Capitolul I MICROORGANISMELE DIN LAPTE ( MICROFLORA LAPTELUI )

Laptele reprezinta un mediu de cultura complet si favorabil pentru numeroasemicroorganisme sau un mediu convenabil de supravietuire a altor microorganisme si virusi care nu se pot multiplica n lapte, dar care l pot polua (M. tuberculosis, M. bovis, virusi). Compozitia microbiologica a laptelui este diferita din punct de vedere calitativ si cantitativ, deoarece sursele de contaminare pot fi numeroase. Sursele de infectie a laptelui pot fi interne si externe. Sursele interne: n glanda mamara exista ntotdeauna bacterii care patrund pe canalul lactic alugerului care contamineaza laptele mulsului, contaminarea fiind mai mare cu ct sfincterul mameloanelor este mai relaxat si exista o permanenta deschidere larga a mameloanelor.Primul lapte extras din mamela este cel mai contaminat, numarul de microorganismescaznd pe masura ce mulsoarea progreseaza. Volumul primelor jeturi este mic, deciinfluenta asupra nivelului de contaminare este nesemnificativa. n glanda mamara pot sa patrunda microorganisme pe doua cai: calea ascendenta, prin canalul mamelonului, cale care este folosita desaprofiti (Micrococcus, Streptococcus si altele) calea endogena, prin intermediul circulatiei sangvine, n care caz microflora se localizeaza n mamele si produce diverse leziuni (M.tuberculosis, Brucilla etc.). Surse externe: Principala sursa externa de contaminare a laptelui l reprezinta mediul nconjurator, care este prezent n toate fazele de prelucrare ncepnd cu materia prima si terminnd cu produsele finite.

Apa, aerul, solul, dejectiile si apele reziduale pot constitui surse de infectare microbiana alaptelui si produselor lactate. Astfel : apa naturala folosita la spalarea ambalajelor, utilajelor etc. poate contine pe lnga microflora specifica si germeni patogeni proveniti din aer, sol, dejectii animale siumane si de aceea calitatea microbiologica a acesteia trebuie verificata periodic n laboratoarele de specialitate; aerul contaminat accidental cu microorganisme prin intermediul particulelor de praf, apei n suspensie, sporilor bacterieni sau particulelor de saliva eliminate prin tusepoate constitui o sursa de infectie pentru lapte. organismele din sol pot ajunge n lapte prin intermediul diferitelor impuritati, a prafului, resturilor vegetale, acolo unde mulsul se executa neigienic saulaptele este tinut n conditii necorespunzatoare. De asemenea microflora solului poateajunge si prin intermediul curentilor de aer, al apei impurificate, al ncaltamintei si al mbracamintei personalului muncitor. Vegetalele n mod normal nu contin germeni patogeni. Totusi resturi din vegetalecontaminate cu bacterii coliforme si lactice, drojdii si mucegaiuri, pot ajunge n lapte,influentnd negativ calitatea acesteia. Rozatoarele sunt frecvent purtatoare de bacterii patogene si n special deSalmonella, din care motiv se impune combaterea rozatoarelor n mod sistematic, att laproducatorii de lapte, n unitatile care industrializeaza laptele ct si n cele de desf acere. Insectele, n special mustele, gndacii si mai putin furnicile, au un rol deosebit ncontaminarea laptelui si derivatelor sale mai ales n sezonul calduros. Omul este purtatorul si eliminatorul de germeni care pot contamina alimentele, att n perioada de incubatie ct si imediat dupa vindecarea unei boli microbiene, situatie cuatt mai grava n cazul produselor care consumndu-se ca atare nu mai sufera nici un felde prelucrare termica, industriala sau n gospodarie.

Obiectele folosite la muls, inclusiv instalatia mecanica de muls, n conditiile uneiigienizari defectuoase a acestuia, care pot contamina laptele cu microflora aflata n faza dedezvoltare logaritmica (bacterii lactice si pseudolactice). Atmosfera adaposturilor sau spatiilor unde se mulg animalele. Microorganismele din praful degajat de pe paiele de asternut, furaje, fecale, vehicule (furajele grosiere poarta n special bacterii sporulate tip Bacillius, Clostridium; silozurile contin bacterii butirice;fecalele contin enterobacterii si n special coli) 1.Originea microorganismelor Laptele normal, muls n conditii aseptice, contine diferiti germeni.Sursele de contaminare sunt: - mamela - n intervalul dintre doua mulsuri, pe canalul galactofor intra din mediulexterior numerosi germeni, care gasesc conditii prielnice de multiplicare. n parteaterminala a mamelei, se gasesc ntotdeauna microorganisme nepatogene cu proprietatiproteolitice si acidifiante. - animalele cu diferite boli sau afectiuni mamare - n lapte apare un numar mare demicroorganisme patogene responsabile ale afectiunii respective. - n timpul mulsului, laptele se infecteaza cu germeni proveniti de pe partea externa augerului, de pe minile mulgatorului, din vasele de muls manual sau mecanic, din prafuldin aer, de pe diferite impuritati organice sau anorganice ce patrund n lapte, etc.Gradul de contaminare al laptelui depinde deci n mare masura de:- starea de sanatate a animalului; - starea de igiena n timpul mulsului si manipularii lui.

2.Actiunea microorganismelor asupra laptelui Sub actiunea microflorei, laptele dupa recoltare de la animal este supus unor transformari, unele dorite, folosite pe scara industriala, altele daunatoare.

Succesiunea acestor transformari corespunde la 4 perioade: - bactericida - de acidifiere - de neutralizare - de putrefactie a. Prin coborrea temperaturii laptelui ct mai aproape de zero, se constata oprelungire a fazei bactericide a laptelui, adica perioada n decursul careia n lapteleproaspat muls nu se dezvolta bacterii, scaznd chiar numarul lor.

b. Dupa faza bactericida, microorganismele intra n faza de multiplicarelogaritmica, si ca urmare aciditatea laptelui creste. Caracteristicile laptelui se modifica,gustul si mirosul devin acide, cazeina precipita. Excesul de acid nu mai convinegermenilor lactici, care ncep sa fie inhibati, n schimb mediul este prielnic pentru drojdiesi mucegaiuri.

c. Perioada de neutralizare - Drojdiile si mucegaiurile consuma ntreaga cantitatede acid, neutraliznd mediul si creeaza conditii pentru dezvoltarea microflorei deputrefactie.

d. Bacteriile proteolitice de putrefactie degradeaza stratul proteic, laptele devineneconsumabil, cu miros si gust respingator. Modificarile provocate de microorganisme n lapte si produse lactate apar caurmarea degradarii celor 3 componenti principali: lactoza, proteinele si grasimea.Lactoza sufera fermentatii caracterizate prin: - producere de acizi organici ( fermentatia lactica ) - acizi organici, gaze, alcool ( bacteriile din grupul coli, unele bacterii lactice). - acizi organici si gaze ( bacterii propionice, butirice ) - gaze si alcooli ( drojdiile )

- substante vscoase ( anumiti germeni cu actiune filanta ) Proteinele sunt degradate cu formare de peptone, polipeptide, aminoacizi, amoniac.Grasimile sub actiunea lipazelor microbiene sunt hidrolizate si apare gustul iute,rnced.

3.Clasificarea microorganismelor din lapte

a. homofermentative Ce fermenteaza lactoza, producnd 90 -97 % acid lactic sinumai urme de produsi secundari. Ca exemple se pot da: - Lactobacillus lactis, L. helveticus. L. bulgaricus, L. thermophilus, ce se gasesc nculturile de iaurt, chefir, svaiter. Ei sunt acidifianti puternici avnd o temperatura optimade dezvoltare de 37 62 C. - Lactobacilus casei, L. plantorum - sunt acidifianti lenti, au actiune proteolitica destul deputernica si un optim de dezvoltare ntre 28 si 32 C. - Streptococus lactis si Str. cremonis sunt acidifianti moderati, folosindu-se lafermentarea smntnii si a brnzeturilor. - Str. Thermophilus intra n componenta culturilor pentru iaurt si brnzeturi.

b. heterofermentative Formeaza putin acid lactic, dar n cantitati mari alti acizi,diferite substante si gaze. Astfel de bacterii sunt: - Lactobacilus bifidus care produce cantitati mari de acid acetic - Lactobacilus caucasium care traieste n simbioza cu drojdiile n chefir,producnd acid lactic, acid mucinic, gaze. - Lactobacilus fermenti, L. brevis ce se gasesc n brnzeturi.

- Leuconostoc, bacteria ce da aroma caracteristica untului si smntnii. Streptococcus lactis - Cel mai important pentru toate produsele lactate.Sub forma decoci,diplococi sau lanturi.Coaguleaza laptele prin acidifiere la 120 oT la temperature optima de 20 32 C. Streptococcus cremoris - Este caracteristic pentru fermentarea smantanii,sub forma delanturi lungi,temperatura optima de 30 38 C produce aciditate de 110-115 oT cu gust pur acru.Descompune usor cazeina,dand coagul fin,cu vascozitate mare. Streptococcus diacetilactis - caracteristic pentru smantana si unt,produce si substantede aroma. Streptococcus termophilus - caracteristic pentru iaurt si branzeturi cu pasta tare.Subforma de lanturi lungi,temperatura optima este de 45 C ,actiune acidifianta,cu tendintade mucilagiu. Leuconostoc citrovorum si paracitrovorum - sunt bacterii heterofermentative,pentru aroma la unt.Sub forma de coci,produc o cantitate mica de acid si nu coaguleaza laptele. Lactobacillus lactis - sunt bacterii termofile,temperatura optima este de 37-45C ,sunt sub forma de bastonase lungi,produce cantitati mari de acid lactic si descompune cazeina. Lactobacillus bulgaricus - sunt bacterii caracteristice iaurtului,au o actiune acidifianta puternica, produc in masura mai mica descompunerea proteinelor. Lactobacillus helveticus

- este important in maturarea branzeturilor cu pastatare,aciduleaza puternic mediul(300-450 oT) si produce o usoara descompunere acazeinei. Lactobacillus casei - este sub forma de bastonase cu lanturi mai scurte sau mailungi,temperatura optima este de 28-32 C, caracteristic branzeturilor, cu actiune de descompunere a cazeinei.

1. Bacterii pseudolactice Fac parte din grupa Coli -Aerogenes,din care fac parte Aerobacter si Escherichia Coli.Sunt bacterii de infectie,care ajung in lapte dinapa,sol,nutreturi,balegar,provocand defecte,multe gaze si gust impur. Aerogenes aerogenes - sub forma de bastonase,mobile,izolate sau in gramezi-coaguleaza laptele;produce putin acid lactic,dar si alti acizi,precum si multe gaze(mai mult CO2 decat H2), ataca putin proteinele. Escherichia Coli - reprezentantul tipic al microflorei intestinale,sub forma de bastonasemobile,produce multe gaze(CO2 si H2 in cantitati egale), provoaca balonarea timpurie a branzeturilor si gust neplacut in produsele lactate.

2. Bacterii propionice - se gasesc curent in lapte,dar actioneaza numai in anumite conditii, avand un rol important in fabricarea branzeturilor tari si semitari. Produc fermentatia propionica acesta fiind un proces anaerob prin care acidul lacticeste transformat in acid propionic,acid acetic,apa si CO2. Bacteriile propionice se gasesc in lapte sub forma de bastonase scurte sau alipite.

Sunt bacterii Gram pozitive,anaerobe,sursele de hrana fiind lactatii,citratii,glicerol. Sunt mezofile,temperatura optima fiind de 28-30 C, se dezvolta la pH=6,5-7. Ele determina formarea retelelor de ochiuri in branzeturi de tip Emmenthal si Schweizer.

3.Bacteriile butirice produc ca produs principal acid butiric si CO2, iar ca produsi secundari alcool etilic, alcool butiric, alcool propilic si acetona. Sunt bacterii Gram pozitive, sporulante, nu se distrug prin pasteurizare, au forma de bastonase si sunt strict anaerobe. Sunt mezofile, actioneaza la pH-uri de 4-4,5. Au un efect negativ asupra branzeturilor, rupturi in pasta si un miros dezagreabil.

4.Bacteriile de putrefactive sunt bacterii mezofile si psihrofile determina efecte graveale laptelui. Au o actiune intensa de proteoliza si apar in lapte prin nerespectareaconditiilor de igiena.

5.Bacteriofagii sunt virusuri si ataca bacteriile lactice,blocandu-le activitatea metabolica, se ataseaza de streptococi si lactobacili. Avem doua categorii debacteriofagi: temperati si virulenti(cei temperati mai periculosi decat cei virulenti). Incidenta lor in lapte este favorizata de:ionii de Ca2+ din mediu, rezistenta lor la pasteurizare(70-75C /30 minute) si pH-ul de 4,5-8,6.

Bacteriile patogene provin de la animalele bolnave sau din mediul exterior, de la manipulare. Animale bolnave contin: - Mycobacterium tuberculosis; - Salmonella typhimurium ; - Brucella abortus. Din surse umane ajung n lapte: - Salmonella paratyphi;

- Streptococus scarlatinae; - Virusul poliomelitei. Majoritatea acestor germeni patogeni nu provoaca modificari sensibile alecomponentilor laptelui.

7. Mucegaiurile Sporii mucegaiurilor ajung n lapte n mod accidental si se dezvolta dupa ce bacteriilelactice au pregatit mediul formnd o aciditate neta, de aceea nu se gasesc dect n laptele foarte alterat sau pe unt si brnza. Se dezvolta pe suprafata produselor, iar n interior numai la unt si brnzeturi. Mucegaiurile inferioare: mucor mucedo si rhizopus nigrans se dezvolta pebrnzeturile moi producnd defecte. Monilis nigra - provoaca pete brune sau negre pe brnzeturile tari. Penicillium camemberti si Penicillium candidum sunt mucegaiuri caracteristice brnzei Camembert si Brie. Penicillium roqueforti este mucegaiul brnzei Roguefort. Penicillium casei cauzeaza pete brune pe coaja brnzei svaiter.Cladosporium butyri provoaca rncezirea untului. n lapte germenii prezenti se dezvolta foarte rapid n functie de temperatura de pastrarea acestuia.

8.Drojdiile n lapte se gasesc drojdii adevarate ( Saccharomyces, Zigosaccharomyces )si drojdiifalse ( Torulopsis, Candida ). Sacharomyces lactis, Sacharomyces fragilis fermenteaza lactoza, formnd alcool sigaze, pot provoca balonarea brnzeturilor cu pasta moale si a celor cu continut mic degrasime. Torula cremoris, Torula sfericae produc n lapte si smntna cantitati importante de gaze si dau gust strain, neplacut.Torula chefiri, Torula kums au rol important la

fabricarea produselor lactateacide.Torula amare, torula lactis condensi produc defecte la laptele concentrat.Torula nigre, Torula rubre produc pigmentari.

Capitolul II CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL LAPTELUI, PRODUSELOR LACTATE ACIDE SI A BRANZETURILOR

Proprietile bacteriostatice i bactericide ale laptelui Proprietatea laptelui proaspt muls de a mpiedica dezvoltarea microorganismelor, care au ajuns nel n procesul de obinere, se numete proprietate bacteriostatic, iar cea de a distruge unele bacterii - proprietate bactericid. Aceste proprieti ale laptelui proaspt muls se datoresc prezenei n el a unor substane specifice, numite lactenine i a unor substane biologic active cum sunt anticorpii, lizozimul,etc. Laptele colostral are proprieti bactericide mai pronunate datorit coninutului mai mare deanticorpi. Perioada de timp n decursul creia numrul de bacterii n lapte nu se mrete se numete faza bactericid. Substanele ce condiioneaz proprietile bacteriostatice i bactericide ale laptelui sunt foartenestabile i se distrug n laptele nercit n decursul a 2.. .3 ore, dup ce numrul de bacterii crete brusc. Se distrug aceste substane i n procesul tratamentului termic al laptelui, deci, laptele pasteurizat sau fiert nu manifest proprieti bactericide. Durata fazei bacteriostatice i bactericide este condiionat de mai muli factori, principalii fiind:Intervalul de timp de la mulgerea laptelui pn la rcire. Cu ct aceast perioad este mai redus,cu att durata fazei bacteriostatice i bactericide este mai mare. Se recomand ca laptele s fie rcit numai trziu de o or dup obinere. Temperatura de rcire: - cu ct ea este mai aproape de 0C, cu att durata fazei bactericide i bacteriostatice va fi mai mare. Gradul iniial de impurificare a laptelui cu bacterii.

Cu ct acesta va fi mai redus, cu att faza bacteriostatic i bactericid va fi mai lung. Crearea condiiilor necesare pentru meninerea laptelui n faza bacteriostatic i bactericid permite pstrarea proprietilor lui de lapte proaspt pn la prelucrarea industrial.

1.Recoltarea si pregatirea probelor pentru analiza microbiologica Produsele in ambalajele pana la 1Kg se recolteaza ca atare, pentru produse din ambalaje mai mari de 1 Kg se recolteaza in mod aseptic probe de 250-500 mL (pentru lapte si produsele lichide) si 250-500g (lapte praf, brnzeturi si unt). Probele se analizeaza imediat dupa recoltare sau dupa caza se admite o pastrare la 2-4C timp de maximum 4 ore pentru produse lactate si maximum 24 ore pentru brnzeturi, unt, lapte praf.. Pentru controlul microbiologic probele se omogenizeaza si se executa dilutii decimale in ser fiziologic steril , cu urmatoarele precizari: - smntna consitenta se mentine nainte de omogenizare, pe baie de apa termostatata la 47C; - din branzeturi, lapte praf si late produse lactate se cantaresc aseptic cate 10g se omogenizeaza in mojar steril si se adauga 90 ml ser fiziologic steril incalzit pana la 47C si se obtine o suspensie uniforma ( dilutia 1) - in cazul untului se cantaresca septic 10g intr-o eprubeta sterila si se adauga 20 ml apa peptonata. Se mentine la 47C pe baie de apa pana la topirea untului si se fac rotiri repetate pentru omogenizare, pana se observa separarea grasimii de zara. Cu o pipeta sterila, se preleveaza 2 ml zara ( cantitatea care corespunde la 1g unt, se adauga 8 ml solutie de diluare, obtinandu-se astfel diluatia 1/10.

2. Aprecierea calitatii microbiologice a laptelui Pentru determinarea numarului de microorganisme din lapte se poate folosi: - metoda directa - metoda de numarare Breed ( lapte si produse lactate); - metoda indirecta cand se poate aprecia calitatea microbiologica a laptelui in functie de durata in care se produce modificarea culorii unor indicatori de pH si rH

(albastru de metilen si resazurina), sub actiunea reductazelor si a catabolititlor formati in conditii standardizate , sub actiunea microorgansimelor vii prezente in produs.

a.Proba reductazei cu albastru de metilen

Principiu: Albastru de metilen este un indicator de oxidoreducere care in prezenta reductazelor trece din forma oxidata colorata in albastru, la leucoderivatul incolor.

Tehnica de lucru: Pentru analiza laptelui, se introduc 20 ml lapte intr-o eprubeta sterila se adauga 1 ml solutie de albastru de metilen si se noteaza dupa omogenizare timpul. Eprubeta se mentine in baie de apa termostata la 38-40C astfel incat nivelul apei sa fie superior probei. Se fac notatii asupra modificarii culorii la intervale de 20,60,120,180,330 minute. Prin metoda rapida se procedeaza in acelasi mod folosind urmatoarele cantitati: 10 ml lapte si 1ml solutie albastru de metilen dilutie 1/10. Interpretarea rezultatelor si aprecierea calitatii laptelui se face dupa datele din tabelul 1. Tabelul 1. Aprecierea calitatii laptelui in proba reductazica cu albastru de metilen
Durata decolorarii probei in minute 330 330 Numar bacterii pe ml 180 180 5x105 Buna 5x105-4x106 Satisfacatoare 330 180 4x106 -20x106 Slaba 330 180 20x106 Foarte slaba IV III 20 8 I II 120-330 20-120 60-180 8-60 Calitatea laptelui Categoria Metoda clasica Metoda rapida

b.Proba reductazica cu resazurina Principiu: Resazurina este un indicator redox care isi schimba culoarea de la albastru la violet spre roz si incolor in funtie de potentialul de oxidore-ducere.

Tehnica de lucru : Pentru aprecierea calitatii microbiologice a laptelui crud in eprubete cu 10ml lapte de analizat se adauga 1 ml solutie de resazurina 0.05, se astupa cu dop de cauciuc si se face termostatare la 38-40C urmarindu-se modificarea culorii dupa 20 si 60 minute. In proba reductazica cu resazurina 0.05%, aprecierea culorii se face dupa datele inscrise in tabelul 2.

Interpretarea rezultatelor Se apreciaza ca la temperatuta de 38-40C capacitatea reductazica superioara o au lactobacilii, streptococcii si bacteriile coliforme. Daca probele se mentin la 22C la reducere participa si bacterii din genul achromobacter, g. Bacillus, g. Enterococcus.

Tabelul 2 Aprecierea numarului de bacterii din proba de lapte

Timp de modificare a culorii Dupa 1h Dupa 1h proba Albastru Albastru violet Dupa 1h Ros-alb Culoare Numar de bacterii la 1ml lapte 5x105 Buna 5x105 - 4x106 Satisfacatoare 4x106 20x106 Slaba Dupa 20 min Alb 20x106 Foarte slaba IV III I II Calitatea laptelui Categoria

c. Proba fermentatiei (lactocoagulare) Intr-o eprubeta sterila se introcu 20 mL lapte si se mentine in termostat la 37C. - se urmareste timpul in care se produce coagularea iar dupa 24 ore se examineaza aspectul coagulului.

Daca coagularea s-a produs dupa 4-6 ore rezulta ca in lapte predomina bacteriile lactice care produc prin fermentatie acid lactic care determina coagularea acida a cezeinei. Un coagul compact si omogen denota prezenta bacteriilor homofermentative; - un coagul buretos in care se disting bule de gaz, evidentiaza predominanta bacteriilor coliforme. Executarea unui frotiu colorat prin tehnica Gram intareste concluziile privind aspectul probei fermentate ( bacteriile lactice sunt bacterii Gram +, bacteriile coliforme Gram negative

3.Determinarea bacteriilor butirice ( laptele destinat fabricarii branzeturilor si branzeturilor) Se executa prin metoda Weinzirl in probe de lapte destinat fabricarii branzeturilor.

Tehnica de lucru In 5 eprubete ce contin parafina se introduc cate cinci mlililitri proba de analizat. Dupa pasteurirzare ( mentinere 10 minute la 80C) si termostatare 48 ore la 37C se apreciaza eprubetele pozitive, in care s-a produs deplasarea dopului de parafina.

Interpetarea rezultatelor Lapte caliatate buna toate eprubetele sunt pozitive Lapte calitate satsfacatoare 1 eprubeta pozitiva din 5 Lapte de calitate nesatisfacatoare 2 pana la 5 eprubete pozitive.

4. Determinarea bacteriilor coliforme (lapte , produse lactate si branzeturi) Se executa prin metoda titrului prin insamantarea a cate 1 ml in cate 3 eprubete cu mediu BBLVP din trei dilutii succesive si termostatare la 37C timp de 48 ore. In functie de numarul de eprubete pozitive se stabileste cifra caracteristica si numarul probabil de coliformi.

5. Testul stabilitatii Pentru produsele lactate proaspete, cum sunt deserturile pe baza de lapte, produsele lactate acide si branzeturile proaspete, este util sa se realizeze testul de stabilitate, care consta intr-o incubare timp de 3 zile la 30C. in acest interval de timp se urmareste aparitia alterarilor ( modificarea caracteristicilor senzoriale, producere de gaz, etc.).

6. Determinarea microbiotei aerobe mezofile totale ( branzeturi) - prezenta bacteriilor mezofile se pune in evidenta prin insamantarea probei sau a dilutiilor decimale prin procedeul incorporarii intr-un mediu nutritiv solid incubat la 37C, 48h, urmat de numararea coloniilor dezvoltate.

Tehnica de lucru Din proba omogenizata prin miscari de rotire ale flaconului in plan orizontal, in ambele sensuri, se ia cu o pipeta un volum de 1ml si se introduce intr-o cutie Petri. In cazul probelor cu numar mai mare de bacterii, este necesar sa se insamanteze si probe diluate. In fiecare cutie Petri se introduce medi ude cultura fluidificat si racit la 30-40C. se omogenizeaza continutul cutiilor Petri prin miscari circulare, in ambele sensuri, dupa care se lasa sa se solidifice mediul de cultura. Cutiile Petri insamantate se termostateaza la 37C, 48h.