CASTELANI, L. e DUARTE, K.M.R. Mtodos moleculares em microbiologia de alimentos. PUBVET, Londrina, V. 5, N. 2, Ed. 149, Art. 1000, 2011.

PUBVET, Publicaes em Medicina Veterinria e Zootecnia.

Mtodos moleculares em microbiologia de alimentos

Lvia Castelani1 e Keila Maria Roncato Duarte2

1

Mestrando do curso de Produo Animal Sustentvel, Instituto de Zootecnia.

Nova Odessa. e-mail: livia_cast@yahoo.com.br

2

Pesquisadora Cientifica. CPDNAP Instituto de Zootecnia. Rua Heitor Penteado,

56 Nova Odessa, SP 13460-000. e-mail: keila@iz.sp.gov.br

Resumo As tcnicas moleculares constituem-se hoje em ferramentas de alto valor para identificao de patgenos em alimentos, sejam quaisquer forem suas origens. Nesta reviso esto listados a maioria dos testes moleculares utilizados em microbiologia de alimentos, com exemplos de uso. A aplicao de tcnicas mais eficazes permite que erros na identificao e conseqentemente no tratamento do paciente e erradicao do patgeno sejam cada vez menos freqentes, melhorando a sade tanto dos animais de produo como da populao, ambos acometidos por infeces alimentares.

Molecular methods for food microbiology

Abstract Molecular techniques are nowadays a valuable tool for food pathogens identification, no matter its origin. In this review, the major molecular

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techniques are listed for food microbiology tests. The use of most efficient techniques as molecular ones, allows errors in the identification and

consequently in the treatment of humans and livestock animals less frequent, improving health fast treatments for food infections.

Introduo As doenas ocasionadas por patgenos alimentares so de grande relevncia econmica e para a sade pblica. O risco de disseminao destes microrganismos vem crescendo continuamente, e a implantao de programas de controle de qualidade se torna imprescindvel. A utilizao de mtodos de deteco de microrganismos uma das ferramentas que garantem a segurana microbiolgica dos alimentos. Mtodos tradicionais utilizados em microbiologia so baseados nos aspectos morfolgicos e bioqumicos dos microrganismos para tipagem, subtipagem e identificao de gneros, espcies e subespcies microbianas. Estas anlises so realizadas em meios de cultura no-seletivos e seletivos complementadas por testes bioqumicos diferenciais juntamente com testes sorolgicos (1). Entretanto, estas tcnicas, embora

confiveis e eficientes, requerem vrios dias ou mesmo semanas para se obter os resultados. E as bactrias podem no expressar suas propriedades fenotpicas pelas quais so identificadas (2). A descoberta de Kary Mullis, em meados da dcada de 80, da reao em cadeia de polimerase (PCR), revolucionou a biologia, tanto na rea de pesquisa, quanto nas reas aplicadas. As tcnicas moleculares tm aplicao direta na deteco e caracterizao de bactrias patognicas (3). O desenvolvimento da tcnica de amplificao de sequncias especficas de cidos nuclicos por PCR veio colmatar a dificuldade das anlises efetuadas com pequenos fragmentos ou pequenas quantidades de DNA e permitir a tipagem rpida de microrganismos, tornando-se uma ferramenta valiosa na identificao e classificao de bactrias. Segundo Marlony et al. (4), a

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introduo da tcnica de PCR em diagnstico microbiano estabeleceu uma alternativa vivel aos mtodos tradicionais de cultura.

Tcnicas moleculares

PCR - Reao em cadeia da polimerase

A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) uma tcnica altamente sensvel, por meio das quais pequenas quantidades de sequncias de DNA ou RNA especficas podem ser enzimaticamente amplificadas at que sejam obtidas milhes de cpias da seqncia alvo (5). A PCR uma das tcnicas mais empregadas nas diversas reas do diagnstico molecular. uma tcnica bastante flexvel que permite uma srie de modificaes que possibilitam o seu emprego na anlise de uma grande variedade de amostras. Entretanto, sua implementao na rotina laboratorial requer um alto investimento em equipamentos e reagentes. Tambm no h padronizao e regulamentao de rgos oficiais quanto s tcnicas (4). Conforme Boer e Beumer (6), outra desvantagem da tcnica de PCR est na complexidade da anlise. Para a realizao da PCR, utiliza-se uma enzima termoestvel (DNA polimerase) que na presena de um par de oligonucleotdeos iniciadores (primers) e dos nucleotdeos que compem a molcula de DNA, amplifica a regio de interesse a partir de uma pequena quantidade de DNA. Esta amplificao ocorre durante repetidos ciclos de temperatura em equipamentos denominados termocicladores. O DNA amplificado pode, ento, ser separado e visualizado em gis de agarose ou poliacrilamida e utilizado para diversos fins (7).

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Esquema representativo da PCR.

Fonte: Molina e Tobo (7)

RAPD - Random Amplified Polimorphic DNA

RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) ou AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) uma variao da PCR clssica e foi proposta por Welsh & McClelland em 1990 (8) para anlise de DNA genmico de uma variedade de espcies. A tcnica baseia-se na anlise do polimorfismo dos fragmentos de DNA amplificado aleatoriamente. Resulta da utilizao de uma sequncia iniciadora arbitrria (com cerca de 9, 10 pares de bases), combinado com dois ciclos de PCR de baixa restringncia e muitos ciclos de alta restringncia, que gera um conjunto de produtos de amplificao, com diferentes tamanhos e

reprodutibilidades, caracterstico de um genoma particular. A base desta anlise assenta no fato de, a uma temperatura suficientemente baixa, um iniciador poder formar hbridos com muitas sequncias, mesmo no sendo estas inteiramente complementares. Quando algumas destas regies se encontram distanciadas de algumas centenas de pares de bases e em cadeias opostas, o processo de amplificao ocorrer. Na maior parte dos casos, as sequncias iniciadoras que geram o melhor perfil de DNA para diferenciao so determinadas empiricamente (9).

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A principal vantagem desta tcnica sobre a PCR tradicional a possibilidade de detectar polimorfismos do DNA sem a necessidade de conhecimento prvio da sequncia de nucleotdeos de um gene relevante ou do DNA alvo (1). No entanto, as dificuldades de padronizao (condies reacionais muito variveis em funo das sequncias iniciadoras) e de reprodutibilidade so as principais limitaes desta tcnica. Alm disso, o processo de amplificao extremamente sensvel a pequenas diferenas de temperatura de hibridao, conduzindo a variabilidade nos perfis (9). O mtodo de RAPD tem sido usado com sucesso em tipagem de isolados da espcie Staphylococcus aureus (10) e de bactrias do complexo B. cepacia (11).

REP, ERIC, BOX

tcnica

REP-PCR

utiliza

sequncias

oligonucleotdicas

iniciadoras

complementares de sequncias de DNA repetitivas muito conservadas e presentes em numerosas cpias no genoma da maioria das bactrias Gram negativas e de vrias bactrias Gram positivas. Existem trs famlias de sequncias repetitivas: as sequncias REP (Repetitive Extragenic Palindromic) com 35-40 pares de bases, as quais so conservadas em vrias espcies bacterianas; as sequncias ERIC

(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) de 124-127 pares de bases, as quais contm um elemento repetitivo central invertido altamente

conservado e que esto localizados nas regies extragnicas do genoma bacteriano (9); e o BOX de 154 pares de bases, que apresentam trs subunidades (Box A, Box B e Box C), localizadas em regies intergnicas distintas ao redor do genoma (12). Os elementos repetitivos podem estar presentes em ambas as orientaes e os iniciadores esto concebidos de forma a permitirem a sntese de DNA a partir da repetio invertida, nos REP e ERIC-PCR, e da subunidade boxA, nos

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BOX-PCR, amplificando assim regies genmicas distintas localizadas entre os elementos repetitivos. Segundo Hulton et al. (13), as sequncias REP e ERIC foram inicialmente identificadas com base na informao proveniente da sequenciao dos genomas de Escherichia coli e de Salmonella typhimurium, mas existem numerosas descries da sua existncia noutras espcies bacterianas. A sua amplificao por PCR pode ser feita com um nico iniciador, com um par ou vrios pares de iniciadores. Segundo Alves et al. (14), este mtodo extremamente fivel,

reprodutvel, rpido e altamente discriminativo. Esta tcnica tornou-se uma ferramenta valiosa na identificao e classificao de bactrias, e em estudos epidemiolgicos de patognicos de humanos e fitopatognicos.

RFLP-PCR - Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms

A tcnica de RFLP-PCR (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphisms) baseia-se na hidrlise do DNA com enzimas de restrio e posterior separao, por eletroforese, dos fragmentos gerados, que correspondem a padres de restrio especficos. Estes padres podem ser caractersticos ao nvel da espcie ou mesmo ao nvel da estirpe, dependendo do grau de heterogeneidade genmica intraespecfica (14). Uma vez que estirpes distintas apresentam diferenas (ainda que, por vezes, mnimas) ao nvel do genoma, o que esta tcnica explora a possibilidade dessas diferenas se encontrarem no interior da sequncia de reconhecimento das enzimas de restrio utilizadas (9). Esta tcnica foi desenvolvida por Shangkuan et al. (15) para anlise da diversidade genmica de 21 cepas de Bacillus anthracis e de 28 cepas de Bacillus cereus, que concluram que esta apresenta metodologia simples e de rpida execuo para tipagem e discriminao de B. anthracis e de B. cereus de outras bactrias do mesmo gnero.

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Segundo Alves et al. (14), a RFLP-PCR apresenta como vantagens o fato de ser altamente reprodutvel e de no necessitar de informao prvia sobre a sequncia de DNA. Embora esta anlise seja dificultada pelo elevado nmero de fragmentos, possvel restringi-la a uma gama de pesos moleculares correspondentes zona de maior resoluo do gel. Entretanto, apresenta-se uma desvantagem de analisar apenas uma frao do genoma.

Ribotipagem por PCR

Esse mtodo utiliza sequncias iniciadoras complementares s sequncias conservadas dos genes que codificam as subunidades 16S e 23S do rRNA, para diferenciar estirpes de bactrias com base nos polimorfismos da regio espaadora intergnica 16S-23S do operon do RNA ribossmico (16). Todas as bactrias possuem mltiplas cpias dos genes que codificam o RNA ribossmico. Assim, cada operon de rRNA contm uma regio espaadora com um tamanho potencialmente diferente e a amplificao destas regies pode originar um perfil caracterstico. E a variao no nmero, tamanho e composio destas regies espaadoras que permite a maior ou menor discriminao entre isolados (9). Com a utilizao desta tcnica, pode-se tambm realizar a digesto dos fragmentos amplificados com uma enzima de restrio, realizar corrida eletrofortica, transferir os fragmentos desnaturados para um filtro, hibridizar com uma sonda marcada e revelar os padres de bandas (1). O PCR ribotipagem um mtodo rpido que exige pequenas quantidades de DNA e simples e sensvel, possibilitando a anlise rpida de um elevado nmero de estirpes. Pode ser utilizado com sucesso na diferenciao de estirpes que possuam grande heterogeneidade dentro dos operons do rRNA. Entretanto, o poder discriminatrio deste mtodo geralmente no to bom quanto o de REP-PCR e RAPD, devido essencialmente pequena poro do genoma examinada.

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Esta tcnica foi j aplicada com sucesso e boa reprodutibilidade em diversos estudos para identificao de isolados das espcies Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Burkholderia cepacia e em algumas espcies de Enterobacter (17). Ferreira, et al. (18), utilizaram a tcnica de PCR ribotipagem para avaliao dos padres de resistncia a antimicrobianos de 77 estirpes de Staphylococcus aureus isoladas de amostras de leite de casos de mastite subclnica bovina, e demonstraram que a PCR ribotipagem mais adequada que os testes in vitro de sensibilidade aos antimicrobianos, por apresentarem maior capacidade discriminatria.

PCR em tempo real

A reao de PCR tradicional fornece caractersticas qualitativas, o que limita a tcnica para estudos quantitativos. Em funo desta limitao, desenvolveu-se a tcnica de PCR em tempo real (Real Time PCR). A PCR em tempo real permite a quantificao dos produtos de amplificao gnica em todas as fases de uma reao de PCR (19). Durante a reao, o acmulo de amplicons detectado em "tempo real", para cada ciclo, por meio da excitao de fluorocromos que marcam sondas sequnciaespecficas ou primers usados na reao. O uso de transcrio reversa associada a PCR em tempo real tornou a quantificao de mRNA mais simples e precisa (20). A PCR em tempo real requer uma plataforma de

instrumentao que contm um termociclador acoplado a um sistema tico para a excitao da fluorescncia e captura da emisso, alm de um computador para aquisio de resultados e anlise final da reao (21). Kimura et. al (22) propuseram o uso da tcnica de PCR em tempo real para monitoramento de cepas de Clostridium botulinum tipo E em amostras de cultura pura e amostras de peixe embalado em atmosfera modificada contaminadas por C. botulinum, demonstrando que o PCR quantitativo um

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mtodo altamente sensvel rpido para avaliao do risco do botulismo em amostras de peixe. No estudo realizado por Oliveira (23), onde se avaliou 30 amostras de palmito comercial industrializados, a tcnica de PCR quantitativa mostrou-se como uma alternativa vivel para o teste da presena da neurotoxina botulnica do tipo A.

PCR Multiplex

A PCR Multiplex (mPCR) uma variao da PCR tradicional, e vem sendo empregada de maneira crescente nos ltimos anos. Baseia-se na utilizao de mais de um par de primers na mesma reao, o que torna possvel a amplificao simultnea de mais de uma seqncia de DNA e a identificao de mais de uma espcie bacteriana atravs da mesma PCR, promovendo uma anlise mais ampla, mais rpida e mais barata (1;24; 25). Desde sua introduo, a mPCR tem sido aplicada com sucesso em muitas reas de diagnstico de DNA, incluindo anlise de deleo, mutao e polimorfismo, anlise quantitativa e deteco de RNA. Zoche et al. (26), avaliaram a tcnica de PCRm na deteco dos genes de EEA, EEB, EEC e EED de Staphylococcus aureus presentes em alimentos de origem animal (leite in natura, queijo, charque, embutidos crneos e carcaa de frango) e concluram que a metodologia eficiente. Silva (25), analisando leite de vacas com mastite, confirmou a eficcia da PCRm como mtodo diagnstico, demonstrando ser uma tcnica rpida, por utilizar diretamente o leite bovino, sem a necessidade de pr-tratamentos ou de isolamento bacterianos; tambm confirmou possuir boa sensibilidade e reprodutibilidade nos resultados.

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RT-PCR

tcnica

de

RT-PCR

(Reverse

Transcriptase

PCR)

baseia-se

na

amplificao de DNA obtido por meio da transcrio reversa de RNA. Atravs da enzima transcriptase reversa (RT), o RNA convertido em DNA

complementar (DNAc), que posteriormente amplificado por PCR (27). Esta metodologia pode ser utilizada na anlise de expresso de genes de virulncia e/ou produo de toxinas em alimentos, pois amplifica o RNA viral. As principais vantagens dessa tcnica incluem a rapidez na obteno dos resultados, a no exigncia da infecciosidade da partcula viral e, quando devidamente padronizada, as altas taxas de sensibilidade e especificidade (28;29).

Concluso

Qualquer mtodo utilizado para tipagem gentica de microrganismos deve permitir a diferenciao clara de estirpes, e principalmente, deve possuir uma elevada reprodutibilidade. Todos os mtodos possuem vantagens e

desvantagens. Como tal, a escolha da tcnica a ser utilizada deve ser feita de acordo com a finalidade pretendida, como identificao e diferenciao do microrganismo, entre outros aspectos como poder discriminatrio,

sensibilidade e especificidade, reprodutibilidade, custos abrangidos, etc.

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