1 INTRODUO

O amido um polissacardeo de extrema importncia em alimentos, produzido em grande quantidade nas folhas dos vegetais como forma de armazenamento dos produtos da fotossntese, e constitudo por dois outros polissacardeos estruturalmente diferentes: a amilose e a amilopectina (NEVES; V. A e SOUZA, K. A. F. , 2010). Para sua determinao em reaes qumicas, diferentes compostos podem ser utilizados, sendo comumente utilizados o lugol, o qual trata-se de uma soluo de iodo(1%) e iodeto de potssio (2%) em gua destilada, e o reativo de 3,5 dinitrosalicilato, conhecido como DNS. Esses reagentes so utilizados devido as suas reaes caractersticas com o amido. O lugol, por se tratar de uma soluo de iodo, reage com molculas de alto peso molecular (como a amilose e a amilopectina), fazendo com que essas sofram reaes de complexao, com formao de compostos coloridos, resultando em complexo azul e vermelho-violceo, respectivamente. A colorao verificada em um tubo contendo ambos dissacardeos ser predominantemente azul em funo da amilose, que diferentemente da amilopectina, possui uma conformao helicoidal que aprisiona o iodo, interagindo melhor com esse, garantindo, assim, maior intensidade da colorao azulada e menor intensidade ao composto da amilopectina (NEVES; V. A e SOUZA, K. A. F. , 2010). J ao reagir o DNS com o amido, aquele reduzido para formar um derivado monoaminado de colorao vermelha, cuja quantidade de amido pode ento ser determinada por um espectrofotmetro (LAPA, N. e MORAIS, J. , 2010). Logo, ao analisar-se as coloraes obtidas para essas reaes pode-se determinar a presena ou no de amido em um produto. A hidrlise do amido para a formao de compostos menores pode ocorrer de diferentes modos, sendo a principal a enzimtica. A hidrlise do amido por via enzimtica corresponde a uma das principais na natureza, sendo essa um dos procedimentos iniciais da digesto dos alimentos, ocorrendo de forma muito rpida nos organismos. Apesar de ser mais comumente encontrada na natureza, h outros tipos de hidrlise, podendo essa ocorrer atravs da adio de cidos. A hidrlise cida ocorre mais lentamente que a enzimtica, de modo que a quebra no ocorre to facilmente, sendo facilmente encontradas amostras de amilopectina e amilose em soluo mesmo aps certos tempos de amostra (BEZERRA, C., 2010).

2 OBJETIVOS

Objetivou-se demonstrar as diferenas entre as hidrlises cidas e enzimticas do amido, de modo que em seguida determinou-se a quantidade de amido atravs do mtodo de curva de calibrao.

3 MATERIAIS E MTODOS 3.1 MATERIAIS E REAGENTES MATERIAIS E REAGENTES Soluo de amido a 1% 1 estante para tubos de ensaio Soluo de lugol 1 bico de gs Reativo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS) 1 tela de amianto HCl concentrado 1 trip Soluo de NaCl 0,9% 8 pipetas de 2mL Soluo de saliva (1:20) 2 provetas de 25mL Soluo padro de glicose (22mg/mL) 2 erlenmeyers de 100ml 1 bquer de 1000mL 1 grade para tubos de ensaio 26 tubos de ensaio 2 pras Banho-maria Conta-gotas 3.2 PROCEDIMENTO 3.2.1 Curva de calibrao para dosagem de acar redutor Reao do DNS

Primeiramente foi identificado 6 tubos de ensaio e os reagentes foram adicionados de acordo com a tabela 1.
Tabela 1 - Preparao de amostras

Tubo 1(branco) 2 3 4 5 6

Soluo de glicose gua destilada ---0,1mL 0,2mL 0,4mL 0,8mL 1,0mL 1,5mL 1,4mL 1,3mL 1,1mL 0,7mL 0,5mL

DNS 1,0mL 1,0mL 1,0mL 1,0mL 1,0mL 1,0mL

Em seguida, todos os tubos foram aquecidos em banho-maria fervente por 5 minutos. Aps resfriados, adicionou-se 7,5mL de gua destilada em cada um deles. Ento suas absorbncias a 540nm foram lidas e anotadas. Sendo assim, um grfico de concentrao por absorbncia foi elaborado e os resultados foram interpretados.

3.2.2 Hidrlise cida do amido

Em um tubo de ensaio, foi colocado 5mL de soluo de amido, levandoo em banho-maria fervente por 5 minutos. Adicionou-se 0,2mL de HCl concentrado, misturou-se e imediatamente retirou-se 0,4mL, os quais foram transferidos e divididos igualmente em dois outros tubos, para a realizao do teste de iodo e de acares redutores. Este foi considerado o tempo zero. Recolocou-se, imediatamente, aps a retirada das alquotas, os tubos de volta ao banho. Em um dos contendo 0,2mL da soluo adicionou-se 3 gotas de lugol e 10mL de gua destilada, para realizao do teste de iodo. No outro tubo, adicionou-se 1,3ml de gua destilada e 1,0ml de DNS, para testar os acares redutores. Repetiu-se ento os procedimentos para os tempos 5, 10, 15 e minutos. Aps cada coleta, foi realizado imediatamente os testes de iodo e acares redutores. Aps a coleta da ltima alquota, executou-se procedimentos seguintes apenas para os tubos coletados para a anlise acares redutores. 20 de os de

Foi levado ao banho-maria fervente, os tubos correspondentes ao tempo zero, 5, 10, 15 e 20 minutos, por 5 minutos. Aps resfriados, foi adicionado a cada um deles 7,5mL de gua destilada. Em seguida, suas absorbncias foram lidas e devidamente anotadas. Utilizando a curva de calibrao, construda previamente, calculou-se as quantidades de acar redutor formado (em MG de glicose) durante a hidrlise. Traou-se, ento, um grfico de mg de glicose por tempo de hidrlise. E seus resultados foram interpretados.

4.2.3 Hidrlise enzimtica do amido

Colocou-se 5mL de soluo de amido em um tubo de ensaio, e esse foi levado em banho-maria a 37C por 5 minutos. Durante esse tempo, foi preparada a soluo de saliva com NaCl 0,9% na proporo 1:20. Em seguida, adicionou-se ao tubo com a soluo de amido, 0,2mL da soluo de saliva diluda, misturou-se e imediatamente retirou-se 0,4mL, os quais foram transferidos em partes iguais para outros 2 tubos de ensaio, para a posterior realizao dos testes de iodos e de acares redutores. Esse foi considerado o tempo zero da reao. Repetiu-se, ento, uma parte dos procedimentos realizados na hidrlise cida do amido.

4 RESULTADOS E DISCUSSES

4.1 CURVA DE CALIBRAO PARA DOSAGEM DE ACAR REDUTOR DO DNS

A curva de calibrao para a dosagem de acar redutor forneceu o grfico 1 descrito. Para a construo do grfico foram utilizados os dados obtidos atravs da degradao de um padro de glicose 2mg/L atravs de uma reduo do DNS. O procedimento foi realizado para concentraes de 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 2,0mg/L assim como mostrado na tabela 2.

Tabela 2. Concentrao do padro de glicose

Tubo Soluo de glicose gua deionizada Concentrao Absorbncia 1 2 3 4 5 6 0 0,1 0,2 0,4 0,8 1,0 1,5 1,4 1,3 1,1 0,7 0,5 0 0,2 0,4 0,8 1,2 2,0 0 0,063 0,129 0,276 0,528 0,682

Grfico 1. Curva de calibrao para a glicose padro

Com os dados do padro da reao possvel descobrir a quantidade de glicose reduzida pelo DNS tendo apenas a absorbncia da soluo vista em 540nm em um espectrofotmetro. A equao que define a curva encontrada est descrita na equao 1, na qual A a absorbncia esperada e C a concentrao da amostra.

A = 0,0037 + 0,3607C Equao 1

4.2 HIDRLISE CIDA DO AMIDO

O tubo de ensaio contendo a soluo de amido, depois de ser levado ao banho-maria e reao com o cido, a qual gera uma reduo do amido, foi testado com o lugol e o DNS. O teste com lugol fornece se na soluo ainda h amido a ser degradado acar redutor. Ento na presena de iodo a soluo adquire uma tonalidade perto do roxo ou azul escuro. Em observao aos tubos que so reagidos observou-se uma tonalidade de azul nos dois primeiros tubos de ensaio e uma colorao amarelada nos 3 tubos restantes. Porm com

o passar do tempo a tonalidade ia clareando at se tornar amarelo claro. A tabela 3 mostra, qualitativamente, a cor que a soluo ficou aps a adio de lugol.

Tabela 3. Cor da soluo de amido com adio de lugol.

Tubo 1 2 3 4 5

Tempo 0 5 10 15 20

Cor Azul escuro Lils Amarelo escuro Amarelo Amarelo claro

No teste realizado com a adio de DNS foram feitas 5 amostragens da amostra principal. Em todas aps a adio de DNS a soluo adquiriu uma cor amarelada at laranja dependendo da quantidade de acar reduzido presente na amostra. A tabela 4 mostra a relao entre a absorbncia e o tempo decorrido da adio do cido clordrico no tubo.

Tabela 4. Relao entre a degradao do amido e o tempo decorrido na hidrlise cida

Tubo 1 2 3 4 5

Tempo 0 5 10 15 20

Absorbncia 0,087 0,146 0,190 0,122 0,261

Com o passar do tempo o cido reduz cada vez mais amido gerando mais aucares que reagem com o DNS para formar o complexo amarelo, ou seja, quanto mais amido reduzido maior ser a intensidade da absorbncia medida pelo aparelho. Porm um erro, no detectado pela equipe, fez com que os tubo 4 ficasse com uma absorbncia no esperada. Esse erro pode

estar associado a uma troca entre os tubos, uma reao incompleta ou a um equivoco na colocao dos reagentes. O esperado para essa prtica era que a reao acontecesse mais com o decorrer do tempo aumentando sua absorbncia proporcionalmente. O grfico 2 mostra a relao obtida, pela equipe, ao decorrer do tempo de reao de hidrlise. Com ele mais fcil visualizar a desconformidade encontrada.

Grfico 2. Absorbncia medida para a reao com DNS na hidrlise cida

Considerando a reao correta em todos os tubos a concentrao encontrada no tubo 6, o que ficou reagindo por 20 minutos, seria de 0,7133mg/L de glicose na amostra. Em comparao o tubo que reagiu apenas 5 minutos tem uma concentrao de amido de 0,3945mg/L de amido. Com isso possvel perceber um aumento de quase duas vezes na concentrao em apenas 15 minutos de diferena. Juntando o resultado dos dois testes possvel entender essa diferena. Com a diminuio de amido, perceptvel pela mudana de cor com o lugol, h um aumento do acar, isso mostra que o amido est sendo hidrolisado.

4.3 HIDRLISE ENZIMTICA DO AMIDO

O tubo de ensaio contendo a soluo de amido, depois de ser levado ao banho maria e reao com a amilase (vinda da soluo de saliva preparada), a qual gera uma reduo do amido, foi testado novamente com o lugol e o DNS. Assim como na hidrlise cida o lugol, foi utilizado para verificar a presena do amido na soluo. Porm a reao com a enzima foi muito rpida o que ocasionou uma degradao quase que imediata do amido presente na amostra e impossibilitou a visualizao da mudana de cor. Porm o teste com DNS indicou a presena de um pouco de amido na soluo, j que a colorao tornou-se amarelada. A tabela 5 coloca a relao entre a soluo com o complexo com DNS e a absorbncia medida que o tempo passa.

Tabela 5. Relao entre a degradao do amido e o tempo decorrido na hidrlise enzimtica.

Tubo 1 2 3 4 5

Tempo 0 5 10 15 20

Absorbncia 0,079 0,081 0,063 0,247 0,081

Como ocorreu na hidrlise cida os resultados da reao no ocorreram como o esperado. Os resultados esperados era um aumento continuo da quantidade de acar produzido, porm houve uma mudana muito brusca ao decorrer da reao. O grfico 3 construdo apartir dos dados da tabela 5, nele possvel ver essas mudanas.

Grfico 3. Absrobncia medida no decorrer do tempo da hidrlise enzimtica

Esse erro experimental pode ser atribuido pela utilizao de vrias amostras para a construo do grfico. Durante o procedimento o tubo contendo a soluo foi perdida e por falta de tempo para a realizao de uma nova amostra, a soluo da bancada ao lado foi utilizada. Mas esse erro grande no est associado somente a essa utilizao de mais de uma amostra, outro erro deve estar presente.

4.4 QUESTES

1) Com relao natureza dos produtos de hidrlise, diferencia a ao de um cido mineral e da -amilose salivar sobre o amido.

A reao de hidrlise por um cido mineral sob aquecimento quebra as ligaes glicosdicas (14) e as (16), resultando glicose, j a hidrolise enzimtica pode resultar diferentes produtos. Quando ocorre a quebra ligaes (14) origina uma mistura de maltose, amilopectina e glicose, no rompimento das ligaes (16) ocorre a formao de outra mistura de polissacardeos denominada dextrina. (WELKER, 2007)

2) Em que se fundamenta o mtodo do DNS para a dosagem de acares redutores?

O objetivo de se adicionar o DNS a formao do 3-amino-5nitrosalicato, que absorve luz no comprimento 540nm. A formao desse produto ocorre da seguinte forma, durante a hidrlise do amido o 3,5dinitrosalicitato reduzido a 3-amino-5-nitrosalicato, cada mol do acar redutos formar um mol desse composto. (WELKER, 2007)

3) Explicar os resultados obtidos na hidrlise cida e enzimtica do amido, em funo da evoluo das cores obtidas nos tempos zero a 20 min, com o iodo e o DNS.

Teoricamente com o passar do tempo a tonalidade de amarelo das solues com DNS ficam mais escuras,pois a formao de uma maior quantidade de 3-amino-5-nitrosalicato sendo maior a intensidade da absorbncia medida pelo aparelho. (WELKER, 2007)

4) Supondo que a hidrlise cida mineral do amido fosse parcial a ponto de permitir o isolamento preferencial de dissacardeos, qual seria a estrutura destes dissacardeos (tipos de ligaes glicosdicas)? Lembre que o amido composto por dois tipos de polissacardeos.

A estrutura do dissacardeo formado pela hidrolise parcial ser a mostrada a seguir, pois haver somente a quebra das ligaes das ramificaes, (16), permanecendo as ligaes (14). (WELKER, 2007)

5) Para dosagem de acares redutores pode ser usado tambm o reativo de Benedict. Qual a composio desse reativo e qual o funcionamento desse mtodo?

O reagente de Benedict contm o on cprico complexado (azul) em meio bsico com o on citrato (UALG, 2007), cuja funo fazer com que o on Cu2+ no reaja com o meio alcalino (Reao 1), ou seja, para evitar que essa reao acontea, mascarando o teste para acares redutores, adicionado o citrato de sdio, que mantm o Cu2+ em soluo, atravs da formao de um complexo. (UNESP, 2010)

Reao 1

As oses e glicdios redutores quando aquecidos com reativos contendo metais tm a propriedade de reduzir estes metais. A propriedade redutora dada pelo nmero de enediis formados na soluo. Para o glicdio formar enediis necessrio que tenha sua hidroxila heterosdica livre, podendo passar da estrutura cclica para estrutura aberta. (UFCSPA, 2010) A ao redutora de acares em meio alcalino bastante utilizada para a determinao quantitativa e qualitativa de acares. Pois, com o aquecimento do acar com grupamento redutor, em presena dos ons Cu2+ e OH-, o Cu2+ reduzido a Cu+ e o acar oxidado, e ocorre a formao de precipitados de Cu2O (xido cuproso), de acordo com a reao 2. Sendo que a cor do precipitado depende do contedo de acar redutor. (USP, 2008)

Reao 2

6) Se uma amostra de amido for tratada com -amilase por um longo perodo de tempo, o teste de Benedict dar resultado positivo? Justifique.

O amido quando tratado com saliva se degrada totalmente at glicose, sua ose fundamental. Isso ocorre por que encontramos na saliva a enzima amilase, que atua sobre o amido, realizando sua hidrlise enzimtica. Porm nessa hidrlise, o amido passa pelas seguintes etapas intermedirias (FURG, 2010):

Durante a reao com o reagente de Benedict a soluo muda da cor azul para verde a vermelho escuro dependendo da quantidade de ons cobre(II) presentes (PATACA, 2006). Sendo que a cor do precipitado tambm depende do contedo de acar redutor (USP, 2008), no possvel ter certeza se o resultado dar positivo, uma vez que a soluo no homognea, o que no permite a realizao de uma curva de calibrao.

5 CONCLUSO

Apesar dos erros evidentes nos experimentos foi possvel verificar a presena do complexo 3-amino-5-nitrosaliciato nas solues que continham DNS, nas com iodo alm de analisar a presena do amido foi possvel quantificar o analito, por meio da observao da colorao das solues, as quais variaram da cor azul a amarelo claro. A prtica tambm proporcionou a observao experimental do fato da velocidade de uma hidrolise enzimtica ser muito maior do que a de uma hidrolise cida.

6 REFERNCIAS

BEZERRA, Clovis. Desencolagem/Desengomagem. Disponvel em <http://clovisbezerra.tripod.com/materiais-didaticos/proqui-i/desencolagem.pdf> . Acessado no dia 09-06-2010.

FURG. Qumica de Glicdios. Disponvel em <http://www.octopus.furg.br/ Ensino/Praticas/bioquimica/biologia/rotbiol.rtf>, acessado no dia 9 de junho de 2010.

LAPA, Nuno; MORAIS, Joo. Tipos de Lipdeos. Disponvel em <http://gdeh.fct.unl.pt/mestrado/Teoricas/Aula%203%20-%20An%E1lise%20de %20l%EDpidos%20e%20de%20a%E7ucares.pdf>. Acessado no dia 09-062010.

NEVES, Valdir Augusto; SOUZA, Karina de Ap. F. de;. Teste do Iodo. Disponvel em <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/ teste_amido.htm>. Acessado no dia 09-06-2010.

PATACA, Luiz Carlos Moutinho. Anlises de mel e prpolis utilizando mtodos quimiomtricos de classificao e calibrao. Orientador: Ronei Jesus Poppi. Tese - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica. Campinas, SP: [s.n], 2006.

UALG. Oxidao de compostos orgnicos. Disponvel em <http://w3.ualg.pt/~abrigas/QOIIP0708P1.pdf>, acessado no dia 9 de junho de 2010.

UFCSPA. Glicdios. Disponvel em <http://bioquimica.ufcspa.edu.br/pg2/ pgs/nutricao/quimicanut/glicidios.pdf>, acessado no dia 9 de junho de 2010.

UFSC. Pesquisa de acares redutores: prova de Benedict. Disponvel em <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/benedict.htm>, acessado no dia 9 de junho de 2010.

USP. Prticas de Bioqumica Conceitos Gerais. Disponvel em <http://www.fcfrp.usp.br/dfq/Bioquimica-Odonto/APO_BIOQUIMICA_Conceitos _Gerais%20-%20ODONTO%20-%201o_sem_2008.pdf >, acessado no dia 9 de junho de 2010.

WELKER, Alexandre. Bioqumica- aulas prticas. Editora UFPR. 7Edio. Curitiba, 2007