Microbiologa parcial 2.

Citoplasma Bacteriano (protoplasma).

1. Parte de la clula que est dentro de la membrana citoplasmtica. 2. Tiene una consistencia parecida a un gel: compuesto de agua, enzimas, sustancias nutritivas, desechos, y gases. 3. Contiene estructuras celulares: ribosomas, cromosoma y plsmidos. 4. La matriz citoplasmtica son las sustancias dentro de esta membrana, excluyendo el material gentico. 5. Material gentico. En bacterias el 90% es expresable y 10 % es regulatorio (no se expresa); en levaduras el 70% es expresable, mientras que en el ser humano, slo el 3%. Cromosoma (ADN) disperso en el citoplasma bacteriano (Tambin es llamado nucleoide). Puede ser circular o lineal (como en actinomicetos o streptomyces). El ADN circular se encuentra superenrollado y se organiza en dominios mediante las protenas like histonas (por ejemplo H, HU, IHF, H1, HLP1, P), para formar hebras infraenrolladas. Existen enrollamientos positivos (hlice sobreenrollada, que se protege contra radiaciones) y negativos (infraenrollada, es ms comn). En el proceso de enrollamiento, participan las enzimas topoisomerasas que tuercen la hebra. Ejemplos de topoisomerasas: ADN-girasa (clase II): Es blanco de algunos antibiticos, est presente en bacterias y muchas arqueas. Topoisomerasa I: elimina el superenrollamiento y regresa la cadena al estado relajado Plsmidos. Son porciones de material gentico extracromosmico, en general son circulares pero existen algunos lineales. Pueden ser unicopia (una sola replicacin por ciclo celular que se coordina con la replicacin genmica) o multicopia (pueden reproducirse varias veces, independientes a la reproduccin de la bacteria). Algunos de ellos contienen genes que proporcionan caractersticas diferentes a las bacterias, como el plsmido F (plsmido conjugativo) que puede transferirse a otras bacterias mediante la conjugacin, tiene una regin denominada regin Tra que se excreta por el pili sexual mediante un sistema de secrecin tipo IV, ste slo es recibido una vez y se vuelve una bacteria F+. Otros, llamados plsmidos episomales, pueden integrarse al cromosoma y se replican bajo control de ste. Existen plsmidos que se combinan con el ADN cromosmico llamados transposones. Secuencias de insercin. Transposasas transposones(elaborada). Normales y Replicativos. Modelo de crculo rodante. Endonucleasa (enzima que puede reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos). Griffith: Ciertos pptidos activan seales de la clula. Transcriptasa reversa: se utiliza en eucariontes para copiar una parte de ADN. Bacterifagos: abren canales.
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Un transposn o elemento gentico transponible es una secuencia de ADN que puede moverse de manera autosuficiente a diferentes partes del genoma de una clula, un fenmeno conocido como transposicin. En este proceso, se pueden causar mutaciones y cambio en la cantidad de ADN del genoma. Anteriormente fueron conocidos como "genes saltarines" y son ejemplos de elementos genticos mviles. El transposn modifica el ADN de sus inmediaciones, ya sea arrastrando un gen codificador de un cromosoma a otro, rompindolo por la mitad o haciendo que desaparezca del todo. En algunas especies, la mayor parte del ADN basura (hasta un 50% del total del genoma) corresponde a transposones. A diferencia de los provirus, los transposones se integran en el ADN celular en lugares bien determinados. Su existencia fue propuesta por Barbara McClintock en el maz, sin embargo, su existencia no se demostr hasta mucho ms tarde en bacterias. Por ello fue laureada con el Premio Nobel en 1983.

Los plsmidos son herramientas muy importantes en los estudios de biologa molecular, se emplean como vectores (agentes generalmente orgnicos que sirven como medio de transmisin de un organismo a otro) de genes para la transformacin de clulas. Los eucariontes no contienen plsmidos, pero pueden insertrseles para que produzcan
una determinada protena.

Teniendo un plsmido, se puede insertar material gentico a travs de enzimas de restriccin. ARN. En la clula existen tres tipos principales de ARN (cido ribonucleico). ARNm (mensajero) ARNt (de transferencia) ARNr (ribosomal). S son unidades de sedimentacin que no son aditivas, sino que se les aplica una centrifugacin y las subunidades corren diferente que el ribosoma completo. Los polisomas o polirribosomas son los ribosomas unidos a una molcula de ARN mensajero y que se encuentran sintetizando los pptidos. Son visibles al microscopio electrnico.

http://www2.uah.es/biomodel/model1j/rna-prot/ribosoma.htm 6. A diferencia de los eucariotes, en las bacterias no existen compartimentos, por los que los procesos de replicacin de ADN, transcripcin (ADN ARNm) y traduccin (ARNm + ARNt + ARNr Protenas) ocurren en el citoplasma.

7. Inclusiones citoplasmticas. (presentes en algunos microorganismos)

Grnulos de polisacridos. Unidades de glucosa que son reserva de carbono y energa que se forma en un exceso de carbono.

Glucgeno.
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Almidn(se identifica con lugol: solucin yodo-yodurada).

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Inclusiones lipdicas. Aparecen en varias especies de Micobacterium, Bacillus, Azotobacter (alginatos), Spirillum. Su nombre genrico es poli--hidroxialcanoatos (PHA) que se forman en exceso de carbono. Pueden observarse al microscopio electrnico de transmisin o con colorantes solubles en aceites.

Grnulos metacromticos (volutina). Reserva de fosfato que se ponen en evidencia con una tincin con el azul de toluidina, al combinarse con el polifosfato da un color violeta rojizo. Este fenmeno se denomina metacromasia.

Grnulos de azufre. Reserva de fosfato que se ponen en evidencia con una tincin con el Bacterias quimiolitotrofas y fototrficas que oxidan el H2S a S, este ltimo forma acumulaciones refringentes y visibles al microscopio (brillan en fondo oscuro). El S puede ser oxidado nuevamente para producir SO42- y las inclusiones desaparecen. Cianoficinas. Polmero de carbono y nitrgeno que se forma en cianobacterias

(bacterias fotosintticas). Es el nico material de reserva conocido de nitrgeno y no es sintetizado en los ribosomas. Se tien con azul de metileno. Carboxisomas. Son acumulaciones de la enzima 1,5-di fosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) empleada por los microorganismos auttrofos para fijar CO2 mediante el ciclo de Calvin, donde se une a una pentosa y la molcula de 6C puede ser aprovechada en el metabolismo para formar finalmente AcCoA. Magnetosomas. Partculas de magnetita (Fe3O4). Imparten propiedades magnticas, lo

cual se cree orienta a las bacterias. Rodeados por una membrana. Vacuolas de gas. Formadas por dos diferentes protenas: GvpA (Gas Vacuole Protein A) y GvpC. Estas vesculas permiten a los microorganismos flotar en los sistemas acuticos. Hay desplazamiento vertical en una columna de agua en respuesta a cambios ambientales (inflan las bolsitas). Las producen las cianobacterias, las bacterias fototrficas verdes y prpura, y algunas aqueobacterias. Parecen como granitos de arroz.

Preparaciones microbiolgicas.
http://microexpfqunam.blogspot.mx/

1. Preparaciones en fresco (microorganismos vivos). Tinciones supravitales, se introducen en el organismo mientras las clulas an se encuentran vivas, colorante muy diluido. 2. Preparaciones fijas y teidas (microorganismos muertos) Hongos Condiciones cidas. Exoenzimas secretadas.

Frotis:

capa delgada de muestra extendida

sobre un portaobjetos que permite el paso de la luz a travs de ella.

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Impronta. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, es como un sello y se obtienen muestras delgadas. Gota de cultivo lquido. Se toma una gota y se coloca en portaobjetos. Cultivo slido suspendido. Frotis sanguneo. Gota en portaobjetos especial. Se usa para buscar protozoarios, cpsulas o diferenciales.

Cinta adhesiva transparente. Hisopo. Puede ser de alginatos, algodn o un abatelenguas. Se puede fijar con calor (frotis seco) o con solventes como etanol o metanol. A los micobacterium puede fijrseles con solucin de albmina.

Tinciones.
1. Positivas. Se observa teida la clula sobre un fondo claro. Simples (1 solo colorante: azul de metileno, safranina, cristal violeta, etc.) y compuestas (como Gimsa, Wright y May Crnwald). Pueden usarse mordentes (compuestos qumicos intensificadores de color aumentando la afinidad
colorante-molcula) y decolorantes.

2. Negativas. El fondo se tie de oscuro para observar clulas o estructuras refringentes, como la cpsula donde se usa tinta china (tincin negativa de cpsula) 3. Diferenciales. Se pueden diferenciar las distintas especies por su coloracin. (ZIehl-Neelsen, Gram). 4. Selectivas. Son utilizadas para dar color y aislar partes especficas de los microorganismos (Endosporas, Flagelo, Ncleo).
Generalmente, se mezclan los colorantes con glicerina, ya que pueden ser muy agresivos y daar a la clula.

Colorantes.
Compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color; estn formados por un grupo cromforo que es la parte responsable del color, y un grupo auxcromo que al formar sales le permite disociarse y combinarse. Si se rompen los enlaces conjugados, la molcula deja de tener color. Se unen a protenas o cidos nucleicos. 1. cidos El cromforo es el anin de la molcula (eosina). 2. Bsicos. El cromforo es el catin de la molcula (azul de metileno, cristal violeta, safranina, fucsina).

Tcnicas de tincin.
3. Tincin simple. Frotis fijo con calor, seco. Nos seala la forma, agrupacin

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4. Tincin de cpsula (Selectiva) Extendido, no se puede fijar al calor porque se deshidratan las cpsulas, se seca al aire. Muestra + tinta china o nigrosina (carbn activado) Safranina de Gram (es mejor la safranina 0.5, ms concentrada) o Cristal Violeta (1 min) 5. Tincin de endosporas (Selectiva). Slo se tie el exosporio. Verde de maquila 5% con emisiones de vapor de agua (10 minutos). Situacin estresante para que permita el paso del colorante. Lavar con agua Safranina 0.5% (1minuto) 6. Tincin de flagelo. Tampoco se puede fijar el colorante con una tincin simple. Colorante primario. Pararosa anilina (preparada en el momento). Mordente. Acido tnico, permite la fijacin, principalmente al flagelo. Se deja depositar. Colorante de contraste. Azul de metileno. Proteus: Vibrio con flagelo pertrico. Se cultiva en agar inclinado, se gotea SSI (solucin salina) en la parte alta y se separan dos fases (la mitad es medio de cultivo lquido), se mantiene a 37C. Frotis: se toma la muestra con mucho cuidado con una pipeta Pasteur y se coloca en un portaobjetos con un rectngulo marcado con marcador de cera, se deja secar sin calor y se procede a la tincin. 7. Tincin de Gram.

Colorante primario. Cristal violeta 1% en sol. de oxalato de amonio al 0.85% (1 min). Mordente. Lugol I/KI 1g/2g en 300 mL de agua (1 minuto). Forma complejos. Decoloracin. Etanol-Acetona 70:30 hasta eliminar el exceso de colorante para que no

Penetra en las clulas, en G- no pasa a citoplasma.

se mezclen. Las G- pierden cristal violeta ya que se daa su membrana externa. Las G+ deshidratan
su pared y no permiten salir el colorante.

Colorante de contraste Safranina 0.25% (1 minuto).

Los hongos no tienen Gram, porque su pared est hecha de quitina.

8. Tincin de Ziehl-Neelsen. Serologa (anticuerpos) PCR Baciloscopa: es la tcnica ms segura para detectar tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis). Se toma la primera expectoracin del da. Neutralizar cido. Se deja secar una gota de muestra (frotis) y se sella con albmina. Medio de cultivo 37 C. cidos miclicos retienen la fucsina bsica (Bacterias AAR: cido alcohol resistentes) El azul de metileno de Loeffler, se ha dejado oxidar 6 meses. Tambin tie esporas.
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Microscopa.

Tipos de microscopas:

Metabolismo microbiano.
Suma de reacciones bioqumicas requeridas para la generacin de energa (catabolismo) y el uso de ella para sintetizar material celular a partir de molculas del medio ambiente (anabolismo). Las reacciones catablicas producen energa como ATP, el cual es utilizado en las reacciones anablicas para sintetizar el material celular a partir de nutrientes. 1. Enzimas: protenas con funcin de catalizadores biolgicos; reducen la energa de activacin de una reaccin Son para un qumica. especficas sustrato.

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Grupo prosttico: molcula no proteica que se une a la protena(enzima) y forma parte de su estructura. Cofactor (inorgnico) o coenzima (orgnico): se unen a la enzima para que aumente la afinidad por el sustrato. La enzima cuando no est unida al cofactor se le llama apoenzima. Coenzimas de oxido-reduccin: NAD+(principal coenzima de xido-reduccion; acarreador de electrones), NADP+, FAD+, FMN+. Otras coenzimas: CoA, Vitaminas.

La actividad enzimtica es la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Es modificada por factores que afectan a las protenas, por ejemplo: la temperatura y el pH. El pH que al influir sobre las cargas elctricas, podra alterar la estructura del centro activo y, por lo tanto, tambin influir sobre la actividad enzimtica. La temperatura elevada desnaturaliza las molculas proteicas por lo que los sitios activos se ven modificados. La enzima se satura a cierta concentracin del sustrato, o sea que aunque aumentemos la concentracin, no aumentar la velocidad de la catlisis puesto que se ha alcanzado la velocidad mxima de la enzima.
INHIBIDORES ENZIMATICOS. Un inhibidor competitivo se une a la enzima en el sitio activo, impidiendo la entrada y unin del sustrato. Un inhibidor alostrico modifica la afinidad de la enzima por el sustrato, al unirse en un sitio distinto (sitio alostrico) al sitio activo. REGULACIN DE LAS VAS METABLICAS. Regulacin por producto final de la reaccin -> Cuando hay suficiente producto, ste es un inhibidor de una enzima reguladora, generalmente la primera para que no se siga efectuando la va.
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REGULACIN DE LA EXPRESION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS (nivel gentico).

Nivel transcripcional: induccin (mayor transcripcin) y represin (menos transcripcin)-> operones. procesamiento del ARNm. Nivel traduccional: Regulacin de la sntesis de las protenas ribosmicas. Inhibicin de la sntesis de protenas. ATP. Compuesto de alta energa, (los enlaces fosfato son muy energticos y por ello son usados por medio de su formacin y rompimiento para almacenar y liberar la energa obtenida de los procesos catablicos). Formacin de enlaces fosfato: 1. 2. Fosforilacin a nivel de sustrato. (se forma el ATP apartir de ADP + Pi, en un sitio alostrico de una enzima que cataliza una reaccin que libera energa, utilizando esa energa para crear el enlace fosfato) Cadena respiratoria. (fosforilacin oxidativa, que se da en la membrana plasmtica de bacterias y en la mitocondria en eucariotes, por medio de un gradiente de H+ y en algunos casos Na+, generado por el paso del electrn disminuyendo gradualmente su potencial a travs de distintos complejos proteicos, algunos de los cuales son canales para H+ que se abren al pasar por ellos el electrn y van generando un gradiente elctroqumico de protones, los cuales pasan a travs de una protena ATPasa que se encarga de fosforilar ADP) (Justo debajo de ciclo de Krebs viene la explicacin ms completa) 3. Fotofosforilacin. Los pigmentos captan la energa luminosa proveniente del sol (fotones) y la llevan al fotosistema uno (P680), donde esta clorofila es excitada a un estado de mayor energa (mayor potencial), por lo que el electrn va disminuyendo su potencial a medida que pasa por distintos complejos acarreadores de electrones, luego pasa al fotosistema dos (P700), quien recibe otro fotn, quien pasa a un estado excitado y vuelve a disminuir su potencial gradualmente, generando un gradiente electroqumico de protones a medida que el electrn pasa por las protenas canal con centros redox, el cual es dispersado de manera similar a la cadena respiratoria; por medio de una ATPasa. Atenuacin y

c. orgnicos fotohetertrofos Luz fottrofas Fuente de carbono CO2 fotoauttrofos

Fuente de energa c. orgnicos quimiohetertrofos Fuente de carbono

c. orgnicos quimiohetertrofos

CO2 Redox quimitrofas c. orgnicos mixtrofos c. inorgnicos quimilottrofos Fuente de carbono CO2 litoauttrofos

Gluclisis
La va de la gluclisis (EMP), se encuentra en todos los eucariotes y muchas especies de bacterias. 1. En la primera etapa hay gasto de 2 molculas de ATP por molcula de glucosa La glucosa siempre que entra a la clula es fosforilada, a manera de que no salga de nuevo por la membrana y se encuentre en un flujo constante hacia el interior de la clula, adems, esta glucosa-6-fosfato se isomeriza a fructosa-6P y luego se vuelve a fosforilar a fructosa-1,6-bisfosfato que ya es una molcula simtrica; cada fosforilacin requiere de un ATP que done su grupo fosfato, convirtindose en ADP. Becerril Romn Mara del Mar J. Gutirrez Hernndez Bernardo Novelo Carmona Milton B.

2.

En la segunda parte se forman 4 molculas de ATP por fosforilacin a nivel de sustrato (cuando una molcula fosforilada posee una gran energa de hidrlisis puede ceder su grupo fosfato a un ADP, para formar ATP) y 2 molculas de NADH (molcula reducida a la que se conoce como poder reductor que si suponemos que el ATP es el efectivo en energa, el NADH es como un cheque que se va a canjear en la cadena de transporte de electrones por 3 ATPs por cada molcula de NADH que cede su electrn). Esa fructosa1,6bisP, se rompe en dos molculas de 3 carbonos: gliceraldehdo3P y 3dihidroxiacetonafosfato, que se isomeriza a gliceraldehido3P ste gliceraldehdo va sufriendo cambios conformacionales y va pasando por intermediarios de alta energa que ceden su grupo fosfato a un ADP en 2 ocasiones; como tenamos 2 molculas de gliceraldehdo 3P por gaca molcula de fructosa1,6bisP, se generan en total 4 ATP en esta parte, adems en una de las reacciones, se libera NADH que tambin se multiplica por 2.

3.

La ganancia total son 4 ATP y 2 NADH, y como se invirtieron 2 ATP para fosforilar la glucosa, la ganancia neta es de 2 ATP por molcula de glucosa que se convierte por esta va en piruvato (molcula de 3 C sin grupo fosfato).

Ciclo de las pentosas fosfato

Es una va anablica, ya que produce los precursores de la ribosa (5 carbonos), para formar los cidos nucleicos y provee de eritrosa fosfato (4 carbonos) como precursor de aminocidos aromticos. Se produce en est va NADPH, la mayor fuente de electrones de la biosntesis (NADH se le llama poder reductor, y NADPH es un poder reductor biosinttico) y varias de sus reacciones las comparte con el ciclo de Calvn (fase independiente de la luz en la fotosntesis, donde se utiliza la energa ganada en la fase luminosa para formar fructosa mediante la fijacin de CO2) Mecanismo: 1. Se tienen 3 molculas de glucosa6P que se oxidan a a 6-fosfogluconolactona (una lactona es un ster cclico), producindose 3 NADPH. 2. Las 6-fosfogluconolactonas se rompen para formar 3 molculas de 6-fosfogluconato, que despus son oxidadas, reduciendo 3 NADP+ a NADPH y se descarboxilan, liberando 3 molculas de CO2 y son transformadas as en ribulosa5P (Ru5P) que es un azcar de 5 carbonos (pentosa). 3. Una de esas Ru5P, es isomerizada a ribosa5P (R5P), y las otras dos se isomerizan a xilulosa5P (Xu5P). Dos carbonos de la Xu5P son transferidos por medio de una trancetolasa a una R5P, formando sedoheptulosa7P y gliceraldehdo3P; obsrvese que de dos molculas de 5 carbonos, se formaron una de 3 carbonos y una de 7 carbonos. 4. Se remueven 3C de la sedoheptulosa7P y se unen al gliceraldehdo3P , formando ahora un azcar de 4 carbonos (eritrosa4P) y un azcar de 6 carbonos (fructosa6P) 5. Esa eritrosa recibe 2C de la otra Ru5P, resultando otra fructosa 6P y un gliceraldehdo3P.

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Va Entner-Doudoroff
Muchos tipos de bacterias no poseen la enzima fosfofructocinasa-1 (PFK1 de la gluclisis, donde la fructosa6P se fosforila mediante un gasto de ATP a ADP a fructosa1,6bisP). Una va alterna es Entner-Doudoroff, en la cual la glucosa 6P es convertida a del 6-fosfogluconato que es deshidratado a 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato (KDPG) que ya se rompe en 2 molculas e 3C (piruvato y Gliceraldehdo-3-fosfato).

Fermentacin.
Se realiza en condiciones anaerbicas. Utiliza el NADH producido en la gluclisis que no es canjeado en la cadena respiratoria, ya que no hay O2 para que acepte los electrones, por lo que emplea como aceptor de electrones a una de molcula orgnica: reduce el cido pirvico (piruvato generado) ya sea por gluclisis, va las pentosas o va de Entner-Doudoroff. cido frmico, etanol vino,

(saccaromyces) (malta-> cerveza, frutas-> etc.), cido lctico (lactobacillus), cido propinico, (etanol-> cido actico)(acetobacter aceti), etc Madre de vinagre: consorcio

formado por levadura y bacteria; acetobacter y saccaromyces. Acido lctico Leche Yogurt Streptococcus) y queso (Lactobacillus, Otras fermentaciones cido propinico y CO2 Leche Queso freudenreichii) Acetona y acetobutylicum) suizo (Propionibacterium (Clostridium

Granos Pan de centeno (Lactobacillus bulgaricus) Col Chucrut o Sauerkraut (Lactobacillus plantarum) Carne Salchichas (Pediococcus)

butanol

Glicerol (Saccharomyces cerevisiae) cido ctrico melazas (Aspergillus niger) Metano cido actico (Methanosarcina) cido ascrbico Sorbitol (Acetobacter)

Ciclo de Krebs = Ciclo de los cidos tricarboxlicos = Ciclo del cido ctrico
Piruvato Acetil-CoA (enzima: piruvato deshidrogenasa). La acetil-CoA tambin se forma por la -oxidacin de los cidos grasos.
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ste piruvato es oxidado a CO2 en el CK (ciclo de Krebs). Mecanismo: 1. 2. El oxalacetato u cido oxalactico es una molcula de 4C, que se une al grupo acetil (2C) para formar cido ctrico. ste cido ctrico es isomerizado y oxidado, liberando NADH y CO2, por lo que nos queda una molcula de 5C, llamada cido--cetoglutrico, que es oxidado a su vez, liberando NADH, ATP y CO2 a cido succnico (4 carbonos). ste es oxidado a cido fumrico, liberando FADH2 (que es otro poder reductor, acarreador de electrones), que pasa a su vez, liberando otro NADPH a oxalacetato.

3.

Por Acetil-CoA se forman 2 molculas de NADH, una de NADPH y una de FADH2, adems de un ATP por FNS (fosforilacin a nivel de sustrato).

Fosforilacin oxidativa.
Las coenzimas reducidas (como el NADH), transfieren los electrones a un aceptor final oxidado, no directamente (como en la fermentacin), sino a travs de una cadena transportadora de electrones al final de la cual existe un aceptor exgeno oxidado, que se reduce. Respiracin aerobia: el aceptor final es el O2 Respiracin anaerobia: el aceptor final es distinto del O2 (nitrato, sulfato, etc.)
Menor potencial redox

La transferencia de electrones se da en la direccin de mayor potencial redox, con la liberacin de energa libre que se va a traducir en un potencial electroqumico de protones, cuya disipacin a travs de ATPasas de membrana origina ATP, conocindose este proceso como fosforilacin oxidativa.
Mayor potencial redox

ste proceso se da en la membrana citoplasmtica en procariontes, o la membrana interna en cloroplastos y mitocondrias. La membrana interna es pues, muy selectiva y rica en protenas que llevan a cabo el proceso de transporte de electrones: NADH deshidrogenasa. (complejo proteico 1) Transfiere los e- y los H+ del NADH; es una protena tipo canal que al pasar el electrn por ella, se abre y hace pasar H+ contra gradiente (es un tipo de transporte activo). Flavoprotenas. Transfieren los e- y los H+. Protenas de hierro y azufre. Acarreador de electrones. Citocromos. Acarreador de electrones. No protenas Quinonas. (coenzimas Q; molculas orgnicas no proteicas, embebidas en la membrana que tambin transfieren los e- y los H+).

En la fosforilacin aerobia: Los electrones pasan primero al complejo 1 (si provienen del acarreador NADH) o al complejo 2 (si provienen de FADH2); ambos complejos donan su electrn a las quinonas, quienes lo transfieren al complejo 3; ste lo transfiere al citocromo C (citocromo es una protena perifrica pequea que posee un centro redox); del citocromo C, el electrn pasa al complejo 4, que finalmente, dona el electrn al oxgeno (O 2 O22-), quien se une a dos protones H+ (que ya pasaron a travs de la ATPasa hacia el citoplasma) para formar H2O. Los complejos 1,3 y 4 son canales de protones, mientras que el complejo 2 es simplemente un acarreador. El donador es el NADH o el FADH2; el aceptor es el O2 y el producto final es H2O.

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El gradiente de protones generado, es utilizado para la sntesis de ATP mediante una protena ATPsintasa (ATPasa); quien posee dos complejos: Complejo F0 responsable de la transferencia de protones a travs de la membrana. Embebido en la membrana citoplasmtica. Complejo cataltico F1 responsable de la interconversin de ADP+ Pi y ATP. Se encuentra en el lado citoplasmtico. http://www.youtube.com/watch?v=WggF8DGEmEs La ATPasa es reversible; puede funcionar como bomba de protones contra gradiente, mediante la hidrlisis de ATP. En la respiracin anaerobia, los compuestos que se reducen en lugar del O2 pueden ser:

Oxidacin del Hidrgeno.

Las bacterias captan H2 y poseen la enzima hidrogenasa (que tiene un cofactor de Ni 2+ en su estructura), sta rompe la molcula en dos tomos de H y puede estar en la membrana y generar un gradiente de protones, as como transferir los electrones a una cadena de transporte, o bien, estar en el citoplasma y utilizar esos hidrgenos para generar NADPH, que junto con el CO2 entran a ciclo de Calvin para generar carbohidratos.
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Oxidacin del azufre

La va de la sulfito oxidasa es la ms comn en la oxidacin de compuestos de sulfito. La adenosina fosfosulfato reductasa (APS) la emplean pocos microorganismos que oxidan el sulfito. Los electrones liberados entran a nivel del citocromo C, para formar ATP. El NADH es producido por un flujo reverso de electrones para producir NADH necesario para la fijacin del CO2 en el ciclo de Calvin.

Oxidacin del azufre

1. Nitrificacin paso 1: Oxidan el amonio a nitritos. NH4+ + 1O2 NO2 - + 2 H+ + H2O Protenas de membrana citoplasmtica que llevan a cabo stas funciones : Amonia Monooxigenasa (AMO). Protena transmembranal; Oxida el NH4+ a hidroxilamina (NH2OH). Hidroxilamina oxidoreductasa (HAO). Protena periplsmica; Oxida la hidroxilamina a NO2- (nitrito). 2. Nitrificacin paso 2: Nitrito Oxidoreductasa (NOR). Protena transmembranal.

NO2- + O2 NO33. Las bacterias nitrificantes fijan CO2 por el ciclo de Calvin. Las que oxidan nitrito pueden ser hetertrofas con glucosa y otros compuestos orgnicos.

Oxidacin del hierro

Fe2+ + H+ + 1O2 Fe3+ + H2O Rusticianina. Protena periplsmica que contiene Cobre. Los electrones liberados entran a nivel del citocromo C, para formar ATP. La bacteria vive en pH bajos, para obtener su gradiente de protones. El NADH es producido por un flujo reverso de electrones para producir NADH necesario para la fijacin del CO2 en el ciclo de Calvin (Ver pgina 14).

Organismos Auttrofos
Organismos que utilizan el CO2 como fuente de carbono y lo pueden incorporar por diversas vas: Ciclo de Krebs reverso. Bacterias verdes del azufre (Chlorobium) Va del Hidroxipropionato. Bacterias verdes (Chloroflexus) Va Acetil CoA reductiva. Bacterias acetognicas (Clostridiumthermoaceticum, Acetobacterium woodii), metanognicas (Methanobacterium thermoautotrophicum) y auttrofas sulfato reductoras (Defulfobacterium autotrophicum) Ciclo de Calvin. Bacterias prpura, cianobacterias, algas, plantas verdes, muchas bacterias quimiolittrofas y algunas arqueobacterias halfilas e hipertermfilas.
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La fijacin es realizada por la enzima Ribulosa bifosfato carboxilasa (RubisCO) que forma cmulos llamados carboxisomas.

Fotosntesis.
Consta de 2 fases: 1. Fase Luminosa: fotofosforilacin (catablica), la energa solar es transformada 2. en energa qumica (ver en la pgina 8). Fase independiente de la luz: ciclo de de como para el Calvin-Benson fuente de (anablica), involucra la fijacin
CO2

1 2

carbono celular.

crecimiento

Mecanismo del ciclo de Calvin: La enzima RUBISCO fija el CO2 a la ribulosabisfosfato (5 carbonos) y divide la molcula en 2 molculas de 3fosfoglicerato (cada una de 3C), la cual es fosforilada y reducida a gliceraldehido3P, que como sabemos, es precursor de la fructosa. Despus se da la regeneracin de Ribulosa bifosfato, que es el sustrato para la fijacin de nuevas molculas de CO2. Los organismos fottrofos convierten la energa luminosa en energa qumica para formar ATP. Fotosntesis oxignica. Cianobacterias, algas y plantas

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Fotofosforilacin acclica Ocurre en la fotosntesis oxignica. El donador de electrones es el agua y el aceptor final es una coenzima oxidada. Hay produccin de oxgeno.

Fotosntesis anoxignica. Bacterias prpura, verdes y heliobacterias.

Fotofosforilacin acclica Ocurre en la fotosntesis anoxignica. Los donadores de electrones son principalmente: H2S, S, S2O32-. Los electrones son devueltos a la bacterioclorofila por medio de transportadores (cadena reversa).

Fotofosforilacin

no

fotosntetica

(mediada

por

el

pigmento

bacteriorodopsina). Halobacterium sp (arquea haloflica). Crecen en agua de mar (salmuera) en las salinas de evaporacin.

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La bacteriorrodopsina tiene siete hlices alfa que comprenden toda la seccin de la membrana. El cromforo retinal todo-trans (prpura) esta unido covalentemente mediante una base de Schiff al grupo -amino de una Lys. Una serie de residuos Asp y Glu, y molculas de agua asociadas aportan la va transmembranal para los protones (flechas rojas).

En cianobacterias, la ficoeritrobilina y la ficocianobilina como pigmentos capturadores de la luz. Las ficobilinas estn unidas covalentemente a protenas de unin especficas, formando las ficobiliprotenas, que se asocian en complejos ordenados llamados ficobilisomas. Estas son las principales estructuras de captacin de luz en los microorganismos. (Son como antenas) En estos ensamblajes los pigmentos de ficobilina se unen a protenas especficas que forman pigmentos llamados ficoeritrina (PE), ficocianina (PC) y aloficocianina (AP). La energa de los fotones absorbidos por PE o PC es transmitida por AP a la clorofila a del centro de reaccin mediante un proceso conocido como transferencia de excitones.

Medios de cultivo
1. Macronutrientes en los medios de cultivo

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2. Micronutrientes en los medios de cultivo

3. Factores de crecimiento

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4. Clasificacin.
Composicin Naturales o complejos. No tienen una composicin definida. Sangre, suelo, frutas, etc. o medios que contengan ingredientes cuya composicin no est completamente definida como el extracto de levadura, peptonas o el agua de la llave. Sintticos. Composicin completamente conocida, componentes son extrapuros, como en los medios empleados para investigacin. Estado Medios lquidos. Generalmente tienen componentes completamente solubles. Son tiles en la propagacin de microorganismos pero tienen la desventaja de que no se pueden detectar contaminaciones. Medios fluidos. Contienen agar aprox. 0.1%, consistencia lquida pero la presencia de agar disminuye la velocidad de disolucin de O2 ambiental. Se emplea generalmente en el cultivo de microorganismos anaerobios y microaeroflicos. Semislidos. 0.2 genticas. Slidos. 1.5 a 2.0% de agar, consistencia dura y forman un soporte para el crecimiento microbiano. Se emplean para cultivo, aislamiento, diferenciacin, cuantificacin, pruebas de sensibilidad y en algunos casos para conservacin (inclinados). Uso Enriquecidos. Contienen componentes ricos nutritivamente y permite el crecimiento de microorganismos no exigentes. Ejemplos: Agar cuenta estndar (cuenta en placa) Infusin cerebro y corazn (BHI) Agar Soya Tripticasena (TSA) Agar nutritivo (AN) Agar sangre (AS) De enriquecimiento. Contiene componentes y condiciones que permiten el desarrollo de un tipo microbiano y disminuyen la velocidad de crecimiento de la flora acompaante. Ejemplos: Agua peptonada pH 9: Deteccin de V. cholerae Caldo tetrationato: Pre-enriquecimiento para Salmonella Caldo selenito: Deteccin de Salmonella, Enterobacter sakazakii y Yersinia enterocolitica Selectivos. Contiene componentes que permiten el desarrollo de un tipo microbiano e inhiben el crecimiento de los dems microorganismos. Ejemplos: Agar cetrimida Caldo bilis verde brillante Agar Bacillus cereus Agar Sabouraud cicloheximida Diferenciales. Contiene componentes que permiten diferenciar las actividades metablicas de los microorganismos inoculados. La presencia de indicadores o el uso de reveladores despus de la incubacin ponen de manifiesto la actividad. Ejemplos: Agar DNAsa Agar almidn Agar cromognico para Candida Diferenciales y selectivos. Agar sal y manitol Agar eosina azul de metileno (EMB) Becerril Romn Mara del Mar J. Gutirrez Hernndez Bernardo Novelo Carmona Milton B. a 0.8% de agar, son suaves y permiten observar la movilidad de los microorganismos. Esta consistencia es utilizada en los medios de transporte, las pruebas de movilidad, pruebas biqumicas y pruebas

Agar XLD Agar Endo Agar Mc Conkey De conservacin. Algunos medios de cultivo son empleados para la conservacin temporal de microorganismos, como son: Medio slido en caja a 4C (hasta 1 semana). Medio de agar inclinado 4C (hasta 2 semanas) con sello de glicerol estril a 4C (varios meses dependiendo del microorganismo). Medio fluido de tioglicolato con carne molida con sello de aceite mineral estril a temperatura ambiente (varios meses dependiendo del microorganismo).En la liofilizacin tambin se emplea la leche descremada (aos). De transporte. Son medios que se emplean para el transporte de muestras sin alterar la viabilidad y la proporcin de microorganismos. Tienen consistencia semislida, con amortiguador de pH y reducidos en nutrientes para preservar la proliferacin de microorganismos por varias horas. Las muestras se recolectan con asas o con hisopos de alginatos que no inhiben a los microorganismos. Medio Amies Medio de Stuart De transporte. Son medios de cultivo que tienen los nutrientes para poner en evidencia la actividad metablica de un microorganismo puro. Pueden emplear reveladores y/o indicadores.

Pruebas bioquimicas
Determinan la actividad metablica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificacin y clasificacin de bacterias y hongos.

Partes.
Sustrato (contenido en el medio de cultivo) Enzima o va metablica (secretada o en el interior del microorganismo) Producto Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)

1. Hidrlisis del almidn. Polmero de glucosa compuesto de amilosa (poco

ramificada) y amilopectina (ms ramificada). Agar almidn. Sustrato: Almidn Enzima: Amilasa (exoenzima). Producto: Glucosa. Revelador: Lugol que forma un complejo color caf-prpura que desaparece cuando el almidn ha sido degradado.

2. Degradacin de la casena. Las proteasas son excretadas al medio para la

degradacin de protenas, la casena es la protena de la leche que le confiere el color blanco, cuando la casena es hidrolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento microbiano. Agar Leche Descremada. Sustrato: Casena Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminocidos. Revelador: No requiere.

3. Hidrlisis de la lecitina y reduccin del telurito. Las colonias productoras de lecitinasa

forman una zona opaca a su alrededor. El medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y cuantificacin de estafilococos coagulasa positivos, al que se adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias tpicas de S. aureus son oscuras por la reduccin del telurito (TeO32-) a Teo, adems presentan el halo de hidrlisis de la lecitina. Agar yema de huevo/Agar Baird Parker. Sustrato: Lecitina. Enzima: Lecitinasa hidroliza la lecitina (fosfolpido). Producto: Fosforilcolina. Revelador: No requiere. Becerril Romn Mara del Mar J. Gutirrez Hernndez Bernardo Novelo Carmona Milton B.

4. Licuefaccin de la gelatina. La gelatina es una protena que cuando es hidrolizada por la

gelatinasa en los aminocidos que la componen, pierde su caracterstica de gelificar. Si al refrigerar el medio en donde se incub por 7 das el microorganismo la gelatina cuaja, el microorganismo creci pero no la degrad. Otra opcin es con carbn activado, si ste se esparce por todo el medio, quiere decir que hubo degradacin. Gelatina Nutritiva (base nutritiva en caldo y despus se agrega el gelificante) Sustrato: Gelatina (protena). Enzima: Gelatinasa (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminocidos. Revelador: No requiere o puede emplearse el carbn activado en polvo.

5. Fermentacin. Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes) deben ser

incorporados, algunos requieren de ser degradados en monmeros y transportados a la clula para posteriormente en condiciones anaerobias ser metabolizados por la va fermentativa. La fermentacin (degradacin) de un compuesto orgnico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la formacin de gas capturado en la campana de fermentacin. Prueba positiva (cido y gas), si nicamente vira el indicador se trata de prueba posistiva (cido). Medio base caldo rojo de fenol (indicador pH), con campana de fermentacin (Durham). Sustrato: Carbohidrato o polialcohol. Va: Fermentativa. Producto: cidos orgnicos. Indicador: Rojo de fenol (bugambilia, rojo, amarillo), prpura de bromocresol (prpura, violeta, amarillo) o cualquier indicador de pH.

6. Oxidacin/fermentacin. Las bacterias obtienen energa a partir de

hidratos de carbono por uno de dos procesos metablicos; fermentativo u oxidativo. Prueba para determinar si el microorganismo oxida, fermenta o es facultativo. Se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxgeno. Hugh and Leifson. Sustrato: Carbohidratos. Vas: Fermentativa y/u Oxidativa. Producto: Acido pirvico. Indicador: Azul de bromotimol u otro indicador cido/base.

7. Fermentacin cida o neutra.

Fermentacin cido mixta: Los productos son cidos orgnicos que provocan un descenso del pH inicial (indicador: amarillo pH por encima de 5,1 y rojo pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4 molculas de cido pirvico (piruvato) formadas, se reducen dos a cido lctico y dos las metabolizan para formar cido actico y frmico; parte del actico pasa a etanol y parte del frmico a CO2 y H2 . Fermentacin butilengliclica: en sta, parte del piruvato se metaboliza produciendo cantidades menores de cido lctico, frmico y actico, la mayor parte del piruvato se condensa formando acetilmetilcarbinol, que es reducido a 2,3-butilenglicol, productos que son neutros. Para determinar la presencia de los productos neutros (acetona) (prueba de VogesProskauer): Se agrega un poco de a-naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le aade (KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita fuertemente. La acetona reacciona con el a-naftol, y produce un cromforo rojo en presencia de oxgeno. (Prueba positiva color rosado - violceo en la parte superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloracin).

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Rojo de Metilo/Voges Proskauer (Caldo RM/VP) Sustrato: Glucosa. Vas: Fermentacin cida o neutra. Producto: cidos orgnicos o acetona. Reveladores: Solucin de Rojo de Metilo, Alfa Naftol y KOH 40%.

8.

Utilizacin del citrato. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como nica

fuente de carbono tambin utiliza las sales de amonio del medio como nica fuente de nitrgeno. La extraccin de nitrgeno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino. Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio. Va: Varias dependientes del pH del medio. Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO2, lactato/Acetona en condiciones cidas. Indicador: Azul de bromotimol.

9. Agar Hierro de Kligler (KIA). Identificacin de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas. En presencia de
tiosulfato en el medio o la degradacin de protenas liberando aminocidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa. El gas incoloro H 2S se forma en condiciones cidas y reacciona con el citrato de amonio frrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metlico. Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan el medio. Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente tambin utilizan aerbicamente la glucosa y debido a la baja concentracin de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio (el pico de flauta). Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al trmino de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificacin completa del medio. Alcalino: rojo/bugambilia, cido: amarillo. Agar hierro de Kligler Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos SH de la cistena. Va: Fermentativa Enzimas: Tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa Productos: cidos mixtos y H2S. Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+.

10. Medio SIM (Sulfhdrico Indol Movilidad). Derivacin del de Kligler. (medio semislido)
Sustratos: Tiosulfato o grupos SH de la cistena y triptfano. Enzimas: Tiosulfato reductasa, cistena desulfurilasa y tiptofanasa. Producto: H2S e Indol. Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehdo (DMABA). Resultados: 1. Reduccin del azufre (precipitado negro). 2. Formacin de indol a partir de triptfano (se forma un cromforo rojo en la superficie) y 3. Movilidad (si se esparce por el tubo de ensaye o si slo se presenta en la parte donde se inocul).

1.

2.

3.

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5. Ureasa. La hidrlisis de la urea por la ureasa libera dos molculas de amoniaco

que alcaliniza el medio. Caldo urea o agar urea de Cristensen. Sustrato: Urea. Enzima: Ureasa. Producto: Amonaco. Indicador: Rojo de fenol.

6.

Reduccin de nitratos. Anaerobios y asimiladores de nitrgeno.

Reduccin asimilativa: los nitratos pasan a -NH2 Reduccin desasimilativa: se reduce hasta formar N2

Nitrato reductasa (NAR). (la que se quiere medir) Nitrito reductasa (NIR). NO reductasa (NOR). N2 reductasa (N2OR).

Caldo nitratos Sustrato: Nitrato de sodio. Enzima: Nitrato reductasa. Producto: Nitritos. Revelador: Reactivos de Griess (a y b) (cido sulfanlico y dimetil-a-naftilamina (a-naftilamina) que forman un cromforo rojo, despus de 24 horas de la incubacin, en presencia del nitrito. Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la campana de fermentacin o la prueba del zinc, ya que es posible que la bacteria haya logrado reducir an ms el nitrito hasta N2 (donde se observara la presencia de un gas). El zinc, reduce nitrato a nitrito, y si sale positiva, quiere decir que la bacteria no logr reducir el nitrato.

7. Descarboxilasa. Los aminacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas (prueba

positiva)lo que incrementa el pH del medio y el indicador (prpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son tiles en la diferenciacin de enterobacterias. Medio base de descarboxilasas (caldo con aa. Y fuente de carbono) u otros medios como LIA (lisina.hierro.agar) o MIO (algo con quitina..) Sustrato: Aminocidos (lisina, ornitina o arginina). Enzimas: Lis. Producto: Amonaco y diaminas. Indicador: Prpura de bromocresol.

8. Coagulasa. Exoenzima producida por S. aureus, (factor de virulencia) esta enzima

acta sobre los factores de la coagulacin presentes en el plasma y forma un coagulo visible con las protenas del hospedero para evadir a sistema inmune. Plasma de conejo. Sustrato: Factores de la coagulacin. Enzima: Coagulasa (estafilocoagulasa). Producto: Coagulo. Revelador: No requiere.

9. Oxidasa. Se debe a un sistema de citocromo oxidasa (complejo IV, ver fosforilacin

oxidativa). La prueba positiva se observa por la oxidacin del reactivo de Kovacs (incoloro, reducido) formndose un producto colorido. amarillo es negativo, fucsia y azul marino es prueba positiva. Cultivo de medio nutritivo Sustrato: Compuesto reducido. Enzima: Oxidasa. Producto: Compuesto oxidado. Revelador: Reactivo de Kovacs: diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TPD) al 1%.

Crecimiento Bacteriano
Crecimiento: incremento en el # de clulas Biparticin (fisin binaria): una clula se divide para formar dos iguales. Generacin: intervalo que transcurre en la formacin de dos clulas. Becerril Romn Mara del Mar J. Gutirrez Hernndez Bernardo Novelo Carmona Milton B.

Fisin binaria: cada clula hija recibe una copia del cromosoma, ribosomas, complejos macromoleculares, as como monmeros y iones inorgnicos para existir como una clula independiente. El ADN se ancla a la membrana y as, cada clula hija se queda con una copia. Se forma un septo que dar lugar a cada una de las clulas, las envolturas rodean a cada copia del ADN y finalmente se da la separacin de las clulas. Proteinas Fts (filamentous temperature sensitive): forman el aparato de divisin (divisoma) o FtsZ polimeriza y forma un anillo en el centro de la clula. o FtsA es una enzima ATP hidrolasa que provee la energa para ensamblar protenas en el divisoma. o ZipA ancla a FtsZ a la membrana citoplasmtica. o FtsI es una protena involucrada en la sntesis de peptidoglucano, tambin llamada protena de unin a penicilina (su actividad es bloqueada). Replicacin del ADN Previo a la formacin del anillo FtsZ que se forma en el espacio entre los cromosmas duplicados. o MinC: inhibidor de la divisin celular y previene que FtsZ ensamble el anillo hasta que el centro se encuentre formado. o MinE: inhibe la actividad de MinC y se ancla al centro de la divisin. o FstK participa en la elongacin. o FstZ: tiene actividad de GTP hidrolasa, libera energa para la polimerizacin y despolimerizacin, as como para el ensamblaje y desensamblaje del anillo. Protena MreB y la forma de las bacterias. La presencia de esta protena se ha relacionado con las bacterias no cocoides. o FtsZ tubulina bacteriana. o MreB actina bacteriana. Autolisinas: realizan pequeas aberturas, presentes en el complejo divisoma. La sntesis del nuevo peptidoglocano deja en las clulas Gram positivas una cicatriz. (de donde empieza a sintetizar la clula hija su propio pptidoglucano) La abertura y sntesis deben ser coordinadas para evitar la autolisis de la clula. Bactoprenol y transpeptidacion. El bactoprenol (protena en el periplasma de gran negativas) acarrea los precursores de la pared celular, en el periplasma interacta con la enzima que inserta los precursores de pared celular y cataliza la formacin del enlace glucosdico. La transpeptidasa forma el enlace peptdico entre las cadenas de aminocidos de las unidades de murena. Crecimiento bacteriano: duplicacin de un cultivo de manera regular durante un intervalo de tiempo. o Grafica logartmica: muestra el crecimiento exponencial; puede calcularse el tiempo de generacin. Tiempo de generacin (G): tiempo requerido para que una clula se divida o una poblacin se duplique. G = t/n n= numero de generacin t=tiempo No= nmero inicial de microorganismos N = No2n lg N = lg No + n lg 2

El crecimiento se produce en progresin geomtrica: 1 generacin -------------> 2 clulas 2 generaciones -------------> 4 clulas 3 generaciones -------------> 8 clulas Bacteria que se duplica ms rpido: E. coli Ms lenta: Treponema pallidum Curva de crecimiento:
A (Fase Lag). Latencia/adaptacin: no aumento significativo d densidad celular, crecimiento asincrnico. B (Fase Log). Crecimiento exponencial, sincrnico y se alcanza la mxima velocidad de crecimiento. C (Fase pre-estacionaria). Retardo, desaparece crecimiento exponencial, microorganismos en estrs. D (Fase estacionaria). Estacionario: equilibrio entre los microorganismos vivos y muertos. E (Fase de muerte). El equilibro desaparece y predominan los microorganismos muertos. No hay nutrientes para el recambio y las condiciones del medio de cultivo son adversas para el crecimiento.

Tipos de cultivo. Cultivo en lote. Varios matraces, muestrear de cada uno en el tiempo, se construye una curva, mtodo analtico analtico a pequea escala. Becerril Romn Mara del Mar J. Gutirrez Hernndez Bernardo Novelo Carmona Milton B.

Cultivo en lote alimentado. Cambiar condiciones, inducir algn sistema. Cultivo en continuo. Fermentador (bioreactor) para cultivo. La cepa se inocula en fase log, cuando entra en fase preestacionaria, debe depurarse y utilizar ms medio de cultivo a modo de evitar que entren en fase estacionaria y su produccin sea eficiente.

Temperatura
(1). Gelificacin de la membrana; los procesos de transporte se llevan a cabo lentamente y no hay crecimiento. (2). Las reacciones enzimticas aumentan su velocidad. (3). Las reacciones enzimticas se llevan a cabo a su mxima velocidad. (no todas, cada enzima tiene su temperatura ptima). (4). Desnaturalizacin de protenas y membrana citoplasmtica. Lisis trmica.

pH

Microorganismos patgenos. Acidofilos 1-6 Neutrofilos 7-10 Alcalofilos 11-14

Oxigeno.

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Cultivo de anaerobios. Se lleva a cabo en jarra de anaerobiosis. NaHCO3 + NaBH4 + O2 CO2 + H2O + H2 Radicales generados en respiracin aerobia. O2 + e- O2- Superoxido O2- + e- + 2H+ H2O2 Perxido de hidrgeno H2O2 + e- + H+ H2O + OH- Radical hidroxilo Superoxido dismutasa (SOD) Enzima detoxificante que se hace cargo del superxido. O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2 Catalasa. Enzima detoxificante que se hace cargo del perxido. H2O2 + H2O2 2H2O + O2 Peroxidasa. H2O2 + NADH + H+ 2H2O + NAD+

Concentracin de solutos.

Actividad del agua (aw ): disponibilidad del agua para los microorganismos.Osmfilos y xerfilos pueden vivir en bajas aw

Solutos compatibles: Los forman los microorganismos para compensar la concentracin de solutos exterior. (para poder vivir en medios hipertnicos) Aminocidos: Glicina-betana y ectoina Carbohidratos: Sacarosa y trehalosa Poli alcoholes: Manitol y glicerol Otros: KCl y propionato dimetilsulfonico (PDS)

TABLA DE EXTREMOFILOS

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Medicin del crecimiento microbiano.

1 Viables. Presencia de microorganismos vivos. Al menos 24 horas incubacin e interpretacin de resultados.

Se emplean medios de cultivo generales, enriquecidos selectivos y diferenciales dependiendo de los microorganismos a cuantificar. Cuenta en placa. Principalmente cuantificacin de bacterias y hongos. UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean diluciones de una muestra concentrada para que cada colonia formada provenga de un solo microorganismo (Criterio: 25 a 250 UFC por placa). Se reporta como: #UFC/unidad de volumen o peso. http://people.rit.edu/~gtfsbi/IntroMicro/20081MicrobialGrowthCh6.htm

TECNICAS DE CUENTA EN PLACA:

Vaciado (se vacia la muestra y despus se pone el agar), extendido (se extiende la muestra sobre el agar ya preparado) Miles y Misra. Las placas son divididas en sectores. Preparacin de diluciones seriadas de una suspensin bacteriana. Se toman en cuenta los sectores donde hay menos de 20 UFC. El nmero de bacterias viables se obtiene calculando la media de cada dilucin en las repeticiones realizadas. Asa calibrada. Tomar volmenes pequeos, inoculados en la superficie del agar mediante la tcnica de siembra masiva. Las colonias son contadas y se multiplican por el factor de dilucin del asa empleada. Se determinan las UFC/g o mL de muestra. Filtracin. La membrana de celulosa retiene a los microorganismos en su malla con poros de 0.25-0.45m. Esta membrana se transfiere a un medio de cultivo para el desarrollo de colonias. Nmero ms probable. Tambin llamada tcnica de dilucin en tubo: estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado.

Microorganismos COLIFORMES.
Coliformes totales: bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h a 35C. Este grupo esta conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales: bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de incubacin a 44 C. Este grupo no incluye una especie determinada; la ms prominente es Escherichia coli.

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2 Totales. Microorganismos vivos y muertos no se pueden distinguir. Son rpidos pero se requiere contar en algunos casos
con curvas de calibracin.

Recuento microscpico.

1.

Cmaras de Petroff-Hausser y de Neubauer. Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero de muestras. No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que sean No distinguen clulas vivas de muertas.

observadas al microscopio.

2.

Cuenta de Breed. Se usa: muestra a evaluar (directa o diluida), objetivo calibrada o micropipeta micromtrico, asa

rea de la muestra = bxh y convertir a m2 Determinar el rea del campo: A= xr2(m2) Observar 10 campos, contar las bacterias de cada uno de ellos y obtener el promedio X Factor= Am/Ac Calcular el nmero de bacterias por mL x Factor x 100 = bacterias_____ /mL 100 es la dilucin inicial al tomar 0.01mL Becerril Romn Mara del Mar J. Gutirrez Hernndez Bernardo Novelo Carmona Milton B.

Nefelometra (Turbidimetra).

La turbidez producida por el crecimiento microbiano e determina por la

densidad ptica (DO) que puede ser expresada como Absorbancia, % de Transmitancia o Unidades Klett (UK). Longitud de onda () Bacterias 540nm Protozoarios 580nm Levaduras 600nm

Actividad metablica (produccin de CO2).

CO2 + 2NaOH Na2CO3 + H2O Na2CO3 + BaCl2 BaCO3 + 2NaCl NaOH (residual) + HCl NaCl + H2O

Peso seco y determinacin de protena. Ms protena, ms clulas.

El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. til para grandes volmenes. Desventaja: componentes voltiles pueden perderse y puede existir degradacin. La muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado.

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Factores que afectan la sobrevivencia de los microorganismos.

Esterilizacin: destruccin de toda forma de vida microbiana. Esterilizacin comercial: destruye esporas de Clostridium botulinum. Desgerminacin: eliminacin de microorganismos en un rea limitada. Sanitizacin: eliminacin de microorganismos patgenos. Desinfeccin: destruccin de formas vegetativas en superficies inertes. Antispsis: tratamiento qumico en tejidos vivos. Asepsis: ausencia de contaminacin significativa. Tcnicas aspticas: minimizan la contaminacin en reas y equipos. Biocida: mata a los microorganismos Bio-esttico: detiene el crecimiento de los microorganismos. Bioltico: tiene accin sobre membrana o pared celular. Sepsis: indica contaminacin por bacterias. En medicina describe una infeccin en el torrente sanguneo.

1. Agentes qumicos.
Mecanismo de accin

Concentracin Tiempo de exposicin Factores ambientales Susceptibilidad de los microorganismos Edad de los microorganismos Presencia de materia orgnica Fenoles y sus derivados. Destruccin de la membrana citoplasmtica y desnaturalizacin de enzimas.

Biguanidas. Destruccin de la membrana citoplasmtica. Clorhexidina. Bactericida no txico. Se emplea en infecciones bucales, en la prevencin de infecciones tras ciruga bucal, combate y reduce la formacin de la placa dental, lavado quirrgico y lavado antisptico. Halgenos. CLORO. Agente oxidante. Usado como desinfectante de superficies, agua y equipos. SOLUCIONES DE IODO. Se une a residuos de tirosina y desnaturaliza protenas. Antisptico y desinfectante. Alcoholes. Solubiliza lpidos y desnaturaliza protenas. Etanol e isopropanol. Bactericida y funguicida. Antisptico no afecta esporas y virus envueltos.
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Metales pesados.

Colorantes. Cristal violeta, verde brillante, eosina. Combinacin especfica con cidos nucleicos principalmente. Biostticos. Antifngicos, antispticos locales, inhibidores en los medios de cultivo selectivos. Surfactantes. 1. Jabones aninicos cidos. Remocin mecnica de microorganismos. Germicida de piel. Algunos contienen otros antimicrobianos. 2. Detergentes aninicos cidos. Interaccin con la membrana citoplasmtica cargada, probable inactivacin o destruccin de enzimas. Sanitizante. No txico, no corrosivo, acta rpidamente y es de amplio espectro. Equipo de procesamiento de alimentos. 3. Detergentes catinicos. Desnaturalizacin de protenas, inhibicin de enzimas y destruccin de la membrana citoplasmtica. Bactericidas, bacteriosttico, funguicida y virucida, destruye virus envueltos. Antisptico de piel, instrumentos, utensilios y gomas. Cloruro de Benzalconio. cidos orgnicos. Conservadores (cido srbico, cido benzoico, cido ortofosfrico, cido ctrico, cido ascrbico) Inhibicin metablica. Antifngicos en alimentos y cosmticos. Aldehdos. Inactivan protenas por la formacin de enlaces covalentes con grupos funcionales (-NH2, OH, -COOH y SH) Formaldehdo. Biocida. Eliminacin de bacterias y virus en vacunas. Conservacin de especmenes biolgicos. Glutaraldehdo. Esterilizante. Biocida de bacterias incluyendo a M. tuberculosis, esporas y virus. Peroxignos. Su mecanismo de accin es la oxidacin de molculas. Ozono. Desinfectante en agua. Costoso. Perxido de hidrgeno H2O2. Antisptico y desinfectante. Esporocida. Usado en heridas y superficies. Perxido de benzoilo. Antisptico contra bacterias anaerobias en el tratamiento del acn.
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cido peractico. Esterilizante. Biocida para hongos y bacterias, endoesporas y virus. No txico. Desinfectante de equipo mdico y de procesamiento de alimentos. Esterilizantes gaseosos. Esterilizantes de plsticos y materiales termosensibles. Desnaturalizan protenas.

Anlogos. Molculas similares a material celular.

Antibiticos.

Becerril Romn Mara del Mar J.

Gutirrez Hernndez Bernardo

Novelo Carmona Milton B.

Antibiograma. Resistencia. Natural Adquirida Una cruzada Una asociada

Factores Fsicos.
Calor hmedo
Ebullicin. Desnaturaliza los componentes celulares. Punto trmico mortal. Temperatura variable y tiempo constante. La temperatura que destruye a los microorganismos en un tiempo determinado. Periodo trmico mortal. Tiempo variable y temperatura constante. El tiempo que tardar en destruir a los micoorganismos en una muestra a una temperatura determinada. Tindalizacin. Proceso de destruccin de formas vegetativas por medio de vapor de agua y una incubacin para favorecer la germinacin de endosporas, para posteriormente repetir el proceso. Pasteurizacin lenta. Calentar la leche entre 62 y 64C y mantener durante 30 minutos. Luego enfriar entre 4 y 10C . Pasteurizacin rpida. Llamada tambin pasteurizacin continua o bien HTST (High Temperature Short Time), consiste en aplicar a la leche una temperatura de 72 - 73C en un tiempo de 15 a 20 segundos.
Una leche ultrapasteurizada: 110C y 115C por 4 segundos, mientras que la leche esterilizada : 140-150C en 2 s;

inyeccin de vapor purificado, con la cual se eleva la temperatura; la leche pasa inmediatamente a una cmara de vaco, en donde ocurre una expansin del lquido con la siguiente separacin del vapor. Todo tratamiento trmico a temperaturas inferiores al 100C son considerados mtodos de pasteurizacin. Autoclave. Esterilizacin 121C, 15lb, 20 minutos. Esterilizacin comercial 70C.

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Gutirrez Hernndez Bernardo

Novelo Carmona Milton B.

Calor seco
Produce desecacin de la clula, es esto txico por los niveles elevados de electrolitos y fusin de membranas. Transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos. La accin destructiva del calor sobre protenas y lpidos requiere mayor temperatura cuando el material est seco o la actividad de agua del medio es baja. Ventajas: No es corrosivo para metales e instrumentos. Desventajas: Requiere mayor tiempo de esterilizacin respecto al calor hmedo. Materiales que se pueden esterilizar: materiales no alterables por el calor, no hace falta que sean porosos pero s que resistan altas temperaturas, durante prolongados periodos de tiempo. Estufas de esterilizacin (horno). Doble cmara, el aire caliente generado por una resistencia circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cmaras. Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal, que al dilatarse por el calor, cortan el circuito elctrico. Para el control del proceso existen: Mtodos fsicos. Uso del termmetro interno vs externo. Mtodos qumicos. Cinta testigo y tiras reactivas. Mtodos biolgicos. Bioindicadores de B. subtilis. Temperaturas bajas. Disminuye la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Provoca la formacin de cristales*. Conservacin de alimentos, reactivos y muestras biolgicas. Refrigeracin 4C. Congelacin -20C* Ultracongelacin -96C* Tiempo de reduccin decimal D. Es el tiempo que una poblacin se reduce en 10 ordenes a una temperatura determinada. Es caracterstico de cada microorganismo.

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