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Manual de Laboratorio de Inmunologa

Universidad Autnoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Qumicas

Manual de Laboratorio de Inmunologa

Semestre Enero Junio 2012 M.C. Carmen Miriam de la O C. Dra. Roco Infante R. M.C. Tania Siqueiros C. Dr. Gilberto Erosa de la V.

CONSIDERACIONES GENERALES.
El correcto desarrollo de cualquier tipo de prcticas de laboratorio, implica la necesidad de contar con elementos apropiados que permitan establecer los fundamentos y metodologas sobre el trabajo a realizar. As mismo es necesario marcar algunas consideraciones sobre las reglas de seguridad, condiciones para trabajar dentro del laboratorio as como los parmetros de evaluacin. Se establece: 1. La hora de entrada al laboratorio es la indicada en los horarios establecidos y publicados por la Secretara Acadmica y slo se permitir la entrada al alumno hasta diez minutos despus de iniciada la clase; despus de este tiempo, podr entrar al laboratorio pero manteniendo inasistencia en las listas de control. 2. No se permite la entrada de alumnos sin bata, la cual deber usarse abrochada. 3. No se permite la entrada al laboratorio con alimentos o bebidas. 4. No se permite fumar dentro del laboratorio. 5. El alumno deber permanecer dentro de las instalaciones del laboratorio hasta en tanto no concluya con la prctica, a menos que se indique que puede salir. 6. El alumno es enteramente responsable por material(es) y equipo(s) que emplee, los cuales debern usarse adecuadamente. 7. Es responsabilidad del alumno dejar su rea de trabajo perfectamente limpia y ordenada al concluir con la prctica. 8. El material empleado debe ser enjuagado y depositado en los contenedores especialmente preparados para su desinfeccin, para posteriormente ser lavados.

Con relacin a la forma de calificar se establece. o Presentacin escrita y/o oral (segn corresponda) de formato en V para cada prctica como prerrequisito, equivalente al 25% de la calificacin final o Evaluacin durante las prcticas (25 %): Actitud Disciplina Medidas de seguridad Destreza Conocimiento del mtodo Trabajo en equipo o Evaluacin escrita: 3 exmenes equivalente al 25% de la calificacin final. Entrega de 3 reportes escritos equivalente al 25 % de la calificacin final.

FORMATO V
TTULO. Correspondiente a la prctica OBJETIVO GENERAL. (es proporcionado en el programa de prcticas) DIAGRAMA DE FLUJO. Consiste en un diagrama rpidoelaborado explcitamente para cada prctica, ste debe ser presentado al inicio de cada prctica, as sean ms de una las que se vayan a realizar. RESULTADOS. Datos concretos de los resultados obtenidos, incluye clculos, grficas, tablas,unidades de medicin, etc... INTERPRETACIN DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES. Significado de los resultados expresado en sus propias palabras.

REGLAMENTO DE LABORATORIO.
Con el objetivo de definir los derechos y obligaciones del laboratorio, as como los aspectos de seguridad e higiene que deben contemplarse dentro de stos, se transcriben los artculos relacionados del Reglamento de Laboratorios de la Facultad de Ciencias Qumicas. Articulo 14o. Derechos de los usuarios: Los grupos de docencia tendrn la prioridad para el uso de las instalaciones en el horario establecido para tal fin, siempre bajo la supervisin del maestro que tiene asignado el grupo. Articulo 15o. Obligaciones de los usuarios: a). Trabajar en los horarios oficialmente asignados para ello. b). Ser responsables del uso correcto de instalaciones, mobiliario, equipo especializado, equipo de seguridad y sustancias utilizadas durante su trabajo. c). Al finalizar su trabajo, deber devolver el material que le fue entregado. En el caso de material extraviado o daado deber reponerlo en un plazo no mayor de cinco das hbiles. Articulo 17o. Seguridad e Higiene Con el fin de mantener la salud y la seguridad de las personas que trabajan en el laboratorio, los usuarios debern acatar las disposiciones de seguridad como son: a). Usar los equipos de proteccin tales como bata, guantes, cubreboca, lentes, pinzas y mascarillas segn se requiera en el laboratorio. b). Comentar al maestro las sugerencias y observaciones que juzgue para evitar accidentes. c). Dar aviso inmediato al maestro, cuando se registre algn accidente. d). Quedan prohibidas las siguientes acciones: Fumar, consumir alimentos y bebidas dentro del laboratorio. Pipetear directamente con la boca. Trabajar a solas en el laboratorio. La permanencia en el laboratorio de personas ajenas a ste.

MANEJO DE RPBI
SEPARACIN Y ENVASADO
TIPO DE RESIDUO Sangre Cultivos y Cepas de Agentes Infecciosos Residuos No Anatmicos Patolgico Patolgico Objetos Punzocortantes ESTADO FSICO Lquido Slido Slido Slido Lquido Slido ENVASADO Recipiente Hermtico Bolsa de Plstico Bolsa de Plstico Bolsa de Plstico Recipiente Hermtico Recipiente Rgido COLOR Rojo Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo

RESIDUOS SLIDOS BOLSA ROJA Abatelenguas, algodn, aplicadores de madera, bolsas recolectoras de secreciones, cajas de Petri con cultivos contaminados, cubrebocas, gasas con sangre, hisopos, jeringas, medios de cultivo, tiras reactivas, torundas con sangre y tubos que hayan contenido sangre. RESIDUOS LQUIDOS CONTENEDOR HERMTICO ROJO La sangre y sus componentes en su forma lquida, as como sus derivados. RESIDUOS PATOLGICOS SLIDOS BOLSA AMARILLA rganos o partes de rganos tejidos. Cadveres de animales y vsceras RESIDUOS PATOLGICOS LQUIDOS CONTENEDOR AMARILLO Orina, Esputo, Heces y Lquido cefalorraquideo. HERMTICO

RESIDUOS PUNZOCORTANTES Agujas, Cubreobjetos y portaobjetos, Hojas de bistur, Lancetas y Pipetas Pasteur

Prctica No. 1.

Uso de Micropipetas
Objetivo
Aprender el uso correcto de las micropipetas, as como sus partes y funcionamiento; realizar una curva de calibracin para utilizar el lector de placas de ELISA.

Fundamento
Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volmenes pequeos desde 0.2uL hasta 1mL o ms, dependiendo de la micropipeta. En las micropipetas de volumen variable se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado. Todas utilizan puntas de plstico desechables que se ajustan al extremo de la micropipeta, en ellas se deposita el lquido a medir. Para absorber el lquido, la pipeta debe estar en posicin vertical, el pistn es presionado hasta una primera posicin o tope, la punta se pone en contacto con el lquido sumergindola de 1 a 3mm y despus, lentamente, se permite que el pistn vuelva a su posicin original para llenar la punta con el volumen seleccionado previamente. Para depositar el lquido tomado, se coloca la parte inferior de la punta contra la pared interior del recipiente donde se colocar el lquido, con un ngulo entre 10 y 40; se aprieta el botn pulsador suavemente hasta el primer tope y despus hasta el segundo tope para vaciar el resto del lquido. Manteniendo apretado el botn pulsador en el segundo tope, retirar la micropipeta deslizando la punto por la pared del recipiente y soltar el botn pulsador. Finalmente se expulsa la punta con el botn expulsor en un recipiente especial para puntillas usadas.
A) Botn de mando B) Ajuste de Volumen

C) Botn expulsor de puntillas

Figura 1. Esquema de Micropipeta. A) Botn de mando o pulsador. B) Ajuste de volumen. C) Botn expulsor de puntillas. D) Puntilla desechable.
D) Puntilla Desechable

Material
Micropipetas Puntas para micropipeta de 10uL (blancas) y 200 uL (Amarillas) Balanza analtica Agua destilada Placas de ELISA Colorante de concentracin conocida Guantes

Metodologa
NOTA: Asegurarse de utilizar la micropipeta correcta para el volumen indicado. 1. Utilizar el colorante azul de bromofenol a una concentracin inicial de 10 mg/mL para hacer diluciones seriadas en una placa de ELISA. 2. Hacer las diluciones por duplicado. 3. Poner 200uL del colorante en el primer pozo de la placa (A1 y B1) 4. Poner 100uL de agua en los pozos A2 hasta A7 y de B2 hasta B7. 5. Tomar 100uL del primer pozo (A1) y ponerlos en el pozo A2, mezclar con la micropipeta 3 veces subiendo y bajando el lquido hasta el PRIMER tope de la micropipeta para no meter aire (dilucin 1:2). 6. Tomar 100uL de la dilucin 1:2 (pozo A2) y pasarlos al pozo A3 (1:4), mezclar con la micropipeta 3 veces, tomar 100uL y pasar al pozo siguiente hasta llegar al pozo A7. 7. En el pozo A7 finalmente quedarn 200uL como volumen final, de ah desechar 100uL al pozo A8 para que todos los pozos queden con el mismo volumen. 8. Aqu se tienen las diluciones seriadas desde el concentrado que es el pozo A1 hasta la ltima dilucin que ser 1:64 en el pozo A7.
Pozo Vol. Dil. Conc. A1 200uL
colorante

Conc.
10mg/mL

A2 100uL agua 1:2 50

A3 100uL agua 1:4 25

A4 100uL agua 1:8 12.5

A5 100uL agua 1:16 6.25

A6 100uL agua 1:32 3.125

A7 100uL agua 1:64 1.56

A8

9. Leer en el lector de ELISA Microplate Reader Benchmark de Biorad 10. Promediar las Absorbancias obtenidas para cada dilucin y graficar las lecturas de Absorbancia promediadas contra las concentraciones de cada dilucin. 11. Sacar el valor de R2 del grfico el cual debe estar entre 0.96 y 1.0.

Prctica No. 2

Toma de Muestra
Objetivo El alumno asistir a una conferencia "Mtodos Actuales del Manejo de Muestras", donde conocer las diferentes metodologas para la obtencin de muestras, la forma de manejarlas y almacenarlas; Posteriormente en clase se practicarn los diferentes mtodos de toma de muestra. Introduccin Composicin de la Sangre: La sangre est formada por un lquido amarillento denominado plasma, en el que se encuentran en suspensin millones de clulas que suponen cerca del 45% del volumen de sangre total. Tiene un olor caracterstico y una densidad relativa que oscila entre 1,056 y 1,066. En el adulto sano el volumen de la sangre es una onceava parte del peso corporal, de 4,5 a 6 litros. Una gran parte del plasma es agua, medio que facilita la circulacin de muchos factores indispensables que forman la sangre. Un milmetro cbico de sangre humana contiene unos cinco millones de corpsculos o glbulos rojos, llamados eritrocitos o hemates; entre 5.000 y 10.000 corpsculos o glbulos blancos que reciben el nombre de leucocitos, y entre 200.000 y 300.000 plaquetas, denominadas trombocitos. La sangre tambin transporta muchas sales y sustancias orgnicas disueltas.

Funciones de la Sangre 1. Respiracin: La sangre transporta oxgeno desde los pulmones hasta los tejidos y lleva CO desde los tejidos a los pulmones.
2

2. Nutricin: La sangre transporta los materiales alimenticios absorbidos. 3. Excrecin: La sangre lleva los desechos metablicos a riones, pulmones, piel e intestino para su eliminacin. 4. La sangre interviene en el mantenimiento del equilibrio cido-bsico normal del organismo. 5. Interviene en la regulacin del balance hdrico por los efectos que ella tiene sobre el recambio de agua que ocurre entre el compartimiento intravascular y el intersticial. 6. Interviene tambin en la regulacin de la temperatura corporal distribuyendo el calor en el organismo. 7. Constituye uno de los mecanismos de defensa del organismo contra la infeccin por medio de los leucocitos y de los anticuerpos circulantes. 8. Contribuye a la regulacin del metabolismo, transporte de hormonas. 9. Transporta a los metabolitos.

Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad * * 1 1 1 1 1 Equipos y Materiales Tubos al vaco Vacutainer Jeringa de 3 ml Pipeta Pasteur Tubo de ensaye (centrfuga) Lanceta Ligadura Torundas con alcohol

Cantidad Sustancias * Etanol Sangre Venosa 2- 3 ml

Metodologa Puncin venosa 1. Procure mostrar seguridad al paciente, de esta manera ser mas fcil tomar la muestra. 2. Tome la aguja y rompa el sello de seguridad a la vista del paciente 3. Coloque la aguja en el sistema vacutainer o bien en el caso de jeringa de plstico puede ser necesario o no realizar este paso 4. **En caso de utilizarse una jeringa debe de sacarle el aire y verificar que la aguja est bien apretada** 5. Coloque el brazo que se va a puncionar apoyando en la mesa de trabajo formando un ngulo. 6. Ponga la ligadura, localice la vena de mejor grosor, haga asepsia correspondiente y destape la jeringa colocando el bicel hacia arriba que dando en forma perpendicular a la vena. 7. Introduzca la aguja, cuando est en vena, en el caso de vacutainer es en este momento cuando se introduce el tubo de vaco para obtener la muestra, en cambio en el caso de jeringa de plstico se debe de jalar el mbolo para aplicar la presin negativa. En ambos casos se debe de fijar la jeringa esto es para evitar movimientos de avance hacia dentro o afuera la vena. 8. Quite la ligadura y presente la torunda en donde se encuentra la aguja, saque sta lentamente y aplique presin sobre el sitio de la puncin. 9. Retire y agite suavemente el tubo en caso de vacutainer. 10. Quite la aguja y en el caso de la jeringa introduzca la sangre por las paredes de tubo de ensaye. 11. Retire el cogulo de su muestra utilizando un palillo de madera introduciendo ste por la pared del tubo y girndolo en la muestra con movimiento circular sin separarlo de la pared del tubo (cogulo-recipiente rojo). 12. Coloque su muestra en la centrfuga cuidando que tenga un tapn as como un contrapeso exacto. Centrifugue a 3500rpm por 5 minutos. 13. Una vez centrifugada extraiga su muestra de la centrfuga y retire el suero (parte clara y superficial) con la ayuda de una pipeta pasteury deposite en un tubo para muestras de SHT (Tubo eppendorf de 1.5mL). Tenga cuidado de hacerlo en un rea cercana a la interfase de su muestra ya que esto puede contaminar su muestra con eritrocitos y dems clulas sanguneas. 14. Para la extraccin de sangre de la mano se utiliza la aguja en mariposa pero la metodologa y cuidados son los mismos slo que en esta se debe de tener en consideracin que el flujo sanguneo es menor y por esto tardarn en llenarse los tubos.

Puncin capilar 1. Hacer asepsia en el dedo que se va a puncionar. 2. Abrir la lanceta por la parte superior dejando la punta en el paquete. 3. Presionar el dedo y picar con fuerza una sola vez. 4. Comienze a llenar el tubo capilar hasta partes dando ligeros masajes al dedo puncionado sin tocar el sitio de puncin. Tiempo estimado de la prctica: 5 horas Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Prctica No. 3

Inmunizacin de Animales
Objetivo Conocer el funcionamiento del bioterio de la Facultad as como la manera correcta de manejar a los animales del mismo. Conocer las diferentes vas de administracin de antgenos y lograr distinguir entre stas, cual es la ms conveniente segn el tipo de antgeno y realizar la aplicacin en conejos parara lograr obtener la respuesta inmunolgica ms adecuada (sueros hiperinmunes). Introduccin Se conoce como inmunizacin al proceso mediante el cual, se induce una respuesta inmunolgica en el individuo competente , a consecuencia del contacto con antgeno especfico en forma natural o artificial. La respuesta inmune obtenida puede ser humoral, celular o ambas dependiendo de diversos factores tales como: dosis, va de administracin. tipo de antgeno, etc. En el caso de la respuesta humoral, el suero con un alto contenido de anticuerpos, se conoce como antisuero o suero hiperinmune. La aplicacin prctica de los antisueros es muy diversa pues se puede utilizar con fines teraputicos (inmunizacin pasiva) en diversos estados infecciosos o txicos (neumona, ttanos, etc.). Adems son tiles en la identificacin de microorganismos aislados de procesos infecciosos y en la clasificacin taxonmica de diversas especies. Tambin han servido como herramientas de trabajo para dilucidar mecanismos inmunolgicos bsicos: especificidad inmunolgica, activacin del complemento, fagocitosis, citotoxicidad y en la determinacin rpida y especfica de la naturaleza de diversas substancias qumicas (protenas, carbohidratos, haptenos, etc.). Vas de inmunizacin: Se pueden emplear vas tales como la oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intracardaca, subcutnea, intradrmica, intraperitoneal, etc. La eleccin de la va depender, entre otras cosas, de la especie que se trate, de las caractersticas del antgeno y del propsito de la inmunizacin. Sin constituirse en regla los antgenos particulados, resultan buenos inmungenos cuando se administran por va intravenosa en conejos por ejemplo, mientras que para antgenos solubles la va usual es la intradrmica o subcutnea, siempre y cuando el antgeno se acompae de los llamados adyuvantes. Adyuvantes: Son substancias que cuando se inyectan junto con el antgeno, permiten aumentar el nivel de anticuerpos circulantes aunque tambin pueden inducir o elevar el grado de respuesta celular, Algunos adyuvantes son en s antignicos (endotoxinas de bacterias Gram negativas como Bordetellapertusis, micobacterias, etc.), mientras que otros no lo son (tartrato alumnico de potasio o alumbre, fosfato de calcio, aceite mineral, lanolina, diversos agentes tensodepresores, polinucletidos y otros). Tericamente los adyuvantes pueden funcionar: a) Aumentando directamente el nmero de clulas involucradas en la formacin de anticuerpos.

b) Favoreciendo el mejor procesamiento del antgeno por las clulas fagocticas. c) Prolongando la duracin del antgeno en el animal inmunizado.

Actualmente, el adyuvante de mayor uso es el de Freund. El llamado adyuvante incompleto de Freund es una mezcla de aceite mineral (Drakeol, Bayol, Nujol) con un detergente (Falba,Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, por ejemplo: Arlacel-Drakeol (1:9); Arlacel-Bayol (3:17), etc. El adyuvante completo de Freund contiene adems una micobacteria ( M. tuberculosis, M.bovis, M. phelei u otros) cuya cantidad es variable (por ejemplo, de 1.0 a 5.0 mg de la bacteria, peso seco, por cada 1.0 mi de la mezcla incompleta de Freund). En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvantes (Freund completo o incompleto) ya que su aplicacin puede conducir al desarrollo de granulomas severos. Sangrado: Para todos los antgenos el sangrado se har antes y despus del protocolo de inmunizacin, generalmente de 4 a 7 das despus de la ltima inmunizacin, tratando de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado es indispensable para contar con el suero testigo. La separacin del suero se hace despus de incubar la sangre coagulada a 37C durante 30 a 60 minutos. Es conveniente remover el cogulo con un aplicador al principio de la incubacin, con el objeto de facilitar la retraccin del mismo y la separacin del suero. El suero se separa del cogulo mediante centrifugacin a 3000 rpm durante 2 min y se transfiere con pipetas Pasteur a recipientes apropiados. Se puede conservar indefinidamente si se mantiene estril o adicionado con merthiolate (concentracin final 0.01%) o azida de sodio (0.1 %). Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad Equipos y Materiales * Jeringas estriles de 2.5 ml con agujas del #21. * 1 1 * 1 1 Jeringas estriles de 50 ml, con agujas del 18 para sangrado Una caja para sujetar animales (conejos). Frasco con torundas de algodn con alcohol. Tubos de 13 x l00 mm Frascos con solucin salina estril al 0.85 %. Mechero

Cantidad Sustancias * Antgeno suficiente para inmunizar a conejos de acuerdo al protocolo de inmunizacin. (Se describen a continuacin). 1 Animales (conejos) suficientes para obtener la cantidad adecuada de antisueros, segn la necesidad del curso.

Metodologa
PROTOCOLO DE INMUNIZACIN

Jaula Antgeno

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Un programa estndar de inmunizacin para conejos es el siguiente: Da Inyeccin Sangrado 0 1* Preinmune 14 2** 28 3** 2 ml 38 56 4** 20 ml 60 ml 66 87

* Inmunizacin: se realiza por va intradrmica (da 1 del protocolo). En el inculo se administran 250g de antgeno en un volumen de 1ml (Se aade PBS al antgeno hasta completar 0.5ml y posteriormente se mezcla con 0.5ml de Adyuvante Completo de Freund uniendo dos jeringas con un conector y pasando el fluido de una a otra para conseguir una correcta homogenizacin de los componentes).
Precaucin: est seguro que el montaje es seguro!

** Boosters= dosis de recuerdo. En cada booster se administran 125g de antgeno en un volumen de 0.5ml por va intramuscular (Se aade PBS al antgeno hasta completar 0.25ml y posteriormente se mezcla con 0.25ml de Adyuvante Incompleto de Freund siguiendo el mismo proceso que en la inmunizacin) Tiempo estimado de la prctica: 3 horas Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Reporte:
Datos del Conejo: Raza Edad Sexo Caractersticas particulares

Jaula ____________. Antgeno ______________.


Da 1 14 28 38 56 66 87 Fecha Procedimiento Obtencin suero preinmune / Inmunizacin 1erBooster 2doBooster Obtencin de suero para titular. 3erBooster Obtencin de suero para titular. Sangrado final. Obtencin suero hiperinmune. Ag/Adyuvante Observaciones

Bibliografa: - Campbell, D.D., Garvey, J.S., Cremer, N.E., Sussdorf, D.H. (1970). Methods in Immunology.2aEd. W.A. Benjamm, Inc. - Kabat, E.A., Mayer, M.M. (1961). Experimental Immunochemistry, 2aEd. Charles C. Thomas, Illinois, USA: 150. - Williams, C.A., Chase, M.W. (1967). Methods in Immunology and Immunochemistry. Ed. Academic Press Inc., New York and London. 2:197. http://depa.pquim.unam.mx/inmuno/contenido/capi-4/adyuvantes-3.htm Garvey, J.S., Cremer, noreste, y Sussdorf, ADO. (1977) En: Mtodos en inmunologa. Pub. Benjamin/Cummings Publishing Company. Massachusetts pp545

Prctica No. 4

Demostracin de rganos Linfoides


Objetivo Identificar los rganos Iinfoides y las diferentes clulas que intervienen en la respuesta inmune utilizando modelos animales. Introduccin El sistema inmune est organizado para llevar a cabo sus funciones de defensa, homeostasia y vigilancia. Al respecto son de especial importancia cuatro tipos de tejido linftico: 1) Ndulos linfticos 2) Ganglios linfticos 3) Bazo 4) Timo Aunque las cuatro variedades parecen llevar a cabo linfopoyesis, solo responden activamente a los estmulos antignicos los tres primeros. El timo parece autnomo al respecto, podra ser un rgano linftico encargado de la embriognesis y la orquestacin del resto de los tejidos linfoides perifricos. Timo Es un rgano plano y blando situado en la cavidad torcica, por encima del corazn. Est formado por dos lbulos rodeados por cpsula de tejido conjuntivo. A su vez, los lbulos estn divididos en lobulillos separados entre s por trabculas de tejido conjuntivo. Cada lobulillo tmico est relleno de clulas linfoides denominadas timocitos, dispuestas en una corteza de gran densidad celular y una mdula (interior) de menor densidad celular. Desde la corteza hasta la mdula existe un gradiente de diferenciacin. El timo de los mamferos va involucionando con la edad, a partir de la pubertad. La Bolsa (bursa) de Fabricio es una porcin especial dorsal de la cloaca, con una estructura a base de corteza y mdula. La mdula sea en los adultos de los mamferos es un equivalente "disperso" de la Bolsa de Fabricio. La porcin implicada en la maduracin de los linfocitos B est constituida por islas de tejido hematopoytico. Precisamente por su carcter difuso es ms difcil de estudiar que la Bolsa. Los linfocitos maduros vrgenes que salen de los rganos linfoides primarios emigran a los rganos y tejidos linfoides perifricos: Capsulados: en ellos se produce la secrecin de Anticuerpos (Ac) que se distribuirn por la circulacin; tambin se dan respuestas celulares locales. ganglios (recogen Antgenos (Ag) de la piel y de superficies internas) bazo (recoge Ag de la sangre) rganos no capsulados asociados a mucosas (MALT): protegen del Ag que entre directamente a travs de mucosas (gastrointestinal, respiratoria, genitourinaria). Su respuesta es la secrecin de inmunoglobulina A secretoria (sIgA), que recubrir la superficie mucosal (epitelial). Acmulos ms o menos difusos (no capsulados), dispersos por casi todo el cuerpo.

Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad 2 1 1 1 * 3 1 * * Metodologa Equipos y Materiales Guantes Ratones Equipo de diseccin Caja para anestesiar animales Cloroformo Caja de petri mbolo de jeringa Pipetas pasteur Bulbos para pipeta

1. Aplique la anestesia a un algodn y colquelo en un frasco de plstico. 2. Introduzca el algodn impregnado de cloroformo o ter y espere a que se duerma completamente. 3. Se coloca boca arriba, se toma de la cabeza y se tira fuertemente de lacola, con el fin de desnucarlo. 4. Despus se coloca en la plataforma y se aseguran las patas en cada extremo.

5. Se procede haciendo un botn en la parte ventral del cuello a la altura delas extremidades superiores y se hace el corte longitudinal (del cuello a labase de la cola). 6. Cortar con las tijeras por el borde del trax, las costillas y extraiga los rganos linfoides con pinzas y depostelos en la caja petri (que contiene solucin salina) para su observacin. 7. Macerar los rganos con el mbolo de la jeringa. 8. Corte una de las patas traseras del animal y retire el tejido adherido a el hueso. 9. Con la ayuda de una jeringa inyecte solucin salina por uno de los extremos y reciba el contenido en un portaobjetos.

10. Realizar un frotis haciendo una extensin* sobre un portaobjetos tanto de sangre como de cada uno de los rganos a analizar. Marcar los portaobjetos. * La extensin ideal comprende una porcin gruesa y una delgada, con una transicin gradual entre ambas; su aspecto ha de ser liso y nivelado, sin ondulaciones, resaltes, ni poros. 11. Dejar secar al aire todos los frotis. Tincin Rpida con Hemocolorante 1. Sumergir el frotis en la solucin fijadora 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 2. Sumergir el frotis en el hemocolorante UNO, 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 3. Sumergir el frotis en el hemocolorante DOS, 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 4. Lavar con agua destilada y dejar secar. 5. Observar al microscopio. RESULTADOS E INTERPRETACIN 1. Los eritrocitos son rosa salmn. 2. Los ncleos de los neutrfilos es prpura, sus grnulos son lila marrn y el citoplasma rosa plido. 3. Los eosinfilos tienen ncleo violeta; con grnulos rojo a naranja y citoplasma azul. 4. Los basfilos tienen un ncleo prpura o azul oscuro, con grnulos prpura oscuro (casi negro). 5. Los linfocitos tienen un ncleo prpura oscura y citoplasma azul. 6. Los monocitos tienen ncleo prpura y citoplasma azul-gris. 7. Las plaquetas tienen coloracin violeta o prpura. Tiempo estimado de la prctica: 3 horas y media Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Bibliografa: Abbas, A., Lichtman, A., Pober, J. (1995).Cellular and Molecular Immunology. ED. W.B. Saunders Company. U.S.A :22- 32. Roitt,I. (1994) Essential Immunology. Eighth Edition.E.D.Blackwell Scientific Publications. Roitt,I., Brostoff,J., Male,D.(1994).Immunology. Fouth Edition.Ed Mosby. Gradwohl S. y Jarett. (1986). Mtodos y diagnsticos del Laboratorio Clnico. Ed. Md. Panam. 8a. Ed. Vives J.L., Aguilar J.L. (1992) Manual de Tcnicas de Laboratorio en Hematologa. Ed. Masson-Salvat Med.

REACCIONES DE PRECIPITACIN
La reaccin de precipitacin se presenta cuando un antgeno multivalente en estado soluble, se une con su anticuerpo especfico y as da lugar a la formacin de un complejo insoluble. Esta reaccin se utiliza ampliamente para demostrar y cuantificar antgenos y anticuerpos y se puede llevar a cabo en medio lquido o semislido. La precipitacin en medio lquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa. En la primera slo se estima la cantidad relativa de precipitado formado y en la segunda, al precipitado formado se le determina la concentracin de protenas totales por mtodos espectrofotomtricos. Cuando la reaccin se realiza en MEDIO LQUIDO, la cantidad de precipitado vara segn la proporcin de los reactivos. Si disponen una serie de tubos conteniendo el mismo volumen de antisuero y cantidades crecientes de antgeno, puede observarse que el precipitado formado alcanza un mximo, despus del cual, progresivamente se encuentra una disminucin en la cantidad de precipitado. Si se analizan los sobrenadantes de todos los tubos, los correpondientes a los que presentan un mximo de precipitacin prcticamente no tienen antgeno ni anticuerpos, en tanto en los precedentes, puede demostrarse la presencia de anticuerpos y en el resto, la presencia de antgeno. Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de antgeno agregado y en el de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva, generalmente en forma de campana, que se puede dividir en 3 regiones, segn se ilustra en la figura siguiente:

La reaccin de precipitacin en MEDIO SEMISLIDO, se efecta en gel y se

conoce como Inmunodifusin. Esta consiste en la difusin, a travs de un gel, de un antgeno y su anticuerpo homlogo con la consiguiente aparicin de una banda de precipitado en el sitio en donde se alcanzan las concentraciones ptimas de ambos reactivos. La velocidad de la difusin depende de la forma, tamao y concentracin de las molculas participantes, as como de la temperatura a la cual se realice la reaccin. Cuando se tienen dos o ms tipos de molculas, estas pueden difundir a diferente velocidad. En el sitio en que se localicen zonas de concentracin ptima de antgenos y de anticuerpos, se formarn bandas de precipitacin. El nmero de bandas presentes es igual al nmero mnimo de sistemas antgeno-anticuerpo. Existen diferentes tipos de inmunodifusin. Aquel en el que ambos reactivos difunden libremente en el gel, se le llama Doble difusin o Mtodo de Ouchterlony, en el cual puede tener diversas aplicaciones, por ejemplo, la determinacin de la posible relacin inmunolgica entre dos antgenos, el nmero de sistemas antgeno-anticuerpos presentes y la semicuantificacin de un antgeno o de un anticuerpo. Otra variante en la que slo uno de los reactivos (generalmente el antgeno) difunde en el gel, donde se haya embebido otro (generalmente el antisuero), se conoce como inmunodifusion simple. En la inmunodifusion radial se aplica este principio para determinar cuantitativamente la concentracin de un antgeno, este se encuentra en una concentracin inicial tan alta, que se forman complejos solubles y a medida que va difundiendo, la concentracin disminuye hasta que en el sitio en donde los reactivos estn en proporciones ptimas se forma un halo de precipitacin cuyo dimetro tiene relacin directa a la concentracin del antgeno. Para esta prueba se deben utilizar muestras estandarizadas de concentracin conocida del antgeno, que sirven como patrones de referencia. La tcnica de inmunoelectroforesis fue propuesta por Grabar y Williams quienes combinaron las tcnicas de electroforesis y de inmunodifusion, para separar y determinar la presencia de los componentes de una mezcla de sustancias antignicas. Primeramente los componentes de la mezcla son separados por la aplicacin de una corriente elctrica y posteriormente se hacen reaccionar con sus anticuerpos especficos, con lo que se realiza la precipitacin. En la contrainmunoelectroforesis, los antgenos y sus anticuerpos, simultneamente se someten a la accin de un campo elctrico en un gel a pH 8.6. En estas condiciones, los anticuerpos, casi no tienen carga, por lo que no se desplazan bajo el efecto de la corriente elctrica, sin embargo, se mueven hacia el ctodo debido al flujo endosmtico del regulador usado. Los antgenos que posean carga negativa migran hacia el nodo y mediante la disposicin apropiada de los pozos en el agar, se puede lograr que el antgeno y el anticuerpo se encuentren, reaccionen y se desarrollen bandas de precipitacin en poco tiempo, dependiendo de la concentracin y la velocidad de migracin de los reactivos. Obviamente este mtodo no es aplicable a antgenos con carga positiva o neutra. BIBLIOGRAFA. Rose,N., Friedman,H. Fahey. J.C. Thirth Edition.(1986). Clinics Immunologic Methods. Ed. American Society Of Microbiology.

Prctica No.5

Inmunodifusin Doble (Mtodo de Ochterlony).


Objetivo Practicar las diferentes reacciones antgeno-anticuerpo, usadas con ms frecuencia en inmunologa clnica y distinguir entre reacciones de precipitacin, aglutinacin activa y aglutinacin pasiva. Introduccin Gracias a que las molculas de inmunoglobulina tienen por lo menos dos sitios para unirse con el antgeno, es decir son por lo menos divalentes; a que normalmente son policlonales y a que las molculas de antgeno tienen generalmente ms de un determinante antignico, el encuentro entre las dos poblaciones, la de antgenos y la de sus inmunoglobulinas especficas, resulta en la formacin de una red tridimensional entre ellas. Esta red o complejo, Ag-Ac, facilita fagocitosis del antgeno in vivo; y, siendo lo suficientemente grande para ser visible, se utiliza in vitro para demostrar la presencia de antgenos especficos para una Ig de especificidad determinada. Diversas tcnicas tales como, inmunodifusin radial, inmunoelectroforesis e inmunodifusin doble utilizan la formacin de complejos Ag-Ac para detectar antgenos. En este ejercicio haremos inmunodifusin doble. En esta tcnica se prepara un gel de agarosa, en el cual se colocan, a una distancia de varios mm una de otra, las dos poblaciones. Tanto las inmunoglobulinas como los antgenos migran por difusin y en minutos, o pocas horas, se encuentran. Si hay especificidad entre ellas y estn presentes en las concentraciones apropiadas se forma en pocas horas, el complejo Ag-Ig que es visible como una lnea blanca. Esta lnea se forma en el frente del encuentro de las dos poblaciones y es por lo tanto perpendicular a la direccin de migracin entre ellas. Generalmente se quiere comparar la presencia de antgeno en diversas muestras, entonces las diversas muestras se colocan a distancias equidistantes de la preparacin de Ig. Si dos preparaciones colocadas en la vecindad una de otra contienen el antgeno sus lneas de complejo Ag-Ac, tambin llamadas lneas de precipitacin, se fusionan y aparecen como un arco continuo. Principio de la Prueba: Las pruebas de Inmunodifusin, se basan en el principio de Difusin Doble. Anticuerpos y Antgenos solubles se inoculan en pozos separados sobre la superficie de un medio de difusin (Gel de Agarosa comercial (Placas de Agarosa IMMY) casero y/o Cleargel), permitiendo que difundan a travs del mismo durante el tiempo de incubacin. En todos aquellos puntos donde el Antgeno y los Anticuerpos difundan juntos, es decir se combinen en concentraciones relativamente equivalentes acorde a la especificidad de la reaccin Ag-Ac, se formaran bandas lneas visibles de precipitado, que pueden leerse fcilmente

observando la placa contra un fondo negro y bajo la incidencia de una lmpara de luz blanca de alta intensidad Lectura de la Prueba: -Las bandas precipitantes que se formaron en la placa despus de la incubacin, pueden ser fcilmente ledas o detectadas colocando la placa sobre un fondo negro y haciendo pasar un haz de luz blanca de alta intensidad desde el fondo de la placa hacia la superficie de la misma y en un ngulo de incidencia de aproximadamente 45. -El ojo de la persona que est leyendo debe estar sobre la placa, fuera del punto donde incide el haz de luz y en una posicin adecuada de manera tal que la luz refractada a partir de la superficie de la placa le permita observar las bandas existentes, las cuales se observan ms brillantes que el gel. -Las Bandas de No Identidad son significativas ya que los Sueros Controles pueden no reaccionar con todos los eptopes antignicos especficos presentes. Cuando se observan Bandas de No Identidad, la placa debe ser sumergida en una solucin de Citrato de Sodio al 5% ph 7.0 por 45 min. Posteriormente a esta incubacin, se decanta el exceso de Citrato de Sodio y se reexaminan las placas. Al observar de nuevo las placas, es posible que algunas de las Bandas de No Identidad observadas inicialmente ya no aparezcan. Si esto ocurre, estamos seguros que esas bandas eran causadas por la presencia de Protena C reactiva en la muestra del paciente y no por ser una Banda de No Identidad realmente. Si despus de la incubacin con Citrato de Sodio, se siguen observando la presencia de Bandas de No Identidad, estas deben ser reportadas. -Para que la Corrida sea vlida, siempre deben estar presentes las Bandas de Control. Si las mismas no pueden ser detectadas, es decir, no se formaron, la prueba debe ser repetida. Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad Equipos , Materiales y Sustancias 1.2 gr Agar Noble o agarosa. * Solucin salina isotnica, pH 7.2 * Solucin de merthiolate al 1% 2 Portaobjetos limpios y desengrasados. 2 Cajas Petri 4 Aplicadores. 2 Discos de papel filtro. 2 Pipetas pasteur o capilares. * Soluciones de antgeno * Antisueros * Tubos de 13 x 100

Metodologa 1. En un vaso de precipitado de 250 ml, se colocan 150 ml de agua destilada. 2. Se agregan 150 ml de agar noble o agarosa y se hace hervir hasta la disolucin total del agar (aproximadamente 1 h). El volumen de agua evaporada, se repone con agua destilada. 3. En la solucin de agar aun caliente, se sumergen portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados, los cuales posteriormente son secados y colocados en un horno precalentado a 100oC, hasta que se sequen. 4. En forma semejante a la indicada en los pasos 1 y 2, se preparan 100 ml de una solucin de agarosa al 1% en solucin salina pH 7.2. Se debe aadir 1 ml de solucin de merthiolate. 5. Los portaobjetos secos se acomodan sobre una superficie perfectamente horizontal y con una pipeta de punta ancha, se les colocan a cada uno, 4 ml del agarosa al 1% caliente. La agarosa deber dejarse gelificar a temperatura ambiente. NOTA: los pasos del 1 al 5 los realizan previo a la prctica los alumnos de ayudantas. 6. Con ayuda de un molde apropiado, se practican perforaciones al gel y la agarosa residual se remueve con un aplicador. 7. Los pozos as formados, se llenan con el antgeno en el centro y los sueros alrededor y viceversa segn sea el caso. 8. Se improvisa una cmara hmeda, usando una caja de petri cuya tapa se recubre con un disco de papel filtro hmedo. 9. Se colocan los portaobjetos en el interior de la cmara hmeda sobre aplicadores de madera. 10.Se incuban a temperatura ambiente durante 24 a 48 hrs y se buscan bandas de precipitacin. Tiempo estimado de la prctica: 2 horas Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Resultados: Se dibuja el esquema de perforaciones utilizado, indicando que solucin fue colocada en cada perforacin, as como las bandas que hayan aparecido.

Bibliografa: Manual of ClinicalLaboratoryInmunology 3 Edicin. Autor(es): Noel R.Rose, Herman Friedman, John L. Fahey http://www.labgeminis.com/techinfo/immy/serologia_hongos.html

Prctica No. 6

Inmunodifusin Radial
Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad 1.2 gr * * 2 2 4 2 2 * * * 1 Equipos , Materiales y Sustancias Agar Noble o agarosa. Solucin isotnica, pH 7.2 Solucin de merthiolate al 1% Portaobjetos limpios y desengrasados. Cajas Petri Aplicadores. Discos de papel filtro. Pipetas pasteur o capilares. Soluciones de antgeno (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32; 1:64) Antisueros Tubos de 13 x 100 Micropipeta de 10-200 l

Metodologa 1. Se preparan portaobjetos barnizados con agarosa, en forma similar a la descrita para la inmunodifusion doble (incisos IIb, 1, 2 y 3). 2. Se prepara una solucin de agarosa de igual manera a la descrita para la inmunodifusion doble (incisos IIB,4). 3. La solucin de agarosa se deja enfriar entre 50-55o y se le aade 5% (v/v) del antisuero mezclando perfectamente. 4. Los portaobjetos barnizados y secos se colocan sobre una superficie perfectamente horizontal y con una pipeta de punta ancha, se les colocan a cada uno, 4 ml de la solucin de agarosa al 1% que ya contiene el antisuero. La agarosa deber dejarse gelificar a temperatura ambiente. NOTA: los pasos del 1 al 4 los realizan previo a la prctica los alumnos de ayudantas. 5. Sobre un eje longitudinal al centro del gel, se practican 4 perforaciones equidistantes de un dimetro de 3mm y la agarosa residual se remueve con un aplicador. 6. Cada pozo se llena con un volumen conocido de las soluciones de antgeno de diferente concentracin. 7. Se improvisa una cmara hmeda usando una caja petri cuya tapa se recubre con un disco de papel filtro hmedo.

8. Se colocan los portaobjetos en el interior de la cmara sobre aplicadores de madera. 9. Se incuban a temperatura ambiente, durante 24 a 48 h. 10.Se miden los dimetros de los halos de precipitacin obtenidos. Tiempo estimado de la prctica: 2 horas Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata. Resultados

Bibliografa: - Campbell,D.H., Garvey, J.S., Cremer,N.E., y Sussdorf, D.H 1970 Methods in Immunology, 2a E. W.A Benjamin, Inc. N.Y - Cawley, L.P 1969. Electrophoresis and inmmunoelectrophoresis. Little Brown and Co., Boston. - Davis, B.D., Dulbecco, R., Ginsberg, H.S., Eissen, H.N. y Wood, W.B. 1968. Principles of Microbiology and Immunology. Ed. Harper International N.Y. y Tokio.

Prctica No. 7

Inmunoelectroforesis
Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad Equipos y Materiales * Unidad de Electroforesis 2 Portaobjetos limpios y desengrasados 2 Cajas petri 2 Aplicadores Algodn 1 Disco de papel filtro 2 Pipetas transferencia Cantidad Sustancias * Buffer de barbituratos 0.1M, pH 8.6 * Solucin de antgeno Antisuero o antisueros especficos Solucin de merthiolate al 1% 1.2 gr agarosa. Metodologa: 1. Se preparan 100ml de una solucin de agarosa al 1% en buffer de barbituratos 0.1M pH 8.6. 2. Finalmente se agrega 1 ml de merthiolate al 1% para tener una concentracin final de 0.01%. 3. Los portaobjetos secos se acomodan sobre una superficie perfectamente horizontal y con una pipeta de punta ancha se les colocan 4 ml de agarosa al 1% caliente a cada uno. La agarosa deber dejarse gelificar a temperatura ambiente. 4. Hasta antes de su uso los portaobjetos con agarosa se debern conservar sumergidos en regulador de barbituratos 0.1 M pH 8.6 a 4C. NOTA: los pasos del 1 al 4 los realizan previo a la prctica los alumnos de ayudantas. 5. Para ser empleados los portaobjetos con agarosa se perforan segn el esquema seleccionado, extrayendo cuidadosamente el cilindro de agarosa de la perforacin pero NO el del canal. 6. En el recipiente de la cmara de inmunoelectroforesis se agrega la cantidad necesaria de regulador de barbituratos. Se acomodan los portaobjetos, se establece el contacto entre la placa de agarosa y el regulador mediante tiras de papel filtro. 7. En las perforaciones de las placas de agar se colocan las soluciones de antgeno usando una pipeta o capilar y cuidando que quede completamente llena la cavidad pero sin que se derrame el lquido sobre la superficie de la placa. Una de las muestras de antgeno deber estar teida con azul de bromofenol para que sirva como indicador del desplazamiento.

8. Se conecta la cmara de electroforesis a la fuente de poder y se ajusta la corriente a 8-10 volts/cm de gel. La electroforesis debe llevarse a cabo de negativo a positivo. 9. Al cabo de 2 o 3 horas, cuando en el portaobjetos se observe que la muestra se ha desplazado unos 3 o 4 cm, se suspende la corriente y la cmara se desconecta. 10.Se retiran los portaobjetos, se remueve el canal de agarosa y se llena con el antisuero. 11.Se toma una caja petri, y en el interior se colocan aplicadores de madera sobre los cuales les se coloca al portaobjetos. En el fondo de la placa se pone algodn humedecido con agua, se deja a temperatura ambiente durante 24 a 48 hr, al cabo de las cuales les se hacen las lecturas.

Tiempo estimado de la prctica: 2 horas Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata. Resultados

Bibliografa: - Campbell,D.H., Garvey, J.S., Cremer,N.E., y Sussdorf, D.H 1970 Methods in Immunology, 2a E. W.A Benjamin, Inc. N.Y - Cawley, L.P 1969. Electrophoresis and inmmunoelectrophoresis. Little Brown and Co., Boston. - Davis, B.D., Dulbecco, R., Ginsberg, H.S., Eissen, H.N. y Wood, W.B. 1968. Principles of Microbiology and Immunology.Ed. Harper International N.Y. y Tokio.

Prctica No. 8

Cuantificacin de las fracciones C3 y C4 del Complemento por turbidimetra


Objetivo General Interpretar los resultados de la cuantificacin de las fracciones C3 y C4 del complemento en una muestra problema. Introduccin: El complemento srico comprende un grupo de protenas que median las respuestas inmunolgica e inflamatoria. La denominada cascada del complemento involucra una serie de reacciones enzimticas que se llevan a cabo en la sangre. La actividad del complemento (CH50, CH100, componente terminal del complemento o protenas del complemento individual) se mide para determinar si el complemento est involucrado en el origen de muchas enfermedades. La actividad del complemento tambin se mide para evaluar la severidad de una enfermedad o determinar la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, los pacientes con lupus eritematoso activo pueden tener niveles deprimidos de C3 y C4 y estos niveles del componente pueden servir como ndice preliminar de la actividad de la enfermedad. FUNDAMENTO. Es un ensayo turbidimtrico para cuantificacin del complemento C3 y C4 en suero o plasma humano. Los anticuerpos anti-C3 y anti-C4 forman compuestos insolubles cuando se combinan con el C3 o C4 respectivamente de la muestra del paciente, ocasionando un cambio en la absorbancia proporcional a la concentracin de C3 o C4 en la muestra problema y que puede ser cuantificada por comparacin con un calibrador de concentracin conocida. Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad Equipos , Materiales y Sustancias Diluyente R1 para montar Diluyente tris 20 mmol/L, g/L, PEG 8000 pH 8.2 azida muestras y calibradores sdica Muestra Anticuerpo R2 Calibrador Suero o plasma diludo 1:21 con diluyente. Suero humano, conteniendo azida de sdica 1 g/L. La concentracin deC3 es de 480 mg/dL y de C4 es de 80 mg/dL PROT CAL

Metodologa TODOS LOS REACTIVOS DEBEN LLEVARSE A TEMPERATURA AMBIENTE ANTES DE TRABAJAR. Reactivo de Ac y diluyente, listos para trabajar. Curva de calibracin. Preparar las siguientes diluciones del Calibrador de protenas (PROT CAL en NaCl 0.9% como diluyente) PARA OBTENER LAS CONCENTRACIONES DE CADA DILUCIN DE C3 Y C4, MULTIPLICAR LA CONCENTRACIN DE C3 O C4 DEL CALIBRADOR POR EL FACTOR CORRESPONDIENTE INDICADO EN LA TABLA.

PROCEDIMIENTO Curva de calibracin. C3 Y C4 SE PROCESAN EXACTAMENTE IGUAL, SOLO TENGA CUIDADO DE ETIQUETAR ADECUADAMENTE SUS TUBOS DE REACCIN. # Dilucin del Calibrador Calibrador (l) NaCl 0.9% (l) Factor de dilucin Concentracin de la dilucin de C3 Concentracin de la dilucin de C4 1 -100 0 0 0 2 10 90 3 25 75 4 50 50 5 75 25 6 100 --

0.1 0.25 0.5 0.75 1.0 48 120 240 360 480 8 20 40 60 80

PROCEDIMEINTO PARA PROCESAR LA CURVA DE CALIBRACIN Y LAS MUESTRAS PROBLEMA. 1. Calentar los reactivos y los portacubetas del espectrofotmetro a 37C. 2. Ajustar el espectrofotmetro a CERO frente a agua destilada a 37C 3. Pipetear en una cubeta (*o en placa de ELISA):

Reactivo R1 950 l (238 l*) Muestra Problema o cada calibrador 10 l (2.5 l*)

4. Mezclar y leer la absorbancia (A1) a 340 nm, despus de la adicin de la muestra. 5. Inmediatamente despus pipetear en la cubeta: Reactivo R2 Anticuerpo 50 l (12.5 l*) * Volmenes para utilizar en placa de ELISA 6. Mezclar y leer la absorbancia (A2) a 340 nm, exactamente 2 min despus de aadir el reactivo R2

CLCULOS Calcular las diferencias de absorbancias (A2-A1), obtenidas para los distintos calibradores y construir la curva de calibracin de los valores obtenidos frente a las concentraciones de C3 o C4 de cada dilucin del calibrador. La concentracin de C3 o C4 en la muestra se calcula por interpolacin directa de su diferencia (A2-A1) en la curva de calibracin. DIFERENCIA DE ABSORBANCIA CONTRA CONCENTRACIN) Dibujar la curva uniendo los puntos. Para determinar las concentraciones reales de protena en una muestra clnica, marcar diferencia de la absorbancia de la muestra en el eje de las ordenadas y buscar el punto de insercin en la curva de calibracin deslizndose luego hasta el eje de las abscisas donde se lee el valor de la concentracin. VALORES DE REFERENCIA Recin nacidos: 70-196 mg/dL C3 Adultos: 90-180 mg/dL Recin nacidos: 13-38 mg/dL C4 Adultos: 10-40 mg/dL

Sin embargo los valores normales varan en funcin de diversos factores como la edad, sexo, rea geogrfica, raza y la metodologa. Tiempo estimado de la prctica: 60 a 90 min Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Resultados - Interpretacin de Resultados y Conclusiones Bibliografa: 1. Clinical guide to laboratoty test, edited by NW Tietz W.B Saunders Co. Philadelphia, 483,1983. 2. Yang Y et cal. CurrdirAutoimmun 2004 :7:98-132 3. Carrol MC, Annual Review Of Immunology 1998:16:545-568 4. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003356.htm

Prctica No. 9

Fagocitosis: Reduccin de Nitroazul de Tetrazolio (Puncin Capilar)


Objetivo General Determinar la capacidad fagoctica de las clulas como mtodo de evaluacin de la respuesta inmune inespecfica. Introduccin EllieMetchnikoff, en 1880, descubri que la funcin de lasclulas fagocticas era esencial para la supervivencia de todaslas especies del reino animal. En los organismos unicelularescomo los protozoarios, la funcin fagoctica es el nico mediopor el cual estos organismos adquieren su alimento. Lafuncin fagoctica de estas clulas se mejora a lo largo de laevolucin y se mantiene en los animales ms evolucionados,aunque aqu la funcin de los fagocitos deja de serpreponderantementenutricional para constituirse en un eficientemecanismo de proteccin no especfico contra agentes infecciososy de eliminacin de clulas muertas o seniles. Cadaetapa del proceso fagoctico (la migracin, el reconocimientode lo que puede y debe ingerirse, la endocitosis y la destruccinde partculas) se descubre cada vez ms complicada; da a dase identifican ms componentes moleculares y se establecenms interacciones y rutas metablicas. Aunque el proceso dela fagocitosis no est esclarecido en su totalidad, ahoratenemos una mejor idea de cmo se reconocen las partculasque deben eliminarse y de los mecanismos subsecuentes quellevan a su destruccin. En este artculo, se hace una revisinconcisa del proceso de la fagocitosis y se enfatiza suimportancia como mecanismo de proteccin en losvertebrados, sealando, aunque de manera somera, aquellosaspectos que en la actualidad son objeto de mayor estudio,incluyendo estructura celular, la existencia y funcin de lasprotenas de adhesin, los receptores para endocitosis, lasprotenas G, las cascadas de sealizacin, la maduracin delos fagosomas, y la generacin de los metabolitos txicos deloxgeno y el nitrgeno. Introduccin: Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad Equipos , Materiales y Sustancias 1 Lanceta * Sangre perifrico 1 Portaobjetos Levaduras opsonizadas * NBT

* *

Metanol Safranina

Metodologa 1. Por puncin con lanceta, poner en un portaobjetos, una gota de sangre perifrica del paciente y en el otro extremo un testigo (paciente normal). 2. Colocar los portaobjetos, en una cmara hmeda, incubar a 37C durante 20 minutos. 3. Desfibrinar con una aguja, quitando la capa superior de cada una de las gotas de sangre y queda una capa inferior donde se encuentran los fagocitos. 4. Las preparaciones se lavan con solucin salina con cuidado que escurra lentamente. 5. Colocar los portaobjetos en la cmara hmeda y agregar NBT cubriendo la superficie de la preparacin, ms levaduras opsonizadas. 6. Incubar a 37C durante 30 minutos. 7. Lavar con solucin salina para quitar el exceso de NBT. 8. Fijar con metanol por 1 minuto. 9. Teir con safranina por 7 minutos. 10. 1Observar al microscopio y contar las clulas que reduzcan el NBT (grnulos de formazn) y reportar en porcentaje de reduccin.

RESULTADOS: Observar clulas fagocticasendocitando levaduras y distinguir entre clulas que redujeron el NBT (levaduras azules en su interior) de aquellas que no lo hicieron (solo levaduras rojas en su interior). El grado de endocitosis ocurrido y la capacidad de las clulas para reducir el NBT se puede evaluar determinando el porcentaje de clulas que han endocitado levaduras y el porcentaje de clulas que habiendo endocitado, han reducido el colorante.

Tiempo estimado de la prctica: 30 a 60 min Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Referencia Oscar Rojas-Espinosa O. Arce-Paredes P. 2003. Fagocitosis: mecanismos y consecuencias. Bioquimia. 28:4. P20.

Prctica No.10

Cuantificacin Turbidimtrico

de

IgG

por

el

Mtodo

Objetivo Utilizar un mtodo de anlisis de Turbidez para cuantificar la IgG. Introduccin La cuantificacin de las subclases de IgG y su distribucin en los anticuerpos puede proporcionar informacin para identificar inmunodeficiencias, evaluar las defensas del husped en la produccin de anticuerpos, y la fisiopatologa de los mismos. La determinacin de las concentraciones de las subclases de IgG es esencial en el diagnstico de las inmunodeficiencias. La IgG es la inmunoglobulina ms importante producida por clulas plasmticas, y representa un 75% del total de inmunoglobulinas. Su principal funcin es neutralizar toxinas en el espacio tisular. El dficit de IgG puede ser debido a problemas congnitos primarios (inmunodeficiencia congnita y adquirida) y supone un riesgo especial en nios. La hiperglobulinemiapoliclonal es la respuesta normal a infecciones, especialmente en hepatitis y cirrosis as como en enfermedades autoinmunes. Incrementos de IgG monoclonal se observan en el mieloma mltiple, leucemia linfoctica y la macroglobulinemia de Waldenstrm. Los anticuerpos anti-IgG forman compuestos insolubles cuando se combinan con la IgG de la muestra del paciente, ocasionando un cambio de absorbancia proporcional a la concentracin de IgG en la muestra, y que puede ser cuantificada por comparacin con un calibrador de IgG de concentracin conocida. MUESTRA. Suero o plasma. REACTIVOS. Diluyente RI Buffer tris 20 mmol/L. PEG 8000, pH 8.2, azida sdica 0.95. Anticuerpo R2 Suero de cabra anti-IgG humana pH 7.5. azida sdica 0.95 g/L. opcional Calibrador IgG 2606 mg/dL

Advertencia y precauciones: Deben manejarse todos los reactivos como potencialmente infecciosos a pesar de que fueron NO reactivos para las enfermedades transmitidas por sangre, lquidos corporales y tejidos. USAR SIEMPRE GUANTES.

Contiene azida de sodio, en contacto con la piel, lvese abundantemente con agua. Su ingestin es peligrosa. Forma complejos de plomo y cobre al contacto con las tuberas, deje correr el agua durante algn tiempo despus de verter soluciones que contengan azida de sodio. Metodologa: Curva de calibracin. Preparar las siguientes diluciones del Calibrador de protenas (PROT CAL) en NaCl 0.9% como diluyente. PARA OBTENER LAS CONCETRACIONES DE CADA DILUCIN DE IgG, MULTIPLICAR LA CONCENTRACIN DE IgG DEL CALIBRADOR POR EL FACTOR CORRESPONDIENTE INDICADO EN LA TABLA.

# Dilucin del Calibrador Calibrador (l) NaCl 0.9% (l) Factor de dilucin Concentracin de la dilucin de IgG

1 -100 0 0

2 10 90 0.1

3 25 75 0.25

4 50 50 0.5

5 75 25 0.75

6 100 -1.0

260.6 651.5 1303 1954.5 2606

PROCEDIMEINTO PARA PROCESAR LA CURVA DE CALIBRACIN Y LAS MUESTRAS PROBLEMA. 1. Calentar los reactivos y los portacubetas del espectrofotmetro a 37C. 2. Ajustar el espectrofotmetro a CERO frente a agua destilada a 37C 3. Pipetear en una cubeta:

Reactivo R1 950 l Muestra Problema o Cada Calibrador 7 l

4. Mezclar y leer la absorbancia (A1) a 600 nm (580-620nm), despus de la adicin de la muestra. 5. Inmediatamente despus pipetear en la cubeta: Reactivo R2 Anticuerpo 50 l

6. Mezclar y leer la absorbancia (A2) a 600 nm, exactamente 2 min despus de aadir el reactivo R2

CLCULOS Calcular las diferencias de absorbancias (A2-A1), obtenidas para los distintos calibradores y construir la curva de calibracin de los valores obtenidos frente a las concentraciones de IgG de cada dilucin del calibrador. La concentracin de IgG en la muestra se calcula por interpolacin directa de su diferencia (A2-A1) en la curva de calibracin. Dibujar la curva uniendo los puntos. Para determinar las concentraciones reales de protena en una muestra clnica, marcar diferencia de la absorbancia de la muestra en el eje de las ordenadas y buscar el punto de insercin en la curva de calibracin deslizndose luego hasta el eje de las abscisas donde se lee el valor de la concentracin. VALORES DE REFERENCIA Entre 700 1600 mg/dL. Sin embargo los valores normales varan en funcin de diversos factores como la edad, sexo, rea geogrfica, raza y la metodologa. Tiempo estimado de la prctica: 3 horas Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Bibliografa: 1. Clinical Guide to Laboratory tests, edited by NW Tietz W B Saunders Co., Philadelphia, 483, 1983. 2. SkougJonh W et al. Clinchem1988 ; 34/2 : 309-315. 3. Dati F et al. Eur J ClinchemClinbiochem 1996, 34: 517-520.

Prctica No.11

Tipificacin del Sistema ABO y Sistema Rh.


Objetivo General Identificar los resultados de aglutinacin para un suero control as como para la muestra problema. Introduccin:

Debido a la globalizacin tecnolgica y mercantil, se encuentra una amplia variedad de reactivos, tanto nacionales como extranjeros para una infinidad de determinaciones, y nos encontramos ante un dilema; Cul elegir? En base a esto se realiz el siguiente estudio para determinar si ambos insumos cuentan con el mnimo control aceptado por el Centro Nacional de la Transfusin Sangunea, organismo rector en cuanto a transfusiones o trasplantes de Hemoderivados se refiere. Los resultados arrojados muestran que ambos, nacionales y extranjeros, cuentan con el mnimo control antes mencionado, incluso algunos nacionales superan a otros extranjeros, ya sea en avidez o en titulacin.

La primera transfusin que salv una vida la llev a cabo hace menos de 200 aos James Blundell, en 1818. En la actualidad en Estados Unidos se transfunden anualmente
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ms de 22 millones de donaciones de sangre . La seguridad de la transfusin sangunea ha mejorado de manera sostenida desde que se fund el primer banco de sangre de
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EUA en el decenio de 1940 . En la actualidad se investigan nuevas tcnicas diagnsticas moleculares para mejorar la sensibilidad de las pruebas utilizadas en el anlisis de la sangre donada, en donde se incluyen, reactivos para determinacin de isoantgenos humanos, pruebas de compatibilidad, tcnicas para la deteccin de agentes infecciosos, solo para tener un fin comn, la transfusin de sangre segura y asegurar el bienestar tanto del donante como del receptor. El sistema ABO fue descubierto en 1900 por Karl Landsteiner, quien observ que los glbulos rojos humanos podan ser clasificados en tres grupos (ABO) de acuerdo a la presencia de antgenos especficos en la membrana eritrocitaria. El cuarto grupo (AB), de menor frecuencia fue descubierto por Von Decostello y Sturly.

El antgeno A puede presentarse bajo varias formas. Las dos ms comunes de A son A1 y A2, y ambas comprenden el 99% de todos los grupos de A. Los subgrupos de B son an ms raros que los de A. En la actualidad para la determinacin de grupos sanguneos se utilizan antisueros que pueden ser del tipo de las IgG o bien una mezcla de IgGs e IgMs, que son elaboradas a partir de murinos o de conejos. Estos anticuerpos son producidos por fusin de clulas de mieloma murino linfocitos de ratones inmunizados en el caso de transclone anti A: 26A2, transclone antiB:95.3, transclone antiAB:AB5-63 A5A2/26A/95.3 o bien anticuerpos producidos por cultivo de eritrocitos de hibridomamurino de la lnea Birma-1 y ES-4, los cuales secretan anticuerpos Anti-A y Anti-B, respectivamente. El reactivo anti-AB es una mezcla de anticuerpos monoclonales de la misma lnea de clulas, junto con una que reacciona con ambos antgenos A y B. Este es un producto de clulas de hibridoma de la lnea ES-15. Estos reactivos pueden inclur un buffer especial que potencializa la aglutinacin, con o sin albmina bovina, libre de caprilato y a una concentracin de protenas que no exceda del 3% a 0.1% de azida de sodio como preservativo; adems el reactivo anti-A contiene azul potente como colorante y el Anti-B amarillo naftol. Para la tipificacin de subgrupos de A, en el laboratorio, se utiliza un reactivo a base de extractos de semillas, las cuales contienen aglutininas con especificidad hacia grupos de glbulos rojos humanos. El extracto de las emillas de Dolichusbiflorus (lectina) es especfico para el antgeno A1 de los eritrocitos. Los glbulos rojos que son aglutinados con lectina Anti-A1 se clasifican dentro del subgrupo A1. Aquellos que no son aglutinados con la lectina Anti-A1 caen dentro de subgrupos ms dbiles perteneciendo la mayora al subgrupo A2. La tipificacin sangunea D y la deteccin de anticuerpos es recomendada en todas las mujeres gestantes en su primer visita prenatal, incluyendo visitas por cesreas electivas. Repetir el dosaje de anticuerpos D en todas las mujeres D-negativas no sensibilizadas en las semanas 24-28 de gestacin, seguido de la administracin de una dosis completa de 300 g de inmunoglobulina D si son anticuerpos negativos (Recomendacin B). Esta dosis debe repetirse dentro de las 72 horas despus del parto si el infante es D-positivo. A menos que el padre sea conocido como D-negativo, la dosis completa de inmunoglobulina D es recomendada para todas las mujeres D-negativas despus de un aborto electivo (50g antes de las 13 semanas) y anmiocentesis. Es insuficiente la evidencia para recomendar la administracin de rutina de inmunoglobulina D despus de otros procedimientos o complicaciones obsttricas como ser tomar muestra de una vellosidad corinica, terminacin de un embarazo ectpico, cordocentesis, ciruga fetal o manipulacin (incluyendo versin externa), hemorragia placentaria anteparto, muerte fetal anteparto, y alumbramiento de un mortinato. Equipos, Materiales y Sustancias:

Cantidad Equipos , Materiales y Sustancias 1 Portaobjetos limpios y desengrasados. 1 4 2 * 2 jeringas Muestras problemas. palillos de madera antisueros A, B, AB y D(Rh). Pipetas pasteur o capilares.

Metodologa TIPADO GLOBULAR (MTODO DE PLACA) 1. Con un lpiz graso se marcan las letras A, B, AB, y Rh de derecha a izquierda. 2. Se coloca una gota de sangre TOTAL en cada uno de las secciones. 3. Se coloca una gota de antisuero correspondiente en cada seccin. 4. Con ayuda de un palillo de madera se mezclan las gotas de antisuero y sangre, usando un aplicador distinto para cada muestra. 5. Esperar un mximo de tres minutos, dando a la placa un movimiento de rotacin suave. 6. La presencia de aglutinacin indica que el antgeno est presente en el glbulo rojo. Interpretacin de resultados:

TIPADO SRICO (Identificacin de aglutininas)

Confirmacin del grupo sanguneo.

Tcnica: 1. Marcar los tubos con la letras A, B, AB y 0respectivamente. 2. lnactivar los sueros por tres minutos a 62C en baomara. La inactivacin es necesaria para inactivar elcomplemento y evitar que destruya los glbulos rojos. 3. Colocar una o dos gotas del suero por analizar en cadatubo. 4. Agregar una gota de suspensin en solucin salina al 2% de glbulos rojos frescos de los diferentes tipossanguneos a cada uno de los tubos. ORh(+), ARh(+), BRh(+), ABRh(+). 5. Mezclar bien y centrifugar durante 30 seg a 2000rpm. 6. Para la lectura se sacude ligeramente cada tubo a fin de resuspender elcentrifugado y se observa la aglutinacin. 7. La ausencia de aglutinacin indica el tipo sanguneo respectivo a lamuestra de suero problema, ya que se estn determinando losanticuerpos circulantes contra los determinantes antignicos presentes enlos glbulos rojos conocidos.

Tiempo estimado de la prctica: 30 a 60 min Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Interpretacin de Resultados y Conclusiones Tipado globular: Como se puede apreciar en la imagen de la izquierda el resultado es A Rh (+) y a la derecha se puede apreciar la confirmacin por medio de la
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tipificacin srica. El segundo Tubo es el ARh(+) en tanto que el tercero de izquierda a derecha es el tubo ABRh(+) quedando ala izquierda el tubo para BRh(+) y a la derecha el Orh(+)

En la imagen de la izquierda se muestran los resultados para el factor Rh, por tanto el resultado completo es A Rh (+)

(E

pos pos

neg pos

).

Bibliografa: Manual de prcticas de Laboratorio de Inmunologa / M.C. Ana Bertha Torres Reyes , M.C. Roco Infante Ramrez. Inmunologa bsica y clnica. 9a edicin. El Manual Moderno. Mxico, 1997 pp. Pgs 319-320. http://www.geocities.com/spectroq/vol3no2/valoracion.htm

Prctica No. 12

Pruebas Cruzadas
Previo a la realizacin de una transfusin sangunea entre individuos compatibles en el sistema ABO y para el sanguneo D, es necesario realizar una prueba cruzada que ponga de manifiesto la existencia de otros anticuerpos dirigidos contra antgenos de los sistemas menores. Esta prueba cruzada se lleva a cabo con eritrocitos del donador y suero del receptor (prueba mayor) y con eritrocitos del receptor y suero del donador (prueba menor). Antes de efectuar una prueba cruzada, es necesario conocer los datos clnicos del receptor y del donador para elegir las pruebas adecuadas del anlisis, sin embargo, si se desconocen estos datos en necesario efectuar todas las pruebas que se indican a continuacin. 1) Paciente que nunca ha sido transfundido o que no haya tenido embarazos: prueba de salina rpida, albumina rpida y ficina o papana rpida. 2) Paciente politransfundido, que haya tenido embarazos o que se desconozcan sus antecedentes: prueba de salina rpida, albmina rpida, ficina o papana rpida, salina a 37C/Coombs.

En el primer caso podran existir anticuerpos contra antgenos de los sistemas sanguneos menores, adquiridos en forma natural. En el segundo caso, adems de estos anticuerpos, pueden existir otros inducidos por las transfusiones previas o por el paso de eritrocitos del producto hacia la madre.

MATERIAL POR GRUPO: Centrifuga clnica

MATERIAL POR EQUIPO: 2 jeringas estriles con aguja del # 20 11 tubos de 10x75 mm 2 tubos de 15x125 mm con 5 ml de solucin salina estril 2 tubos de 13x100 mm Pipetas Pasteur Solucin de albmina al 25 % Solucin de ficina (1mg/ml) o de papana (10mg/ml). Esta solucin se vende comercialmente, lista para usarse. Suero de Coombs.

METODO: PROCEDIMIENTO DE PRUEBAS CRUZADAS 1. Se obtienen5mldesangrevenosasin anticoagulante,deldonador,ysecolocan 0.1mldeesasangreenuntuboquecontengasolucinsalina(suspensinal5%).El restodelasangresedepositaenuntuboparaobtenerelsuero. 2. Serepiteelproceso,ahoraconlasangredelreceptor. 3. Sedisponeunaseriede3tubosyseetiquetancomosigue: PM (prueba mayor) pm (prueba menor) Auto (autotestigo) 4. A cada tubo se le agregan las siguientes cantidades segn corresponda: SUSPENCIN AL 5% GR DEL DONADOR 1 gota SUERO DEL DONADOR SUSPENCIN AL 5% GR DEL RECEPTOR 1 gota 1 gota SUERO DEL RECEPTOR 1 gota 1 gota 1 gota

PM Pm Auto

5. Una vez hechas las mezclas centrifugar 15 segundos a 2500 rpm y observar en bsqueda de aglutinacin, en caso de observarla se detiene el proceso marcando que son incompatibles, en caso de no observar aglutinacin continuar con el proceso. (A esta fase se le llama SALINA RPIDA). 6. En aquellos tubos donde no se observ aglutinacin agregar 2 gotas de albmina y centrifugar 15 segundos a 2500 rpm y observar en busca de aglutinacin, los tubos que no presentaron aglutinacin continan en el proceso. 7. Incubar a 37 C por 10 minutos y centrifugar 10 segundos a 2500 rpm. Observar en busca de aglutinacin, los tubos que no se presentaron aglutinacin continan en el proceso. (A esta fase se le conoce ALBMINA) 8. Lavar el contenido de los tubos, agregando 3 ml de solucin salina luego homogeniza la solucin, centrifuga 15 segundos a 2500 rpm y desecha el sobrenadante esto reptelo 2 veces ms. 9. Agrega a cada tubo 2 gotas del reactivo de Coombs despus centrifuga 15 segundos a 2500 rpm y observa en bsqueda de aglutinacin, si sta es positiva hay incompatibilidad sangunea si es negativa hay compatibilidad sangunea. (A esta fase es la COOMBS).

Prctica No. 13

Reacciones Febriles
Objetivo General Identificar e interpretar los resultados de aglutinacin para un suero control as como para la (s) muestra(s) problema. Introduccin: Cuando el organismo ha sido invadido por bacterias patgenas, responde en la mayora de los casos produciendo anticuerpos especficos contra los antgenos de los grmenes invasores. La demostracin de estos anticuerpos y la elevacin de los mismos es til para el diagnstico e identificacin del tipo de infeccin as como el curso de la misma. La titulacin de anticuerpos en el suero del paciente por medio de la aglutinacin de las suspensiones de las clulas bacterianas muertas conocidas (antgeno) es una ayuda diagnstico valiosa en las fiebres de origen no determinado. Esta prueba determina la mayor dilucin del suero del paciente que causar la aglutinacin del antgeno bacteriano, conocido como ttulo. Las reacciones febriles incluyen: 1) REACCIN DE WINDAL Se usa para el diagnstico diferencial de Paratifoidea y Tifoidea, y comprende: a) Titulacin del antitfico 0 b) Titulacin del antitfico H c) Titulacin del paratfico A (S. enteritidis A) d) Titulacin del paratfico B (S. enteritidis B) a) Titulacin del antitfico 0 somtico: - Ttulos menores de 1:80 carecen de importancia clnica. - Ttulos de 1:80 - 1-160 aparecen en el perodo de incubacin de fiebre tifoidea, portadores convalecientes y en caso de respuesta inmunolgica por vacunacin. - Ttulos mayores de 1:160 se consideran anormales y concluyentes de infeccin activa por Salmonella typhi. b) Titulacin del antitfico H flagelar - Ttulos menores de 1:80 carecen de importancia clnica. - Ttulos de 1:80 a 1:160 se presentan en el perodo de incubacin de la fiebre tifoidea, en pacientes en convalecencia y en caso de portadores crnicos, detectndose en ste ltimo la presencia de anticuerpos especficos para el antgeno Vi (antgeno capsular de

Salmonella typhi). - Ttulos mayores de 1:160 son concluyentes de fiebre tifoidea si estn elevados junto con las aglutininas anto 0 somticas en 1:160 o ms; de lo contrario tiene la misma significancia clnica que los ttulos anteriores. c) Titulacin de aglutininas paratfico A: - Ttulos menores de 1:80 no tienen ninguna significancia clnica. - Ttulos de 1:80 a 1:160 detecta perodo de incubacin de la enfermedad, portadores convalecientes y portadores crnicos. - Ttulos mayores de 1:160 indican infeccin activa por Salmonella enteritidis biotipo A. d) Titulacin de aglutininas antiparatfico B: - Ttulos menores de 1:80 no tienen ninguna significancia clnica. - Ttulos de 1:80 a 1:160 detecta perodo de incubacin de la enfermedad, portadores convalecientes y portadores crnicos. - Ttulos mayores de 1:160 indican infeccin activa por Salmonella enteritidis biotipo B. 2) REACCION DE WEIL FELIX: En 1916 Weil y Felix aislaron una cepa de Proteus de la orina de un paciente con fiebre tifos. El suero del paciente aglutinaba con sta cepa de la misma manera que lo hacia con otros pacientes con fiebre tifos. La naturaleza qumica de los antgenos de Proteus, que reaccionaba en forma cruzada con los anticuerpos rickettsicos no ha sido completamente determinada, sin embargo comparten un antgeno glucolopido comn. Esta prueba es altamente til en el diagnstico diferencial de ciertas enfermedades rickettsicas. Basicamente los anticuerpos del tfico (murino) y de la fiebre moteada de las montaas Rocallosas, reaccionan conelProteus OX-19. Los anticuerpos del tifosScub (Tsusugamishi) reaccionan con el Proteus OX-K, mientras que los anticuerpos de la viruela rickettsica y de la fiebre Q no reaccionan con ninguna cepa de Proteus. En la fiebre Tifus los anticuerpos empiezan a aparecer entre 7 y 10 das despus de la infeccin y alcanzan su mximo alrededor del da 14. El ttulo de 1:40 hasta 1:80 son sospechosos y ttulos de 1:160 es indicativo de enfermedad

Reaccin de Weil-Felix en las enfermedades Rickettsicas:

Enfermedad

Antgeno Proteus OX19 OX2 OXK Tifus epidmico xxxx X 0 Tifus endmico (murino) xxxx X 0 Tifus de Scrub (Tsutsugamuchi) 0 0 xxx Fiebre Moteada de las Montaas Rocallosas xxxx X 0 Viruela Rickettsica 0 0 0 Fiebre Q 0 0 0

C) REACCIN DE HUDDLESON La brucelosis humana es causada por la Brucellaabortus, B. melitensis, B. suis. La principal fuente de B. abortus es la leche de vaca no pasteurizada y el ganado infectado. Los anticuerpos empiezan a aparecer de 2 a 3 semanas despus de la inoculacin y alcanza un mximo entre 3 a 5 semanas. Un ttulo de 1:80 a 1:160 en presencia de sntomas clnicos es indicativo de infeccin, mientras que el ttulo de 1:300 o ms es conclusivo de enfermedad. Los ttulos altos pueden persistir durante aos pero generalmente disminuye de manera gradual. Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad 5 10 4 1 Equipos , Materiales y Sustancias 5 placas de vidrio divididas en seis partes palillos de madera Pipetas de l/100ml equipo para reacciones febriles con controles

Metodologa

Prueba Cualitativa: 1. Una gota de antgeno y una gota de suero (aproximadamente 0.1 ml) 2. Mezclar homogneamente con un aplicador y observar Nota: La reaccin que de positivo se proceder a hacer la prueba cuantitativa. Prueba Cuantitativa: Con una pipeta serolgi ca graduada de 1 ml hacer las siguientes diluciones:

80L de suero + 30L de antgeno = 1:20 40 L de suero + 30 L de antgeno = 1:40 20 L de suero + 30 L de antgeno = 1:80 10 L de suero + 30 L de antgeno = 1:160 5 L de suero + 30 L de antgeno = 1:320 Agitar con un aplicador de madera hasta que el contenido se distribuya homogneamente. Debe usarse aplicador diferente cada vez. Se toma la placa y se sostiene encima de una superficie iluminada de vidrio translcido. Se rota y se balancea lentamente durante 2 min. Se observa si hay aglutinacin, si se encuentra, se reporta hasta dilucin que presente franca aglutinacin macroscpica. INTERPRETACIN DE RESULTADOS El grado de aglutinacin se registra como sigue: 4+ Aglutinacin del 100% de los organismos 3+ Aglutinacin del 75% de los organismos 2+ Aglutinacin del 50% de los organismos 1+ Aglutinacin del 25% de los organismos - Aglutinacin del 0% de los organismos

El ttulo del suero ser la inversa de la dilucin ms alta en donde se observa una aglutinacin del 50% de organismos (2+).

PRECAUCIONES

1. todos lossueros a probar debern estar totalmente claros y libres de contaminacin bacteriana. 2. NO caliente el suero antes de probarlo. 3. Agite bien el antgeno antes de utilizarlo para asegurar una suspensin uniforme.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO 1. Algunos sueros normales pueden dar un ttulo de 1:20 a 1:40 y hasta 1:80 pero esto puede ser debido a vacunaciones o alguna infeccin anterior. No siempre se presenta produccin de aglutininas en infecciones bacterianas. 2. se pueden producir reacciones cruzadas de aglutininas debido a vacunaciones para ciertas enfermedades. La vacuna tfica puede producir aglutininas contra antgenos Proteus. 3. En la reaccin de Huddleson ttulos de 1:80 pueden considerarse ya de significado clnico.

Tiempo estimado de la prctica: 10 a 20 min Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata. Resultados

Interpretacin de Resultados y Conclusiones

Bibliografa: Manual de prcticas de Laboratorio de Inmunologa / M.C. Ana Bertha Torres Reyes, M.C. Roco Infante Ramrez. Spink, W.W.: AMER, J. clin, Path., 22:201, 1952. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000597.htm http://www.tusalud.com.mx/120663.HTM

Prctica No. 14

DETERMINACIN DE PROTENA C REACTIVA


Tillet y Francis concluyeron en 1930 que la reaccin que se originas en el suero de pacientes que pacientes que sufren de enfermedades inflamatorias precipita con un extracto de pneumococo no protico llamado polisacrido C. la protena que causa este tipo de reaccin fue llamada protena C reactiva. Como un fenmeno no especfico el incremento en la concentracin de protena C reactiva se puede presentar en cualquier proceso inflamatorio agudo (ya sea infeccioso o no infeccioso). La concentracin de protena C reactiva generalmente se encuentra por debajo de 6mg/L en el suero de adultos sanos y en enfermedades inflamatorias estos valores frecuentemente se incrementan en un lapso de 4 a 8 horas despus de presentarse un evento agudo alcanzando niveles de 20 a 500mg/L. El principio del procedimiento involucra una reaccin inmunolgica entre la protena C reactiva (como antgeno) y el anticuerpo correspondiente adsorbido a las partculas de ltex (ltex sensibilizado con anti-protena C reactiva). Mtodo Cualitativo 1. Enun tubo de 13*100 depositar 950 L del diluyente glicina-salina pH 8.2 diluido. 2. Aadir 50 L del suero problema (dilucin 1:20). 3. En un anillo de la placa depositar 50L del suero diluido. 4. En otro anillo depositar una gota del control positivo y en otro anillo una gota del control negativo. 5. Aadir a cada uno de los 3 anillos una gota de ltex anti-protena C reactiva previamente resuspendido. 6. La placa se oscila suavemente con la mano o con el agitador mecnico por 2 minutos. 7. Se busca aglutinacin de las partculas de ltex bajo una fuente de luz directa.

Interpretacin de Resultados Resultado positivo.- presencia de agregados macroscpicos (aglutinacin comparable al control positivo). Resultado Negativo.- ausencia de agregados macroscpicos (sin aglutinacin, comparable al control negativo). Mtodo Semicuantitativo 12. Seleccionar los sueros positivos de la prueba cualitativa. 13. colocar en una gradilla 5 tubos de 12x75mm y numerarlos. 14. Depositar al tubo 1 0.95 mL de diluyente diluido. 15. depositar del tubo 2 al 5, 0.5mL de diluyente diluido. 16. Aadir al tubo 1 0.05mL del suero problema dilucin 1:20 y mezclar. 17. Pasar 0.5mL del tubo 1 al 2 y mezclar.

18. continuar esta operacin hasta el tubo 5. 19. Depositar 0.05mL de cada una de las diluciones en anillos diferentes de la placa. 20. aadir una gota de ltex a cada una de las diluciones. 21. Mezclar durante 2 minutos. 22. Realizar la lectura del resultado bajo una fuente de luz directa. INTERPRETACIN El ttulo del suero problema ser la ltima dilucin que presente agregados macroscpicos (aglutinacin). Tubo 1 2 3 4 5 Dil. 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320

Tiempo estimado de la prctica: 45 a 60 min Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Resultados

Interpretacin de Resultados y Conclusiones

Bibliografa: Manual de prcticas de Laboratorio de Inmunologa / M.C. Ana Bertha Torres Reyes , M.C. Roco Infante Ramrez. Harrison F Word et al. The occurrence during aaccute infections of a protein not normal present in the blood. J. Exp. Medical. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003509.htm

Prctica No.15

Determinacin de Factor Reumatoide


FUNDAMENTO El factor reumatoide pertenece a un grupo de anticuerpos dirigidos contra la estructura terciaria modificada de la fraccin Fc de la inmunoglobulina IgG. Su presencia se relaciona con enfermedades tales como: Artritis reumatoide y lupus eritematoso generalizado, entre otras. Las tcnicas ms utilizadas se basan en la aglutinacin de partculas de ltex de poliestireno cubiertas con una capa de gamma globulina humana adsorbida. El factor reumatoide presente en la muestra reacciona tonel material cubierto originando una aglutinacin visible de las partculas de ltex inhertes.

Mtodo Cualitativo 1. Se prepara una dilucin del suero problema 1:20 con 1mL del diluyente concentrado y 0.05mL del suero. 2. En una divisin de la placa, se coloca 50 Ldel suero diluido. 3. En otra divisin colocar una gota del control positivo y en otro una gota del control negativo. 4. Se aade a cada uno una gota de reactivo de ltex-globulina humana previamente resuspendido. 5. Con un aplicador de madera o un palillo, se mezclan ambas gotas. 6. La placa se oscila suavemente con la mano o con el agitador mecnico durante 2 minutos. 7. Se busca la presencia de aglutinacin de las partculas de ltex bajo una fuente de luz directa. Interpretacin de Resultados Resultado positivo.- presencia de agregados macroscpicos (aglutinacin comparable al control positivo). Resultado Negativo.- ausencia de agregados macroscpicos (sin aglutinacin, comparable al control negativo). Mtodo Semicuantitaivo 1. Seleccionar los sueros positivos de la prueba cualitativa. 2. colocar en una gradilla 8 tubos de 12x75m y numerarlos. 3. Depositar al tubo 1 1 mL de diluyente diluido. 4. depositar del tubo 2 al 8, 0.5mL de diluyente diluido. 5. Aadir al tubo 1 0.05mL del suero problema y mezclar. 6. Pasar 0.5mL del tubo 1 al 2 y mezclar. 7. continuar esta operacin hasta el tubo 8. 8. Depositar 0.05mL de cada una de las diluciones en anillos diferentes de la placa. 9. aadir una gota de ltex a cada una de las diluciones.

10. Mezclar durante 2 minutos. 11. Realizar la lectura del resultado bajo una fuente de luz directa. INTERPRETACIN El ttulo del suero problema ser la ltima dilucin que presente agregados macroscpicos (aglutinacin). Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 Dil. 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560

Bibliografa: 1. Lloyd, Panush R. Cell Mediated Immunity in RhehumatoidArtritis. J. Rheumatology. 1977; 231-244. 2. Segon P. et al. Depress primary in vitro antibody response in rheumatoid artritis. Clin. ExpInmunology. 1979. 93; 196-204.

Prctica No.16

Determinacin de VDRL
Objetivo General Identificar e interpretar los resultados de floculacin para un suero control as como para la muestra problema. Introduccin: La sfilis es una infeccin altamente tratable. Adems de examinar individuos con signos y sntomas de sfilis y/u otras enfermedades de transmisin sexual, el tamizaje de sfilis es una parte rutinaria del cuidado prenatal durante el embarazo. Varios estados tambin exigen el tamizaje de sfilis antes de obtener una licencia de matrimonio. La prueba de VDRL es un examen de tamizaje para sfilis que mide los anticuerpos reagnicos que se producen en la sfilis como resultado de la interaccin de la bacteria causante de la sfilis ( Treponema pallidum) y el cuerpo del paciente. Este examen es una herramienta de tamizaje til para la sfilis, aunque su capacidad de deteccin depende de la etapa de la enfermedad. En la etapa ms temprana (sfilis primaria) el examen es positivo en aproximadamente el 60% de las ocasiones. Su utilidad aumenta en etapas posteriores como sfilis secundaria y sfilis latente donde puede ser positivo en el 70 a 90% de las ocasiones; en las etapas finales (sfilis terciaria) el examen es positivo en slo el 60% de los casos. Existen varias condiciones que pueden producir un examen falso positivo tales como VIH, enfermedad de Lyme, neumona por micoplasma, malaria y lupus eritematoso sistmico. Por lo tanto, si este examen de tamizaje resulta positivo se debe confirmar con un examen ms especfico como FTA-ABS. FTA-ABS: Prueba de absorcin de anticuerpos treponmicos fluorescentes

Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad 1 1 1 1 1 1 1 Equipos , Materiales y Sustancias IMMUTREP USR ANTIGEN SUERO CONTROL POSITIVO Suero problema Micropipeta para 22 y 50uL Placas de aglutinacin Placa de agitacin 180 r.p.m. Microscopio

Metodologa Tomar la muestra de sangre venosa, se puede trabajar tanto con suero como con plasma siempre y cuando sea fresco. No utilizar suero o plasma hemolizado, contaminado o lipmico ya que puede afectar los resultados. El suero o el plasma se pueden guardar a 4C por hasta 48 horas a -20C por hasta 6 semanas. Dejar todos los reactivos a temperatura ambiente antes de efectuar la reaccin. Agitar el frasco antes de usarlo y durante el reparto. Mtodo Cualitativo 1. colocar una gota de la muestra problema (50uL) 2. adicionar 22uL del antgeno mezclado a la muestra. (no hay necesidad de mezclar estos 2 componentes). 3. agitar la muestra a 180 r.p.m. durante 4 minutos. 4. Inmediatamente despus de los 4 minutos, inspeccionar el resultado microscpicamente bajo el objetivo de 10X. Mtodo semicuantitativo 1. Utilizando solucin salina Isotnica (0.9% NaCl) preparar diluciones seriadas de la muestra (1/2, , 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 o ms). 2. Transferir una gota de cada dilucin de la muestra (50uL) al crculo de prueba en la placa. 3. Adicionar 22uL del antgeno mezclado a la muestra. (no hay necesidad de mezclar estos dos componentes). 4. Agitar la placa por 4 minutos a 180 r.p.m. 5. Inmediatamente despus de los 4 minutos, inspeccionar el resultado microscpicamente bajo el objetivo de 10X

RESULTADOS E INTERPRETACIN El control positivo del kit debe dar un resultado positivo en ttulos +/- una doble dilucin a los 4 minutos. Mtodo Cualitativo Agregados medianos o grandes Reaccin Agregados finamente dispersados Reaccin dbil Agregados no visibles, apariencia griscea No reaccin Mtodo semicuantitativo El ttulo es la ltima dilucin que produce un resultado de reaccin

Tiempo estimado de la prctica: 30 a 60 min Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Bibliografa: OMEGA DiagnosticsLtd 2003. Manual de prcticas de Laboratorio de Inmunologa / M.C. Ana Bertha Torres Reyes, M.C. Roco Infante Ramrez. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003512.htm http://www.tusalud.com.mx/120010.htm

Prctica No. 17

Determinacin de Antiestreptolisina O en suero


INTRODUCCIN. El anticuerpo Antiestreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en ttulos bajos, debido a que las infecciones estreptoccicas son comunes. Sin embargo un ttulo alto o creciente, indica una infeccin reciente producida por un estreptococo beta hemoltico del grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela, etc. FUNDAMENTO DEL MTODO. Los Ac antiestreptolisina O se detectan en suero por su reaccin con la estreptolisina O adsorbida sobre un soporte inerte de ltex. Los Ac antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina produciendo una aglutinacin visible macroscpicamente. MATERIAL Placas de vidrio Palillos de madera Cronmetro Lmpara o fuente de luz Homogenizador de placas a 80-100 rpm

Muestra biolgica Suero: Obtener suero de manera usual. Los sueros marcadamente lipmicos o contaminados pueden dar resultados falsos positivos. PROCEDIMIENTO. Llevar todos los reactivos y muestras biolgicas a temperatura ambiente TCNICA CUALITATIVA. 1. Poner todos los reactivos a temperatura ambiente. 2. Colocar 50l de control positivo sobre un crculo en el extremo izquierdo de una placa para aglutinacin. 3. Colocar 50 l de suero problema sobre un circulo en el centro de una placa para aglutinacin 4. Colocar 50 l de control negativo sobre un crculo en el extremo derecho de una placa para aglutinacin. 5. Homogeneizar suavemente el reactivo de ASO antes de usar. Colocar una gota de Reactivo de ltex a cada una de las gotas anteriores,

6. Mezclar con un palillo desechable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspensin uniforme en la superficie de la placa. 7. Inmediatamente disparar el cronmetro y balancear la placa. 8. Observar el resultado dentro de los 2 minutos.

TCNICA SEMICUANTITATIVA Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en tubos de Kahn. 1. Colocar 0.5 ml de solucin fisiolgica en cada uno de los tubos. 2. Agregar 0.5 ml de suero al tubo No.1 y mezclar 3. Transferir 0.5 ml de esta dilucin al tubo siguiente y mezclar, continuando as las diluciones hasta el ltimo tubo. Las diluciones obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc. 4. Ensayar cada dilucin segn la tcnica cualitativa. RESULTADOS: NEGATIVO: Suspensin homognea. POSITIVO: Aglutinacin que aparece dentro de los 2 minutos. TTULO: Inversa de la mxima dilucin a la que se produce aglutinacin visible macroscpicamente. Se obtiene aplicando la siguiente frmula: 200 X Titulo de ASO=UI/ml En el mtodo semicuantitativo se define le titulo como la dilucin mayor que da resultado positivo. LIMITACIONES Una determinacin aislada no da informacin suficiente acerca del estado actual de la enfermedad. Tiempos de reaccin mayores de 2 minutos pueden producir resultados falsos positivos por efecto de secado de reactivos. Se pueden producir falsos negativos en nios mayores de 6 meses y menores de 6 aos o en infeccin reciente. Debe tenerse en cuenta que en este tipo de infecciones, un resultado aislado slo constituye un dato auxiliar, por lo que se recomienda efectuar determinaciones seriadas cada 15- 20 das durante 4 6 semanas. BIBLIOGRAFA. Sonnewirth, A.C., Jarret, L., GradwohlMethdos and Diagnosis of Clinical Laboratory.ED. Panamericana, (1983)

Prctica No.18

Determinacin cualitativa de anticuerposanti-Brucellaabortus por Aglutinacin con el Antgeno Rosa de Bengala.


Objetivo General Identificar e interpretar los resultados de aglutinacin para un suero control as como para la muestra problema.

Introduccin: Fiebre de Malta; fiebre ondulante; fiebre de la roca; fiebre de Chipre; fiebre de Gibraltar Es una enfermedad causada por el contacto con animales de granja portadores de la bacteria Brucella. La bacteria Brucella infecta al ganado, las cabras, los perros y los cerdos. Esta enfermedad se transmite a los seres humanos por contacto con carne infectada, placenta de animales infectados o ingestin de leche o queso no pasteurizados. La enfermedad puede ser crnica y persistir por aos. Las medidas preventivas ms importantes son la pasteurizacin de la leche y la ingestin exclusiva de quesos pasteurizados. Las personas que manipulan carne deben utilizar lentes y ropas protectoras y cubrir (proteger) cualquier lesin de piel para evitar su infeccin. La deteccin de animales infectados permite el control del origen de la infeccin. Existen vacunas para el ganado, pero no para los seres humanos. Fundamento: El rosa de bengala es una tcnica de aglutinacin en porta para la deteccin cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos anti-brucella en suero humano o animal. La suspensin bacteriana y coloreada es aglutinada por anticuerpos IgG o IgM en el suero del paciente. Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad 1 1 4 2 Equipos , Materiales y Sustancias Pipetas desechables Portaobjetos Palillos de Madera Reloj

Reactivos: Suspensin de Brucellaabortuscepa 544 en buffer lactate 1 mmol/L, fenol 5g/L, Rosa de bengala pH 6.3 Control positivo: Suero animal con anticuerpos anti-brucela>50UI/ml, azida de sodio

Control negativo: Suero animal en azida de sodio. Metodologa Mtodo cualitativo: 1. Coloque los reactivos, controles y sueros a temperatura ambiente 2. Usando una pipeta, adicione 1 gota del suero paciente en el extremo izquierdo de un portaobjetos. 3. En el extremo derecho coloque una gota de control positivo. 4. Mezcle el Ag Rosa de Bengala gentilmente, y adicione una gota de reactivo, tanto a la gota de suero problema como a la gota de control positivo. 5. Mezclar con un palillo desechable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspensin uniforme en la superficie de la placa. 6. Inmediatamente disparar el cronmetro y balancear la placa. 7. Observar la presencia o ausencia de aglutinacin a los 2 minutos exactamente. La presencia de aglutinacin indica una concentracin igual o mayor a 25UI/ml. En el mtodosemicuantitativo se define el titulo como la dilucin mayor que de aglutinacin positiva. Mtodosemicuantitativo: a. Realizar diluciones dobles de las muestras en solucin salina. b. Proceder para las diluciones como en la prueba cualitativa.

Clculos: La concentracin aproximada de anticuerpos anti-brucella en la muestra del paciente se obtiene: 25 X ttulo de anti-brucella= UI/ml Valores de referencia: Hasta 25 UI/ml. Tiempo estimado de la prctica: 30 a 60 min Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Bibliografa: Manual de prcticas de Laboratorio de Inmunologa / M.C. Ana Bertha Torres Reyes M.C. Roco Infante Ramrez. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000597.htm

Principio de las pruebas de Inmunocromatografa

a) Composicin de la tira: 1- base plstica; 2-membrana de absorcin; 3-montaje de conjugado; 4-membrana de trabajo; 5-almoadilla de absorcin. b) reactivos introducidos. Ab- anticuerpo especfico; Ab2- anticuerpos contra IgG de Conejo; Ab-CG- Anticuerpos especficos conjugados con oro coloidal. c) representacin esquemtica del anlisis: 6-difusin del lquido o muestra; 7-linea de prueba; 8-linea control. d) resultado de la prueba en ausencia del antgeno: una banda coloreada en el rea de la lnea control. e) resultado de la prueba en presencia del antgeno: dos bandas coloreadas en el rea de las dos lneas, la control y la prueba.

Referencia: Byzova N.A., Safenkova I.V., Chirkov S.N., Sherdev A.V., Blintsov A.N., Dzantiev B.B. y Atabekov I.G. (2009). Development of Immunochromatographic Test System for Express Detection of Plant Viruses.App Biochem and Microbiol. 45 (2) 204-209.

Prctica No. 19

Determinacin Cualitativa de la Hormona Gonadotropina Corinica Humana (GCH) por el mtodo en Tira (Dipstick).
Introduccin: La gonadotropina corinica humana (GCH) es una glicoprotena, hormona segregada por la placenta despus de la fertilizacin y que aparece en la orina de mujeres embarazadas o con ciertos tipos de procesos neoplsicos. Un embarazo normal la GCH se detecta en suero a los 7 das despus de la concepcin. El perodo en el cual el nivel de GCH es ptimo para obtener resultados con esta prueba, comprende hasta el da a 109 aproximadamente despus del ltimo perodo menstrual. La persistencia de GCH en niveles altos es sugerente de un proceso neoplsico. La UNISTEP plus (DIPSTICK) es una prueba cualitativa de inmunoensayo conjugado para la determinacin de GCH. El mtodo usado es una combinacin de anticuerpos policlonales y monoclonales para la identificacin de GCH en las muestras del examen, por lo cual se tiene una gran sensibilidad. La prueba detecta 25 mUl / ml de GCH. PRINCIPIO DE LA PRUEBA La prueba est basada en un complejo de anticuerpos y oro coloidal, para la determinacin cualitativa de la GCH en suero y en orina, El resultado es visual para la deteccin de embarazo. Durante la prueba, la muestra (orina o suero), entra en contacto con el papel absorbente para empezar la reaccin, los anticuerpos conjugados de la GCH forman un complejo anticuerpo-antgeno. Este complejo anti-GCH se manifiesta en la zona de reaccin positiva y desarrolla una banda de color rosa que indica la concentracin de GCH. La aparicin de una banda rosa en la zona control indica que la prueba termin y que estuvo bien realizada. Beta-GCH cualitativa en suero; gonadotropina corinica humana cualitativa en suero; prueba de embarazo en sangre; beta GCH srica cualitativa; GCH srica Definicin GCH cualitativa en suero es una prueba que se utiliza para detectar beta-GCH (gonadotropina corinica humana, una hormona que normalmente se produce durante el embarazo) en suero.

Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad 1 * * Equipos , Materiales y Sustancias Tubos de 10 x50mm gradillas para tubos de 10 x 50 mm Tiras de prueba (cada una contiene en la membrana, Ac policional y en la zona de problema contiene Ac monoclonal IgG conjugado con una matriz proteica en 0.1 % de azida de sodio.

Metodologa 1. La reaccin se realiza a temperatura ambiente. 2. No es necesario realizar ningn procedimiento previo a la muestra. 3. Remueva la tira del sobre (tmela por el extremo verde). 4. Introduzca la tira en la orina o suero, verticalmente hasta el nivel de absorcin. 5. Espere a que la banda de control aparezca para retirar la tira de la muestra. 6. Espere de 3-5 min para leer la prueba.

Resultados. La aparicin de una banda en la zona de control, indica un resultado negativo; la aparicin de una banda ms en la zona de problema indica un resultado positivo y la ausencia de ambas indica un resultado invlido. VALORES ESPERADOS. Mdicamente se considera que no hay embarazo si no est presente la GCH. En aproximadamente 7 das despus de la concepcin, la concentracin de GCH es de 5-50 FALSO NEGATIVO: Diluir la orina y condiciones que pueden ocasionar deterioro de la GCH. Concentraciones menores de 24 mUl / ml es resultado negativo.

Tiempo estimado de la prctica: 45 a 60 min Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Resultados

Interpretacin de Resultados y Conclusiones

Bibliografa: Manual de prcticas de Laboratorio de Inmunologa / M.C. Ana Bertha Torres Reyes, M.C. Roco Infante Ramrez. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003509.htm

Prctica No. 20

Determinacin de Antgeno Prosttico (PSA)


Objetivo General Deteccin cualitativa de un nivel anormal de antgeno prosttico (PSA) en suero o plasma. INTRODUCCIN El antgeno prosttico es una protena de unos 34 kDa de peso molecular (en estado libre) y con actividad enzimtica tipo serin-proteasa que cumple un papel destacado en los procesos de licuefaccin-gelificacin del semn. Su utilidad en diagnstico radica en el hecho de ser uno de los pocos marcadores tumorales cuya deteccin por encima de determinada concentracin presenta utilidad clnica en el diagnstico de cncer de prstata, el segundo cncer masculino en importancia y el ms significativo en edades avanzadas. PRINCIPIO DEL MTODO El PSA presente en el suero reacciona con las partculas de ltex coloidal que estn conjugadas con anticuerpos monoclonales especficos contra PSA. Este complejo de partculas coloidales-anticuerpos-PSA migra por un proceso cromatogrfico hacia la zona de reaccin. En esta zona hay anticuerpos contra PSA que reaccionarn con el complejo partculas de ltex coloidales-anticuerpos-PSA. Esta reaccin origina una lnea rojo/rosa. PROCEDIMIENTO 1. Atemperar la muestra y otro material necesario para la prueba antes de realizar el ensayo. 2. Extraer la placa del sobre y colocarla sobre una superficie plana. Identificar cada placa con los datos del paciente. 3. con la pipeta suministrada, colocar exactamente 4 gotas (0.125 mL) de suero o plasma en la ventana circular sealada con una flecha (ventana de la adicin de la muestra). 4. leer el resultado a los 5 minutos. INTERPRETACIN DE RESULTADOS Negativo.- slo aparece una lnea transversal AZUL en la zona central del dispositivo de reaccin (alineada con la letra C (control) marcada en la carcasa). Siempre debe aparecer esta lnea. Positivo.- Adems de la lnea AZUL de control aparece otra lnea transversal ROSA/ROJA en la zona central del dispositivo de reaccin alineada con la letra T (test) marcada en la carcasa. La intensidad de esta coloracin va a ser variable segn la concentracin presente de antgeno. No vlido.- Si no aparece una lnea C en la lnea de control tras 5 minutos de la adicin de la muestra, no se ha procedido correctamente, los reactivos se han deteriorado o se ha aadido una cantidad incorrecta de muestra. Repetir la prueba

con una placa nueva. TODA LNEA QUE POR LA NATURALEZA DE LA MUESTRA PUEDA APARECER PASADOS LOS 5 MINUTOS NO TENDR VALOR DIAGNSTICO.

CARACTERSTICAS DEL MTODO Sensibilidad.- SPIN-PSA da un resultado positivo con muestras que contienen ms de 4ng/mL de PSA. Especificidad.- los anticuerpos monoclonales uilizados presentan una especificidad nica para PSA, sin reaccin cruzada con otras protenas del suero humano. Detectan tanto PSA libre como PSA acomplejada con ACT (alpha-1-antiquimotripsina). REFERENCIA SPINREACT, S.A. Ctra. Santa Coloma, Espaa.

Prctica No. 21

DETERMINACIN DE ANTICUERPOS ANTI-HIV 1/2 POR INMUNOCROMATOGRAFIA


OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos anti-HIV 1/2 por inmunocromatografa

INTRODUCCION En 1983 fue descubierto el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) el cual es un retrovirus que es el agente etiolgico del Sndrome de Inmunodeficiencia Humana Adquirida (SIDA). El SIDA es caracterizado por cambios en la poblacin de linfocitos T que tienen una funcin esencial en sistema inmunolgico. En individuos infectados con VIH hay una disminucin de la subpoblaciones de linfocitos T, lo cual lleva al paciente a ser susceptible a infecciones oportunistas y ciertos cnceres. La principal ruta de infeccin es contacto sexual, exposicin a sangre o productos sanguneos contaminados y transmisin mam- recin nacido. El VIH consiste en un virus con una cpside y envoltura que protegen a una molcula de RNA. La envoltura es el blanco para respuesta inmunolgica humoral. La presencia del virus en los pacientes provoca que el sistema inmunolgico produzca anticuerpos. La deteccin de estos anticuerpos puede ser usada como una herramienta diagnostica. Hay varios sistemas que actualmente estn disponibles para la deteccin de VIH-1 y VIH-2 como lo son ELISA, Western Blot, inmunocromatografa, PCR, etc.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA Emplea una combinacin nica de anticuerpos especficos unidos a protenas los cuales estn conjugados a oro coloidal unido a partculas antignicas VIH-1/2 las cuales se encuentran unidas a una fase slida membranosa. La muestra sangunea es aplicada en sitio indicado junto con el buffer de corrida el cual facilita el flujo de la muestra y promueve la unin de los anticuerpos al antgeno. La mezcla muestra/buffer migra a lo largo de la tira de prueba por accin capilar reconstituyendo el conjugado. Si estn presentes los anticuerpos se unen al conjugado de oro coloidal. En una muestra reactiva el complejo conjugado-anticuerpo migra en la membrana y es capturado por los antgenos inmovilizados en la prueba produciendo una lnea rosa o roja. La muestra continua migrando y produce una lnea rosa o roja en el rea del control que contiene antgeno IgG. Equipo, materiales y sustancias Cantidad Equipo, materiales y sustancias * Equipo de venopuncin * Tubos amarillo para recoleccin

* * * * 1

sangunea Centrfuga Pipetas de transferencia Tira de prueba Buffer de corrida Cronmetro

Metodologa 1. Tomar una muestra de sangre venosa. 2. Separar el suero. 3. Sacar del empaque la prueba rpida. 4. Coloca 5l de muestra en el pozo indicado para la muestra. 5. Aadir 3 gotas de buffer lentamente y de forma vertical en el pozo donde se coloca la muestra. 6. Leer los resultados entre 15-20 minutos despus de aadir el buffer de corrida.

RESULTADOS Una lnea rosa o roja en el rea del control sin ninguna lnea en rea de la muestra indica un resultado negativo, lo cual indica que no se detectaron anticuerpos anti VIH-1/2. Dos lneas rosas o rojas, una en el rea del control y otra en el rea de la muestra indica un resultado positivo. La lnea en el rea del control siempre debe aparecer de no ser as la prueba es invlida.
Tiempo estimado de la prctica: 45 a 60 min Disposicin de RPBI: Recipiente de color rojo, bolsa roja material y equipo en contacto con residuos infecto contagiosos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata,

Resultados

Interpretacin de Resultados y Conclusiones

Bibliografa: Manual de prcticas de Laboratorio de Inmunologa / M.C. Ana Bertha Torres Reyes, M.C. Roco Infante Ramrez.

Prctica No. 22

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE IgE EN SUERO HUMANO POR ELISA.


INTRODUCCIN Los pacientes con enfermedades alrgicas atpicas tales como el asma atpico, dermatitis atpica y fiebre de heno, han demostrado exhibir incremento en los niveles de IgE totales en sangre, en general estos Ac IgE indican una probabilidad incrementada de hipersensibilidad mediada porIgE, responsables de reacciones alrgica. Las infestaciones parasitarias tales como la uncinaria y ciertos desrdenes clnicos como la aspergilosis, han demostrado elevaciones importantes de IgE. Por otro lado, los niveles disminuidos de IgE son encontrados en casos de hipogamaglobulinemia, enfermedades autoinmunes, colitis ulcerativa, hepatitis, cncer y malaria. Los niveles de IgE en el suero pueden tener un valor diagnstico para evaluar el riesgo de condiciones alrgicas futuras en nios.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA. El mtodo de ELISA utiliza un Ac anti-IgE monoclonal que reviste de la fase slida (pozos de microvaloracin) y un Ac anti-IgE de cabra en la solucin de conjugado de enzima-Ac (peroxidasa de rbano picante). La muestra de suero es agregada a los pozos revestidos de Ac e incubados con un buffer cero a temperatura ambiente por 30 min. Si hay IgE presente se combinar con el Ac unido al pozo. Despus el pozo es lavado para remover cualquier muestra de prueba residual y posteriormente se agrega un Ac conjugado con peroxidasa de rbano. Este conjugado se unir a la IgE de la muestra (causando que la IgE de la muestra problema quede entre la fase slida y los anticuerpos del conjugado). Despus se incuba por 30 min a temperatura ambiente, se lavan los pozos con agua para remover los Ac no unidos. Se agrega unasolucin de H O /TMB y se incuba por 20 min ms, provocando el
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desarrollo de un color azul. La reaccin es detenida con la adicin de HCl 3N cambiando el color azul a amarillo que es medido espectrofotomtricamente a 450nm. LA CONCENTRACIN DE IgE ES DIRECTAMENTE PROPORCIONAL A LA INTENSIDAD DEL COLOR DE LA MUESTRA. La cantidad mnima detectada en este ensayo es de 6 UI/ml. REACTIVOS Placa de microvaloracin revestida de Anti -IgE monoclonal Buffer Cero

Conjugado de Anti-IgE-enzima Estndares de referencia de 0,10,15,50,100,500 y 8 00 UI/ml Cromgeno (reactivo de color) A Cromgeno (reactivo de color) B Solucin de frenado (HCl 3N)

MATERIAL REQUERIDO ADICIONAL Pipetas de precisin y puntas de 0.02, 0.01 0.2 y 1000l Agua destilada Tubos de ensaye o matraces para mezclar soluciones de reactivos de color A y B Mezclador vrtice Papel absorbente Lector de ELISA a 450 nm Papel cuadriculado

MUESTRAS Suero humano total. PROCEDIMIENTO 1. PREPARACIN DE REACTIVOS. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente. 2. PROCEDIMIENTO PARA EL ENSAYO. 1. Elija el nmero necesario de pozos de acuerdo al diseo requerido. (Todas las muestras de estndares y problemas se montan por duplicado) 2. Vierta 20 l de estndares, y especmenes en los pozos. 3. Agregue 100 l de Buffer cero en cada pozo. 4. Mezcle completamente por 10 segundos. 5. Incube a temperatura ambiente por 30 min 6. Lavar 2 veces los pozos con agua destilada en lavador automtico .Si no tiene disponible el lavador automtico: Retire el contenido de cada pozo en un recipiente para desechos biolgico lquidos, lave con agua destilada o desionizada depositando 200 ul y aspirando totalmente el lquido y seque volteando la placa sobre papel absorbente hasta eliminar todas las gotas residuales. 7. Vierta 150 ul de reactivo de conjugado en cada pozo . Mezcle por 10 seg. 8. Incube a temperatura ambiente por 30 min. 9. Para preparar la solucin de H O /TMB. Hacer una mezcla 1:1 de reactivo de
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color A y Reactivo de color B 15 minutosantes de su uso. Mezclar bien para asegurar homogeneidad. Puede prepararse inclusive 1 hora antes, ya que es estable hasta 3 horas. 10. Lavar 5 veces los pozos con agua destilada en lavador automtico.

11. Vierta 200 l de solucin H O /TMB en cada pozo y mezcle por 5 segundos.
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12. Incube a temperatura ambiente por 20 min. EN OBSCURIDAD. 13. Frene la reaccin con 50 l de solucin de frenado a cada pozo y mezcle por 30 segundos o hasta asegurarse que todo el color amarillo cambie a azul. 14. Lea Absorbancia a 450 nm en un lector de placas de ELISA.

CALCULOS DE RESULTADOS. 1. Calcule los valores de absorbancia promedio de todos los estndares y muestras problemas. 2. Elabore una curva estndar, graficando Absorbancia contra concentracin de los estndares utilizados. 3. Utilice el valor de absorbancia media de cada muestra problema para determinar la concentracin correspondiente de IgE en UI/ml desde la curva estndar.

VALORES DE REFERENCIA. Adultos libres de proceso alrgicos. Los niveles de IgE deben ser menores de 100 UI/ml. Tiempo estimado de la prctica: 3 hrs Disposicin de RPBI: Los residuos generados durante el desarrollo de la prctica son eliminados en un recipiente hermtico rojo, donde permanecen en congelacin hasta el momento de su recoleccin. Resultados

Bibliografa: Zetterstrom and Johansson S.G.O. Allergy 1981; 36:537 Buckley R.H. Immunopharmacology of Allergic Disease 1979; 117 Michel F.B., Bousquet J. and Greilier P. J. Allergy Clin.Immunol.1980; 64:422.

Prctica No. 23

Determinacin de Rotavirus por inmunocromatografa


Objetivo
Realizar una deteccin cualitativa de Rotavirus en muestras de Heces

Introduccin
SIGNIFICADO CLNICO Rotavirus es la causa ms frecuente de gastroenteritis en nios y jvenes, tambin se ha observado en adultos. Este virus se transmite por contacto feco-oral. Los principales sntomas de esta gastroenteritis vrica son diarrea acuosa y vmitos. Tambin puede presentarse con dolores de cabeza, fiebre y dolor de estmago. Por lo general los sntomas comienzan 1 2 das despus de infectarse y pueden durar 3 das. PRINCIPIO DEL MTODO Este es un inmunoensayocromatogrfico. Durante la prueba, la muestra reacciona con los conjugados coloreados (anticuerpos monoclonales de ratn anti-rotavirus-microesferas rojas) previamente secados en el test. Este complejo avanza por capilaridad a travs de la membrana del test. Para dar el resultado como positivo, una lnea de color ROJO aparecer en la zona de resultados de la membrana. La ausencia de esta lnea sugiere un resultado negativo. Independientemente de que haya presencia o no de Rotavirus, la mezcla de conjugado va avanzando por la membrana hasta la regin de control donde se han inmovilizado anticuerpos y siempre aparecer una lnea de color VERDE (lnea de control). La aparicin de esta lnea se utiliza: 1) para verificar que se ha aadido el volumen de muestra suficiente y 2) que el flujo ha sido el apropiado; y 3) como control interno de los reactivos.

MTODO
TOMA DE MUESTRA Tomar suficiente cantidad de muestra de heces (1-2 g o mL para muestras lquidas). Las muestras de heces deberan ser almacenadas en un recipiente limpio y seco (sin conservantes o medios de transporte). Las muestras se pueden conservar, hasta el momento de utilizarlas, 1 2 das a 2-4 C. Para conservar las muestras durante un tiempo prolongado, como mximo 1 ao, deben mantenerse congeladas a 20C. La muestra debe descongelarse totalmente y alcanzar la temperatura ambiente para poder utilizarla en la prueba. Preparacin de la muestra - Con ayuda del palito se toma una muestra de las heces recogidas. Para ello se pasa el palito por la muestra recogiendo una pequea cantidad de heces. - Se introduce el palito en el tampn de extraccin, para dilucin de la muestra, cerrando el tubo.

- Agitar para facilitar la dispersin de la muestra. - Para muestras lquidas, utilice una pipeta y aada 100 L en el vial para muestra con diluyente. PRECAUCIONES 1. Se deben seguir las instrucciones incluidas en el kit para obtener resultados fiables. 2. No usar tests caducados. 3. Tomar las precauciones necesarias durante la toma de muestra y su manipulacin; Tratar muestra y material de ensayo como potencialmente infeccioso. 4. Para cada muestra, utilizar una pipeta desechable y una placa. No reutilizar la pipeta ni la placa. 5. Los tests usados deben ser gestionados como residuos sanitarios (contenedor de residuos sanitarios). PROCEDIMIENTO 1. Atemperar (15-30C) la muestra y los otros materiales necesarios para el test, incluidos los dispositivos, antes realizar el ensayo. 2. Para cada muestra o control se debe usar un tubo de dilucin de la muestra y un dispositivo diferente. Identificar cada uno con los datos de la muestra. 3. Agitar el tubo de dilucin de la muestra para asegurar una buena dispersin. 4. Romper el extremo superior del tubo (4). 5. Extraer el dispositivo de reaccin de su envase para utilizarlo inmediatamente. 6. Depositar 5 gotas o 150 L del lquido de extraccin en la ventana circular del dispositivo marcada con una flecha o una S, evitando aadir partculas slidas con el lquido (5). Si se da el caso de que el test no funciona debido a la presencia de partculas slidas en la ventana circular, retirarlas y aadir una gota de tampn hasta que se vea avanzar al lquido (zona de reaccin y de control). 7. Leer el resultado del test a los 10 minutos tras la adicin de la muestra.

INTERPRETACIN NEGATIVO: Una sola lnea de color VERDE aparece en la ventana central del dispositivo de reaccin, en la zona marcada con la letra C (lnea de control). POSITIVO: Adems de la lnea de control VERDE, tambin aparece una lnea ROJA (lnea de resultado) en la zona marcada con la letra T (zona de resultado). INVLIDO: Cuando la lnea de control (VERDE) no aparece independientemente de que aparezca o no la lnea de resultado (ROJA). Las causas ms comunes por las que puede aparecer un resultado invlido son: una cantidad insuficiente de muestra, una forma de proceder incorrecta o un deterioro de los reactivos. Si ocurriera esto, debe revisarse el procedimiento y repetir la prueba con un nuevo dispositivo de reaccin. Si persistiese el problema, debe contactar con su proveedor y dejar de utilizar la prueba. Notas La intensidad de la lnea roja en la zona de resultado puede variar dependiendo de la concentracin de antgenos presentes en la muestra. Sin embargo, esta prueba es cualitativa por lo que, ni la cantidad ni la tasa de aumento de antgenos puede ser determinada por la misma. CONTROL DE CALIDAD Control de Calidad interno El test contiene un control de calidad interno, la lnea verde que aparece en la zona de control (C). La presencia de esta lnea indica que se ha usado un volumen correcto de muestra y el procedimiento seguido ha sido el adecuado. La claridad del fondo de la ventana es tambin un control interno. Si el test funciona correctamente, este fondo estar claro y no interferir con la lectura del resultado. Control de Calidad externo Se recomiendan controles externos, positivos y negativos, para controlar el desarrollo del ensayo. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO 1. El test es slo para diagnstico in vitro profesional. 2. Una vez abierto, el dispositivo no debe usarse despus de 2 horas. 3. Un exceso de muestra puede dar resultados negativos, dando lneas no muy definidas de color pardo que no tienen ningn valor diagnstico. Diluir la muestra en ms tampn y repetir el ensayo. 4. Despus de una semana de infeccin la presencia de virus eliminados en heces disminuye considerablemente por lo que es probable una menor concentracin en la muestra. Se debe tomar la muestra de heces dentro de la primera semana de aparicin de los sntomas. 5. Esta prueba diagnostica una posible infeccin de Rotavirus, situacin que debe confirmarse por un especialista o mdico cualificado, teniendo en cuenta las pruebas clnicas y de laboratorio evaluadas. VALORES PREVISTOS Se esperan resultados negativos en nios y jvenes sanos, as como en adultos libres de infeccin. CARACTERSTICAS DEL MTODO Se han realizado estudios y evaluaciones para comparar la eficacia del test. El Spin-Rotavirus Test se evalu en paralelo con un test rpido del mercado para deteccin de Rotavirus.

Sensibilidad La deteccin de Rotavirus presenta un 100% de concordancia en sensibilidad. Especificidad La deteccin de Rotavirus presenta un 98% de concordancia en especificidad. El uso de anticuerpos monoclonales de ratn en el diseo del Spin-Rotavirus asegura un alto grado de especificidad para la deteccin de rotavirus. BIBLIOGRAFA 1. CUKOR G., and BLACKLOW N. R., Human Viral Gastroenteritis, Microbiological Reviews, Vol. 48 No 2, June 1984, pp. 157-179 2. ESTES, M. K. and COHEN, J.; Rotavirus Gene Structure and Function, Microbiological Reviews, Vol. 53 No 4, Dec. 1989, pp. 410-449 3. PAI C. H., SHAHRABADI M. S., and INCE B., Rapid Diagnosis of Rotavirus Gastroenteritis by a Commercial Latex Agglutination Test, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 22 No 5, Nov. 1985, pp. 846-850 4. CUKOR, G.,PERRON, D.M., and BLACKLOW, N. R.: Detection of Rotavirus in Human Stools by Using Monoclonal Antibody, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 19, 888-892

Prctica No. 24

DETERMINACIN DE ANTICUERPOS IgM ANTI Rubola POR EL MTODO DE ELISA


Objetivo General Utilizar el mtodo de ELISA para determinar anticuerpos tipo IgM contra el virus de rubola Aprender el uso correcto del lector de ELISA BenchmarkMicroplate, para realizar una correcta interpretacin de los resultados.

Introduccin: La Rubola es una enfermedad viral contagiosa con distribucin mundial, tambin llamada sarampin alemn o sarampin de 3 das. La infeccin por Rubola es predominantemente una enfermedad que afecta nios y ancianos. Sus manifestaciones clnicas incluyen fiebres, dolores de cabeza y erupcin en la piel. Esta infeccin durante el embarazo es ms peligrosa ya que puede causar malformaciones, cataratas, retraso mental e incluso la muerte del feto. La demostracin de anticuerpos IgG anti- rubola en mujeres en edad frtil es til para proteger al feto de posibles infecciones virales con Rubola durante el embarazo. PRINCIPIO DE LA PRUEBA Esta tcnica es un anlisis inmunoenzimtico en fase slida llamado Mtodo ELISA indirecto. Los AcsIgM anti- Rubela presentes en la muestra se ligan al Ag fijado en los pocillos de la placa. Posteriormente el Ac marcado se liga a las IgM sricas que han reaccionado con el Ag de Rubela, la presencia del complejo inmune (Ag de RubelaIgG sricas anti- Rubela conjugado anti-IgG) se revela mediante la adicin de una solucin de revelado enzimtico en cada pocillo. La reaccin enzimtica se para con la adicin de H SO 4N; la densidad ptica a 492/620 nm es
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proporcional a la IgM anti- Rubela. Cuando estn presentes Ac sricos de la clase IgM, se combinan con el Ag del virus del rubela adheridos a los micropozos de poliestireno. El suero residual es removido por lavado y se adiciona el conjugado de peroxidasa con Anti-IgM humana. Los micropozos son lavados y se adiciona entonces un sistema de sustrato incoloro de tetrametilbencidina/perxido de hidrgeno (TMB/H O ). El
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sustrato es hidrolizado por la enzima y el cromgeno cambia a color azul. Despus de detener la reaccin con cido, el TMB cambia a amarillo, donde la intensidad del color es directamente proporcional a la concentracin de Ac IgM del virus del rubela en la muestra problema.

REACTIVOS 1. Tiras microelisas: Depsitos cubiertos de antgeno Rubela purificados 2. Solucin absorbente. Tapa negra 3. Concentrado de lavado 10X. Tapa blanca 4. TMB sustrato. Botella mbar 5. Solucin C: Conjugado de enzima 6. calibrador Cutt-Off (parmetro) ndice Rubela= 1.0. Tapa amarilla 7. Control negativo. Tapa color natural 8. Control Positivo. Tapa roja 9. Solucin de paro; HCl 2N. Metodologa 1. Preparar la solucin de lavado 1X. (100 ml de solucin + 900 ml de agua destilada). 2. Utilizando una navaja, corte el nmero deseado de tiras cubiertas, desprenda la cinta protectora, asegure la tira en el soporte. 3. Preparar una dilucin 1:40 de control negativo, control positivo, calibrador y sueros problema aadiendo 5L de la muestra y 200uL de solucin absorbente. Mezclar bien. 4. vierta 100L de suero diluido, calibrador y controles en los depsitos apropiados. Para el blanco de reactivo, vierta 100L de diluyente de muestra en la posicin A1. Mezcle e incube por 30 minutos a temperatura ambiente. 5. retire el lquido de todos los depsitos y repita el lavado 3 veces con el buffer de lavado. 6. vierta 100L de conjugado de enzima a cada depsito e incube 30 minutos a temperatura ambiente. 7. Retire el conjugado de enzima de todos los depsitos. Repita el lavado 3 veces con el buffer de lavado. 8. Vierta 100L de solucin TMB e incube por 30 minutos a temperatura ambiente. 9. agregue 100L de HCl 2N para detener la reaccin. 10. ASEGRESE QUE NO ESTAN BURBUJAS EN CADA DEPSITO ANTES DE LA LECTURA. 11. Interprete el O.D. (OpticalDensity/Absorbancia) en 450 nm con un lector de microelisas.

CLCULOS: 1. Calcule la media del valor Xc del calibrador duplicado. 2. Calcule la media del control positivo, negativo y muestras duplicados. 3. Calcule el ndice Rubeola M de cada determinacin al dividir los valores de la media de cada muestra entre el valor Xc de la media del calibrador.

Ejemplo: Calibrador de Cut-off (parmetro) ndice Rubola M=1.0 D.O. calibrador cut-off= 0.350, 0.375 Xc= 0.363 D.O. control negativo: 0.162, 0.175 Xn= 0.169 ndice rubola M= 0.169/0.363 = 0.0.46 D.O. control positivo: 1.086, 1.097 Xp= 1.092 ndice Rubola M= 1.092/0.363 = 3.00 D.O. muestra: 1.119, 1.203 Xm= 1.161 ndice Rubola M= 1.161/0.363 = 3.20 INTERPRETACIN Negativo: el ndice Rubela M menor de 0.90 es negativo para el anticuerpo IgM para Rubeola. Errneo: ndice Rubeola M entre 0.91 0.99 es errneo. La muestra debe ser vuelta a procesar. Positivo: ndice rubela M de 1.00 o mayor es positivo para el antiuerpoIgM para Rubelaie indica la probabilidad de infeccin con Rubola presente o reciente. Tiempo estimado de la prctica: 2-3 hrs. Disposicin de RPBI: Los residuos generados durante el desarrollo de la prctica son eliminados en un recipiente hermtico rojo, donde permanecen en congelacin hasta el momento de su recoleccin. MEDIDAS DE SEGURIDAD: 1.- El alumno deber usar, mientras se encuentre trabajando en el laboratorio, bata abrochada, guantes y lentes de proteccin. 2.- Queda estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimentos dentro del laboratorio. 3.- Al terminar, su rea de trabajo deber quedar totalmente limpia. Bibliografa: 1.Measles mumps and rubella. Vaccine use and strategies for elimination of measles, rubella and congenital rubella syndrome and control of mumps: recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR. May 22, 1998 / 47 (RR); 1-57 2.Center for Disease Control. Measles (Los Angeles County, 1988.MMWR. 1989; 38. 3. Patrick r. Murray., george s. Kobayashi,.,michael a. Pfaller., ken s. RosenthalMicrobiologageneralSegunda edicin. 1996

Prctica No. 25

Determinacin de Drogas por Mtodos Rpidos Anfetaminas, Cocana y Marihuana.


Objetivo Determinar la presencia de metabolitos de drogas a travs de mtodos r pidos de inmunocromatografa. Introduccin: Este examen puede emplearse para evaluar posibles sobredosis o envenenamiento por causa accidental o intencional, como cuando existe la necesidad de evaluar el tipo y cantidad de droga legal o ilegal utilizada por una persona. Este examen puede emplearse para determinar la causa de toxicidad aguda por droga, para evaluar la dependencia de la droga y para determinar la presencia de sustancias en el cuerpo (para propsitos mdicos y/o legales). Ver tambin: Primeros auxilios en caso de abuso de drogas. Si el examen se utiliza como exploracin selectiva de drogas existe una cantidad finita de tiempo despus de la ingestin durante la cual se puede detectar la droga o cualquiera de sus metabolitos:
Cocana o2 a 4 das y desde 10 hasta 22

das si el consumo es excesivo Anfetaminas o24 a 48 horas Herona o1 a 2 das Morfina o1 a 2 das Fenciclidina (CFC) o1 a 8 das Alcohol o3 a 10 horas Benzodiazepinas ohasta 6 semanas con alto nivel de Valores normales

consumo Hidromorfona o1 a 2 das Tetrahidrocannabinol (THC) o6 a 11 semanas con consumo excesivo Propoxifeno o6 a 48 horas Metadona o2 a 3 das Codena o1 a 2 das Barbitricos ohasta 6 semanas

Los niveles normales varan de acuerdo a la institucin que realiza el examen. La sangre puede ser examinada para detectar la presencia y niveles (cantidades) de medicamentos. La exploracin selectiva en orina generalmente se reporta como positiva (la sustancia est presente) o negativa (ausente), pero en la orina tambin se puede medir con bastante precisin el nivel de ciertas sustancias. Se detectan niveles teraputicos de medicamentos con o sin receta mdica (ver

medicamento especfico). Normalmente, no se detecta la presencia de alcohol, de medicamentos que requieren receta, que no han sido indicados por el mdico, o de drogas ilegales. Significado de los resultados anormales La presencia de drogas ilegales o drogas no recetadas indica uso ilegal de drogas . Los niveles elevados de alcohol o drogas prescritas pueden indicar intoxicacin y/o sobredosis intencional o accidental. Algunas veces, este examen forma parte de una investigacin de uso o abuso de droga; pueden requerirse consentimientos especiales, manejo y etiquetado de especmenes u otros procedimientos especiales. PRINCIPIO. Se utiliza un inmunoensayo de reconocimiento del Ag (droga) , basado en la deteccin especfica de sta por anticuerpos marcados con oro coloidal que se unen a la misma y por cromatografa migran hacia la parte superior de la tira donde este complejo es reconocido por otro anticuerpo (anti-anticuerpo) desarrollando color, nicamente presentando una marca (PRUEBA POSITIVA) Para una PRUEBA NEGATIVA, el anticuerpo marcado con oro coloidal migra hacia la parte media de la tira unindose a la droga colocada y desarrollando color. El exceso de anticuerpos migra hasta la parte superior y son reconocidos por el complejo previamente mencionado. Metodologa Permitir que la tira y las muestras estn a temperatura ambiente. Antes de realizar la prueba. 1. Sacar la tira reactiva de su empaque y utilizarla lo ms pronto posible. Retirar la tapa plstica de la parte inferior de la tira. 2. Sumerja la tira en la orina de manera vertical (flechas apuntando hacia la muestra de orina) por al menos 10 segundos. Sumergir la tira por lo menos al nivel de las lneas onduladas pero no por encima de las flechas de la tarjeta de prueba. 3. Coloque la tapa y mantenga la tarjeta de prueba en una superficie no absorbente. Leer resultados a los 5 minutos. Interpretacin de Resultados

Negativo

Positivo

Invlido

Disposicin de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de ltex, bata.

Bibliografa: Hawks RL, CN Chain. Urine Testing for Drugs of Abuse.National Institute for Drug Abuse (NIDA), Research Monograph 73, 1986. Baselt RC. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man. 6 th Ed. Biomediccal Publ., Foster City.CA. 2002.

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