PRUEBAS DE SENSIBILIDAD POR DILUCIN.

Los mtodos de dilucin se consideran de referencia para la determinacin cuantitativa de la actividad de los antimicrobianos La prueba por dilucin en caldo se divide en dos categoras: macrodilucin y microdilucin. En la prueba por microdilucin el volumen total de caldo es de 0,05 a 0,1ml y para la prueba por macrodilucin los volmenes habituales del caldo son de 1,0ml o ms. Debido a que la mayora de las bacterias para las pruebas de sensibilidad requieren probar varios antibiticos a varias concentraciones diferentes, el menor volumen usado con la microdilucin permite hacer convenientemente la prueba en una sola placa de microtitulacin. (1)

ANTIBIOGRAMA POR MACRODILUCIN EN CALDO La prueba de sensibilidad en caldo por macrodilucin fue una de las primeras en ser desarrolladas y sigue sirviendo como mtodo de referencia. MTODO 1. Se realizan varias diluciones del antibitico en caldo, despus de lo cual se agrega una suspensin bacteriana estandarizada. 2. Se prepara una serie de 10 tubos de ensayo que contienen caldo de Mueller-Hinton con suplemento de cationes. 3. Se diluyen en forma seriada distintas cantidades del antibitico desde 100 pg/mL hasta 0,4 pg/mL. El tubo nmero 10 no tiene el antibitico y se utiliza como control del crecimiento. 4. Se inocula cada uno de los 10 tubos con una suspensin calibrada del microorganismo por evaluar y se lo incuba a 35 durante 18 horas 5. Al final del perodo de incubacin, se examinan visualmente los tubos para detectar turbidez. La turbidez indica que el crecimiento bacteriano no ha sido inhibido por la concentracin del antibitico contenido en el medio.

6. La concentracin inhibitoria mnima de cada antibitico se lleva a una tabla que seala si el microorganismo es sensible o resistente; es decir, si la CIM del antibitico es inferior o superior a la plasmtica.

Figura 1: Se observa que los cinco tubos de la izquierda estn claros y los cinco de la derecha aparecen turbios.

Figura 2: Se muestra que el valor crtico de inhibicin del crecimiento de la figura 1 se encuentra
entre los tubos 5 y 6, o entre 6.25 pg/mL y 3,12 pg/mL del antibitico. Este valor crtico representa la CIM, definida como la concentracin ms baja del antibitico en microgramos por mililitro que impide el crecimiento in vitro de bacterias que en este caso es de 6.25 pg/mL.

ANTIBIOGRAMA POR MACRODILUCIN EN AGAR

El procedimiento por dilucin en agar, que es el segundo mtodo de referencia, ha sido adaptado con xito para el uso de rutina en laboratorios grandes y evala slo concentraciones seleccionadas del antibitico.
MTODO

Se inocula una suspensin estandarizada de bacterias en una serie de placas de agar, cada una de las cuales contiene una concentracin diferente del antibitico, que abarca el intervalo teraputico del frmaco. Por ejemplo, si el intervalo teraputico para un antibitico dado es 2 a 12 g/mL, se podra utilizar una serie de placas de agar que contuvieran 4, 8, 16 y g/mL del antibitico para determinar la sensibilidad del microorganismo que se va a evaluar. Si el microorganismo crece en las tres primeras placas, pero no en la placa que contiene 16 g/ml del antibitico, se puede establecer un valor de CIM de 16 g/mL, similar a la interpretacin del parmetro en la tcnica por dilucin en caldo. Esta tcnica, al permitir sembrar vanas cepas (20-40) por placa, facilita el estudio simultneo de la CIM de un gran nmero de cepas a un antimicrobiano.

Figura 3: Se muestran placas de dilucin en agar listas para su interpretacin. Se observa que los microorganismos que son sensibles a la concentracin del antibitico contenido en cualquier placa de agar dada no producen un crculo de crecimiento en el sitio del inculo, mientras que aquellas que son resistentes aparecen como colonias circulares. Las placas de agar se marcan con una cuadrcula para que cada microorganismo pueda ser identificado con un nmero y los resultados ingresados en la hoja de trabajo.

Fig. 4: Replicador Steers Para facilitar el examen de gran cantidad de cultivos, se utiliza un instrumento conocido como replicador Steers. (3)

MICRODILUCIN La tcnica de microdilucin en caldo es de gran utilidad prctica para el estudio de las CIM. No es ms que la tcnica de dilucin en medio lquido, sealada anteriormente, pero realizada en placas de poliestireno, con micropocillos en lugar de tubos. Existen comercializados diversos paneles con varias columnas de pocillos, cada una con diferentes antimicrobianos. Los pocillos de cada columna contienen concentraciones crecientes de un antibitico en forma de suspensin liofilizada o desecada, por lo que slo debe aadirse el medio de cultivo lquido en el que se ha efectuado una suspensin de la bacteria a estudiar (generalmente alrededor de 200 g de medio por pocillo).Tras la incubacin, se determina la CIM. Como en la macrodilucin, la concentracin inhibitoria mnima de cada antibitico se lleva a una tabla que seala si el microorganismo es sensible o resistente; es decir, si la CIM del antibitico es inferior o superior a la plasmtica. Un antibitico se considera adecuado para tratar una infeccin causada por una bacteria cuando, administrado en dosis teraputicas (es decir, no txicas), alcanza en el foco de infeccin concentraciones cuatro o ms veces superiores a la CIM.

Figura 5: Paneles comercializados que permiten detectar la concentracin inhibitoria mnima por tcnica de microdilucin en caldo. Los pocillos de cada columna contienen, de arriba a abajo, concentraciones decrecientes de antibiticos (cada columna corresponde a un antibitico diferente). Puede observarse el crecimiento y la inhibicin en los diferentes

pocillos La concentracin inhibitoria mnima para cada columna de antimicrobiano es la del pocillo con menor cantidad de antibitico que inhibe a la bacteria. (2)

BIBLIOGRAFA

1. Bailey Scoot; DIAGNOSTICO MICROBIOLGICO; Doceava Edicin; Consultado en el sitio web: http://books.google.com.ec/books?id=239cauKqSt0C&pg=PA191&dq=microdiluci %C3%B3n+en+caldo&hl=es419&sa=X&ei=VQSjUJPUJLGu0AG564C4DA&ved=0CCsQ6wEwAA#v=onepage&q=m icrodiluci%C3%B3n%20en%20caldo&f=false 2. Koneman; DIAGNOSTICO MICROBIOLGICO; Sexta Edicin; Consultado en el sitio web: http://books.google.com.ec/books?id=jyVQueKro88C&pg=RA1PA30&lpg=PP1&dq=koneman+diagnostico+microbiologico 3. Prats, Guillermo; MICROBIOLOGA CLNICA; Consultado en el sito web: http://books.google.com.ec/books?id=TdsoWPEYaoUC&pg=PA49&dq=microdiluci %C3%B3n+en+caldo&hl=es-419&sa=X&ei=tgijUPumJ4t0AG_iID4Dw&ved=0CDUQ6wEwAg#v=onepage&q=microdiluci%C3%B3n%20en%2 0caldo&f=false