una tira de uno o varios antibiticos y ser el pico mximo de inhibicin. Al realizar el nivel bactericida del suero el de actividad bactericida para Endocarditis. que Si el utilizamos mtodo es similar al de contra automatizado microdiluciones, slo que las diluciones son del suero, aqu se valora el pico tratamiento un antibiograma
es ms rpido, pero es muy costoso, se utilizan microplacas con pozos en U permiten una lectura en forma visual de las pruebas bioqumicas frente al panel de antibiticos. (Libana et al. 2002, Picazo 2000) DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: Se realiza una tcnica que permite obtener un halo de inhibicin medible para determinar categoras de susceptibilidad que puede ser relacionada con las tablas a la CMI. MATERIAL: Material por equipo de 4: 6 placas de Agar Mller Hinton 1 pinza para sensidiscos 2 mecheros 6 tubos con 2 ml de solucin salina estril (con boca amplia para que entre un hisopo) 6 hisopos estriles Cepas para cada equipo: 1 tubo con E. coli 1 tubo con S. aureus 1 tubo con P. mirabilis Sensidiscos disponibles con antibiticos
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METODOLOGA: DIFUSIN EN AGAR (MTODO DE KIRBY BAUER) 1. Preparacin del inculo: Tomar 2 a 3 colonias aisladas y ajustar a una turbidez de 0.5 de la escala de MacFarland en solucin salina estril. Agitar durante 1520 segundos. 2. Tomar el inculo con un hisopo estril y eliminar el exceso del mismo rotando varias veces en la pared del tubo. Inocular en placas Mller-Hinton por la superficie del agar tres veces, rotando la placa unos 60 cada vez y pasndola por ltimo por la periferia del agar, se deja absorber el inculo de 3 a 5 minutos. 3. Colocar los discos con pinza estril presionando ligeramente sobre la superficie, colocarlos a no menos de 15 mm del borde de la placa, y evitar la superposicin. Para placas de 150 mm no se emplearn ms de 12 discos y para las de 100 mm no ms de 6. 4. Incubar las placas de 16 a 18 hrs. a 35C antes de que transcurran 15 minutos (Si el microorganismo es un estafilococo o un enterococo debemos esperar 24 horas para asegurar la sensibilidad a la oxacilina y vancomicina) Interpretacin: Leer el dimetro de las zonas de completa inhibicin con una regla midiendo de un extremo a otro del halo pasando por el centro del disco. 1. En medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa. 2. En medios con sangre se miden sobre la superficie del agar. El tamao de la zona es comparable con estndares para determinar sensibilidad de acuerdo al Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Si hay colonias dentro del halo de inhibicin pueden ser mutantes resistentes, contaminaciones, conviene volver a realizar el ensayo. Regla general: No se consideran las colonias diminutas que aparecen en el halo de inhibicin y que han sido visualizadas mediante luz transmitida, excepto Staphylococcus vancomicina. resistenes a oxacilina Enterococcus resistentes a poblaciones heterogneas o cultivos mixtos y
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RESULTADOS: Se llenar la utilizados.
siguiente tabla de acuerdo a los
antibiticos
Microorganismo: Antibitico Halo (mm) Criterio (S,R,I)
AUTOEVALUACIN. Menciona porque razones un halo grande no implica forzosamente mayor sensibilidad al antibitico probado. Explique por qu la Concentracin Mnima Inhibitoria y la concentracin letal mnima son iguales para antibiticos bactericidas y no para antibiticos bacteriostticos. REFERENCIAS. Brooks, G.F., Butel J.S. y Morse S.A. (2002). Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Mxico: Manual Moderno, CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. (2004). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility- Testing. Volumen 4. # 1 Levinson, W., (2004) Microbiologa e inmunologa mdicas (8 Edicin) Espaa: McGrawHill, Libana, U. J., Allen, S.D., Janda M. W (2002). Microbiologa oral (2 Edicin) Espaa: McGrawHill. Picazo J. J (2000) Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica. Protocolos Clnicos. Mtodos bsicos para el estudio de sensibilidad a los antimicrobianos. Recuperado el 15 de julio de 2009 en http://www.seimc.org/
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FLORA NORMAL
OBJETIVO: El alumno aprender a reconocer los diferentes microorganismos existentes como flora normal de diversas regiones anatmicas. GENERALIDADES: La microflora normal es un trmino que se le da al conjunto de bacterias que pueden ser localizan en residentes permanentes transitorias y se la superficie o interior de casi todas las zonas orgnicas del
hospedador sano en contacto con el exterior, y que en conjunto establecen un equilibrio. Si dicho equilibrio se rompe se desencadenan una serie de procesos perjudiciales. La flora normal generalmente se compone por bacterias y levaduras. (Libana Allen y Janda, 2002; Prats, 2006) Cuando es residente autctona, las bacterias se adaptan a su medio externo y si ste es adecuado permanecen por meses o aos. En su fase de Transitoria transunte, es eliminada despus de un tiempo en que las condiciones le favorecieron, y sta puede volver al ciclo de la primera cuando aparecen o desaparecen las condiciones del medio. (Libana et al. 2002) Los miembros de la flora tienen baja virulencia es decir, baja patogenicidad pero slo en su localizacin anatmica inicial, cuando abandonan sta ocurre lo contrario. Tienen su origen desde el nacimiento, los primeros microorganismos aparecen desde el canal del parto a piel, fosas nasales, etc. (E. coli primera que se instala en el intestino del neonato), externo, adems de factores sustancias inhibitorias, endgenos como es la posteriormente otros celulares
aparecen por factores exgenos como el estado nutricional y el ambiente receptores en semanas queda establecida una microbiota casi
como en el adulto. (Nowrouzian, Hesselmar y Saalman 2003) En la prctica se conocern miembros importantes de la microflora normal de algunas zonas anatmicas que difieren en nmero y tipo de acuerdo a su localizacin y que causan alteraciones cuando hay sobrecrecimiento de ellas, por ejemplo; causar en piel se encuentra Staphylococcus epidermidis (que puede
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infecciones en vlvulas cardiacas prtesis), tambin cndida se encuentra en piel o mucosas, sin embargo, si el medio ambiente dentro de la boca o la Cuando esto garganta entra en desequilibrio, el hongo puede multiplicarse.
sucede, aparecen sntomas de la candidiasis tambin conocida como muguet candidiasis orofarngea, el Staphylococcus aureus es menos frecuente en piel, y muy predominante en nariz, la flora de la boca y garganta la constituyen los Streptococcus del grupo viridans, el clon tiene mayor nmero de flora normal porque posee tanto bacilos y cocos gram positivos como gram negativos, y fuera del clon las ms virulentas son: Escherichia coli y Enterococcus fecalis. (Levinson, 2004., Nowrouzian et al. 2003) Es importante conocer la flora normal de stas diversas regiones para posteriormente identificar si un microorganismo procedente de una muestra de un paciente es realmente el agente causal de alguna enfermedad (Libana et al. 2002) DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: Una vez obtenidas las muestras se realiza un aislamiento de bacterias procedentes de diversas regiones a estudiar en varios medios de cultivo, seguido de la observacin microscpica directa por tincin, posteriormente se incuban los medios de cultivo para observar la bacteriana correspondiente a lo visto en el microscopio. MATERIAL: Por equipo de 4 a) Morfotipos por regin: Nariz, Faringe, Intestino, Piel. 1 equipo para tincin de Gram (Puente de tincin y colorantes) 2 microscopios 8 Portaobjetos 4 hisopos estriles 2 abatelenguas estriles 2 mecheros 1 asa 4 tubos de solucin salina estril morfologa
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b) Microorganismos por regin: Nariz, Faringe, Intestino, Piel. 4 placas de Agar de MacConkey 4 placas de Agar de Sal y Manitol 4 placas de Agar Sangre 4 placas de Agar de Biggy 4 hisopos estriles 2 abatelenguas estriles 2 mecheros 2 tubos de solucin salina estril
METODOLOGA: TOMA DE MUESTRAS. NASAL
1. Pasar el hisopo estril a travs de la nariz suavemente, hay que mantenerlo cerca del septum y suelo de la fosa. Rotar el hisopo y extraerlo. 2. Realizar un inculo en un extremo de cada uno de los medios de cultivo y posteriormente en rea estril estriar masivamente cada medio. 3. Con otro hisopo se realiza un extendido directo para tincin de Gram, observar al microscopio. 4. Incubar las placas a 37C de acuerdo a la tabla 1 y observar. FARNGEA
1. Colocar al paciente sentado con la cabeza ligeramente hacia atrs, con la ayuda de un abatelenguas, se hace presin sobre la lengua, con el hisopo estril tomar una muestra de la faringe posterior. (no tocar la mucosa oral, lengua o vula). Realizar los pasos 2 a 4 anteriores. PIEL 1. Tomar un hisopo estril e introducirlo en un tubo con solucin salina estril, eliminar el exceso de ste, se elige una zona que no tenga mucho contacto con el exterior y tomar la muestra frotando varias veces el mismo sitio. Realizar los pasos 2 a 4 iniciales. INTESTINO (HECES FECALES) 1. Con un hisopo estril, tomar una pequea cantidad de las heces, hacer una suspensin en el tubo con solucin salina estril, eliminar el exceso y realizar un inculo en cada uno de los extremos de los diferentes medios, sembrar por
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estra masiva en rea estril. Realizar un frotis a partir de la suspensin del punto anterior, realizar tincin de Gram y observar. 2. Incubar las placas a 37C de acuerdo a la tabla 1 y observar. Interpretacin: Se observar la morfologa colonial de cada una de las regiones. Medios de cultivo utilizados y morfologa colonial. Tabla 1 Medio de Cultivo Agar MacConkey Microorganismos que crecen y Caractersticas coloniales Enterobacterias, colonias rosas, lactosa (+). Enterobacterias, lactosa (-). Pseudomonas, colonias incoloras Lactosa (-). Agar Sal y Staphylococcus, colonias con halo amarillo, manitol +. Streptococcus alfa hemolisis y beta Beta 24 horas hemlisis. Alfa hemlisis: zona de color verde alrededor de las colonias. alrededor de las colonias. Agar Biggy Candida: Colonias lisas, cremosas o color caf. AUTOEVALUACIN: Explica porqu los resultados del examen microscpico no coinciden totalmente con los aislamientos obtenidos en los medios de cultivo. Hay concordancia entre los gneros bacterianos aislados como flora normal en esta prctica y los reportados en la literatura?, Cuales son las excepciones? 48 horas hemlisis: zona de color amarillo claro 24 horas Manitol Agar Sangre colonias transparentes Tiempo de Incubacin 24 horas
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REFERENCIAS: Libana, U. J., Allen, S.D., Janda M. W. (2002) Microbiologa oral (2 Edicin) Espaa: McGrawHill. Levinson, W., (2004) Microbiologa e inmunologa mdicas (8 Edicin) Espaa: McGrawHill, Nowrouzian F., Hesselmar B., Saalman R. y Escherichia coli in Infants Intestinal colaboradores (2003). Colonization Rate, Microflora:
Strain Turnover, and Virulence Gene Carriage, Resumen objetivo elaborado por el comit de redaccin cientfica de la sociedad iberoamericana de informacin cientfica en base al artculo original completo, publicado por la fuente editorial Recuperado 2009 en: del 18 de julio de
http://www.bago.com/BagoArg/Biblio/gastroweb198.htm. Prats G. (2006) Microbiologa clnica. Madrid: Panamericana.
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BIOFILMS. OBSERVACIN IN VIVO Y FORMACIN IN VITRO.
OBJETIVO: El alumno comprender el fenmeno de adherencia bacteriana y biofilms mediante la observacin de adherencia in vivo biofilm in Vitro. GENERALIDADES: Biofilms es un fenmeno que presentan comunidades clulares procariticas y/ eucariticas de naturaleza heterognea, que debido a las condiciones del medio al que van a colonizar, se presentan envueltas en una matrz de extrapolisacridos, y juntas forman una biopelcula en una superficie, ya sea en el medio ambiente, tejidos blandos del ser humano (placa dental y tejido intestinal), en superficies lisas (prtesis, catter). (Gamazo, Lpez y Daz 2005) 1.- La primera etapa para su formacin es la absorcin hacia la superficie, y la logran en cuestin de segundos por interaccin de las fuerzas electrostticas de Van der Wals, la cual puede ser reversible 2.- La segunda etapa es la adhesin, en la cual gracias a su composicin qumica y estructural como el glucoclix y pilis, en minutos logran la unin a la superficie. 3.- En algunas horas das empieza el crecimiento y divisin bacteriana. 4.- Empiezan a formar la matrz que los mantendr unidos por la produccin de sustancias polimricas extracelulares EPS, las cuales estn compuestas de azcares como N- acetil glucosamina, fructuosa, galactosa, etc. gracias a los que las bacterias pueden atrapar partculas orgnicas y precipitar. 5.- En su etapa final de Desarrollo hay atraccin de otros colonizadores de diversidad biolgica para formar ya el agente activo que ser el biofilms, en horas meses, ya formada la biopelcula sta slo puede cambiar de forma y tamao, mas no de composicin porque sta es irreversible. Dada su complejidad estructural, podr tener acceso a nutrientes que el medio les proporcione. (Douthwright, Delisle y Eidemiller, 2000) En la presencia in vivo de el biofilms activo radica la importancia de la resistencia a algunos antimicrobianos, y su demostracin in vitro ayuda a la comprensin de la complejidad estructural de stos para la terapia. Gracias a que y la formacin de un
las bacterias sufren cambios fenotpicos en el biofilm, presentan tambin una

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constante fuente de inculo porque son capaces de formar mbolos que diseminen hacia va sangunea y permitan la colonizacin de otros patgenos hasta finalmente llegar a lo es estado de sepsis. Como ejemplo en infecciones intrahospitalarias tenemos la presencia de un microorganismo muy virulento como Staphylococcus epidermidis, en punta de catter intravascular y otros S.aureus, y el ms comn, causante del 30 % de como Enterococcus sp,
muertes por infecciones nosocomiales, Pseudomonas aeruginosa asociado con neumonas, infecciones del tracto urinario, y en un 60 % en heridas de quemados (Gamazo, et al. 2005; Van Delden e Iglewski 1998) DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: El primer da se realiza una observacin microscpica de clulas de descamacin procedentes de un raspado de la mucosa oral para demostrar la adherencia bacteriana a las clulas, siguiendo con la demostracin de la formacin de un biofilms similar a la placa dental a partir de una muestra de saliva que se observar microscpicamente. MATERIAL: Da 1 Observacin de biofilms. Por alumno: 1 abatelenguas estril 2 portaobjetos Por equipo de 4: Equipo para tincin de Gram 1 microscopio 1 gotero con aceite de inmersin Formacin de placa dental in Vitro. Por alumno: 1 tubo 15x 150 estril 1 pipeta estril de 1 ml 1 tubo 25x150 con 10 ml de caldo de Soya y Tripticaseina suplementado con 5% de sacarosa y 0.2% de extracto de levadura con un portaobjeto adentro. Mechero Fecha
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Da 2 Por alumno: Mechero 2 portaobjetos Pinzas de diseccin Reactivos para tincin de Gram Tubos 25x150 inoculados en la clase anterior
Fecha
METODOLOGA: OBSERVACIN DE ADHERENCIA EN CLULAS BUCALES 1. Raspar la parte interna de la mejilla con un abatelenguas y depositar la muestra cuidadosamente en el centro del portaobjetos. 2. Dejar secar la preparacin y teir con tincin de Gram. 3. Observar en objetivo de inmersin. Interpretacin: La adherencia de bacterias solas formando microcolonias, se observa sobre las clulas epiteliales. FORMACIN DE PLACA DENTAL IN VITRO 1. En un tubo estril recolectar saliva de cada alumno. Dejar el tubo en reposo unos minutos para que las burbujas de aire desaparezcan. 2. Inocular el tubo 25x150 (que tiene un cubreobjetos en su interior) con 1 ml de saliva utilizando una pipeta estril. Incubar a 37 C por 72 horas. Despus de la formacin del biofilm in vitro: 1. Vaciar el caldo del tubo en el matraz para desechos provisto por el maestro para el grupo. 2. Con unas pinzas sacar el cubreobjetos y dejar secar al aire libre. 3. Realizar tincin de Gram sosteniendo el cubreobjetos con las pinzas y cuidando de no perder cual es el lado en que se hizo la tincin. 4. Pegar con lpiz adhesivo el cubreobjetos en el centro de un portaobjetos limpio y observar en objetivo de inmersin.
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Interpretacin. Se observan los microorganismos principalmente Streptococcus formando una capa bastante homognea sobre el cubreobjetos. AUTOEVALUACIN: Cules seran dos ejemplos de infecciones bacterianas relacionadas con la formacin de biofilms? Adems de los procesos infecciosos, en que otras reas de la ciencia son importantes los biofilms?, mencione un ejemplo para cada caso que refiera. REFERENCIAS: Gamazo C., Lpez G., Daz R., (2005) Manual prctico de Microbiologa (3 edicin) Barcelona, Espaa: Masson. Douthwright J., Delisle, G., Eidemiller B., (2000) American Society for Microbiology. On-Line Biofilms Laboratory Manual. A Manual of Biofilm related exercises. Recuperado 2009.Disponible en: http://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jel5/biofilms/ Van Delden, C & Iglewski H. B. (1998). Centers for Disease Control and Prevention. Emerging infectious diseases. Cell-to-Cell Signaling and en: Pseudomonas aeruginosa Infections. Disponible el 21 de septiembre de
http://www.cdc.gov/ncidod/eid/vol4no4/vandelden.htm
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GNERO STAPHYLOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN.
OBJETIVO: El alumno conocer las caractersticas ms importantes del gnero Staphylococcus as como la diferenciacin de las especies ms significativas en el rea clnica. GENERALIDADES: 1. Caractersticas del gnero: Son Microorganismos inmviles, carecen de flagelos y no forman esporas, presentan una forma esfrica, agrupados en forma de racimo de uvas, miden de 0.5 a 1 um, clasificados como Gram positivos y no presentan endosporas. Es un fuerte productor de catalasa, la cual los diferencia de los Streptococcus. Como la mayora de los Gram positivos son oxidasa negativa. (Murray, Rosethal y Kobayashi; 2002) 2. Especies de importancia clnica: Aunque existen ms de 30 especies y 17 subespecies del gnero que difieren en virulencia y caractersticas bioqumicas, los microorganismos que S. epidermidis enfermedades y S. sistmicas, ms se aslan son saprophyticus. infecciones Tienen en piel, Staphylococcus aureus, amplio tejidos, espectro huesos en etc.
Staphylococcus aureus es el ms patgeno y la causa ms frecuente de bacteremia adems de ser la nica especie en humanos que produce la enzima coagulasa. Sus factores estructurales de virulencia ms importantes son la presencia de cpsula y pptidoglucano (Murray et al. 2002) 3. Algunos de los principales medios para su aislamiento son los siguientes:
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Tabla 1. Medios de cultivo para Staphylococcus.
MEDIO DE CULTIVO
COMPONENTE QUE LOS HACE SELECTIVOS
COMPONENTE QUE LOS HACE DIFERENCIAL
CARACTERSTICAS DE LAS COLONIAS
Colonias medianas, blancas, cremosas con AGAR SANGRE brillo. Colonias amarillo dorado. Pueden presentar hemlisis beta SAL Y MANITOL Cloruro de sodio al 7.5 % Rojo de fenol y Manitol Colonias amarillas o blancas con halo amarillo, manitol (+) Colonias blancas amarillas rodeadas de una zona sin cambio de color rojo ms intenso, manitol (-) VOGEL JOHNSON CON TELURITO POTSICO 1% AL Cloruro de litio y Glicina Telurito potsico Telurito potsico (Se reduce a Teluro de potasio) Colonias pequeas color gris a negro sin Rojo de fenol y Manitol cambio de color rojo ms intenso Manitol (-) Colonias pequeas de color negro con halo amarillo Manitol (+)
Las pruebas bioqumicas claves para la identificacin son las siguientes: Coagulasa en tubo: Es la prueba para separar a los Staphylococcus coagulasa positiva como S. aureus de los coagulasa negativa que incluye principalmente a S. epidermidis y S. saprophyticus coagulasa pero son ms de 30 especies, en sta que al entrar en contacto con el tcnica se visualiza la capacidad de la bacteria de coagular el plasma, por la accin de la enzima fibringeno cogulo. (Prats, 2006) Prueba de la DNAsa: Permite diferenciar bacterias que poseen la enzima activa la coagulacin del plasma, detectada visiblemente como un
desoxirribonucleasa de aquellas que no la poseen. Su fundamento se basa en la deteccin de la enzima termoestable capaz de despolimelizar enlaces fosfodister del DNA. La hidrlisis del DNA se detecta mediante la formacin de un halo
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alrededor del crecimiento y es una prueba que se correlaciona perfectamente con la coagulasa por lo tanto sirve para identificar al S.aureus. (MacFaddin, 2003) Susceptibilidad a la novobiocina: Esta prueba sirve para identificar a S. saprophyticus y se basa en determinar la sensibilidad resistencia a la novobiocina (disco de 5 epidermidis (Sensible), y microgramos) con lo cual se diferencian S. aureus (Sensible), de S. S. saprophyticcus
(Resistente). (Murray et al. 2002) DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: 1 parte. Se inoculan las cepas conocidas en cada uno de los medios provistos, despus de incubar se observa y compara las caractersticas en el crecimiento de cada uno de los medios sembrados completando la tabla 2 con la morfologa observada, posteriormente se realiza la tincin de Gram de las colonias aisladas para observar y comparar la morfologa. 2 Parte. Se montan pruebas de identificacin de acuerdo a las tcnicas
descritas y se anotan los resultados en la tabla 3 para discutirlos en grupo. MATERIAL: (Por equipo de 4) 1 PARTE 3 placas de agar de Vogel-Johnson (agregar antes de vaciar Telurito Potsico al 1 %) 3 placas de de Agar Sangre 3 placas de Agar de Sal y Manitol 2 mecheros 3 portaobjetos 2 asas bacteriolgicas 1 puente de tincin 1 tubo de S. aureus 1 tubo de S. epidermidis 1 tubo de S. saprophyticus Equipo para tincin de Gram Microscopio (checar con el maestro si se usara en esta o la prxima sesin)
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2 PARTE. Tubo 0.5 de la escala de Macfarland 2 tubos 13x100 (rosca) estriles 3 tubos con caldo manitol y rojo de fenol adicionados de 7.5% de NaCl. 1 placa de agar para Dnasa con 0.1g por litro de Verde de Metilo. 1 placa de Agar de Muller Hinton 1 asa bacteriolgica Discos de Novobiocina (5 ug) 1 pinzas de diseccin 2 portaobjetos 2 tubos con sol. Salina estril 2 hisopos 1 pipeta de 1 ml estril 1 gradilla 2 microscopios y aceite de inmersin 2 mecheros
METODOLOGA: AISLAMIENTO 1.- Sembrar a partir de las cepas proporcionadas por estra cruzada una placa de cada medio para cada especie de microorganismo. 2.- Incubar 48 horas a 35-37C 3.- Observar y anotar los resultados en la tabla 2 y agrupacin microscpica. COAGULASA EN PORTAOBJETOS Preparar una suspensin gruesa y bien homognea de cada microorganismo en solucin salina estril. Colocar una gota de la suspensin y una gota de plasma humano o de conejo sobre un el asa y despus por rotacin. Interpretacin. Positivo: Aglutinacin macroscpica entre 5 a 20 segundos. La prueba es Negativa si la aglutinacin no ocurre dentro de los 3 a 4 minutos. NOTA: La prueba de la coagulasa en portaobjetos detecta slo coagulasa unida a los Staphylococcus por lo que es un procedimiento presuntivo (10-20% portaobjetos, mezclar suavemente con TINCIN DE GRAM
Efectuar una tincin de Gram de cada especie y comparar su morfologa
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de los S, aureus dan resultado negativo) y todo resultado retardado (arriba de 20 segundos) o negativo debe ser confirmado por la prueba en tubo. COAGULASA EN TUBO 1. Hacer un pool de plasma citratado y pipetear con pipeta estril 0.5 ml en un tubo de 13 x 100. 2. Tomar una asada de una varias colonia aisladas y mezclar suavemente el tubo. 3. Incubar a 35C 4 a 6 horas (ir observando cada 30 minutos) inclinndolo suavemente. Interpretacin: Positivo: Cogulo completo parcial. Negativo: La suspensin permanece homognea. PRUEBA DE LA DNAsa 1. Elegir una colonia caracterstica de Staphylococcus, inocular en forma de estra en una placa de agar para DNAsa con verde de metilo. 2. Incubar 18 horas a 35 C y observar Interpretacin:
Positivo: Halo transparente alrededor de la siembra (DNA hidrolizado). El tamao de la zona es proporcional a la DNAsa producida. Negativo: Sin cambios en el color del medio. Precipitado nebuloso alrededor del medio debido a las sales precipitadas (DNA no hidrolizado).
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SUSCEPTIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA 1. Preparar una suspensin de cada cepa y ajustar de acuerdo al tubo 0.5 de Macfarland e inocular con un hisopo en agar de Mller Hinton por estra masiva en forma vertical, horizontal y diagonal, con la pinza flameada colocar los discos con 5 g de Novobiocina. 2. Incubar de 16 a 18 hrs. a 35 C y observar. Interpretacin: Halo < a 16 mm (S. saprophyticcus), Halo > a 16 mm (otros Staphylococcus) RESULTADOS: Tabla 2 Morfologa colonial.
Cepa S. aureus Agar Sangre Sal y Manitol Vogel johnson
S. epidermidis
S. saprophyticus
Tabla 3 Pruebas de Identificacin.

S. aureus Agrupacin microscpica Manitol y rojo de fenol S. epidermidis S. saprophyticus
Coagulasa DNasa Novobiocina
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AUTOEVALUACIN: Cules seran las pruebas mnimas que recomendara para lograr identificar la mayora de las especies de Staphylococcus de importancia clnica? Mencione dos o tres especies de Staphylococcus coagulasa negativa diferentes de S.epidermidis que se aslen de procesos infecciosos nosocomiales: REFERENCIAS: MacFaddin, J. F. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica (3 edicin) Madrid, Espaa: Panamericana. Murray, P. R; Rosethal K. S y Kobayashi G. S. (2002) Microbiologa mdica. (4 edicin) Madrid, Espaa: Mosby. Prats G. (2006) Microbiologa clnica. Madrid: Panamericana.
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GENERO STREPTOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
OBJETIVO: El alumno conocer las especies ms importantes del gnero Streptococcus y Enterococcus as como su identificacin. GENERALIDADES: 1. Caractersticas del gnero. Los Streptococcus son cocos Gram S. positivos anaerobios facultativos inmviles, que se agrupan en cadenas cortas o largas, no forman esporas, adems fermentan hidratos de carbono. pneumoniae y algunas cepas de grupo viridans requieren de niveles elevados de dixido de carbono (5%) para crecer, son catalasa negativos y pueden producir uno de los tres tipos de hemlisis: Hemlisis alfa: Zona de lisis parcial de eritrocitos presentes en el Agar Sangre de carnero que se observara como una zona verdosa o griscea alrededor de la colonia. Hemlisis beta: Zona de lisis total de eritrocitos presentes en el Agar Sangre de carnero que se observara como una zona transparente alrededor de la colonia. Hemlisis gamma: En este caso se llama hemlisis aunque realmente no existe una zona de hemlisis alrededor de la colonia. (Forbes y Sahm 2004). 2. Se clasifican serolgicamente de acuerdo al polisacrido C presente en su pared en grupos de Lancefield de los cuales los ms importantes son los grupos A, B, C,D, F y G. Dentro del grupo D hasta 1984 estuvieron incluidos los Enterococcus pero ahora se clasifican como un gnero aparte aunque se siguen estudiando junto con los Streptococcus. (Facklam, 1974; Murray, Rosethal y Kobayashi, 2006) 3. Especies de importancia clnica. Algunos forman parte de la flora normal humana colonizando las diversas mucosas, otros se relacionan con y sndrome de importantes patologas en el humano como son faringitis, fiebre reumtica, infecciones urinarias choque txico entre las ms importantes. Los
patgenos ms frecuentes son: S. pyogenes (grupo A), S. agalactiae (grupo B),
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S. bovis (grupo D), S. pneumoniae (no agrupado serolgicamente) y dentro de los Enterococcus, aunque actualmente existen 29 especies, la que se asla con mayor frecuencia es E. faecalis. (Murray et al. 2006) 4. Medio de cultivo para su aislamiento:
CARACTERSTICAS DE LAS COLONIAS Alfa hemolticos. Colonias pequeas de color blanco grisceo mucoides, rodeadas de una zona de color verde. AGAR SANGRE DE Beta hemolticos. Colonias grandes pequeas de color grisceo rodeadas de una zona transparente. No hemolticos (gamma hemolticos) Colonias grandes de color blanco transparente, sin cambios en el medio de cultivo. blanco
CARNERO (5%)
grande estrecha de medio
5. Identificacin. Si aislamos el gnero Streptococcus nos basamos primero en el tipo de hemlisis que producen: alfa, beta ninguna y en la determinacin de caractersticas fisiolgicas (sensibilidad a Bacitracina, factor CAMP, hidrlisis de la esculina en medio con bilis, tolerancia al NaCl 6.5%) y serolgicas. (Macfaddin, 2003). Para beta hemolticos: Susceptibilidad a la Bacitracina: Esta es una prueba que nos sirve para diferenciar a los estreptococos beta hemolticos del grupo A ( S. pyogenes) que presentan una alta sensibilidad a la Bacitracina presentando un halo cuando se utiliza un disco de 0.04 Unidades del antibitico. (Macfaddin 2003) Prueba de CAMP: Se utiliza una cepa de Staphylococcus aureus productora de Beta lisina (por ejemplo S.aureus ATCC 25923) que se estra en forma perpendicular a la cepa de Streptococcus beta hemoltico que queremos identificar ( ms o menos 3 a 4 mm de distancia entre ambas) a las 24 horas en aerobiosis, se observar la lisis de los eritrocitos en las estras perpendiculares en
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forma de punta de flecha (caracterstica de S. agalactiae, Beta hemoltico del grupo B de Lancefield, como productor de factor CAMP). (Murray et al 2006) Para alfa hemolticos: Bilis esculina: Se utiliza un medio que en su composicin tiene sales grupo D y los
biliares que ayudan a inhibir la flora que pueda interferir en la confirmacin del gnero y especie. Es una prueba presuntiva para identificar el reacciona con fierro formando un compuesto color negro. MacFaddin, 2003). Enterococcus, cuando hidrolizan la esculina producen glucosa y esculetina, que (Koneman, 1998;
Tolerancia al cloruro de sodio: sta prueba se observa la capacidad que tienen las bacterias de tolerar una alta concentracin de NaCl y presentar crecimiento (turbidez) solamente crecimiento y fermentacin de la glucosa (vire del indicador de pH) condicin que distingue (junto con la bilis esculina) a los Enterococcus de los dems cocos Gram positivos catalasa negativos, en sta prueba se inoculan en el medio Todd Hewitt que contiene cloruro de sodio al 6.5 % y se observa la reaccin mediante el viraje del indicador de pH prpura de bromocresol. (MacFaddin, 2003). Susceptibilidad a la Optoquina (Clorhidrato de Etilhidrocupreina): En una placa de Agar Sangre, despus de la estra masiva de la bacteria en cuestin se pone en contacto un disco de 5 g de Optoquina y se incuba a 37C por 18 a 24 horas, sta prueba ayuda a diferenciar el S. pneumoniae (sensible) de los dems alfa hemolticos. (MacFaddin, 2003) Solubilidad en bilis: En sta prueba se observa la solubilidad que caracteriza a los neumococos, a los que se adiciona Desoxicolato de Sodio al 2 %
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a la cepa problema y despus de incubar se observa la desaparicin de la turbidez que indica una reaccin positiva. (Koneman 2004; MacFaddin, 2003). DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: Se proporcionaran dos cepas problema clasificadas solo en base al tipo de hemlisis para su identificacin durante la prctica. 1 PARTE. Aislamiento. Se emplearan dos mtodos de aislamiento especficos para Streptococcus que nos sirven para determinar el tipo de hemlisis, aislamiento por estra cruzada con incisin y placa vaciada. 2 PARTE. Identificacin. En base a las hemlisis determinadas se efectuaran las pruebas fisiolgicas que se describen ms adelante (especificas para alfa o beta hemolticos). En esta parte se proporcionaran cepas identificadas que servirn de comparacin para la identificacin de las cepas problema. MATERIAL: 1 PARTE Por equipo de 4: 10 tubos con aprox. 20 ml. de Agar de Soya y Tripticaseina para vaciar. 10 cajas de Petri estriles vacas. 10.5 ml de sangre de carnero desfibrinada estril. 4 tubos con 2 ml de solucin salina estril. 2 mecheros Para el grupo: Bao Mara a 45C 2 pipetas de 10 ml estriles. Tubos con capacidad mnima de 15 ml, estriles tapn de rosca en nmero igual al nmero de equipos. 2 pipetas de 1 ml estriles. 1 tubo con un Streptococcus alfa hemoltico (si especificar la especie). 1 tubo con Streptococcus beta hemoltico (si especificar la especie). 1 asa bacteriolgica, fenol y algodn.
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2 PARTE Por equipo de 4: 3 tubos de agar bilis esculina. 3 tubos de caldo de Todd Hewitt adicionado de 63 gr/lt de NaCl y 1 ml de prpura de bromocresol (1.6 gr del indicador en 100 ml de etanol al 95% para preparar la sol. que se adiciona al medio). 2 tubos con 1 ml de solucin salina estril. 2 tubos estriles de 13 x 100 (Rosca) 1 tubo con 1.5 ml de Desoxicolato de Sodio al 2 %. 1 tubo con Enterococcus faecalis. Mecheros. Portaobjetos. Gotero con H2O2. Equipo para tincin de Gram. 1 puente de tincin. 2 microscopios. 1 pinza para sensidiscos. Discos de Bacitracina para identificacin de Strep.grupo A. Discos de Optoquina. 2 placas de Agar Sangre. 1 tubo con Streptococcus pneumoniae. 1 tubo con Streptococcus bovis. 1 tubo con Streptococcus pyogenes. 1 tubo con Streptococcus agalactiae. METODOLOGA: 1 PARTE. AISLAMIENTO Y DETERMINACIN DE HEMLISIS 1. Preparar 6 placas de Agar Sangre agregando 1 ml de sangre de carnero a cada uno de los seis tubos de Agar de Soya a 45 C, vaciar y dejar solidificar. Distribuir como sigue: Siembra por estra con incisin: 2 para alfa hemolticos y 2 para beta hemolticos. Conservar 2 placas para pruebas de identificacin. 2. Siembra por estra cruzada con incisin. Se hace un inculo primario en un extremo de la placa, posteriormente se realizan las estras cruzadas,
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finalmente se hacen incisiones con el asa en las diferentes zonas de la placa de acuerdo a la figura. Incubar 24 horas a 35 C.
Siembra inicial
Estras
Incisiones
3. Mtodo de placa vaciada (2 placas para alfa hemolticos y 2 para beta hemolticos) Diluir una asada del inculo en aproximadamente 2 ml de solucin salina estril, mezclar bien. Pasar una asada del inoculo diluido al medio fundido a una temperatura homognea de 42-45C aproximadamente agregar 1 ml de sangre de carnero desfibrinada, mezclar bien y rpidamente vaciar en una caja de Petri estril. Una vez que solidifica incubar en atmsfera normal la placa por 18-24 horas a 37C. 4. Observar y anotar los resultados en la tabla 2 Estras 2 PARTE. Hacer una tincin de Gram para S.pyogenes, Enterococcus faecalis y S.pneumoniae, compare la morfologa, haga un dibujo de cada microorganismo. Realizar las pruebas indicadas en la siguiente tabla:
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BACITRA CINA S. pneumoniae S. bovis S. pyogenes S. agalactiae Enterococcus faecalis Cepa problema
CAMP
BILIS ESCULINA
NaCl 6.5%
OPTOQUINA
SOLUBILIDAD EN BILIS
(beta hemoltica)
Cepa
problema
(alfa hemoltica)
Para beta hemolticos realizar las siguientes pruebas: SUSCEPTIBILIDAD A LA BACITRACINA 1. Tomar 3 a 4 colonias aisladas de la cepa beta hemoltica, colocar un inculo inicial y hacer una estra masiva en de la placa de agar sangre de carnero, colocar con pinza flameada el disco diferencial de Bacitracina (0.04 unidades) presionando ligeramente el agar, incubar normal. Interpretacin: Cualquier halo de inhibicin sin hemlisis es Sensible: Presuntivo de Streptococcus del grupo A (S. pyogenes). Sin halo de inhibicin con crecimiento en la orilla del disco, es Resistente. 24 horas a 37 C en atmsfera
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FACTOR CAMP 1. Utilizar el extremo de la estra de la prueba anterior 3 a 4 mm. Incubar 24 horas a 37C atmsfera normal. Interpretacin: Positivo: Zona de hemlisis en punta de flecha Sin en grupo la B estra (S. problema agalactiae) de Streptococcus del Negativo: otro grupo no B. NOTA: Los Streptococcus beta hemolticos con resultados negativos en las 2 pruebas anteriores se consideran como: No pertenecientes a los grupos A ni B. Para alfa hemolticos realizar las siguientes pruebas: PRUEBA DE BILIS ESCULINA 1. Sembrar con asa estril la cepa problema por estra en agar inclinado, incubar 24 horas a 37 C y observar. Interpretacin: Positivo: Hidrolizado de color negro (Grupo D enterococo). Negativo: No neumococo). hidrolizado de color amarillo (grupo Viridans o en y poner una estra de Staphylococcus aureus (productor de lisina beta) en el centro a una distancia de
hemlisis
Streptococcus
TOLERANCIA AL CLORURO DE SODIO (6.5 %) incubar 24 horas a
1. Inocular un tubo con caldo de Todd-Hewitt con 6.5% de NaCl y Prpura de Bromocresol como indicador con una asada de la cepa e 35C. Interpretacin: Positivo: Turbidez con sin cambio del indicador de pH a amarillo (Enterococcus). Negativo: El tubo permanece claro (Streptococcus del grupo D, S. bovis del grupo viridans).
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SUSCEPTIBILIDAD A LA OPTOQUINA (Clorhidrato de Etilhidrocuprena) 1. Tomar 3 a 4 colonias aisladas de la cepa beta hemoltica, colocar un inculo inicial y hacer una estra masiva en de la placa de Agar Sangre de carnero. 2. Colocar con pinza flameada el disco de Optoquina de 5 g en el centro presionando ligeramente el agar, incubar 24 horas a 37C. Interpretacin: Halo de inhibicin 16 mm es presuntivo de
Streptococcus pneumoniae. Sin halo de inhibicin: Otros Streptococcus alfa hemolticos Enterococcus. SOLUBILIDAD EN BILIS 1. Preparar desoxicolato de sodio al 2 %. 2. Montar 2 tubos: Problema y Control. Suspender la bacteria en 1 ml. de sol. salina ajustada a 0.5 de Macfarland en cada tubo. Adicionar al problema 0.5 ml de Desoxicolato de Sodio al 2% y al control 0.5 ml de sol. salina estril. Incubar 2 horas a 37C. Interpretacin: (Comparar con el control negativo). Positivo: Tubo claro con bacterias disueltas o solubilizadas (S. pneumoniae) Negativo: Tubo sin cambio con bacterias no solubles (S. bovis).
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RESULTADOS: Tabla 2 Resultados de pruebas de identificacin.

Tipo de hemlisis S. pneumoniae Bacitra cina CAMP Bilis Esculina NaCl 6.5 % Optoquina Solubilidad en bilis
S. bovis
S. pyogenes
S. agalactiae
Enterococcus faecalis Cepa problema (beta hemoltica) Cepa problema (alfa hemoltica)
AUTOEVALUACIN: Explique porqu es importante definir el tipo de hemlisis antes de proceder a realizar las pruebas presuntivas de grupo de Streptococcus. Mencione tres razones por las que se utiliza Agar Sangre de Carnero al 5 % y no sangre humana en las placas para aislar Streptococcus. REFERENCIAS: Facklam, R. R., (1974) Manual de procedimientos. Aislamiento e identificacin de Streptococcus. Centers for Disease Control. Atlanta, Georgia: Public health service.
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Forbes, B & Sahm, D. (2004) Diagnstico microbiolgico. (11 Edicin). Buenos aires, Argentina: Mdica panamericana. Koneman, E. W., (2004) Diagnstico Microbiolgico Texto y Atlas color. Buenos aires, Argentina: Panamericana. MacFaddin, J. F. (2003) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. (3 edicin). Madrid, Espaa: Panamericana. Murray, P. R; Rosethal K. S., Kobayashi G. S. (2006) Microbiologa mdica. (4. Edicin) Madrid, Espaa: Mosby.
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CULTIVO DE EXUDADO FARNGEO.
OBJETIVO: Conocer el proceso del cultivo de exudado farngeo para el diagnostico de faringitis. GENERALIDADES: La faringitis es una enfermedad transitoria que inicia con o sin
sintomatologa y a lo largo del evento post recuperacin se vuelve recurrente si el tratamiento no ha sido oportuno y adecuado. El causante es principalmente el Streptococcus pyogenes (beta hemoltico del grupo A de Lancefield) en un 35 % de las infecciones bacterianas y los virus son causantes del 75 % de la enfermedades en sta regin anatmica. (Facklam, 1974) Adems de faringitis como infeccin local, algunos microorganismos ocasionan diversas patologas, cuando es diseminada origina sepsis bacteriana, y cuando es secuela post-infeccin estreptoccica el S. pyogenes causa glomerulonefritis aguda y fiebre reumtica. Otras bacterias que pueden causar infeccin farngea con menor frecuencia son los Streptococcus beta hemolticos del grupo B, del grupo C y del grupo G de Lancefield adems de Archanobacterium haemolyticum. (Facklam, 1974; Levinson 2006). DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: Tomar la muestra de aislar en posteriormente realizar pruebas bioqumicas exudado farngeo y identificar los
Agar Sangre (utilizar placa vaciada cuando sea necesario) para
Streptococcus considerados patgenos. MATERIAL: 1 y 2 PARTE. Por equipo de 4: 4 placas de Agar Sangre 4 hisopos estriles 4 abatelenguas estriles Gotero con H2O2 2 portaobjetos 1 mechero 1 asa 2 tubos de Agar de Soya y Tripticaseina inclinados.
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METODOLOGA: TOMA DE MUESTRA PARA EXUDADO FARNGEO 1. Preparar nuestro material estril y placas sin humedad. 2. Sentado el paciente en posicin cmoda, llevar la cabeza ligeramente hacia atrs, con un abatelenguas estril presionar la lengua e introducir un hisopo estril tomando de la parte posterior de la garganta (tomar de las manchas blancas) sin tocar lengua y mejilla. 3. Inmediatamente sembrar en Agar Sangre de Carnero (5%). Incubar 24 horas a 37C. (ver tcnicas de aislamiento por estra y profundidad y placa vaciada prctica anterior). NOTA: Se puede utilizar el medio de transporte de Stuart de Amies para muestras tomadas en periodo de 2 a 24 horas. 4. Observar la morfologa: Si es beta hemoltico: aislar la colonia en Agar de Soya y Tripticaseina para practicar la catalasa en portaobjetos. 5. Si resulta negativa referirse a la prctica de Streptococcus para su identificacin. Si slo se aislan colonias alfa hemolticas se considera un resultado negativo. Forma de reportar: Positivo: Mencionar grupo de Lancefield, el gnero y especie. Negativo: No se observan microorganismos patgenos.
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RESULTADOS: Exudado Tipo de Hemlisis 1 Pruebas realizadas y resultados Grupo de Lancefied
AUTOEVALUACIN: Mencione las especies de Streptococcus beta hemolticos que se deben reportar en un cultivo de exudado farngeo. Explique por qu los Streptococcus alfa hemolticos y no hemolticos no se deben reportar en un cultivo de exudado farngeo. REFERENCIAS: Batista D. N., Bordes B. A., Dez G. O., et al. (2003) Protocolos Clnicos. Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa clnica, Infeccin de las vas respiratorias superior. Recuperado del 20 de Agosto de 2009: en www.seimc.org/documentos/protocolos/clinicos/proto3.htm. Facklam R. R., (1974). Manual de procedimientos. Aislamiento e identificacin de Streptococcus. Atlanta, Georgia; Public health service. Center for Disease Control. Levinson, W., (2004) Microbiologa e inmunologa mdicas (8 Edicin) Espaa; Editorial McGrawHill.
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UROCULTIVOS.
OBJETIVO: Conocer la metodologa adecuada para la siembra, identificacin e interpretacin del urocultivo y su utilidad en el diagnostico de infecciones de vas urinarias (IVU). GENERALIDADES: Las infecciones de vas urinarias son una de las causas ms frecuentes de visita al mdico, entre los conceptos ms importantes a tener en cuenta tenemos: Bacteriuria: Es un proceso que puede ser sintomtico o asintomtico que refiere a la presencia de bacterias en la orina. Cistitis: Es un sndrome localizado en vejiga cuyos signos son dolor suprapvico, disuria, frecuencia y urgencia en la miccin. Pielonefritis: Proceso bacteriano patolgico del parnquima renal, con signos de poliuria, fiebre de 38.5 C, nuseas, disuria y dolor en la regin lumbar. Prostatitis: Enfermedad bacteriana localizada en la glndula prosttica que puede presentarse espontneamente despus de una uretritis, se caracteriza por urgencia, frecuencia y disuria. (Clarridge, Pezzlo y Vosti 1987) Epidemiologa de las IVU. Dependiendo del sexo y la edad es la incidencia de la enfermedad as como la sintomatologa, el 1er. lugar de prevalencia lo ocupa el sexo femenino, ya que son ms predisponentes a tener IVU recurrente por la ocupacin anatmica de la uretra (es ms ancha ms corta que la del hombre) adems de la cercana con la zona urogenital e intestinal (que vara con la edad y el estado de salud), por lo tanto la proporcin en que se infectan en adultos es de 30 por cada hombre, se puede presentar a cualquier edad y se ha observado una mayor incidencia en padecimientos asociados a condiciones como el Embarazo y Diabetes Mellitus. (Ortz, 1985; Snchez y Tay 2003)
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En el sexo masculino a mayor edad, mayor incidencia, debido a que en adultos mayores y ancianos hay ms riesgo de desarrollar enfermedades en la prstata. (Ortz, 1985) Tabla 1. Prevalencia de de IVU.
Grupos de riesgo Hombres Prevalencia Nios y jvenes: 0.05 % 60 a 63 aos: 10 a 15 % 81 aos: 42 % Por sexo Mujeres Nias y jvenes < 19 aos: 1 % 20-29 aos: 3 hasta 3.5 %, 30-34 aos: 4 % 35 aos: 6 % 60 aos ms: 10 a 15 % Embarazo Condiciones fisiolgicas Embarazo asociado a Pielonefritis Diabetes Mellitus Condiciones patolgicas Condiciones secundarias Hipertensin arterial asociada a Pielonefritis Pacientes hospitalizados, prequirrgicos, con sonda uretral, vesical. Hombres: 12 % Mujeres: 30 % 26 a 68 % Mujeres: 18.8 % Primigestas: 2 % Secundigestas: 2.5 % Multigestas ( 7 ): 6 % 40 %
(Ortz ,1985)
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Tabla 2. Bacterias ms frecuentes causantes de IVU.

% de Infecciones detectadas Pacientes ambulatorios infecciones Iniciales E. coli Proteus mirabilis KlebsiellaEnterobacter sp. Enterococcus Staphylococcus coagulasa negativos Pseudomonas aeruginosa Serratia marcescens otros 2 11 10 10 0 0 1 3 0 <1 6 17 1 1 3 3 15 7 23 5 90 5 1 infecciones recurrentes 69 8 6 42 6 13 Pacientes hospitalizados rea general Terapia intensiva 24 2 16
Toma de muestras: Recoleccin de orina de chorro medio: Es la ms adecuada para realizar el urocultivo y consisten en realizar un aseo en el rea genital con abundante agua y jabn para evitar contaminacin, y recolectar el chorro medio de la primera de la maana en un recipiente estril de boca ancha. (Clarridge al.1987) Aspiracin suprapbica: Es una tcnica transcutnea que evita la et
contaminacin externa, por lo cual es el ms apropiado para nios. Este mtodo es poco usado debido a su invasividad y no lo lleva a cabo regularmente el Qumico Clnico. (Clarridge et al.1987)
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Recoleccin con bolsa estril. Se realiza un previo aseo, se desprende la parte adherible y se coloca la bolsa en el rea genital, obteniendo la orina directa, llevndola inmediatamente al laboratorio. ste es un buen mtodo de recoleccin para nios y ancianos que no controlan el esfnter. La bolsita se debe cambiar cada treinta minutos y se debe retirar inmediatamente despus de la miccin. (Clarridge et al.1987) Muestras de catter: regularmente se prefiere la muestra de chorro medio, sin embargo cuando es necesario dadas las condiciones del paciente se puede hacer de catter recto del chorro medio y directamente en frasco estril, o bien de catter vesical se aspira la orina con jeringa, a travs de un diafragma en la tubera de salida y se transfiere al recipiente estril. (Clarridge et al.1987) Medios utilizados y Morfologa colonial de los uropatgenos. Se puede utilizar una combinacin de dos medios, uno es el Agar Sangre de carnero ms un medio diferencial: CLED, MacConkey EMB. Tabla 3. Morfologa colonial de los Uropatgenos.
Agar Morfologa colonial E. coli: Colonias grandes color gris, con beta hemlisis. Agar Sangre Proteus: Swarming en el medio, colonias blanquecinas y hemolticas. Pseudomonas: Colonias mucoides blancas, medianas. Staphylococcus spp: Colonias medianas, lisas, color blanco a amarillo, algunas veces hemolticas. Streptococcus spp: Colonias pequeas, puntiformes, translsidas, con halo de hemlisis (alfa, beta gamma) CLED E. coli: Colonias color amarillo-dorado rodeadas de una zona amarilla. Proteus: Colonias grandes translsidas de color azul, Swarming en el medio. Enterobacter, Klebsiella: Colonias grandes, amarillo-doradas con halo amarillo alrededor, casi todas mucoides. Pseudomonas: Colonias grandes color parduzco rodeadas de una zona azul. Staphylococcus: Colonias muy pequeas, color amarillo intenso opacas. Streptococcus: Colonias pequeas color plido opacas.
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Tabla 3. Morfologa colonial de los Uropatgenos.

MacConkey E. coli: Colonias de tamao grande, mucoides o no mucoides de color rojo con halo alrededor. Proteus: Colonias caf claro, translcidas puntiformes. Enterobacter y Kelbsiella: Colonias grandes de color rosa, mucoides. Pseudomonas: Colonias mucoides, color caf claro, translsidas. Enterococcus, Staphylococcus y otros: Colonias pequeas de crecimiento aislado, opacas. Salmonella, Shigella y otros: Colonias transparentes incoloras.
DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: En la 1 parte se realiza la siembra de la orina por el mtodo de aislamiento en Agar Sangre y CLED con asa calibrada de 0.001 ml, se incuba por 24 horas y si es negativo por 48 horas, se observa el crecimiento y morfologa comparando con la tabla 3. En la 2 parte se cuentan el nmero de colonias, se calculan las UFC/ml y de
acuerdo a la morfologa colonial comparando con la tabla 3, se realizan cuando sea necesario tincin de Gram, Catalasa, Oxidasa y pruebas bioqumicas para la identificacin del gnero y especie (referirse a las prcticas anteriores para la identificacin de los microorganismos). MATERIAL: Por equipo de 4 1 PARTE 4 placas de Agar Sangre 4 placas de Agar CLED 2 mecheros 2 asas calibradas 0.001 ml Problemas (proporcionados por el maestro) 2 PARTE 4 juegos de pruebas bioqumicas (TSI,LIA,UREA,CITRATO,MIO) 2 mecheros Discos para la prueba de oxidasa perxido de hidrgeno 2 portaobjetos Aguja de inoculacin Asa bacteriolgica
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METODOLOGA: AISLAMIENTO CON ASA CALIBRADA 1. Mezclar cada muestra, en el rea del mechero quemar el asa calibrada e introducirla en forma vertical, hacer un inculo inicial en el Agar Sangre. 2. Extender en forma de cuadricula sin quemar ni volver a tomar muestra. 3. Quemar el asa y tomar nuevamente para sembrar la placa de CLED igual que en la placa de Agar Sangre como se ilustra:
4. Incubar 24 horas a 37 C. y en caso de estar negativo incubar 24 horas ms. 5. Observar el crecimiento bacteriano y morfologa. Contar las colonias y multiplicar por el factor de dilucin (1,000). 6. La interpretacin cuantitativa de acuerdo al criterio de Kass (1955) cuando se obtiene un cultivo puro es: Mujeres y Hombres slo con sintomatologa de IVU y piuria: 100 UFC/ml hasta 10,000 UFC/ml se considera de valor clnico. <10,000 UFC/ml: Cultivo Negativo. > 10,000 y < 50,000 UFC/ml: Puede indicar bacteriuria significativa por lo que se debe corroborar con la clnica y el examen general de orina. De 50,000 a 100,000 UFC/ml y ms: indica bacteriuria significativa. 7. De acuerdo a la morfologa, tincin de Gram y preliminares, se decide la realizacin de pruebas bioqumicas.
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Forma de reportar el Urocultivo. Si es positivo: Cantidad de UFC/ml (si es ms de 100,000 se indica: ms de 100,000 UFC/ml seguido del gnero y especie). Si es negativo: Slo Negativo AUTOEVALUACIN: En qu casos un urocultivo negativo se debe repetir utilizando un asa calibrada de 0.01 ml en lugar del asa comnmente usada de 0.001 ml? Explique por qu un resultado cualitativo en un urocultivo carece de valor diagnostico. REFERENCIAS: Clarridge J. E., Pezzlo M. T., Vosti K. L., (1987). CUMITECH 2 A. Laboratory Diagnosis of Urinary Tract Infections. Washington D. C: Editorial Board for American Society for Microbiology Cumitechs. Ortz Q. F., (1985) Bacteriuria. (1 impresin). Mxico D. F: Ortho diagnostic System divisin Johnson y Johnson. Snchez V; J. & Tay Z. J. (2003) Fundamentos de Microbiologa y Parasitologa mdicas. Mxico D. F: Mndez Editores.
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COPROCULTIVOS.
OBJETIVO: El alumno aprender a realizar las tcnicas en cultivo de heces, pruebas bioqumicas y serologa para identificacin de patgenos causantes de gastroenteritis. GENERALIDADES: La gastroenteritis bacteriana se encuentra dentro de las enfermedades entricas ms importantes cuya transmisin requiere del consumo de alimentos contaminados o por va fecal oral. Los procesos procesos diarreicos de corta larga duracin, generalmente son causados microorganismos toxignicos que pueden ser invasivos y producir diarrea sanguinolenta (en fase aguda de la enfermedad) con porciones mucoides. (Forbes, Sahm y Weissfeld 2004). Entre los patgenos tenemos a la familia Enterobacteriaceae con varias especies de los gneros Salmonella, Shigella y diversas variedades de Escherichia coli diarreognica, y con menos frecuencia en esta familia tenemos a Yersinia enterocolitica. Entre otras bacterias relacionadas con gastroenteritis tenemos a Campylobacter jejuni, adems de Vibrio cholerae y V. parahemlyticus. (Caffer y Terragno 2001) En esta prctica nos enfocaremos a las Enterobacterias ms frecuentes que causan enfermedad spp. (Caffer y Terragno 2001) Coprocultivo para Enterobacerias y su importancia diagnstica. Es un estudio que utiliza medios selectivos y de enriquecimiento que ayudan a identificar microorganismos probables causantes de enfermedades extra o intraintestinal, y su importancia radica en la diferenciacin de microorganismos fermentadores de lactosa y no fermentadores, posterior a una resiembra para identificacin de pruebas bioqumicas y serogrupos patgenos. (Koneman, 2004). Pruebas serolgicas. Se utilizan fundamentalmente para la identificacin de Salmonella, Shigella y E. coli diarrognica. Las pruebas se basan en la como son Salmonella spp. y Shigella
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reaccin antgeno-anticuerpo mediante aglutinacin directa para diferenciacin antignica. Se utilizan sueros polivalentes stas especficos reacciones dirigidos serolgicas contra son microorganismos problema. Aunque
extremadamente especficas, no son definitivas en un resultado final, hay que relacionar y corroborar con pruebas bioqumicas. (Caffer et al. 2001) Medios utilizados para su aislamiento son:
Tipo de medio Ligeramente selectivos Moderadamente selectivos EMB Desoxicolato de Leifson Agar S.S. Enterico de Hekton XLD Altamente selectivos Caldos enriquecimiento de Wilson Blair Verde brillante Caldo de enriquecimiento de selenito de Leifson y Caldo Tetrationato Se inhiben E.coli se y otras usa Enterobacterias Salmonella y Shigella Se utilizan para inhibir a la mayora de Se las Enterobacterias utilizan para y para aislamiento de Salmonella enriquecer Salmonellas, inhibiendo coliformes. Ejemplo Medio MacConkey Microorganismos aislados Crecen todas las Enterobacterias
principalmente para el aislamiento de
Tabla 1 Morfologa colonial En Agar Verde Brillante:

Microorganismos Escherichia coli Salmonella enteritidis Salmonella typhi Salmonella typhimurium Shigella flexneri. Staphylococcus aureus Caractersticas de las colonias Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo Crecimiento inhibido Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo Crecimiento inhibido Crecimiento inhibido
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En agar Entrico Hektoen:

Microorganismos Escherichia coli Proteus Enterobacter y Klebsiella Salmonella Shigella Pseudomonas Bacterias Gram positivas Caractersticas de las colonias Amarillas a salmn, algunas cepas inhibidas Variables, azul a verde azuloso salmn, la mayora con centro negro Grandes Amarillas a salmn Verde azuloso a azul, la mayora con centro negro Verdosas elevadas. Irregulares, verdes a caf No crecen o crecimiento ligero.
En agar MacConkey:
Microorganismos Salmonella, Shigella y otros. Escherichia coli Enterobacter,y Klebsiella. Enterococos, Staphylococcus y otros Caractersticas de las colonias Incoloras, transparentes Grandes, rosadas, halo turbio. Grandes, rosadas, mucosas. Diminutas, de crecimiento aislado, opacas.
En agar XLD:
Microorganismos Shigella, y algunas especies de Proteus Escherichia coli , Klebsiella y Enterobacter Salmonella Citrobacter Bacterias Gram positivas: Caractersticas de las colonias Colonias transparentes o del mismo color del medio (rojo). Colonias color amarillo opaco o brillante. Algunas parcialmente inhibidas. Colonias rojas a rosadas, con o sin centro negro. Colonias amarillas con centro negro. Crecimiento inhibido.
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En agar Salmonella y Shigella (SS):

Microorganismos Salmonella y Shigella Eschericia coli Caractersticas de las colonias Colonias lisas, transparentes, con o sin centro negro, no fermentadoras de lactosa. Colonias incoloras, mucoides, con centro rosa o ligeramente rojo, con precipitado. La mayora son inhibidas. Citrobacter y Proteus sp Enterobacter faecalis Colonias con centro gris a negro o crecimiento inhibido. Colonias incoloras, o crecimiento inhibido.
DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: Dia 1: Se realiza un aislamiento utilizando un medio de cada tipo, uno ligeramente selectivo, uno moderadamente selectivo, uno altamente selectivo y un caldo de enriquecimiento. Da 2: Se hace una resiembra de bacterias a partir del caldo de enriquecimiento incubado a un medio moderadamente selectivo y se montan las pruebas bioqumicas a colonias sospechosas de las placas de la primera siembra. Dia 3: Se Leen las pruebas bioqumicas de la primera siembra y se montan pruebas bioqumicas para colonias sospechosas de la resiembra. En este punto en caso de no tener colonias sospechosas y aunque no forma parte del proceso real se montaran pruebas bioqumicas para una cepa de Salmonella y una cepa de Shigella con el fin de observar sus caractersticas bioqumicas y practicar las pruebas serolgicas en la siguiente sesin. Dia 4: Se leen las pruebas bioqumicas de la resiembra y se practica serologa a las colonias que lo amerite as como a las cepas que se sembraron para demostrar esta parte de la prctica.
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MATERIAL: Por equipo de 4. Da 1 1 muestra fecal fresca por alumno 4 placas de agar MacConkey 4 placas de agar Hektoen (en caso de no haber sustituir por XLD Agar SS) 4 placas de agar Wilson Blair (o Verde Brillante) o 4 tubos con caldo selenito o tetrationato. 4 hisopos estriles 2 mecheros 1 gradilla 4 asas bacteriolgicas
Da 2 8 juegos de pruebas bioqumicas (TSI,LIA,UREA,CITRATO Y MIO) 2 mecheros 2 gradillas
placas
de
agar entrico
de
Hektoen, XLD o SS. 2 agujas de inoculacin.
Da 3 1 tubo con Shigella sonnei 1 tubo con Salmonella enteritidis 2 portaobjetos 2 agujas de inoculacin 2 mecheros
1 gradilla 2 juegos de pruebas bioqumicas (TSI,LIA,UREA,CITRATO Y MIO) Reactivo Kovacs indol
Da 4 2 mecheros 2 portaobjetos 1 gotero con solucin salina Antisuero: Polivalente para Salmonella. Antisuero para Shigella sonnei
Vaso de precipitado con cloro para eliminacin de portaobjetos. Reactivo Kovacs indol Nota.Los antisueros provistos deben ser de acuerdo a las cepas utilizadas como tipo en el da 3.
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METODOLOGA: Muestra: Se requiere para cada alumno una muestra (de preferencia diarreica) fresca, recin emitida de preferencia, o conservada a 4C por no ms de 24 horas. Da 1 SIEMBRA Y AISLAMIENTO PRIMARIO 1. Tomar una porcin diarreica mucoide y hacer un inculo inicial con un hisopo en un lado de la placa de cada uno de (moderadamente, ligeramente y altamente selectivos). 2. Por ltimo introducir con el hisopo una porcin de heces (aproximadamente dilucin 1:10) en caldo de enriquecimiento Selenito Tetrationato, agitndolo suavemente. 3. Quemar el asa bacteriolgica y en rea estril realizar estrias por aislamiento en cada una de las siembras de las placas partiendo de la siembra inicial con el hisopo. Incubar todo a 37 C durante 24 horas y observar el crecimiento. Da 2. RESIEMBRA EN CALDO Y REALIZACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS 1. A partir de la siembra inicial, observar cualquier colonia sospechosa de acuerdo a la tabla de morfologa colonial (tabla 1) y montar pruebas bioqumicas: TSI, LIA, UREA, CITRATO Y MIO. 2. Resembrar a partir del caldo de enriquecimiento, con una asada en una placa de medio moderadamente selectivo (Entrico Hektoen, SS XLD), incubar a 37 C durante 24 horas. Da 3. Lectura de pruebas bioqumicas iniciales y montar nuevas de la resiembra. 1. Leer las pruebas bioqumicas iniciales e identificar Salmonella o Shigella (confirmar cualquier resultado positivo con el maestro). 2. A partir de las colonias sospechosas que le crezcan de la resiembra monte para cada una de ellas la serie de pruebas bioqumicas y en caso de no tener colonias sospechosas puede utilizar (a manera de demostracin) las cepas de Salmonella y Shigella proporcionadas para montar sus pruebas bioqumicas. los medios selectivos
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Dia 4. SEROLOGA 1. Leer las pruebas bioqumicas y practicar serologa en aquellos casos que resultaron Salmonella o Shigella, y en las cepas proporcionadas en la clase anterior. TCNICA DE SEROTIPIFICACIN POR AGLUTINACIN 1. Realizar serolgicas a partir de los tubos de LIA. 2. Colocar una gota de sol. salina en un portaobjetos y hacer una suspensin lechosa con la cepa que se va a analizar utilizando una asa estril. 3. Agregar una gota del antisuero que indique el maestro. 4. Mezclar y agitar en forma circular, observar dentro de los 2 minutos siguientes bajo iluminacin sobre un fondo oscuro. Interpretacin. Considerar cualquier grado de aglutinacin como positivo. Forma de reporte. Si se aisla flora normal no se reportar, slo los microorganismos patgenos. RESULTADOS DE LAS CEPAS PROPORCIONADAS PARA OBSERVACIN. S. enteritidis TSI LIA UREA CS MOTILIDAD INDOL ORNITINA Serologa S. sonnei
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AUTOEVALUACIN. Adems de cultivar Enterobacterias Qu otros microorganismos sera importante incluir en un coprocultivo completo y en qu situaciones? Qu medios de cultivo utilizaras para el cultivo de las bacterias de su respuesta anterior? REFERENCIAS. Caffer M. I., Terragno R., (2001 y 2007) Manual de procedimientos para la caracterizacin de Salmonella. Recuperado del 19 de noviembre de 2009 del sitio web del Departamento de Bacteriologa del instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. : http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/gss/publications/documents/Argentina LevelI/Manual_procedimientos_Salmonella.pdf, Forbes, B; Sahm, D; Weissfeld A. (2004) Diagnstico microbiolgico. (11 Edicin). Buenos aires, Argentina: Mdica panamericana Koneman, E. W., (2004) Diagnstico Microbiolgico Texto y Atlas color. Buenos aires, Argentina: Panamericana.
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GENERO PSEUDOMONAS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN
OBJETIVO: Conocer las caractersticas de cultivo y las pruebas bsicas para identificar el gnero Pseudomonas y en especial la especie ms importante P.aeruginosa. GENERALIDADES: Caractersticas Pseudomonadaceae. del La gnero. Forman se parte refiere de a su la familia palabra Pseudo dimorfismo
(morfologa curva o recta), y comprende 29 especies aeruginosa, en
monad es un trmino griego para designar total; dentro del grupo fluorescente: P.
unidad. Su clasificacin se obtiene en base a su RNA ribosomal 16S que Pseudomas fluorescens, P. putida. P. stutzeri. En el grupo
alcaligenes: P. alcaligenes, P. seudoalcaligenes. (Gimnez, 1999) Es un bacilo gram negativo, mide 0.5 a 0.8 x 1.5 a 3.0 m tiene movilidad mediante flagelos (monotrico loftrico), realiza un metabolismo oxidativo y su crecimiento es estrictamente en presencia de oxgeno, sus caractersticas bioqumicas comprenden la no fermentacin de glucosa y lactosa. Es un patgeno nosocomial oportunista de relevancia clnica, por su capacidad de ser muy agresivo, ya que forma biofilms, y tiene la facilidad para producir marcadores fenotpicos de pigmentacin de naturaleza hidrosoluble. (Ruiz, 2007; Stainer Ingraham y Wheelis, 1992). Los miembros del gnero presentan una fenovariedad que puede ser mucosa o no mucosa, y con produccin o ausencia de pigmentos. Tienen la capacidad de producir olor de acuerdo a la produccin de metabolitos orgnicos como la trimetilamina. (Gimnez, 1999) Producen endotoxinas responsables de la patogenicidad, la cual causa shock sptico, en el nivel hospitalario se tiene una incidencia entre el 10 y 20 % de infecciones, se puede vascular y urinario, causando lesiones supurativas, infecciones del tracto urinario y neumona, dao en sistema nervioso fibrosis aislar en: pacientes con quemaduras, catter qustica, causando infecciones en piel
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central, odo, ojos y sistema Volk, Kadner y Parsons 1999)
gastrointestinal. (Forbes, Sahm y Weissfeld 2004;
Especies de importancia clnica. Pseudomonas aeruginosa P. fluorescens, P. putida. P. stutzeri, P. alcaligenes Produccin de pigmentos por el gnero Pseudomonas. Tabla 1.
Pigmento Piocianina Pioverdina Color Verde-azul Amarillo-verde, fluorescente Piomelanina Piorubina Caf-negro Rojo Bacterias que lo producen P. aeruginosa P. aeruginosa P. fluorescens P. putida P. aeruginosa P. aeruginosa
Aislamiento. Tabla 2
Caracterstica colonial de las bacterias ms aisladas. Agar MacConkey Colonias irregulares, incoloras y mucoides no fermentadoras de lactosa. Se puede observar la presencia de pigmento. Agar Cetrimida con Pseudomonas aeruginosa: colonias mucoides de color blanco 10 % de glicerina cremoso con pigmento azul-verdoso, amarillo o negro (algunas veces todos juntos) Pseudomonas fluorescens: colonias mucoides de color blanco con pigmento amarillo a verde fluorescente.
Identificacin.
La
identificacin
de
Pseudomonas
aeruginosa
se
hace basndose en la morfologa colonial y microscpica la produccin de pigmentos, oxidasa positiva y olor caracterstico (a uvas), en el caso de otras Pseudomonas se deben utilizar microgalerias para su identificacin completa ya que solo se
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podra determinar presuntivamente el gnero basndose en la presencia de bacilos Gram negativos, oxidasa positiva y productores de pigmento. DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: Se llevar a cabo solo una identificacin preeliminar y se har una comparacin con una fermentadores. MATERIAL. Por equipo de 4 2 asas bacteriolgicas 2 mecheros 1 gradilla 3 placas de Agar de MacConkey 3 placas de Agar Cetrimida (aadir 10 ml de glicerina por litro antes de esterilizar) Discos con reactivo de Oxidasa Equipo para tincin de Gram 3 tubos de TSI 3 tubos de LIA 3 tubos de Agar Urea 3 tubos de Citrato de Simmons METODOLOGA: AISLAMIENTO PRIMARIO 1. En el rea del mechero inocular mediante estra por aislamiento cada una las cepas proporcionadas en Agar MacConkey y Agar Cetrimida con 10 % de glicerina, incubar a 35 C durante 24 horas. 2. Observar la morfologa y produccin de pigmentos. 3. Elegir las colonias aisladas productoras de pigmentos y realizar una tincin de Gram. 1 1 tubo tubo 3 tubos de MIO Cepas por equipo: con con Pseudomonas Pseudomonas fluorescens aeruginosa 1 tubo con E.coli Fenol y algodn 4 portaobjetos microscopio aceite de inmersin Fenol y algodn miembro de la familia Enterobacteriaceae como es E.coli, para poder distinguir las caractersticas de bacilos fermentadores y no
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PRUEBA DE OXIDASA 1. Con una pinza estril, tomar el disco de oxidasa, impregnado con agua destilada estril y colocarlo sobre una caja petri. Agregar una asada de una colonia aislada con un asa estril. La reaccin positiva debe ocurrir de 5 a 10 segundos. Comparar con un control negativo que ser la cepa de E. coli. Interpretacin: Positivo: Aparece un color azul intenso en un tiempo menor a 10 segundos se considera positivo lento a confirmar cuando el color aparece entre 10 y 60 segundos. La prueba debe leerse en el primer minuto pues despus pueden resultar falsos positivos. Negativo: No hay desarrollo de color.
PRUEBAS BIOQUMICAS
1. Las colonias aisladas de cada placa se inoculan en los medios TSI, LIA, Agar urea, MIO y Citrato de Simmons. 2. Incubar a 37C por 24 Hrs.
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RESULTADOS:
PRUEBA/ MEDIO P. aeruginosa P. fluorescens E.coli Interpretacin de las diferencias observadas desde el punto de vista bioqumico.
AGAR CETRIMIDA
AGAR MACCONKE Y TSI
LIA
UREA
CITRATO
MOVILIDAD
INDOL
ORNITINA
OXIDASA
TINCIN DE GRAM
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AUTOEVALUACIN. Menciona las 4 pruebas de rutina y accesibles a cualquier laboratorio que se pueden utilizar para la identificacin de Pseudomonas aeruginosa. Porqu la movilidad de superior del tubo de MIO? Porqu la prueba de la Ornitina no es vlida para P. aeruginosa? Dada la dificultad para identificar bacilos aislamiento de estos microorganismos. REFERENCIAS: Forbes, B; Sahm, D; Weissfeld S. A. (2004) Diagnstico microbiolgico. (11 Edicin). Editorial mdica panamericana. Buenos aires, Argentina. Gimnez A. (1999) Pseudomonas aeruginosa, microbiologa e infeccin cutnea primaria. Department of dermatology. Monografa en lnea: http://www.actualidaddermatol.com/art11200.pdf . Philadelphia, USA. Ruiz M. (2007) Pseudomonas aeruginosa: Aportacin al conocimiento de su estructura y al de los mecanismos que contribuyen a su resistencia a los antimicrobianos. Tesis Doctoral en lnea: http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0226108135555/LRM_TESIS.pdf. Universidad de Barcelona, Barcelona Espaa. Stainer Y. R; Ingraham L. J; Wheelis L. M. (1992) Microbiologa. Barcelona, Espaa: Revert. Volk, W. A; Benjamn D. C; Kadner, R. J; Parsons J. T. (1999) Microbiologa Mdica. (3 Edicin) Mxico, D. F.: Editorial McGraw-Hill. University of Pennsylvania, Gram negativos no fermentadores, P. aeruginosa debe observarse slo en la parte
qu recomendaras para los laboratorios que tienen una alta frecuencia de
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10 TINCIN DE ZIEHL NEELSEN. OBJETIVO: El alumno aprender a realizar e interpretar la tcnica para identificacin de bacterias alcohol cido resistente en muestras de expectoracin. GENERALIDADES: La tuberculosis (TB) en una enfermedad reemergente, con trascendencia epidemiolgica, comportndose de diferentes formas como infeccin: activa, latente, reactiva y resistente. Descrita por primera vez por Roberto Koch hace ms de cien aos, sigue teniendo importancia en la actualidad debido a mutaciones genticas del microorganismo y cepas resistentes. En su mayora se presenta como enfermedad pulmonar localizada y otras veces fuera de ste rgano (meninges, peritoneo, huesos, aparato genitourinario, y todas en conjunto: TB miliar), la causa Mycobacterium
tuberculosis, bacteria aerobia, no formadora de esporas, de estructura delgada como bacilo ligeramente curvo, de crecimiento lento en medio de cultivo y no es fcil que se decolore con alcohol acidificado. Tiene en su pared celular una gran cantidad de lpidos (factor de virulencia), mide de 1 a 10 micras de longitud x de 0,2 a 0,6 micras de ancho, resiste la desecacin, el calor, y se elimina con rayos UV. (Blancarte, Anzaldo y Balandrano 1992) (Fernndez de la vega, Moreno y Gonzlez 2005). Tincin de Ziehl Neelsen. La tcnica para sta prctica es la tincin de Ziehl Neelsen empleando calor, cuyo fundamento se basa en la accin qumica entre el cido miclico que posee el pptidoglucano y la estructura de la carbolfuscina, formando puentes de enlace tan fuertes que impide que penetre el cido, prevaleciendo el colorante inicial, por lo que las bacterias se denominan bacilos alcohol cido resistentes: BAAR. (Rosado, 2000) Sensibilidad. Es una tcnica que complementa identificacin, registro y procedimiento analtico de una muestra para diagnstico de tuberculosis, tiene una sensibilidad del 80 % cuando se recolectan 3 muestras, porque detecta de 5,000 a 10,000 bacterias/ml de esputo, ste es el mtodo ms empleado porque es muy
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rpido y barato, aunque se limita a la diferenciacin de los bacilos en general que resisten la decoloracin. (Fernndez de la vega, et al. 2005) Importancia de realizar el estudio. Representa la clave diagnstica en conjunto con la radiologa y clnica, al identificar microscpicamente al causante de la micobacteriosis, para posteriormente realizar una cuantificacin del resultado positivo y un reporte por cruces nmero contable, encaminado a eleccin del tratamiento con vigilancia, para la recuperacin y xito teraputico. (Blancarte et al 1992) Limitaciones de la tcnica. La tcnica de Ziehl Neelsen es poco confiable en estudio de muestras de orina y lavados gstricos ya que stas muestras contienen bacterias saprofticas, que se presentan alcohol cido resistentes, y no necesariamente pueden ser los causantes de tuberculosis. Para ste tipo de muestras es recomendable la realizacin de cultivo. (Blancarte et al 1992) DESCRIPCIN DE LA TCNICA: Se realiza un extendido con un aplicador de madera a la muestra de esputo, se seca a temperatura ambiente, se realiza una fijacin en la flama del mechero, se procede a realizar la tcnica de Ziehl Neelsen con calor y finalmente la observacin en el microscopio para interpretacin. MATERIAL: Por equipo de 4 Muestra de esputo 4 portaobjetos 4 aplicadores de madera 1 puente de tincin Colorantes para tincin de Ziehl Neelsen (Carbolfucsina, azul de metileno y alcohol cido al 3 %) 2 mecheros 1 lmpara de alcohol 2 microscopios Aceite de inmersin
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METODOLOGA: TOMA DE MUESTRA EXPECTORACIN NATURAL: El paciente debe expectorar en ayunas, en un lugar al aire libre, depositar una primera muestra en el momento de ir al laboratorio en un frasco limpio, hermtico y de boca ancha. La segunda muestra a la maana siguiente, y la tercera al subsecuente. PREPARACIN DEL EXTENDIDO 1. Limpiar el portaobjetos, marcar y enumerar consecutivamente la laminilla colocar las iniciales del paciente comenzando por el apellido paterno. 2. Tomar una porcin mucoide (de preferencia con apariencia caseosa y con sangre) de la muestra con un aplicador de madera quebrado de la punta, hacer un frotis no muy delgado en el centro del portaobjetos en direccin de adentro hacia afuera (medidas de 2 x 1 cm de ancho). 3. Desechar las muestras y aplicadores (ver cuadro de disposicin final) 4. Secar a temperatura ambiente, fijar el extendido pasando 3 veces por la flama adecuada del mechero. TINCIN DE ZIEHL NEELSEN Los frotis se colocan, conservando el orden numrico sobre las varillas de vidrio. 1. Cubrir la superficie del extendido con fucsina fenicada previamente filtrada. 2. Con la llama de un mechero de alcohol calentar suavemente; primero por debajo de las laminillas cubiertas con fucsina, hasta que se produzcan vapores blanquecinos visibles; dejar de calentar y repetir la operacin dos veces ms por 5 minutos, ste es el tiempo adecuado para el contacto entre el extendido y el colorante. En ningn caso la fucsina debe hervir o secarse; si esto ocurre debe reponerse el colorante. 3. Eliminar la fucsina, con agua corriente a baja presin. 4. Cubrir el extendido con alcohol-cido al 3 %. Tomar la laminilla por los bordes del extremo numerado y efectuar un suave movimiento de vaivn de modo que
el alcohol-cido vaya decolorando y arrastrando la fucsina (tiempo aproximado de 1
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minuto). Cuando la solucin decolorante adquiere una coloracin roja, se elimina el alcohol-cido con agua corriente a baja presin. Se considera decolorado cuando las partes ms gruesas de la muestra adquieren un ligero color rosa. Slo si no ha quedado bien decolorado es necesario decolorar nuevamente durante 1 minuto ms.
5. Cubrir la superficie del extendido con azul de metileno durante 1 minuto.
6. Eliminar el exceso de colorante con agua corriente a baja presin. OBSERVACIN: 1. Observar con objetivo de inmersin (100X). Para muestras de diagnstico examinar mnimo 100 campos. (para una muestra de control, toda la laminilla).
2.
La forma de visualizar la laminilla es de izquierda a derecha en zig-zag. (slo se contarn los campos con elementos formes: clulas epiteliales, bacilos, cocos, esporas.
3. La observacin de cada campo debe ser completa, siguiendo la mirada en sentido a las manecillas del reloj. Regla: Nunca teir ms de 12 portaobjetos a la vez. Interpretacin. Los bacilos alcohol cido resistentes aparecen rojos, mientras que otros grmenes o clulas toman distintas tonalidades de azul. Nota: En pacientes de control, los BAAR se observan con estructura fragmentada por accin del tratamiento. Negativo: "No se observan BAAR". Positivo: Se cuantifica: 1 a 9 BAAR en toda la extensin (ms de 100 campos) se informar el nmero contable (x ejemplo: 7 BAAR). Menos de 1 bacilo por campo en promedio de 100 campos. 1 a 10 BAAR por campo en 50 campos. Ms de 10 BAAR por campo en 20 campos.
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Falsos negativos: mala tincin, frotis gruesos o muy delgados, mala fijacin, calidad inadecuada de los colorantes, exceso de decoloracin, pocos campos observados, escasa experiencia del microscopista, muestras paucibacilares (de pacientes en control) con < 100.000 micobacterias/ml. Falsos positivos: Precipitados del colorante, contaminacin cruzada de los portaobjetos durante la tincin, contaminacin de barrido con una laminilla positiva por no limpiar el objetivo de inmersin. RESULTADOS: Muestra # 1 Muestra # 2 Muestra # 3 Muestra # 4
AUTOEVALUACIN. Qu riesgos existen que obligan a tener especial cuidado al realizar la tincin de Ziehl Neelsen? Porqu permanecen teidos con fucsina fenicada solamente los bacilos alcohol acido resistentes y no otros microorganismos presentes en la muestra? REFERENCIAS: Blancarte, L. M., Anzaldo de J. G., Balandrano D. S. (1992) Manual de tcnicas y procedimientos de laboratorio de tuberculosis. (1. Reimpresin).Mxico D. F: Publicacin tcnica del INDRE # 20. Fernndez de la Vega F. A., Moreno J. E., Gonzlez M. J. et al. (2005) Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa clnica. Micobacterias, Protocolos clnicos, Recuperado del 23 de noviembre de 2009 en: http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia Rosado, G. R., (2000) Introduccin a la Glicobiologa. (1. Edicin) Mxico D. F.
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11 EXUDADOS GENITALES. OBSERVACIN DE PREPARACIONES OBJETIVO: El alumno conocer las tcnicas microscpicas que auxilian diagnostico de infecciones en genitales. GENERALIDADES: Un exudado genital es un material biolgico procedente de la uretra masculina o en el caso de la mujer puede ser de uretra, vagina o crvix, con presencia de color y olor caracterstico, que se puede presentar en condiciones infecciosas o no infecciosas de inflamacin y que son la consecuencia de una o ms enfermedades causadas por virus, hongos, parsitos bacterias. (lvarez, Boquet y De Fez; 1990). La observacin de los exudados se puede hacer en fresco suspendiendo la secrecin en solucin salina y en un frotis teido por Gram. En el caso del hombre se toma la muestra de exudado uretral para descartar uretritis ocasionadas principalmente por Neisseria gonorrhoeae, y con menos frecuencia infecciones por Trichomonas vaginalis o Candida albicans. (lvarez et al. 1990). Para la mujer la observacin del exudado en la paciente as como en fresco y teido nos da informacin muy importante acerca de las principales causas de leucorrea como las descritas en la siguiente tabla: en el
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Tabla 1. Caractersticas de las leucorreas.

COLOR Claro CONSISTENCIA Mucoide CANTIDAD + a +++ OLOR Ninguno CAUSA PROBABLES Ovulacin normal Estimulacin estrognica tensin sexual excesiva. Lechoso Viscoso + a +++ No (aminas pH alcalino) Blanco Lquido con partculas como requesn Amarillo verdoso Pardo Acuosa + a ++ Mohoso Neoplasias endometrio de o crvix, trompas, Espumosa + a +++ Ftido Trichomonas vaginalis + a ++ Mohoso Candidiosis Vaginosis bacteriana
otras inflamaciones Gris con filamentos de sangre No viscoso + a ++++ Ftido Cervicitis pigena Toalla absorbente olvidada. Neoplasias vaginales, cervicales o endometriales
(Benson, 1986) Entre las leucorreas mencionadas en la tabla merece mencin especial la Vaginosis Bacteriana que es una patologa en la que no se ha determinado un patgeno nico y que ms bien se tiene definido hasta el momento que se debe a un desbalance de la flora normal con aumento de bacterias anaerobias tipo Mobiluncus y Gardnerella, por lo mismo no se hace un diagnostico por cultivo sino siguiendo los criterios de Amsel que son: 1. Presencia de secrecin con olor y color caracterstico. Realizar ste examen fsico de las caractersticas del flujo nos da un panorama inicial del tipo de microorganismo que podemos encontrar en el exudado. En el caso de la Vaginosis Bacteriana se encuentra una secrecin blanco griscea de consistencia homognea y que puede presentar un olor caracterstico a aminas (Benson, 1986)
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2. pH Necesariamente se tiene que medir el pH de una muestra genital, porque esto sirve de ayuda para valorar de manera inicial, las condiciones qumicas en que un microorganismo oportunista, patgeno o no patgeno, puede invadir y establecer desequilibrio en el rea genital. Muestras que tengan un pH superior al pH normal vaginal de 4.5, estn asociadas a Vaginosis Bacteriana. (lvarez, et al 1990). 3. Clulas clave o clue cells Son clulas generalmente procedentes del epitelio escamoso, que en el examen en fresco se observan con abundantes bacterias en su interior (bacilos delgados, rectos, ligeramente curvos o cocos) o en la membrana celular. (Gram positivos, Gram negativos en conjunto. (Forbes y Sahm, 2004) 4. Prueba de Aminas o de Whiff Es una prueba fundamentada en la produccin de aminas (trimeltilamina, putresina, cadaverina), por bacterias relacionadas con la vaginosis bacteriana y es detectada cuando a la secrecin genital le agrega hidrxido de potasio al 10 %, y se percibe la presencia de olor ftido (olor a pescado). (Azar, Blanco y Otero 2007). La observacin en conjunto de 3 de los 4 criterios, sugiere una probable Vaginosis Bacteriana. Un criterio adicional que nos ayuda a saber si es realmente Vaginosis Bacteriana es observar la tincin con Gram, en la vagina sana hay predominio de bacilos de Dderlein, mientras que en la Vaginosis hay ausencia o poca cantidad de stos y predominan bacilos Gram variables en las clulas epiteliales. (Forbes et al. 2004) DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: El maestro describir e ilustrar mediante una presentacin la toma de muestras y se revisaran secreciones genitales tanto en fresco (solucin salina) como tinciones de Gram en muestras y preparaciones En tincin con Gram se observan de la misma forma, y la coloracin ser variable,
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proporcionadas por el maestro. Se llevar a cabo tambin la prueba de las aminas como parte de los criterios de Amsel.
MATERIAL:
Por equipo de 4 2 microscopios 2 portaobjetos 2 cubreobjetos
Para el grupo Aceite de inmersin 1 gotero con KOH al 10% 1 pipeta Pasteur
METODOLOGA: Buscar e identificar los posibles agentes etiolgicos y clulas importantes de acuerdo a las siguientes tablas y las imgenes. EXMEN EN FRESCO
MUJER Elemento observado Leucocitos PMN Imagen #1. Son indicativos de Agente etiolgico Elemento observado Leucocitos PMN Imagen # 1. o Hifas y esporas de Candida. Son indicativos de HOMBRE Agente etiolgico
proceso inflamatorio. albicans
proceso inflamatorio. Candida albicans o
Hifas y esporas de Candida Candida. # 2.
Imagen Candida sp.
Candida sp.
Trofozoitos Clulas epiteliales
Trichomonas vaginalis. Imagen # 3
Trofozoitos
Trichomonas vaginalis. Imagen # 3 Sern valoradas por cantidad y morfologa. No aplica
Sern valoradas por Clulas cantidad y morfologa. epiteliales No aplica
Clulas clave Imagen # 4.
Probable Bacteriana
Vaginosis
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IMGENES #1 #2
#3
#4
TINCIN DE GRAM Mujer Bacilo de Dderlein. Imagen # 5 Diplococos Gram negativos. Imagen # 6 Bacilos Gram negativos Cocos Gram positivos Clulas clave. Imagen # 7 Cocos Gram positivos Hombre Diplococos Gram negativos. Imagen # 6 Bacilos Gram negativos
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IMGENES #5 #6
#7
Interpretacin: 1+ = 1 a 10 elementos por campo. 2+ = 11 a 20 elementos por campo. 3+ = 21 a 30 elementos por campo. 4+ = ms de 30 elementos por campo.
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PRUEBA DE AMINAS O DE WHIFF 1. Colocar con una pipeta Pasteur una gota del tubo con exudado y solucin salina en un portaobjetos, oler la muestra con cuidado, adicionar una gota de Hidrxido de Sodio (KOH) al 10 %, verificar la presencia o ausencia de olor acercndose el portaobjetos ligeramente. Interpretacin: En una prueba positiva se detecta un olor caracterstico desagradable semejante a pescado en mal estado. AUTOEVALUACIN: Por qu no est recomendado el cultivo de el diagnostico de la Vaginosis Bacteriana? Explique por qu el frotis teido por Gram sirve para el diagnstico de gonorrea en secrecin uretral masculina y en la mujer no tiene la misma especificidad. REFERENCIAS: lvarez M. V., Boquet, B. E; De Fez. y Camino M. I., (1990) Manual de tcnicas en Microbiologa clnica (1 Edicin) Madrid, Espaa: Gars. Azar M. J., Blanco G. M., Lepe J.J. Otero L., et al. (2007) Diagnstico Gardnerella vaginalis en
microbiolgico de las infecciones de transmisin sexual y otras infecciones genitales. Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y
Microbiologa Clnica. Recuperado del 15 de diciembre de 2009 de: http://www.seimc.org Benson; R. C. Modificada de (1986). Diagnstico y Tratamiento Ginecoobsttricos. (4 Edicin) Mxico D. F.: El Manual Moderno. Bonifaz A., (2002) Micologa Mdica Bsica. (2 reimpresin) Mxico, D. F.: Mndez editores. Forbes, B & Sahm, D. (2004) Diagnstico microbiolgico. (11 Edicin). Buenos aires, Argentina: Mdica panamericana.
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12 CANDIDA ALBICANS. IDENTIFICACIN. OBJETIVO: Observar por microscopa y cultivo las caractersticas de un hongo importante por su frecuencia y relevancia clnica en el laboratorio de microbiologa clnica. GENERALIDADES: La Candidiosis es una enfermedad mictica causada por eucariotes oportunistas de ste gnero frecuentemente encontrada en la poblacin comunitaria especial causando vulvovaginitis fngica (en embarazadas y diabticas) y los pacientes
inmunodeprimidos (VIH, Diabetes, Tuberculosis, etc.) Asociada a un 80 % de infecciones nosocomiales, Infecta de manera endgena o exgena. (Heyman, 2005). Existen ms de 150 especies de Candida, las cuales comprenden entre las ms importantes: C. albicans, C. stellatoidea, C. tropicalis, C. dubliniensis, C. parapsilosis, y C. glabrata, La especie de importancia clnica ms aislada: Candida albicans tiene la dimorfismo nutricional presentando una forma capacidad invasora por su
multicelular filamentosa (que es la fase infectante y se encuentra en los tejidos) y su forma levaduriforme que es como se desarrolla en los medios de cultivo de rutina. (Barrenetxea, 2002). Para el aislamiento se utilizarn los siguientes medios: Agar Biggy o Nickerson (bismuto glucosa -glicina). Se observa la produccin de pigmento color caf generado por la reduccin de Sulfito a Sulfuro de bismuto, agente que a la vez funciona como inhibidor de varias especies de Candida, prevaleciendo la especie albicans. (Bonifaz, 2002) Agar Dextrosa Sabouraud. Contiene una concentracin alta de dextrosa, que adems del pH cido, y peptonas, proveen los nutrientes necesarios para el aislamiento de hongos. Se considera el cultivo que permite observar la mayora de las especies de Candida con presencia de pseudomicelio en la superficie del agar. (Bonifaz, 2002)
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Como medio para la identificacin final, se utiliza Corn meal agar (harina de maz agar): Es un medio pobre as en nutrientes, indicado para el crecimiento y desarrollo hifas verdaderas, como se clamidosporas de C. albicans, que
pueden observar en un examen en fresco (ver imagen) con caractersticas de esporas de doble pared. (Bonifaz 2002, Barrenetxea 2002). Caractersticas coloniales en medios de cultivo.
Agar Biggy Dextrosa Sabouraud Corn meal agar Colonias color caf oscuro, de tamao mediano C. albicans: Colonias color blanco, blandas, cremosas. Candida albicans: Colonias color blanco, cremosas y brillantes, de tamao mediano.
Como prueba complementaria para su identificacin adems de la morfologa colonial tenemos la Prueba de formacin de tbulos germinales, que se basa en la formacin estructuras filamentosas (tbulos germinales) a partir de la etapa de levadura con clamidosporas en su estructura media o terminal. sta es una prueba presuntiva para C. albicans. (Heyman 2005). DESCRIPCIN DE LA PRCTICA: 1er. Da. Se realiza el aislamiento de 2 cepas diferentes de para su identificacin por formacin de clamidosporas (Corn Meal). 2do. Da. Se realizan observaciones en cultivo y con solucin salina, para comparacin de las especies aisladas de acuerdo a la Tabla 1 y se observa la prueba de formacin de tbulos germinales.
Candida en 3
medios de cultivo dos para observacin colonial (Biggy y Sabouraud) y uno
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MATERIAL: Por equipo de 4 1 PARTE 2 placas de agar Sabouraud 2 placas de agar Biggy o Nickerson 2 placas de agar para clamidosporas (Corn meal agar) 1 tubo con Candida albicans 1 tubo con cualquier Candida que no sea ni albicans ni stellatoidea 2 mecheros 2 PARTE Gotero con sol. salina Microscopios Portaobjetos Cubreobjetos 1 mechero Material para todo el grupo: 1 pipeta Pasteur 1 vaso de precipitado de 250 ml con cloro. METODOLOGA: AISLAMIENTO 1. En el rea estril del mechero, Inocular cada una de las cepas proporcionadas por el mtodo de aislamiento en los medios: Biggy, Sabouraud y Corn meal agar (en ste medio practicar una serie de incisiones). Hacer una preparacin en fresco con la colonia a observar. PRUEBA DE FORMACIN DE TBULOS GERMINALES 1. Tomar con un asa estril una o varias colonias aisladas y colocar en un tubo de ensayo con 0.5 ml de suero humano. Incubar a 35C, por 3 horas. 2. Depositar una gota de la suspensin sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, colocar un cubreobjetos y visualizar en 40 X. Comparar con una preparacin en solucin salina de una colonia del mismo medio sin incubar. Interpretacin: A las 3 horas de incubacin: Uno o varios tbulos germinales, son sugestivos de Candida albicans. (ver imagen 1).
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Presencia de levaduras en gemacin, solas o en pares sin tubos germinales, son sugestivos de otras especies de Candida. (ver imagen 2)
AUTOEVALUACIN: En qu consiste el dimorfismo nutricional que presenta Candida albicans? Explique porque la prueba de tbulos germinales se puede utilizar en muestras de exudado vaginal y no tiene la misma utilidad en muestras que provengan de infecciones nosocomiales. REFERENCIAS: Bonifaz, A., (2002) Micologa Mdica bsica. (2 Reimpresin). Mxico D.F.: Mndez Editores. Heyman, D. L. (2005) El control de las enfermedades transmisibles. (18 Edicin) Washington D. C: Publicacin cientfica y tcnica. Barrenetxea Z. G. (2002). Vulvovaginitis Candidisica [versin electrnica]. Revista Iberoamericana de Micologa. Bilbao, Espaa. 19 (1) 22-24.
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ANEXO I. Eliminacin del material utilizado y residuos.

Prctica 1 Residuo generado Hisopos Cultivos y Cepas en vidrio o plstico 2 Hisopos Heces fecales Eliminar en bolsa roja (RPBI no anatmico) No es RPBI Cerrar bien el recipiente y eliminar en la bolsa negra (basura municipal). Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Abatelenguas No es RPBI Eliminar en la bolsa negra (basura municipal) 3 Abatelenguas No es RPBI Eliminar en la bolsa negra (basura municipal) Tubos con saliva Tubo con caldo y biofilm 4 5 6 7 Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Orina No es RPBI. Se desecha en drenaje, y el frasco en la Lavar con agua y jabn Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin Eliminacin o tratamiento Eliminar en bolsa roja (RPBI no anatmico) Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin
Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin
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MANUAL DE PRCTICAS DE BACTERIOLOGA CLNICA 2010 bolsa negra (basura municipal). 8 Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Heces fecales No es RPBI Cerrar bien el recipiente y eliminar en la bolsa negra (basura municipal). 9 10 Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Muestra de Esputo Cerrar bien el recipiente y Eliminar en bolsa roja (RPBI no anatmico) Aplicadores de madera 11 12 Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Cultivos y Cepas en vidrio o plstico Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin Eliminar en bolsa roja (RPBI no anatmico) Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin Quitar etiquetas y pasar a esterilizacin
RPBI eliminados de acuerdo a la NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOLSSA1-2002, Proteccin ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Clasificacin y especificaciones de manejo.
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NDICE CAPTULO I INTRODUCCIN ................................................................................................... 2 CAPTULO II REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BACTERIOLOGA ................................ 3 CAPTULO III PRCTICAS DE LABORATORIO.

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CAPTULO III. PRCTICAS 1 SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

necesitan ser sometidos a un antibiograma, por ello es preciso entender diversos

son exclusivamente bacteriostticos logran la destruccin bacteriana

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(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI, 2004)

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Escaso contenido de cationes divalentes pH menor a 7.2 pH menor a 7.2

correspondiente antimicrobiano. (Picazo, 2000)

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RESULTADOS: Se llenar la utilizados.

siguiente tabla de acuerdo a los

Microorganismo: Antibitico Halo (mm) Criterio (S,R,I)

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METODOLOGA: TOMA DE MUESTRAS. NASAL

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http://www.bago.com/BagoArg/Biblio/gastroweb198.htm. Prats G. (2006) Microbiologa clnica. Madrid: Panamericana.

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BIOFILMS. OBSERVACIN IN VIVO Y FORMACIN IN VITRO.

las bacterias sufren cambios fenotpicos en el biofilm, presentan tambin una

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GNERO STAPHYLOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN.

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Tabla 1. Medios de cultivo para Staphylococcus.

COMPONENTE QUE LOS HACE SELECTIVOS

COMPONENTE QUE LOS HACE DIFERENCIAL

CARACTERSTICAS DE LAS COLONIAS

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Efectuar una tincin de Gram de cada especie y comparar su morfologa

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Tabla 3 Pruebas de Identificacin.

Coagulasa DNasa Novobiocina

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GENERO STREPTOCOCCUS. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

patgenos ms frecuentes son: S. pyogenes (grupo A), S. agalactiae (grupo B),

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grande estrecha de medio

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TOLERANCIA AL CLORURO DE SODIO (6.5 %) incubar 24 horas a

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RESULTADOS: Tabla 2 Resultados de pruebas de identificacin.

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CULTIVO DE EXUDADO FARNGEO.