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Estructura Tridimensional de las Protenas.

Introduccin El captulo anterior se constituye en la introduccin al concepto de estructura en las protenas, mencionando brevemente los niveles de organizacin espacial. En el presente, se exploran las caractersticas e implicaciones que la ubicacin tridimensional tiene sobre el concepto de protena. En primera instancia, se revisa la relacin entre la secuencia de aminocidos y orden tridimensional de las protenas. En segundo lugar se estudia la relacin entre estructura tridimensional y funcin proteica mientras que en el tercer apartado se analiza como la estructura tridimensional activa en una protena es nica (o est cerca de serlo) y, finalmente se da cuenta de la explicacin de como las fuerzas que son responsables de preservar la estructura tridimensional, son no covalentes. La estructura nativa La columna vertebral de las protenas est formada por miles de enlaces. Estos enlaces tienen en puntos especficos, rotaciones libres que se traducen en un ilimitado nmero de organizaciones que se denominan CONFORMACIONES y que corresponden al arreglo espacial de los tomos en las protenas. La CONFORMACIN qumicamente se refiere a un estado estructural que puede interconvertirse en otro estado estructural sin romper enlaces covalentes en el proceso de transformacin.1 Dentro de las miles de conformaciones posibles solo una (o muy pocas) predominan en las condiciones biolgicas. Generalmente esta conformacin es la ms estable desde la perspectiva termodinmica (dado que posee la ms baja energa de Gibbs) y su organizacin tridimensional (o plegamiento) es la que da cuenta de la forma funcional, a la que se denomina estructura NATIVA. Conceptualmente la estructura de las protenas se considera a cuatro niveles (recordar figura 7-1), donde los tres niveles superiores se refieren a aspectos tridimensionales. La estructura secundaria se relaciona con los arreglos espaciales que ocurren entre residuos de aminocidos adyacentes. La 3ria interpreta la estructura espacial de toda la cadena polipeptdica; y para protenas con ms de una cadena polipeptdica, aparece un cuarto nivel de organizacin que se denomina estructura cuaternaria y que hace relacin a las interacciones entre subunidades. En general la conformacin de las protenas se estabiliza por un gran nmero de interacciones dbiles, considerndose que la estabilidad es la tendencia de una protena a preservar la conformacin nativa. En estos estudios conformacionales se denomina DOMINIO a una regin compacta de entre 40 y 400 aminoacidos que se distinguen como una unidad estructural a lo largo de una cadena polipeptdica. Para una cadena se pueden encontrar muchos dominios independientes y en conjunto dan origen a una estructura termodinmicamente estable. (ver figura 8-1)

1 Carey, F.A. and Sundberg R. (2000) Advanced Organic Chemistry. Fourth Edition ED. Kluwer Academic

Figura 8-1 Dominios en una cadena polipeptdica Es importante tener en cuenta que la conformacin NATIVA (conformacin biolgicamente activa en una macromolcula) es un estado marginal, dado que la diferencia de energa libre entre una protena plegada o no plegada para una protena tpica (y en condiciones fisiolgicas) es solo de entre 20-65 kj/mol. Tericamente una cadena polipeptdica puede asumir incontables conformaciones y en condiciones desplegadas, las protenas se caracterizan por poseer un alto grado de "entropa conformacional". Esta alta entropa adems de otras interacciones entre sustrato-disolvente (protena-agua) mantienen la condicin desplegada. La formacin de enlaces est acompaada de cambios favorables (negativos) en la energa libre. En general, la conformacin de una protena que tiene la menor energa libre (ms estable) es aquella donde se da el mximo de interacciones dbiles (puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas e inicas) ms los puentes disulfuro. Sin embargo la estabilidad proteica no es solo la sumatoria simple de interacciones dbiles. En este punto es importante recordar que para romper un enlace simple se requiere entre 200-460 kJ/mol, mientras que el rompimiento de una interaccin dbil supone el empleo de entre 4-30 kJ/mol. En las protenas, la importancia de las interacciones dbiles est en su nmero y por esto, se sostiene que la conformacin con ms baja energa libre (normalmente la nativa) es la que posee el mayor nmero de interacciones. Tal y como se plante anteriormente, la sumatoria de las energas libres de las interacciones dbiles no explica la estabilidad de una protena ya que al considerar los estados PLEGADO y NO PLEGADO se dan diferencias de energa libre cercanas a cero. Para poder entender porqu a pesar de que la diferencia entre estructura plegada y no plegada es tan baja, se tiene en cuenta que en condiciones fisiolgicas la estructura nativa es dependiente de las interacciones con el agua. Cuando una molcula hidrofbica interacciona con el agua, promueve la formacin de una concha o capa de solvatacin, que implica un aumento en el orden y por consiguiente una disminucin de la entropa; si se incrementa significativamente el nmero de molculas hidrofbicas en un seno acuoso el rumbo hacia la agrupacin (micelas) minimiza el numero de interacciones (polar-no polar) lo que es coherente con la condicin de espontaneidad. En una molcula proteica la evolucin ha marcado un comportamiento en donde los grupos no polares establecen interacciones que conducen a la disminucin en la capa de solvatacin, que a su vez conduce a una disminucin del orden y por tanto un aumento de la entropa. Esto establece un arreglo tpico: Hidrofbicos dentro e Hidroflicos fuera.

3 En condiciones fisiolgicas los puentes de hidrgeno y las interacciones inicas rigen los efectos entrpicos en las protenas. El agua pura posee un mayor nmero de puentes de hidrgeno que una solucin cuando se estima sobre la siguiente premisa: # de puentes/unidad de masa. La organizacin promovida por la interaccin con el agua (interior-exterior) incide en las interacciones polares, que ahora se dan al interior de la protena, contribuyndose en gran medida a una forma plegada (nativa). En resumen se tienen dos reglas generales: 1) Los residuos hidrofbicos estn fuertemente enterrados al interior de la protena. 2) El nmero de puentes de hidrgeno al interior de la protena se maximiza. Caractersticas de los enlaces peptdicos.

Los carbonos adyacentes en un enlace peptdico estn distanciados por 3 enlaces covalentes: La difraccin de rayos X mostr que el enlace C-N es ms corto en pptidos que en aminas, hecho que se ajusta adecuadamente con dos atributos orgnicos: Resonancia y planaridad. En la figura 8-2 se da cuenta clara de que los 6 tomos involucrados en el enlace peptdico estn en el mismo plano y adems el oxgeno y el hidrgeno se encuentran en posicin trans. Por tanto, la columna vertebral de los pptidos es una estructura rgida. Pauling y Corey concluyeron que el enlace peptdico est imposibilitado para rotar

C C

Figura 8-3 grfico de Ramachandran para las rotaciones de los enlaces y

Figura 8-2 El enlace peptdico

4 libremente por la existencia de la resonancia, siendo la rotacin libre restringida a los enlaces: N-C y C-C. Esto puede resumirse en una sentencia simple: La rigidez del enlace peptdico limita la cantidad de conformaciones que puede asumir la cadena polipeptdica. En 1951 y a partir de todas estas evidencias experimentales, Pauling y Corey propusieron la existencia de una estructura secundaria en las protenas, siendo la hlice y la conformacin las dos ms importantes. Estas predicciones fueron posteriormente ratificadas con la elucidacin estructural de las protenas. Al considerar la estructura secundaria, las protenas se pueden clasificar en dos grandes grupos: Protenas globulares y fibrosas. Las fibrosas estn normalmente relacionadas con aspectos estructurales, mientras que las globulares casi siempre son de carcter funcional. En los pptidos cada enlace peptdico presenta resonancia, lo que impide la rotacin y adems, posibilita la generacin de un pequeo dipolo soportado sobre los tomos de oxgeno y nitrgeno. Otra caracterstica importante de este tipo de enlace es que los tomos de oxgeno e hidrgeno se encuentran en posicin trans. Los enlaces denominados y presentan rotaciones que se pueden incluir en el intervalo -180 + 180. La figura 8-3 muestra, mediante las grficos tipo "Ramanchandran" las conformaciones para la mayor parte de los residuos aminoacdicos involucrados en los enlaces y . Pauling y Corey igualmente mostraron que los puentes de hidrgeno eran una consecuencia de la orientacin de los grupos polares -C=O y -N-H presentes en los enlaces peptdicos.

Figura 8-4 La hlice en las protenas

Con los estudios realizados sobre protenas estructurales, se observaron eventos que se repetan cada 0.54 nm (que corresponde a 3.6 aminoacdos) y al resolver toda esta informacin, propusieron una estructura helicoidal que denominaron hlice que se puede ver en las figuras 8-4 y 8-5 No todos los polipptidos pueden formar una hlice estable. Por ejemplo, la carga negativa del grupo carboxlico del Glu reduce la estabilidad de los

8-5 Vista superior de la hlice

5 puentes de hidrgenos e igualmente, la carga positiva tambin puede afectar la estabilidad. Otro hecho que tambin afecta la hlice es la interaccin entre los aminocidos Pro que se encuentran espaciados a 3 (o 4) residuos; finalmente los dipolos que aparecen como consecuencia de los enlaces peptdicos. En la figura 8-6 se ilustran los dipolos y la interaccin entre aminocidos espaciados. En sus trabajos sobre estructura de protenas, Pauling y Corey, tal y como se plante anteriormente, dedujeron un segundo tipo de organizacin estructural denominada conformacin . La conformacin es el tipo de organizacin tridimensional ms comn en las protenas fibrosas tales como la queratina. La organizacin se clasifica a dos niveles segn sean las partes involucradas y se denominan Intracadena e Intercadenas. En el caso de las interacciones entre cadenas (intercatenarias) los puentes de hidrgeno permiten el ensamblaje de

Figura 8-6 Perturbaciones de la helica varias cadenas polipeptdicas.

En la figura 8-7 se presentan los modelos de conformaciones antiparalelas (amino terminal y carboxilo terminal con orientaciones inversas en cadenas adyacentes) y paralelas.

Figura 8-7 Conformaciones tipo . Antiparalela y paralela Los grupos R en los residuos de aminocidos juegan un papel crtico en las conformaciones dado que cuando son voluminosos disminuyen la estabilidad, siendo los aminocidos Gly y Ala los que generan menor impedimento estrico y por tanto favorecen esta organizacin tridimensional. Existen otros tipos de estructuras secundarias que tambin son comunes en las protenas tales como " bend" o " turn" que se asocian principalmente a cambios abruptos en la direccin de la organizacin secundaria de una cadena polipeptdica. En la figura 8-8 se presentan los valores de los enlaces y de los diferentes tipos de conformaciones secundarias de protenas. Ntese que en lo que respecta a la hlice se dan dos orientaciones (izquierda Figura 8.8 Valores de y para diferentes y derecha). estructuras secundarias de protenas

7 La organizacin tridimensional que considera el arreglo de todos los tomos en una protena se denomina ESTRUCTURA TERCIARIA. Se estima que la estructura terciaria es una consecuencia de las interacciones de la secuencia polipeptdica y de los efectos a "larga distancia". La formacin de torsiones en la cadena polipeptdica durante el plegamiento as como la direccin y los ngulos correspondientes, estn determinados por la presencia de diferentes aminocidos tales como Pro, The, Ser y Gly. Por difraccin de rayos X se ha establecido que, por ejemplo, en la mioglobina el eje central de la protena es un conjunto de hlices interrumpidas por abruptas curvaturas. A medida que se profundiza en el estudio de la estructura terciaria de protenas, se ha establecido que existen muchos tipos de organizaciones y para los cuales la posicin de los sustituyentes R puede conferir un ambiente hidrofbico o hidroflico. Se puede plantear que el extremo contrario a la alta organizacin observada en la estructura nativa lo constituye el proceso denominado DESNATURALIZACIN. Cuando se llega a este estado se obtiene una estructura tridimensional azarosa y que se caracteriza por haber perdido su actividad funcional. El incremento de la temperatura, el cambio en el pH ptimo, el uso de disolventes orgnicos o cambios abruptos en las concentraciones salinas, pueden ocasionar este fenmeno de desnaturalizacin. El proceso contrario a la desnaturalizacin se conoce con el nombre de renaturalizacin y a pesar de no ser un proceso generalizado, se ha observado en una gran cantidad de protenas. Es precisamente el estudio en detalle de este ltimo proceso lo que a permitido plantear que la estructura funcional en un poliptido est ntimamente relacionado con la secuencia de aminocidos.

Figura 8-9 Proceso de renaturalizacin de la ribonucleasa

8 Un ejemplo clsico es el que sufre la ribonucleasa al ser expuesta a un agente reductor en una solucin de urea concentrada, tal y como se ilustra en la figura 8-9

9 Un hecho de capital importancia para el entendimiento de los denominados sistemas complejos ha sido el estudio de "la ruta" de renaturalizacin de las protenas y todo apunta a que el proceso es termodinmicamente muy bien definido. En la figura 8-10 se da cuenta de los pasos generales del proceso de renaturalizacin. En una primera fase se alcanza una organizacin secundaria localizada en diferentes puntos de la protena. Para la segunda fase, el orden local alcanzado induce interacciones de "larga distancia" que aumentan la estabilidad hasta completar el proceso de plegamiento. La condicin final alcanzada es tal que generalmente representa la conformacin termodinmicamente ms estable.

Figura 8-10 Posible ruta de plegamiento de una protena Algunas protenas poseen 2 o ms cadenas polipeptdicas o subunidades. Al arreglo tridimensional que es consecuencia de la interaccin de las subunidades se denomina ESTRUCTURA CUATERNARIA. Las interacciones que se observan entre las subunidades son las mismas que en gran medida estabilizan la estructura terciaria: Mltiples Interacciones no Covalentes. En la figura 8-11 se presenta la estructura cuaternaria de la protena tetramrica deoxihemoglobina.

Figura 8-12 termodinmicos plegamiento de

Aspectos del protenas

Figura 8-11 Estructura de la Deoxihemoglobina

10 El plegamiento o desnaturalizacin de una protena se representa en la figura 8-12 en donde se reconoce el proceso general conformacional de una protena: Protena desplegadaprotena nativaprotena desnaturalizada. El estado desplegado de la protena se caracteriza por: Alto grado de entropa conformacional Alta energa libre. Un bajo porcentaje de residuos en conformacin nativa.

La estructura nativa representa el estado opuesto: Baja entropa conformacional. Baja energa libre. La totalidad de los residuos en la conformacin nativa.

En algunos casos la estructura tridimensional de una protena no se adquiere bajo condiciones ambientales controladas y el proceso de plegamiento requiere de la contribucin de un complejo proteico denominado chaperonas. Estas herramientas de organizacin han sido descritas en todos los tipos de organismos. En la figura 8-13 se presenta un modelo del plegamiento de protenas mediado por chaperonas, que son protenas que a costa de gasto energtico, promueven la aparicin de una estructura tridimensional especfica.

Figura 8-13 Plegamiento por chaperonas

11 La figura 8-14 resume las organizaciones tridimensionales que dan origen a la clasificacin estructural de las protenas, mientras que en la figura 8-15 se presenta la clasificacin de protenas basada en la estructura tridimensional.

Figura 8-14 Plegamiento parcial en protenas.

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13 TALLER 8
1. Para el pptido propuesto en el punto 5 del taller 6, seale los enlaces y para la tirosina 2. Clasifique los siguiente aminocidos como constituyentes principales de hlices u hojas , adems ubquelos en los diagramas de Ramachandran

Glutamato, metionina, leucina, valina, isoleucina, fenilalanina

3. Cul es la diferencia entre coagulacin y precipitacin de protenas?, establezca parmetros fsicos y qumicos que favorezcan cada una de ellas y explique el motivo 4. Explique los procesos de desnaturalizacin y adquisicin de la estructura nativa, en trminos termodinmicos 5. Realice un resumen de la clasificacin estructural de las protenas, cules son los principales elemetnos tridimensionales utilizados para dicha clasificacin? 6. Identifique las interacciones qumicas responsables de cada uno de los niveles de organizacin estructural (estructuras 1, 2, 3 y 4) de las protenas y explique cmo cada uno de ellos influye en la estructura tridimensional y funcin de las mismas 7. Defina los siguientes trminos: a. Estructura primaria b. Estructura secundaria c. Motivo d. Estructura terciaria e. Dominio f. Protena filamentosa o fibrosa g. Protena fibrosa h. Estructura cuaternaria i. Unin cooperativa