2.

Reaccin del biuret Fundamento de la reaccin Consiste en tratar una protena o pptido con Cu ++ en medio alcalino, producindose una coloracin violcea por formacin de un complejo de coordinacin entre el Cu++ y los pares electrnicos libres de los nitrgenos de los grupos imino de la unin peptdica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptdicas para que tenga lugar la reaccin. Retomando lo visto anteriormente en el trabajo experimental del mdulo 2 (ver algunas consideraciones), cuando se caracteriza un grupo o familia de sustancias (por ejemplo, caracterizacin cuali o cuantitativa de protenas en una muestra problema) o identifica una sustancia en particular (por ejemplo comprobar la presencia de ovoalbmina en clara de huevo) se debe tener muy en cuenta el objetivo que se persigue. En funcin de este objetivo se seleccionar el mtodo ms indicado. La reaccin del biuret no es una reaccin especfica para protenas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos. Un resultado negativo de la reaccin del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de protenas, ya que puede ocurrir a) que no existan protenas o pptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas), b) que existan una o ms sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reaccin (lo que dara lugar a un resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composicin aproximada de la muestra. Por ejemplo, si deseo determinar el contenido de pptidos generados por una reaccin de hidrlisis cida, los H+ del medio interferirn con la reaccin del biuret, ya que sta necesita de un medio alcalino para la formacin del complejo con Cu++. En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario obtendra un falso negativo como resultado) y c) Que existan pptidos, pero a una concentracin inferior al lmite de sensibilidad del mtodo. Todo mtodo permite determinar la presencia de un compuesto slo si la concentracin del mismo es superior a cierto valor. Existen mtodos mucho mas sensibles que el biuret ISOZIMAS son enzimas que difieren en la secuencia de aminocidos, pero que catalizan la misma reaccin qumica. Estas enzimas suelen mostrar diferentes parmetros cinticos (i.e.diferentes valores de KM), o propiedades de regulacin diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo. En bioqumica, las isoenzimas son isoformas (variantes estrechamente relacionadas) de las enzimas. En muchos casos, son codificadas por genes homlogos que han divergido con el tiempo. Aunque de forma estricta, las aloenzimas representan enzimas de diferentes alelos de un mismo gen y las isoenzimas representan enzimas de diferentes genes cuyos productos catalizan la misma reaccin, los dos trminos se suelen usar indistintamente.

LOS ENZIMAS ALOSTRICOS son enzimas que cambian su conformacin al unirse

un efector, lo que conduce a un cambio aparente en la afinidad de unin de otro ligando en un sitio distinto de la molcula. Esta "accin a distancia" de la unin de un ligando que afecta a la unin de otro en un sitio claramente diferente es la esencia del concepto de alostera o alosterismo. El

alosterismo juega un papel crucial en muchos procesos biolgicos fundamentales, incluyendo la sealizacin celular y la regulacin del metabolismo, entre otros. Los enzimas alostricos no 1 necesitan ser oligmeros como se pensaba anteriormente, y de hecho muchos sistemas han 2 demostrado alostera en enzimas de una sola subunidad. Mientras que los enzimas sin dominios acoplados o subunidades muestran una cintica de Michaelis-Menten, la mayora de los enzimas alostricos tienen varios dominios o subunidades acoplados y muestran una unin cooperativa. En general, la cooperatividad en los enzimas alostricos muestran una dependencia sigmoidal con respecto a la concentracin de sus sustratos en los sistemas positivamente cooperativos. Esto permite que los enzimas ms alostricos varen mucho su actividad cataltica en respuesta a pequeos cambios en la concentracin del efector. Las molculas efectoras, que pueden ser el propio sustrato (efector homotrpico) o alguna otra molcula pequea (efector heterotrpico), pueden hacer que el enzima sea ms o menos activo alterando el equilibrio entre los estados de mayor y menor afinidad. Los sitios de unin para los efectores heterotrpicos, llamados sitios alostricos, son generalmente independientes del sitio activo todava acoplado termodinmicamente.