Unidad4 Libro

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL UNIDAD IV BIOCINTICA 4.
1 FASES DEL CRECIMIENTO CELULAR El crecimiento puede ser definido como el aumento ordenado de todos los componentes qumicos. El aumento de masa, por si solo, podra no indicar un crecimiento real, ya que las clulas pueden estar incrementando nicamente su contenido de productos de reserva, tales como el glucgeno, o el poli-B-hidroxibutirato. (40) En un medio adecuado, al cual se han adaptado perfectamente, las bacterias se encuentran en un estado de crecimiento equilibrado. Durante un periodo de crecimiento equilibrado, una duplicacin de biomasa va acompaada de una duplicacin de todas las dems propiedades medibles de la poblacin como por ejemplo, protenas, ARN, ADN y agua intracelular. Los cultivos en crecimiento equilibrado mantienen una composicin qumica constante. (40) Se dice que una poblacin de bacterias se encuentra en una fase exponencial de crecimiento, cuando la velocidad de aumento de bacterias en un tiempo dado es proporcional al nmero masa de bacterias presentes en ese tiempo, relacionndose aqu la velocidad de incremento de cualquier componente celular. Esta fase describe adecuadamente el crecimiento de la mayora de los cultivos de bacterias unicelulares. Aunque las clulas alteran el medio debido a la toma de sustratos y la secrecin de productos metablicos, la velocidad de crecimiento permanece constante durante la fase logartmica. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentracin de sustrato en tanto que exista exceso de sustrato. Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial a altas velocidades durante largo tiempo. La razn es obvia si se considera que las consecuencias del crecimiento exponencial caen en un aumento exagerado de bacterias en el medio. (40) El crecimiento de las poblaciones bacterianas est limitado normalmente por el agotamiento de los nutrientes disponibles bien por la acumulacin de productos txicos del metabolismo. Como consecuencia, la velocidad de crecimiento disminuye y el crecimiento llega a detenerse. En este punto se dice que el cultivo esta en fase estacionaria. (40) La transicin entre la fase exponencial y la estacionaria implica un periodo de crecimiento desequilibrado, durante el cual los diversos componentes celulares son sintetizados a diferentes velocidades. En consecuencia, ambos tipos de clulas tienen una composicin qumica diferente; las clulas en la fase estacionaria son ms pequeas que en la fase exponencial (dado que la divisin celular continua despus de que se ha detenido el crecimiento en masa), y son ms resistentes a los agentes fsicos (calor, fro, radiaciones) y qumicos diversos. (40) Las clulas bacterianas mantenidas en un estado en el que no hay crecimiento llegan a morir. La muerte es consecuencia de diversos factores; uno importante es el agotamiento de las reservas celulares de energa. (40) La fase de muerte viene representada por una disminucin lineal en el nmero de clulas viables a lo largo del tiempo. La velocidad de muerte de las bacterias es muy variable, y depende tanto del ambiente, como del organismo en concreto. (40) UNIDAD IV BIOCINTICA 74
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Las clulas transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio fresco de igual composicin experimentan un cambio de composicin qumica antes de ser capaces de iniciar crecimiento. A este periodo de ajuste se le denomina fase de latencia y tiene una duracin muy variable relacionada directamente con la fase estacionaria precedente. (40)
II
III
IV
VI
VII
Log de nmero de bacterias
Tiempo en horas
Figura 80 Curva del crecimiento de bacterias segn Buchanan; la fase I representa al inicio, la II representa a la fase lag o de aceleracin positiva, el III representa al crecimiento logartmico, el IV representa a la fase de aceleracin negativa; el V va de acuerdo a la fase estacionaria; VI se refiere a la mortalidad creciente; y , por ltimo, el VII (40) representa la muerte logartmica.
Figura 81 Variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un sustrato cuya concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de (40) la biomasa.
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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 4.2 MTODOS PARA MEDIR EL CRECIMIENTO CELULAR
Medicin de masa celular Es necesario efectuar mediciones cuantitativas, el crecimiento exponencial es por lo general equilibrado, de modo que para determinar la velocidad de crecimiento, puede utilizarse la medicin de cualquier propiedad de la biomasa, por comodidad las propiedades medidas son habitualmente la masa celular o el nmero de clulas. (25) La nica manera directa de medir la masa celular es determinar el peso seco del material celular en un volumen fijo de cultivo, hay que separar las clulas del medio, secarlas, pesarlas; requiere mucho tiempo y es poco sensible. Con un equipamiento ordinario es difcil pesar con exactitud. (25) La tcnica ms adecuada es medir la masa celular de los microorganismos celulares en un mtodo ptico, consistente en la determinacin de la cantidad de luz difractada por una suspensin de clulas. Se basa en el hecho de que las partculas pequeas difractan la luz de manera proporcional, dentro de diversos lmites a su concentracin. Cuando un haz luminoso pasa a travs de una suspensin bacteriana, la reduccin en la cantidad de luz transmitida como consecuencia de la difraccin es una medida de la densidad celular, esto se hace con un espectrofotmetro que se calibra con suspensiones bacterianas de densidad conocida. Constituye un mtodo exacto y rpido de estimar el peso seco de las bacterias por unidad de volumen de cultivo. (25) Se usa conjuntamente con una curva estndar, dado que la difraccin es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda de la luz que se difracta, la sensibilidad de las mediciones incrementa bruscamente si se utiliza luz de longitud de onda ms corta; en general el lmite inferior de sensibilidad del mtodo se alcanza cuando las suspensiones bacterianas contienen unos 10 millones de clulas por mililitro. Para medir con mayor sensibilidad puede usarse un nefelmetro. (25)
Fig.82 Cmara de recuento.
Medicin del nmero de clulas El nmero de organismos unicelulares de una suspensin puede determinarse microscpicamente contando las clulas individuales que hay en un volumen muy pequeo. (25)
La operacin se lleva a cabo en portaobjetos especiales denominados cmaras de recuento (Fig.82) , que van marcados con cuadros de rea conocida, esto permite conocer exactamente el volumen de lquido correspondiente a cada cuadro. El cmputo directo se denomina recuento total de clulas, que incluye tanto clulas viables como las no viables, no se pueden distinguir unas de otras. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Se deben utilizar suspensiones celulares relativamente concentradas, con cierto grado de exactitud slo pueden contarse las suspensiones que contienen 10 o ms millones de clulas por mililitro. (25) Puede utilizarse tambin el instrumento electrnico llamado contador Coulter (Fig.83), que consiste en hacer pasar una alcuota de la suspensin al interior de un tubo de vidrio a travs de un orificio muy pequeo, este orificio cierra un circuito elctrico establecido a travs del lquido de suspensin entre un electrodo del interior y otro del exterior. (25)
Fig. 83 Contador Coulter.
Fig. 84 Esquema de un contador electrnico.
La deteccin se basa en diferencias de conductividad entre la bacteria y el lquido de suspensin. La conductividad disminuye cada vez que una bacteria pasa a travs del orificio, esto es detectado y registrado electrnicamente, el lquido de suspensin debe estar escrupulosamente limpio ya que otras partculas obstruiran el orificio (Fig.84). (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Tambin puede realizarse por recuento en placa, por dispersin sobre o dentro de un medio de agar, dan lugar al crecer de colonias visibles microscpicamente, si se preparan diluciones apropiadas de una poblacin bacteriana y se siembran en un medio conveniente, puede calcularse el nmero de clulas viables contando el nmero de colonias que se desarrolla despus de incubar las placas y multiplicadas por el factor de dilucin, este mtodo se denomina a menudo recuento viable, ya que en contraste con el recuento microscpico directo y el electrnico, mide slo aquellas clulas que son capaces de crecer en un medio slido empleado. (25) El recuento viable es ms sencillo para la determinacin del nmero de bacterias, pues permite incluso detectar una sola clula viable. Es importante tener en cuenta que el nmero de bacterias contina aumentando durante el proceso de dilucin y que el crecimiento celular no puede detenerse sin afectar la viabilidad, puede utilizarse una combinacin de recuentos total y viable. (25) Cintica del crecimiento de microorganismos Se necesita un entendimiento claro de la cintica del crecimiento microbiano cuando se desea manejar adecuadamente un proceso a gran escala. La cintica de crecimiento se trata en forma diferente para los procesos discontinuos que para los procesos continuos. (25) Fig. 85
ELEMENTOS DE UN PROCESO BIOTECNOLGICO
DESARROLLO DE INCULO
Biomasa Cultivo
(fluido) SEPARACIN DE CELULAS
Cultivo stock
Biorreactor de siembra
Biorreactor de produccin
Sobrenadante
EXTRACCIN DEL PRODUCTO
ESTERILIZACIN DEL MEDIO
PURIFICACIN FORMULACIN DEL MEDIO EMPAQUE Constituyentes del medio
TRATAMIENTO DE EFLUENTES
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 4.3 FERMENTACIN DISCONTINUA Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada como un sistema cerrado. A tiempo cero la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin; a lo largo no se aade nada excepto oxgeno en forma de aire, un agente antiespumante y cidos y bases para controlar el pH. La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente en forma continua como resultado del metabolismo de las clulas.(8) Se observan cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia, fase logartmica, fase estacionaria y fase de muerte (Fig.86).(8) Las diversas condiciones fsicas que actan sobre los microorganismos intervienen de manera directa sobre el comportamiento y desarrollo de los microorganismos.(8)
Figura 86 Fases de una curva Batch de crecimiento microbiano.
I: Fase estacionaria II: Fase de aceleracin de crecimiento III: Fase de crecimiento exponencial
IV: Fase de desaceleracin V: Fase de meseta VI: Fase declinatoria
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 4.3.1 pH Es bien sabido que la acidez o alcalinidad del medio ejerce notable influencia sobre el desarrollo de los microorganismos. Por una parte la aparicin de reacciones cida-bsica en los cultivos, ayuda a interpretar las actividades fisiolgicas de los microorganismos correspondientes y por otro lado las condiciones de pH del medio de cultivo determinarn el microorganismo que se desarrolle en l. (8) El pH ptimo para el crecimiento de la mayor parte de las bacterias, si de ellas se tratara, se encuentra entre 6.5-7.5. Aunque algunas pueden crecer en los extremos de la escala de pH, la mayora de las especies tiene los lmites mnimo y mximo entre pH 4 y 9. (8) Las desviaciones fuertes de pH pueden impedirse aadiendo al medio un buffer o regulador. Los reguladores (buffers, puffers, tampones amortiguadores) son compuestos, o pares de compuestos, que tienen la propiedad de amortiguar los cambios de pH. El grado en que un medio haya de ser regulado depende del fin con que se utilice, y est limitado por la capacidad amortiguadora de sus componentes. (8) 4.3.2 TEMPERATURA La temperatura junto con el medio gaseoso y el pH son los factores que deben considerarse como ms importantes al establecer las condiciones ptimas para el crecimiento. (8) En el caso de las bacterias estas pueden sobrevivir en limites amplios de temperatura, incluso crecer. A temperatura ptima alcanzan el ritmo mximo de crecimiento, que disminuye por encima o por debajo de este nivel. (8) Las bacterias de acuerdo a su crecimiento en diferentes condiciones de temperatura se dividen en(8): Mesfilas: son las que viven con temperaturas moderadas. Los microorganismos con apetencia por la naturaleza suelen tener ptimos ms bajos con alrededor de 25-30 C. Psicrfilos: prefieren temperaturas bajas, algunos de ellos pueden crecer por debajo de cero grados. Termfilas: prefieren el calor, con temperaturas ptimas de 55-60 C En el caso de las levaduras la temperatura es un factor importante, ya que cada variedad de levadura esporula ptimamente en cierto intervalo de temperatura. Por encima de una temperatura dada y por debajo de otra, la esporulacin no tiene lugar. Las temperaturas ptimas para las seis variedades de Saccharomyces estn entre 25 y 30 C, siendo 25 C la ptima para tres de ellas. Muchos microorganismos se mantienen vivos a bajas temperaturas pero, sobre todo, los virus son particularmente resistentes. (8) Las bajas temperaturas detienen los procesos de putrefaccin y fermentacin. En este principio se basa el empleo de los refrigeradores, las bodegas y las instalaciones frigorficas. En la prctica higinica sanitaria, para la conservacin de los productos alimenticios. nicamente ciertas especies de microorganismos patgenos son muy sensibles a las bajas temperaturas. Estos mueren con bastante rapidez cuando se les somete al enfriamiento, aunque sea poco prolongado. (8)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL A temperaturas bajas tiene lugar un retardo de los procesos metablicos, la muerte de los microorganismos que a causa de envejecimiento e inanicin y la destruccin celular a consecuencia de la formacin de cristales al congelarse. (8) Un efecto mortfero ejerce sobre ellos la accin alterna de bajas y altas temperaturas. Se ha demostrado, por ejemplo que el enfriamiento brusco provoca no menos debilitamiento de la capacidad vital de los microbios patgenos que el calentamiento repentino. Las esporas son por lo general ms resistentes que las formas vegetativas. (8) Las variaciones individuales y especficas, en lo que se refiere a la resistencia de los microorganismos a las temperaturas, puede tener limites muy diferentes y mrgenes bastante amplios. (8) La accin bactericida de las temperaturas elevadas se debe a la debilitacin de la actividad de la catalasa, de las oxidasas y de las deshidrogenasas, de la desnaturalizacin de las protenas y de la perturbacin de la barrera osmtica (Fig.87). (8)
6 5 4
ln
3 2 1 0 0 0.001 0.002 0.003
1/T
0.004
0.005
0.006
Figura 87 de la dependencia de la temperatura en el crecimiento microbiano utilizando la ecuacin de Arrhenius.
4.4 PROCESOS DE FERMENTACIN ALIMENTADA (FED BATCH) En los procesos convencionales discontinuos, todos los sustratos se aaden al principio de la fermentacin, una mejora del proceso cerrado discontinuo es la fermentacin alimentada, que se utiliza en la produccin de sustancias como penicilina. En los procesos alimentados los sustratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la fermentacin. La formacin de muchos metabolitos secundarios est sometida a represin catablica por altas concentraciones de glucosa, por otros carbohidratos o por otros compuestos nitrogenados. Los nutrientes se aaden en pequeas concentraciones al principio de la fermentacin y continan aadindose a pequeas dosis durante la fase de produccin, no es posible medir la concentracin del sustrato directa y continuamente durante la fermentacin a fin de controlar el proceso de fermentacin, tienen que ser medidos parmetros indirectos que estn correlacionados con el metabolismo del sustrato crtico. Por ejemplo, en la produccin de cidos orgnicos, el valor del pH puede ser utilizado para determinar UNIDAD IV BIOCINTICA 81
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL la velocidad de alimentacin de la glucosa. En fermentaciones con valores osmticos crticos la alimentacin puede ser regulada controlando el valor de la presin de oxgeno o el contenido en CO2 de los gases que se liberen.(8)
Fig.88 Crecimiento microbiano.
4.5 FERMENTACIN CONTINUA En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade continuamente al Biorreactor y una cantidad equivalente de los nutrientes, con los microorganismos, se saca simultneamente del sistema.(8) Entre las distintas clases de fermentaciones continuas pueden ser distinguidos dos tipos bsicos:
Biorreactor mezclado homogneamente. Este es utilizado como un quimiostato o como un turbidostato. En el quimiostato el estado de equilibrio, el crecimiento de las clulas se controla ajustando la concentracin de un sustrato. Cualquier sustrato que se requiera (carbohidrato, compuesto nitrogenado, sales, oxgeno) puede ser utilizado como sustrato lmite. En el trbidostato, el crecimiento de las clulas se mantiene constante utilizando la turbidez para controlar la concentracin de biomasa, y la velocidad de alimentacin de la solucin de nutrientes, se ajusta de forma apropiada.(8)
Fig. 89 Biorreactores de mezclado homogneo.
Reactor de flujo de tapn En este tipo de fermentacin continua, la solucin de cultivo fluye a travs de un reactor tubular sin mezclado. La composicin de la solucin de nutrientes, el nmero de clulas, la transferencia de masa (suministro de oxgeno) y la productividad varan en distintas posiciones dentro del sistema.
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL A la entrada del reactor las clulas deben aadirse continuamente junto con la solucin de nutrientes (generalmente como un flujo que revierte de una desviacin desde la salida del fermentador o desde una segunda fermentacin continua).(8) En un proceso continuo en condiciones de equilibrio, la prdida de clulas debida al fluido que sale, debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo.(8) La velocidad de flujo se define, como la velocidad de flujo volumtrico (que entra y sale) a travs del volumen del fermentador. La velocidad ms baja de flujo el sustrato es casi completamente agotado por las clulas, si la velocidad de flujo aumenta, la densidad de las clulas desciende lentamente, al principio en forma lineal y luego cae bruscamente hasta cero.(8) Pequeas desviaciones en alimentacin pueden originar cambios extremos en la biomasa en la separacin de las clulas. La velocidad especifica mxima de crecimiento en los procesos industriales se escoge de forma que se obtenga el rendimiento ms alto en el volumen ms pequeo del fermentador y en el tiempo ms corto.(8) A bajas velocidades de dilucin la proporcin de CO2 se hace ms grande. Esto se debe a que se utiliza ms fuente de energa para el mantenimiento de la estructura celular, para la regulacin osmtica o para la motilidad; a velocidades altas de flujo, una parte de carbono aadido es oxidado incompletamente a productos como pruvato, acetato o cidos tricarboxlicos; se reduce la productividad.(8) A bajas velocidades de flujo, con nitrgeno como sustrato limitante, se forman materiales de reserva como polisacridos, lo que resulta en un aumento en tamao de la clula y por tanto, de la biomasa.(8) En fermentacin continua a velocidad de flujo constante, existen condiciones de estado de equilibrio y no cambian el contenido del sustrato, las reacciones bioqumicas en el interior de las clulas ni la velocidad de formacin del producto. Sin embargo hay diferencias en el metabolismo a una velocidad constante de flujo dependiendo de la limitacin de sustrato.(7) Adems la velocidad de formacin del producto depende de la velocidad de flujo, esto puede aplicarse no solamente en enzimas individuales sino tambin a la secrecin de metabolitos primarios y secundarios. Cuando se separa la idiofase (fase de formacin de producto) de la trofofase (fase de crecimiento), no puede llevarse a cabo continuamente la formacin de producto en un biorreactor mezclado ptimamente; debe hacerse entonces, utilizando una serie de fermentadores en cascada o un reactor de torre, que utiliza cmaras individuales de reaccin, separadas por placas filtrantes.(8) Han sido desarrollados procesos de fermentacin continua para la produccin de protena de origen unicelular, antibiticos, solventes orgnicos, cultivos iniciadores y para la descomposicin de la celulosa.(8) Los procesos industriales que utilizan fermentacin continua incluyen el tratamiento de las aguas residuales as como la produccin de cerveza, glucosa isomerasa y etanol.(8) Los cultivos continuos han resultado tiles para la aplicacin prctica por varias razones(8): UNIDAD IV BIOCINTICA 83
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Operan continuamente durante 20 - 200 horas. Mantienen las condiciones estriles a escala industrial a travs de un largo periodo de tiempo. La composicin de los sustratos es constante a fin de obtener una mxima produccin. Cuando se utilizan cepas de alto rendimiento se producen mutantes degenerados, los cuales pueden crecer en cultivo continuo ms de prisa que las cepas de produccin. Los cultivos continuos tambin encuentran considerable uso en investigacin sobre procesos ecolgicos. El crecimiento a bajos niveles de sustrato en un cultivo continuo, es anlogo al crecimiento a bajos niveles de sustrato en la naturaleza, de forma que el cultivo continuo proporciona excelentes modelos para el anlisis de los procesos ecolgicos.
4.6 CULTIVO POR LOTE En la Microbiologa Industrial siempre resulta conveniente buscar un grado adecuado de rendimiento de nuestra cepa, as como explotar al mximo sus cualidades, esto se logra conociendo enteramente las condiciones ptimas de crecimiento de nuestro cultivo y los nutrientes que le favorecen en este tpico. Tambin resulta de gran ayuda conocer su metabolismo, los productos que la antagonizan o que la potencian en esta labor.(8) 4.7 RENDIMIENTO Y FORMACIN DEL PRODUCTO Coeficiente de rendimiento Monod defini originalmente el coeficiente de rendimiento como la relacin de clulas producidas a sustrato consumido.(8) Hoy los coeficientes generales de rendimiento, se utilizan para caracterizar los procesos de fermentacin, es decir, las relaciones de las clulas producidas a los sustratos individuales convertidos o a las energas liberadas o consumidas. Sin embargo los coeficientes de rendimiento no son constantes ya que dependen de parmetros biolgicos y qumicos. Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos(8): 1. El primer grupo de coeficientes da informacin acerca de los procesos tcnicos y por tanto acerca de la economa. 2. El segundo grupo describe el catabolismo, anfibolismo y anabolismo. 3. El tercer grupo incluye un coeficiente que describe las relaciones de energa de las clulas. Formacin del producto El propio microorganismo puede ser el producto final deseado; por ejemplo, en el proceso ICIPruteen para la produccin de biomasa como protena de origen unicelular. (8)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que est presente intra o extracelularmente. (8) Producto presente intracelularmente (8): cidos nucleicos. Vitaminas. Enzimas. Ciertos antibiticos (Sisomicina o griseofulvina). Productos presente extracelularmente (8) : Aminocidos. cido ctrico. Alcohol. Algunas enzimas (amilasas y proteasas). Antibiticos (penicilina, estreptomicina).
4.8 DISEO DE BIORREACTORES Un biorreactor es un aparato dentro del cual se efectan reacciones biolgicas, comnmente fermentaciones o biotransformaciones.(8) En un biorreactor la produccin de metabolitos debe ser llevada a cabo con el mximo nfasis en la fiabilidad del proceso y un mnimo de inversin de capital y costo de operacin. La fiabilidad es ms difcil de conseguir en un proceso microbiolgico que en uno qumico, de forma que los biorreactores son ms caros de disear y construir.(8) Debe decidirse en las etapas de planificacin si el fermentador va a ser utilizado. Para un proceso especial, con un organismo determinado, o para una variedad de procesos con diferentes microorganismos.(8)
Fig. 90 Tipos de reactores de flujo continuo.
Fig. 91 Reactor con distribucin de gas.
4.8.1 REACTORES FERMENTACIN AEROBIA
PARA
Pueden ser clasificados en 4 grupos con respecto a la distribucin del gas: Distribucin de gas por agitacin La vasija agitada es el biorreactor ms entendido y ms ampliamente utilizado y es bastante flexible.(8) Reactor de bucle con tubos de tiro es tambin apropiado para la (8) produccin de biomasa. En la produccin de vinagre se usa un sistema en el que el aire es aspirado a travs del tubo por la baja presin al abrigo de las paletas del agitador. Los diferentes sistemas de aireacin en superficie utilizados en el tratamiento de las aguas residuales tambin pertenecen a este tipo.(8)
Fig. 92 Reactores con distribucin de gas.
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Bombas de distribucin de gas En un sistema modificado de reactor elevado por aire, la bomba transporta primariamente lquido y el aire se distribuye ms o menos e independientemente a travs del aspersor. En los sistemas ms eficientes existe una mezcla directa de aire y fluido por medio de una bomba de propulsin de agua.(8) Distribucin de gas por medio de aire a presin En la mayor parte de estos sistemas no existen en el rea estril partes mviles. "El fermentador de ciclo de presin" fue el primer modelo de este tipo, utilizado en biotecnologa para la produccin de protena de origen unicelular, a escala industrial.(8) Fase contina de gas (8) En estos procesos el aire circula sobre una pelcula de microorganismos. En el reactor de goteo el organismo crece sobre un material portador slido inerte. En el reactor de superficie flota sobre o en la solucin nutritiva, o crece en un medio de cultivo slido o semislido. En el reactor de rueda con paletas crece sobre paletas mviles y es alternativamente sumergido en la solucin de nutriente. Los reactores utilizados en el tratamiento de aguas residuales y para la produccin de vinagre o cido ctrico, as como los matraces de cultivo. Tipos bsicos de biorreactores para fermentacin aerobia Distribucin de gas por agitacin (8) Fig. 93 Turbina agitadora.
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Fig. 94 Lecho fluidizado.
Fig. 95 Lecho empacado.
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Fig. 96 Lecho de goteo.
Biorreactores agitados Para su uso industrial, especialmente la farmacutica el biorreactor ms verstil es el fermentador aireado con agitacin sencilla. Sin embargo, no es posible construir un sistema nico que cumpla adecuadamente las necesidades de todos los sistemas biolgicos. Los fermentadores para experimentos de laboratorio que requieren volmenes de hasta 20 l se fabrican de vidrio o de acero inoxidable.(8) Corta corrientes (baffles) Los cortacorrientes transfieren la turbulencia hasta las paredes del fermentador. Normalmente se instalan 4 cortacorrientes, si existe algn problema con la disipacin del calor, pueden ser utilizados hasta 12 corta corrientes.(8) Separadores de espuma La formacin de espuma es frecuentemente un problema en los sistemas aireados a gran escala. Los agentes qumicos antiespumantes no pueden siempre ser utilizados para la reduccin de espuma, ya que pueden tener efectos inhibitorios sobre la fermentacin. Existen varios mtodos por los que puede ser destruida la espuma en el rea estril. El aparato ms sencillo tiene rastrillos montados sobre el agitador; actualmente la espuma se destruye mediante fuerza centrifuga dejando el sistema estril.(8) UNIDAD IV BIOCINTICA 89
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Tipos de agitadores El agitador de disco es el tipo ms comn; con 4 a 8 paletas radiales. Comparado con el agitador de disco, el tipo turbina requiere 50% menos de aire para el mismo consumo de energa y rendimiento. 2 tipos ms consisten en brazos agitadores con paletas unidas en ngulo. Comparadas con los 2 mencionados anteriormente, los agitadores MIG e INTERMIG requieren 25% y 40% menos energa respectivamente.(8) Mantenimiento de la esterilidad. Para favorecerlo debe haber un nmero mnimo de aperturas en el fermentador. Las pequeas aberturas deben ser a prueba de prdidas. No debe haber ninguna conexin directa ente el rea estril y el rea no estril, es decir, los mecanismos para toma de muestra y las puertas de inyeccin deben de estar cubiertas de cierres esterilizables a vapor.(8) Reactores para enzimas clulas inmovilizadas Un tipo importante de reacciones biolgicas a gran escala implican la unin del biocatalizador, o enzima a un soporte inerte a travs del cual pasa el sustrato. (8) Estos biorreactores deben ser construidos de forma que el movimiento entre el sustrato y el biocatalizador no sea limitante en el proceso. La transferencia interna de masa puede ser influida solamente por el mtodo por el cual se ha inmovilizado el catalizador, se utilizan 2 tipos bsicos de biorreactores(8):
Fig. 97 Uso de membranas ultrafiltro para separar Enzima sustrato del producto.
Sistemas unidos a partculas. Para los sistemas que utilizan enzimas unidas a partculas se utilizan reactores agitados o que se mezclan mediante bombas si es necesaria una fuerte aireacin o el control cuidadoso del pH, o si el fluido tiene gran viscosidad. Otro enfoque es el uso de un sistema en el que el catalizador esta inmovilizado en un lecho, este se adapta bien a la operacin a gran escala; sin embargo la formacin de gas puede reducir la deficiencia del biorreactor donde es difcil la regulacin de la temperatura y del pH. En los reactores de cicln no es posible la conversin completa de sustrato a producto.(8)
Reactores de membrana/enzima. En ellos la enzima esta unida a una membrana y el sustrato se introduce en un lado de la membrana. Mediante una bomba se fuerza al producto a travs de la membrana que retiene la enzima. Se elimina gasto de inmovilizacin, se reduce la prdida de la enzima, se mantiene la velocidad de reaccin constante y el sustrato y la enzima pueden ser reemplazados fcilmente. Su principal desventaja es que tiende a desnaturalizar la enzima. Las membranas son bastante estables a la temperatura, presin y ataque qumico y son tambin resistentes a la degradacin microbiana.(8)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 4.9 MTODOS DE EXTRACCIN DE PRODUCTOS DE FERMENTACIN Uno de los aspectos ms crticos de un proceso de fermentacin industrial es la recuperacin y purificacin del producto, esto depende de la naturaleza del producto final, su concentracin, los productos laterales, la estabilidad del material biolgico y el grado de purificacin necesaria.(8) La primera etapa de la recuperacin del producto es, por consiguiente, la separacin de la biomasa celular y los ingredientes del sobrenadante. Para este propsito existen varios mtodos que incluyen: floculacin, flotacin, filtracin o centrifugacin. (8) Si se va a aislar un metabolito intracelular, debe ser liberado antes de las clulas y una vez liberado se seleccionan las etapas adicionales de purificacin y esto depender del producto deseado. Las ltimas etapas en la recuperacin del proceso implican: precipitacin, cristalizacin y/o desecacin. (8) Floculacin y flotacin Las clulas aisladas en el rango de uno a diez micrmetros sedimentan solo muy lentamente y son difciles de precipitar, para eso puede utilizarse la floculacin para producir grandes agregados que sedimentan mucho ms rpidamente, se aade un agente floculante como una sal inorgnica, un polielectrolito orgnico o un hidrocoloide mineral. Dependiendo del agente utilizado puede ser reversible o irreversible. El proceso de floculacin est tambin influido por la naturaleza de las clulas y por los constituyentes inicos y su concentracin.(8) El proceso reverso a la floculacin es la flotacin que es ms fcil de conseguir introduciendo gas en el lquido. Las clulas se adsorben a las burbujas de gas y suben a la capa de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor. (8)
Filtracin
Existen dos principales tipos de filtros denominados filtros profundos y filtros absolutos. Filtros profundos. Estn hechos de una matriz filamentosa como lana de vidrio, papel filtro o asbesto (Fig.98 y 99). Las partculas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz y las partculas que van a ser filtradas son frecuentemente ms pequeas que los poros de filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida que pasan a travs de los intersticios retorcidos del filtro. (8)
Fig. 98 Filtro profundo
Fig. 99 Filtro profundo, corte transversal
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Filtros absolutos. Son membranas en las que el tamao de los poros es ms pequeo que las partculas que van a ser filtradas, por ejemplo los cultivos bacterianos deben ser filtrados con estos filtros (Fig.100). La filtracin est influenciada por numerosos factores, como el tamao de los microorganismos, su morfologa, el pH, viscosidad, presencia de capas mucosas, temperatura y presencia de otros organismos como posibles contaminantes.(8)
Fig. 100 Filtro absoluto.
Centrifugacin La centrifugacin no solo se utiliza para separar partculas slidas de la fase lquida sino tambin para la separacin de fluido / fluido y fluido / partcula, esta ltima es la de mayor importancia, aunque la separacin fluido / fluido se utiliza en la produccin de penicilina. Se utilizan dos tipos distintos de centrfugas (8):
Centrfuga de filtro o tamiz. Centrfuga con deflectores.

En la centrfuga de deflectores la separacin se produce debido a la diferencia de densidad entre las partculas y el lquido. El producto puede ser separado continua o discontinuamente. (8) Para la separacin de fluido/partcula se deben considerar los siguientes factores (8): 1. La pureza necesaria de la base fluida. 2. Recuperacin que se necesite de la base fluida. 3. Recuperacin que se necesite de la base particulada. 4. El contenido en humedad permisible en las partculas.
Fig. 101 Tipos de centrfuga continua.
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Para la separacin de fluido / fluido se deben considerar los siguientes factores (8): La pureza que se necesita del lquido ms ligero ms pesado. La recuperacin que se requiera de la fase ms ligera ms pesada.
Cristalizacin y precipitacin Una vez que ha sido extrado un metabolito puede ser adicionalmente concentrado y purificado por cristalizacin, evaporacin transferencia a baja temperatura, la cristalizacin a baja temperatura es una forma muy suave de purificacin. En el caso de purificacin se aade un agente qumico para facilitar la reaccin de concentracin.(8)
Desecacin Esta tcnica implica esencialmente la transferencia de calor al producto hmedo y el desprendimiento de la humedad con una corriente de gas. La transferencia de calor puede ser por contacto directo, conveccin radiacin. La tcnica que ms se utiliza es la liofilizacin. (8)
Fig. 102 Separador esterilizable.
Desintegracin de los microorganismos En algunos casos la recuperacin de los productos requiere que los microorganismos sean fragmentados por procedimientos fsicos, qumicos o biolgicos, esto depende principalmente de la naturaleza de las clulas aunque las membranas celulares no ofrecen resistencia a la ruptura pero varan en la rapidez de ruptura. Las bacterias Gram positivas y las levaduras son muchos ms difciles de romper que las bacterias Gram negativas o los hongos filamentosos. Incluso dentro de un microorganismo las clulas varan dependiendo de su estado fisiolgico. (8) Para la extraccin de clulas de levadura se utiliza la autlisis. Las enzimas autolticas endgenas de las clulas de las levaduras llevan a cabo la destruccin de su propia pared celular. La adicin de NaCl, acetato de etilo CHCl3, y la incubacin durante 24 hrs. a 45 C aumenta la velocidad del proceso autoltico. (8) Otra tcnica es la plasmlisis siguiendo la adicin de una concentracin alta de NaCl. La desintegracin por ultrasonido es otra tcnica empleada, pero por su alto costo no es adecuada en los procesos a escala industrial. Los molinos de bolas llevan a cabo la ruptura de las clulas mediante la accin de bolas de vidrio, stas se someten a una alta velocidad de mezclado en una vasija de reaccin. Otros aparatos utilizados son los homogenizadores. (8)
Fig. 103 Cromatgrafo de lquidos.
Cromatografa Algunas de las etapas ms caras en la recuperacin del producto implican el uso de mtodos cromatogrficos. Son de esencial valor para la purificacin de materiales biolgicos sensibles y encuentran un amplio uso en farmacia, reactivos de diagnstico e (8) investigacin. Se produce generalmente en una columna: una fase estacionaria se utiliza para adsorber el producto que es luego eluido con una fase mvil (lquida), el lquido de elucin puede tener una densidad nica o puede utilizarse un gradiente de densidad. Utilizando un detector adecuado a la salida de la columna, pueden determinarse las fracciones eludas que contienen el producto deseado, a continuacin se resumen varios mtodos cromatogrficos que se utilizan ampliamente. Segn el mecanismo de separacin tenemos(8): Filtracin en gel: Las molculas de diferentes tamaos pueden ser separadas mediante el paso a travs de geles con diferente tamao de poro (Fig.104). (8) Fig. 104
Cromatografa de adsorcin: La separacin supone interacciones hidroflicas o hidrofbicas (fuerzas de Van der Waals) entre el portador y el material biolgico. (8)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Cromatografa de intercambio inico: La macromolcula se adsorbe al portador y se eluye mediante una solucin de fuerza inica definida. Se usa para la purificacin de antibiticos a partir de caldos de fermentacin, tambin en la purificacin a gran escala de protenas (Fig.105). (8)
Fig. 105
Cromatografa de afinidad: Es un mtodo absolutamente especfico para la purificacin de Fig. 106 los materiales biolgicos (Fig.106). (8)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Isoelectroenfoque: Pueden ser purificadas las protenas utilizando gradientes de pH en asociacin con intercambio inico en geles. Este mtodo es muy bueno, pero con la inconveniencia de que slo pueden ser manejados volmenes muy pequeos. (8)
Extraccin Muchos productos pueden ser purificados mediante extraccin con solventes en un sistema de dos fases. Se ha utilizado ampliamente en la industria de antibiticos como la penicilina utilizando solventes como el acetato de amilo o de butilo. Una variante interesante de este procedimiento es la extraccin con soluciones sper crticas. Este enfoque se utiliza en la extraccin de cafena de los granos del caf y del lpulo en cervecera, pero tambin puede ser utilizado en la extraccin de pigmentos e ingredientes de olor de los materiales biolgicos. (8) 4.10 PRODUCCIN INDUSTRIAL DE LEVADURAS El conjunto de las levaduras se distribuye en tres familias denominadas Saccharomycetaceae, Sporobolomycetaceae y Cryptococcaceae, se caracterizan por un tipo de reproduccin conocida como gemacin. Sus hbitats pueden ser no solo las capas superiores de la Tierra, sino tambin muchas materias orgnicas, sobre todo las de origen vegetal que contienen hidratos de carbono. Las levaduras pueden aislarse especialmente del suelo de los viedos y huertos, de las superficies de frutos, hojas y plantas. Son arrastradas por el aire junto con el polvo y los insectos las trasladan con sus cuerpos. (25) Las clulas individuales suelen ser esfricas, ovoideas y elipsoideas, no poseen flagelo, por lo tanto son inmviles, su tamao vara segn la especie, nutricin, edad y otros factores, pudiendo oscilar entre una a nueve micras de ancho y de dos a veinte de largo. Las clulas de levadura son por lo general mas grandes que las clulas bacterianas. (25) La esporulacin de las levaduras es de mucha importancia ya que constituye la base de un mtodo de reproduccin, desempea una funcin en la produccin de nuevos hbridos y sirve para mantener la viabilidad de la especie durante cambios adversos del medio ambiente. Pudiendo iniciarse por una falta de alimentacin o por acumulacin de productos txicos finales, pero no proseguir si no hay otras condiciones favorables, esto quiere decir que las clulas de levadura deben ser jvenes y fuertes, tener aire y humedad en abundancia, el pH del medio ser adecuado, no haber sustancias inhibitorias y la temperatura de incubacin ha de ser satisfactoria. (25) Con el fin de producir clulas jvenes y fuertes debe cultivarse la levadura en un medio adecuado y ser trasladada a menudo. El oxgeno es indispensable, la temperatura es otro factor importante ya que cada variedad de levadura esporula ptimamente en un cierto intervalo de temperatura. (25) Con el fin de asegurarnos que un cultivo es puro y que en realidad no se trata de una mezcla de dos variedades relacionadas morfolgicamente o de una combinacin indeseable de microorganismos, es necesario el aislamiento de las clulas por medio de una tcnica especial y la observacin de las mismas durante la reproduccin. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Mtodo de la cmara hmeda de Hansen La cmara consta de una lmina, un anillo de vidrio y un cubreobjetos cuadriculado (generalmente 16 cuadros). El cubreobjetos se une al anillo con un cemento vtreo, cera o una mezcla de cera y vaselina.(Fig.107). Antes de emplear la cmara se esterilizan a la llama sus componentes. (25)
Fig. 107 Cmara hmeda de Hansen.
El cultivo de levadura del que se desean aislar las clulas, se diluye en malta de cerveza esterilizada sin fermentar o con agua, hasta que una gota contenga solo algunas clulas. Se coloca una gota del cultivo diluido en un tubo de gelatina-malta, fundida y estril, y el tubo se agita fuertemente para distribuir las clulas de levadura de un modo uniforme por todo el medio. Se extiende una gota de este medio en un portaobjetos, examinndolo al microscopio con cien aumentos para ver el nmero aproximado de clulas. Si el nmero es satisfactorio (20 o menos), se coloca una pequea gota de la gelatina-malta lquida, que contiene las clulas, en la cara inferior del cubreobjetos y se extiende uniformemente sobre los cuadros numerados. La cmara se coloca de modo que la gelatina quede en una capa regular sobre el cubreobjetos hasta que se solidifique. Despus de esto se invierte la cmara, colocando una gota de agua esterilizada sobre el portaobjetos para asegurar una atmsfera hmeda, y se pega fuertemente el anillo al portaobjetos por medio de vaselina. Se observa al microscopio el lugar que ocupan las clulas, anotando sus posiciones en un diagrama que corresponde al cubreobjetos cuadriculado. Generalmente, se preparan varias cmaras al mismo tiempo. Se incuban a la temperatura ambiente o a unos 25C durante dos o ms das, y en este tiempo se observa cuidadosamente el crecimiento de las clulas de levadura: se ver que las clulas aisladas se han convertido en colonias. Entonces se inoculan tubos estriles de extracto de malta con estas colonias, que se sabe tienen su origen en clulas aisladas. (25) Mtodo de Lindner Este mtodo es una modificacin del procedimiento de Hansen. El cultivo que contiene la levadura deseada se diluye en extracto de malta, sidra o zumo de uvas estriles. Empleando una pluma de ave o un alambre esterilizados, se depositan cinco filas de 5 gotitas cada una en un cubreobjetos esterilizado, que puede estar o no cuadriculado. El cubreobjetos se coloca con el cultivo hacia abajo sobre la concavidad de un portaobjetos tallado, despus de poner una gota de agua en la misma. Se cierra con vaselina o parafina. Las gotitas se examinan al microscopio sealando las que contengan una sola clula con pequeos crculos que se marcan a su alrededor o bien anotando la posicin de la gotita en el diagrama correspondiente cuando los cuadrados estn numerados. Despus de la incubacin y observacin se trasladan los cultivos a extracto de malta esterilizado. (25) Mtodo de dilucin de placas Se funden los tubos de agar con dextrosa, malta u otra sustancia apropiada, dejndolos enfriar hasta 42-44 C. Se inocula uno de los tubos con el cultivo de levadura, agitndolo cuidadosamente y separando la menor cantidad de clulas, que se llevan a un segundo tubo. Siguiendo la misma
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL tcnica se inocula el tercer tubo a partir del segundo. El contenido de cada uno de los tres tubos se vuelca sobre placas Petri, incubando las tres placas a una temperatura de 25 a 30 C durante dos o ms das. Cuando se han desarrollado las colonias se examinan al microscopio muestras de todas aquellas que parecen estar constituidas por levaduras puras. Si la levadura resulta satisfactoria puede emplearse para inocular extracto de malta esterilizada. Aunque este mtodo es sencillo no nos da la seguridad de que el cultivo aislado proceda de una sola clula. (25) Mtodo del micromanipulador El micromanipulador puede emplearse con xito en el aislamiento de cultivos puros de levaduras a partir de clulas simples. En manos expertas este mtodo es rpido. El euscopio unido al microscopio ayuda al aislamiento de una sola clula. (25) Otros mtodos Tcnicas semejantes a las usadas en bacteriologa, tales como el rayado, se pueden emplear tambin para el aislamiento de cultivos puros de levadura. (25) Medios usados para el aislamiento de levaduras Se puede utilizar un cierto nmero de medios diferentes para el aislamiento de levaduras. Estos medios deben contener las sustancias nutricias indispensables para el satisfactorio desarrollo de las levaduras y adems ingredientes para inhibir el crecimiento de bacterias y mohos. Se puede emplear un medio de extractos de levadura y de malta para el aislamiento de levaduras con la composicin siguiente (por litro): 3 g de extracto de malta, 3 g de extracto de levadura, 5 g de peptona, 10 g de glucosa y 20 g de agar. El pH se llev a un nivel bajo, de 3 a 4, para el aislamiento de levaduras en muestras que contenan una elevada proporcin de bacterias, y se agreg una capa de 1 cm de parafina lquida para evitar el desarrollo de mohos. Tambin se puede utilizar agar extracto de malta, a un pH de 4.5, para aislar levaduras de los criaderos naturales de Drosophila (lugares fangosos, etc.). Tambin se logra con la incorporacin de 0.003 % de rosa de bengala, 1 % de bilis de buey o de cido lctico, para producir un pH prximo a 4, en un medio de agar dextrosa papa, a fin de caracterizar y aislar levaduras del suelo. Las tres adiciones inhiban el desarrollo de colonias bacterianas, pero mientras que el rosa bengala y la bilis de buey reducan la interferencia de hongos difusores, el cido lctico no lo haca. (25) Aislamiento de una sola espora Se ha desarrollado una tcnica para el aislamiento y cultivo de todas las esporas de un asca. Su mtodo es el siguiente: se hace esporular la levadura colocndola en un bloque de escayola e incubndola al menos durante 30 hr a temperatura ambiente. Con el material esporulado se inocula, usando tcnica asptica, una gotita de malta de cerveza que se tiene sobre un cubreobjetos, colocndose este a continuacin en una cmara especial de trabajo. (25) Se elige un asca, que se separa de la gotita empleando para ello una aguja muy fina de cristal. Naturalmente, el asca lleva adherida una pequea cantidad de malta de cerveza, y si se desea, se puede aadir ms con facilidad. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL El aislamiento se lleva a cabo por medio de dos agujas de cristal. Se introduce una de ellas, que tiene una punta de 7 micras de dimetro, a travs de una abertura de la cmara de trabajo; la otra aguja, que tiene una punta de unas 2.5 micras de dimetro, se introduce por la otra abertura. Se manipula con las dos agujas de manera que se rompa la pared del asca contra la superficie del cubreobjetos. Se lleva por separado cada una de las esporas liberadas a una pequea gota de malta esterilizada que se ha colocado previamente en el cubreobjetos. (25) Despus que la espora ha germinado y se ha desarrollado una colonia de clulas, se trasladan algunas de estas a un frasco de Freudenreich que contenga extracto de malta estril, empleando una aguja de platino esterilizada. Algunas de las clulas restantes pueden llevarse a un segundo frasco empleando para ello el extremo de una pequea tira de papel filtro esterilizado de platino esterilizado. (25) Identificacin de levaduras Para identificar una levadura, algunas de las caractersticas morfolgicas estudiadas incluyen datos referentes a la forma y tamao de las clulas; micelio, seudomiceIio, clulas gemantes, artrrosporas; la forma de la reproduccin vegetativa (por gemacin, escisin, o ambas); la formacin de ascas, en relacin con la conjugacin; la forma y nmero de las ascosporas, y la formacin de balistosporas, clamidosporas o blastosporas. Tambin proporcionan informacin til la aparicin de colonias gigantes, formacin de pelcula y otras caractersticas de crecimiento. (25) Las pruebas bioqumicas comprenden las referentes a la asimilacin de carbono y nitrgeno, fermentacin, cuadros de deficiencia vitamnica y capacidad para crecer a diferentes presiones osmticas, para licuar la gelatina, producir almidn y formar steres. Se utilizaron como suministradores de carbono los azcares glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa y lactosa, junto con el alcohol etlico. En la identificacin de especies se incluy adems trealosa, L-sorbosa, celobiosa, melibiosa, rafinosa, melicitosa, inulina, almidn soluble, D-xilosa, L-arabinosa, D-arabinosa, Dribosa, L-ramnosa, D-glucosamina (clorhidrato), glicerol, i-eritritol, adonitol, dulcitol, D-manitol, alpha-metil-D-glucsido, salicina, D-g1uconato potsico, 2-ceto-D-gluconato clcico, 5-ceto-Dgluconato potsico, sacarato sdico-potsico, cido pirvico, cido DL-lctico, cido succnico, cido ctrico, acetoacetato de etilo e i-inositol. Como fuente de nitrgeno se usa nitrato potsico, porque hay considerable nmero d especies que no lo utilizan. Glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y rafinosa son los azcares ordinarios empleados para indicar la fermentacin o produccin de gas por levaduras. Como las necesidades de levaduras varan, un estudio de los cuadros de deficiencia vitamnica puede resultar til en la separacin de razas, como en el caso de S. cerevisiae. (25) Tcnica auxanogrfica Se emplea para determinar si una levadura puede o no utilizar un determinado tipo de azcar. El medio basal, que contiene 0.1 % de fosfato monopotsico, 0.05 % de sulfato magnsico, 0.05 % de su1fato amnico y 2.0 % de agar lavado, se prepara, esteriliza, enfra y se siembra sucesivamente con la levadura a ensayar, cuando todava se encuentra fundido, y se vierte en cajas de Petri. Se emplea una suspensin muy cargada de levadura para proporcionar las sustancias promotoras del crecimiento requeridas. Pequeas cantidades de los azcares a ensayar (en forma slida) se colocan sobre la superficie seca del agar solidificado y suficientemente separados para evitar la mezcla de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL los materiales disueltos. Se utiliza glucosa como control, puesto que todas las levaduras son capaces de usarla. Las cajas de Petri se incuban a una temperatura ptima para el crecimiento, generalmente entre 25 y 28 C. Los azcares se difunden en el agar, y si son asimilados, originan crecimiento de la levadura. No hay crecimiento si el azcar no se puede utilizar. (25) Dado que el mtodo auxanogrfico puede originar resultados errneos si el azcar o el compuesto nitrogenado se difunden en un rea demasiado amplia en la caja de Petri, algunos investigadores han preferido emplear medios lquidos y ensayar la utilizacin de cada sustancia en tubo de cultivo separado. Anlogamente, puesto que en las investigaciones modernas se estudia cada vez un cierto nmero de levaduras, se prepara una o ms placas que contienen solo un azcar o una sustancia nitrogenada. (25) Tcnica de la rplica de placas Los cultivos de levadura se dejan crecer durante 18 h en tubos inclinados de agar-caldo antes de transferlos a una placa inicial, que puede contener 1) agar-caldo, o 2) levadura base nitrogenada (Difco) con 0.5 % de glucosa y 2 % de agar. Se utiliza suficiente inoculante de levadura para producir colonias del tamao de puntas de alfiler (antes de la incubacin) sobre las placas una vez inoculadas estas, y conteniendo cada una 25 colonias, se incuban a 22-25 C durante 12 a 16 hr. Tras la incubacin, cada placa se invierte y oprime contra un pao estril, previamente montado sobre un bloque de madera. Las placas de ensayo (que contienen una concentracin del 0.5 % de la sustancia carbonada a ensayar, levadura base nitrogenada y agar purificado) se invierten entonces sucesivamente sobre el bloque, se oprimen suavemente contra el pao y se colocan en seguida derechas (para evitar el desplazamiento de las colonias). (25) El orden de duplicacin es: (25) 1) placa testigo, que no contiene ninguna sustancia carbonada utilizable. 2) sacarosa. 3) maltosa. 4) lactosa. 5) galactosa. 6) glucosa. Las placas se examinan tras la incubacin a 22 - 25 C, durante 2 a 6 das. Se pueden realizar de 6 a 10 rplicas sucesivas con el mtodo del bloque de madera y el pao a partir de una placa que contenga 25 colonias diferentes de levadura. (25) Con esta tcnica se ahorra considerable cantidad de tiempo cuando hay que identificar un gran nmero de levaduras. (25) El inoculador mltiple Este aparato, se compone de un tubo portador del inoculante, un inoculador mltiple y un soporte para una caja Petri. Es particularmente til para inocular placas de agar duplicadas con un mximo de 24 cepas de levaduras o bacterias. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL La nutricin de las levaduras Las levaduras, como las bacterias y otras formas de vida, requieren ciertos materiales alimenticios y condiciones en el medio para un apropiado crecimiento y reproduccin. Algunos elementos son bsicamente necesarios, como, por ejemplo: carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno, fsforo, potasio, azufre, calcio, hierro y magnesio. Hay suficientes pruebas acumuladas para deducir que los oligoelementos desempean un papel importante en la nutricin. Vitaminas y otros compuestos orgnicos se requieren tambin para el desarrollo satisfactorio y el funcionamiento normal de muchos tipos de levaduras. Un suministro adecuado de agua es esencial para que puedan llevar a cabo sus actividades vitales. (25) Carbono Al considerar los azcares como fuentes de carbono hay que recordar la diferencia que puede existir entre la capacidad de una levadura para asimilar un azcar y su capacidad para fermentar el mismo azcar. Del mismo modo, la capacidad para asimilar un compuesto determinado vara con las diferentes clases de levadura. (25) El carbono puede suministrarse en forma de azcares, aldehdos, sales de algunos cidos orgnicos, glicerina o etanol, y ocasionalmente, en otra forma, dependiendo del tipo de levadura. No se conoce ninguna especie de levadura capaz de asimilar celulosa o hemicelulosa, y solo algunas especies, sin importancia industrial, segregan las amilasas necesarias para la utilizacin del almidn. Glucosa, fructosa y manosa se asimilan bien por la mayor parte de las levaduras; sacarosa y maltosa son asimiladas por bastantes especies aisladas, y la lactosa solo es asimilada en algunos casos. (25) Acetatos, citratos, lactatos, malatos, succinatos y tartratos, as como los cidos lctico, mlico, succnico y tartrico, el alcohol etlico a concentraciones bajas y otras determinadas sustancias, pueden servir como fuentes de carbono. (25) Nitrgeno Este elemento se puede suministrar a las levaduras, dependiendo de la especie o raza, en forma de amonaco, sales amnicas (tales como sulfato y fosfato diamnico), aminocidos, pptidos, peptonas (u otros derivados protenicos solubles), urea o nitratos. Solo relativamente pocas especies de levaduras son capaces de asimilar el nitrgeno de los nitratos. Las especies del gnero Hansenula, en cambio, tienen generalmente esta capacidad. (25) Amonaco y sales amnicas, particularmente sulfato y fosfato diamnico, parecen ser las fuentes ms adecuadas de nitrgeno por su fcil disponibilidad, bajo precio y sencilla asimilacin. El amonaco es preferido aparentemente por las levaduras a otras fuentes de nitrgeno presentes en el medio. Los aminocidos se des-aminan utilizndose el amonaco por las levaduras. (25) El mosto de cerveza, que contiene aminocidos y otros compuestos nitrogenados solubles (producidos por la accin de los fermentos proteolticos de la malta sobre las protenas de la cebada), es una fuente de nitrgeno muy adecuada. (25) Para asegurar la adecuada nutricin de las levaduras se emplean medios que contengan todas las sustancias necesarias para el crecimiento, reproduccin y fermentacin. Los medios pueden ser de naturaleza sinttica, semisinttica o no sinttica. En un medio sinttico se conoce la composicin de todos los ingredientes, en uno semisinttico existen constituyentes de composicin conocida y otros
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL cuya formula solo se conoce aproximadamente, y finalmente en los no sintticos se desconoce la composicin exacta. (25) LEVADURA DE PANADERIA Desarrollo de la industria La fabricacin del pan se ha practicado desde la ms remota antigedad. Las historias de Egipto, Roma, Grecia y del pueblo hebreo nos revelan muchos hechos interesantes relativos a la fabricacin del pan, el vino y la cerveza, y ya en la Biblia se sugiere un mtodo para la preparacin del pan con levadura. Al ingls Mason se atribuye la preparacin por primera vez de levadura comprimida en el ao 1792. En esta fabricacin no se emple lpulo. Poco despus se extendi el conocimiento de la levadura comprimida a Alemania y Holanda, aunque hay algunos indicios de que en este ltimo pas ya se haba preparado en 1781. (25) El pan con levadura se prepar durante muchos aos aadiendo a la masa una porcin de masa atrasada y dejndola fermentar durante cierto tiempo. Ms adelante se emplearon levaduras residuales de la obtencin de bebidas, que a menudo tenan un sabor amargo procedente del lpulo de las bebidas de malta. (25) Procedimiento viens Algunos consideran que la industria de la levadura comprimida se inici en Viena con el desarrollo del procedimiento viens, una modificacin de la industria cervecera, hacia el ao 1860. En este procedimiento se molan la malta tostada y el trigo, amasndolos con agua y haciendo fermentar el mosto formado sin filtrar. Por medio de mquinas se efectuaba por tamizado la separacin de las levaduras y el grano, obtenindose as rendimientos del 10 al 14 % de levaduras (referidos a la cantidad inicial del grano), junto con una cantidad considerable de alcohol etlico (un 30 %). (25) Posteriormente este mtodo fue modificndose al desviarse hacia la obtencin de mayores rendimientos en levadura, que es lo que interesaba a los fabricantes de levadura comprimida, a expensas de la cantidad de alcohol. (25) En 1879 Marquardt desarroll un mtodo para la aireacin del mosto en la produccin de levadura, aumentando la cantidad de esta y disminuyendo la de alcohol. Otras modificaciones posteriores fueron la filtracin del extracto, y el empleo de temperaturas bajas. Muchos de los mtodos modernos de fabricacin de levadura comprimida estn protegidos por patentes. (25) Poco despus del comienzo de la primera guerra mundial se hicieron trabajos en Alemania que llevaron al desarrollo de algunos de los modernos mtodos empleados en la actualidad. La escasez y el costo elevado de los granos motivaron en gran parte estas investigaciones. (25) Algunas consideraciones generales relativas a la produccin de levadura Se suelen emplear variedades seleccionadas de Saccharomices cerevisiae en la industria de la panificacin. Estas razas deben poseer ciertas propiedades, tales como estabilidad bioqumica (caractersticas uniformes y constantes), capacidad para fermentar la masa de harina vigorosamente (excelente potencia hinchadora de la masa), fcil dispersabilidad en agua, buenas cualidades de conservacin (posibilidad de resistir a la autlisis) y buena apariencia durante un perodo razonable, a las temperaturas normales de manipulacin, as como capacidad para reproducirse perfectamente
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL y con buen rendimiento en el medio de propagacin.

(25)
Materiales nutricios Con el fin de obtener rendimientos mximos de levadura, el medio usado en la propagacin debe contener las necesarias materias nutridas, orgnicas e inorgnicas, en cantidades adecuadas. (25) El carbono lo suministran generalmente los azcares contenidos en las melazas (de caa o de remolacha), en los cereales sacarificados o en otro material semejante. El carbono lo pueden proporcionar tambin, en cantidad ms limitada, ciertos constituyentes no glucdicos, tales como aminocidos, cido lctico, alcohol etlico y otras sustancias. (25) El nitrgeno se puede suministrar como agua amoniacal, sales amnicas, derivados protenicos solubles, tales como peptonas, pptidos y aminocidos, o urea. Los nitratos y nitritos no resultan aceptables. Las aguas de remojo de maz, cuando se disponga de ellas, pueden servir como fuente de nitrgeno orgnico. Las melazas con un contenido inferior de azcar y superior de nitrgeno orgnico dan un rendimiento ms elevado que otro material con mayor proporcin de azcar y menor de nitrgeno. (25) El fsforo es esencial para su nutricin y puede ser proporcionado en forma de fosfatos (cido de calcio, diamnico o disdico), como cido fosfrico o en otra forma. El magnesio, en forma de sulfato magnsico heptahidratado, debe aadirse al caldo si se halla en cantidad insuficiente como consecuencia del anlisis de la materia prima. (25) La levadura de panadera tambin precisa ciertas vitaminas o factores bios para producir un rendimiento mximo. Se encontr que una raza de levadura precisaba 0.29 p.p.m. de biotina disponible, 50 p.p.m. de pantotenato y 1,200 p.p.m. de inositol, para dar un rendimiento mximo sobre melazas de remolacha que contenan 50 % de azcar disponible. Se hall que las melazas de remolacha son una excelente fuente de pantotenato e inositol, siendo en cambio deficientes en biotina. Las melazas de caa de refinera, banda negra (blackstrap) y las purificadas resultaron en cambio fuentes excelentes de biotina, pero ms pobres en pantotenato. A causa de su deficiencia en pantotenato e inositol, las melazas de caa purificadas, se consideran de limitado valor para la fabricacin de levadura. (25) Se sabe tambin que el rendimiento de levadura a partir de melazas dependa muy marcadamente del contenido de biotina del medio. La vitamina B1 (tiamina) y el inositol presentaban cierto efecto sobre el desarrollo de la levadura, mientras que el cido pantotnico y la piridoxina no afectan al rendimiento en las condiciones usadas. (25) Concentracin de azcar La concentracin de azcar se mantiene a un nivel bajo en el tanque de fermentacin (propagacin) para favorecer su utilizacin en la proliferacin de las clulas de levadura ms que en la produccin de alcohol etlico. Las concentraciones usuales en el fermentador varan entre 0.5 y 1.5 %, dependiendo del proceso. La concentracin de azcar en el mosto se mantiene a este nivel bajo durante todo el perodo de produccin, con independencia de que se efecte sobre una base semicontinua. Ello se realiza haciendo entrar lentamente un caldo concentrado a una velocidad predeterminada constante o creciente logartmicamente. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Utilizacin de bacterias lcticas En la fabricacin de levadura a partir de cereal de grano se puede inocular el mosto filtrado con un cultivo del Lactobacillus delbrueckii y mantener por un cieno tiempo una temperatura de unos 50 a 52 C para favorecer la produccin del cido lctico. Las levaduras se desarrollan bien en los medios que contienen cido lctico y al mismo tiempo se reduce la contaminacin, sobre todo con bacterias butricas. La presencia de cido lctico en el pan de levadura inhibe el desarrollo de las bacterias. (25) El pH del caldo de propagacin debe mantenerse bastante uniforme a lo largo de todo el proceso. Los distintos fabricantes de levadura utilizan diferentes valores de pH; sin embargo, los valores comprendidos entre 3.5 y 4.5 parecen ser satisfactorios. En Inglaterra se utilizan valores bajos de pH, mientras que en Estados Unidos los valores suelen oscilar entre 4 y 5. Se ha encontrado que la variacin del pH en el intervalo entre 4 y 6 no tiene influencia sobre el rendimiento. Los valores bajos ayudan a restringir el desarrollo de muchas especies bacterianas. Sin embargo, el color de la levadura puede resultar poco satisfactorio si el pH es excesivamente bajo. Utilizando combinaciones apropiadas de agua amoniacal y sulfato amnico debe ser posible regular el pH hasta cierto punto. En caso necesario se utilizar cido sulfrico, amonaco y carbonato o bicarbonato sdico. (25) Aireado La aireacin adecuada de la masa es uno de los factores ms importantes en la fabricacin de la levadura de pan. Se emplea aire en grandes proporciones. (25) El rea superficial de las burbujas de una determinada cantidad de aire al pasar por un lquido aumenta segn se hacen ms pequeas las burbujas. Hay, por consiguiente, mayor superficie de contacto con burbujas de tamao pequeo que con las grandes, y un mayor perodo de contacto con el medio o el caldo. Se requiere menor cantidad de aire cuando las burbujas son de tamao pequeo, pero cuesta ms producir burbujas muy pequeas. Por ello, el fabricante de levadura ha de seleccionar un mtodo adecuado en el que la eficiencia de la aireacin sea alta sin que el costo resulte excesivo. El tamao de burbujas que se emplea comercialmente vara de 0.0025 a 25 mm de dimetro. Se utilizan con buen resultado tubos de aireacin con orificios de 0.4 a 0.8 mm de dimetro. Para una aireacin ms fina se pueden emplear dispositivos de tipo poroso, aunque tienden a obstruirse y precisan mayores presiones de aire. (25) El aire se introduce junto al fondo del tanque de fermentacin, y la malla de salida de aire debe disponerse de forma que lo distribuya uniformemente por toda la seccin transversal del tanque. Las necesidades de aire de un tanque de fermentacin ancho y bajo sern muy diferentes de las de uno estrecho y alto; en todo caso, cuanto ms tiempo est una burbuja de aire en contacto con el medio ms eficaz es. Sobre la base de la levadura producida, se requiere una cantidad de aire considerablemente mayor para un fermentador pequeo que para uno mayor. (25) La valoracin correcta de las necesidades de aire se basa en la informacin disponible en relacin con la altura del caldo en el fermentador en cada momento (obtenida en forma de grfico), la concentracin de la levadura en relacin con el tiempo, el rendimiento de levadura por unidad de materia prima y la relacin entre levadura nueva y levadura sembrada. Las cantidades de aire que se precisan para la produccin de levadura, varan entre 275 y 530 pies cbicos/libra de levadura nueva con un contenido del 30% de materia slida (19.6 a 37.8 m3/kg). (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Las necesidades de aire se dan generalmente referidas a pies cbicos por a) galn de caldo, b) pie cbico de caldo o pie cuadrado de superficie del fondo del fermentador, c) libras de levadura en 100 gal de caldo, d) libras de levadura producidas, e) toneladas de melazas totales o f) bushel de cereal tratado; y tambin en litros o metros cbicos por unidad de volumen del medio, etc. (25) Los aireadores son de diversos tipos. Pueden ser, por ejemplo, placas, tubos, en forma de candela, de regadera, o falsos fondos. Tambin pueden ser de tipo fijo o movible. Suelen construirse de metal no corrosible, material cermico, caucho duro o blando, carbn poroso, vidrio agujereado, caa u otros materiales. (25) Funcin del oxgeno No se conoce exactamente la funcin del oxgeno en el desarrollo de las levaduras. Probablemente, su accin se debe a varios factores como podran ser: inhibicin de la fermentacin y aumento de la respiracin, agitacin del medio, separacin de los productos finales txicos y estimulacin del desarrollo vegetativo. (25) Temperatura La temperatura al comenzar se mantiene de 25 a 26 C y en este nivel oscila durante la primera parte de la fermentacin. Los tubos de refrigeracin y de calefaccin son una parte esencial de la instalacin del tanque de fermentacin. (25) Conservacin de la levadura Para el almacenamiento de levaduras comprimidas es necesario el empleo de temperaturas bajas. Los mohos y bacterias estropean rpidamente la levadura a la temperatura ambiente; es probable que tenga lugar la autlisis. (25) Se han propuesto varios mtodos para mejorar las cualidades de conservacin de las levaduras; por ejemplo, se ha sugerido que lavando la levadura durante una hora con una solucin de alcohol etlico, proplico, isoproplico, butlico o amilico, antes del prensado, se mejora la cualidad de conservacin. Se ha propuesto tambin el empleo de coloides, pectina, agar, gelatina, goma tragacanto, dextrina, extracto de algas para separar el agua de la levadura, seguido de desecacin hasta un grado definido de humedad, a una temperatura que no perjudique la levadura. (25) Preparacin del cultivo de levadura En la fbrica, la prctica ms generalizada consiste en empezar por una clula aislada y multiplicada por sucesivos pasos hasta que se ha acumulado una masa suficiente de clulas para sembrar el medio o caldo principal. Todo ello hay que realizarlo con gran cuidado para prevenir la contaminacin microbiana. El micromanipulador es un excelente instrumento para el aislamiento de cultivos puros de levadura. Una vez aislada una clula nica se cultiva en tubo inclinado o en caldo en tubo de cultivo. Luego se inocula con un asa cargada con levadura un matraz que contiene melazas adecuadamente equilibradas o un mosto cereal, en cualquier caso esterilizado y con un contenido de azcar del orden del 6 %. Tras una incubacin de 12 h o ms, a 25-30 C y en condiciones anaerobias el contenido del matraz se utiliza para sembrar otro matraz que contiene un volumen mayor de medio de composicin anloga. Este proceso se puede repetir con cantidades progresivamente mayores de medio hasta que se disponga de suficiente cantidad de inoculante para sembrar los tanques situados en la planta apropiada. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Es conveniente preparar los cultivos de levadura en un departamento especial de la fbrica. Esta habitacin debe construirse de forma que garantice la mxima seguridad frente a la contaminacin. Conviene proyectarla de forma que se limpie e higienice con facilidad y trabajar en ambiente de aire filtrado a presin ligeramente positiva. (25) Levadura de siembra Tanto la cantidad como la calidad de la levadura de siembra son importantes para la obtencin de buenos rendimientos. Para sembrar en la produccin comercial se utiliza generalmente alrededor del 20 % de levadura, referida al peso de las melazas. Se encontr que el aumento en cuanto a la siembra de levadura, dentro de ciertos lmites, se traduca en un mayor rendimiento de levadura, y que el contenido de vitaminas de la levadura de siembra era el factor de primordial importancia en la determinacin de la eficacia formadora de nueva levadura. (25) La floculacin es un fenmeno que afecta a la separacin de las clulas de levadura en un sustrato de suspensin. Las clulas se acumulan en la superficie del cultivo en el caso de levaduras de fermentacin alta, y se depositan como sedimento en las de fermentacin baja. (25) Dependiendo del momento en que se presenta, la floculacin puede ser un beneficio o una perturbacin. La floculacin que se produce hacia el final de la fermentacin en las fbricas de cerveza resulta valiosa, en cambio la que se produce demasiado pronto o rpidamente puede originar la atenuacin incompleta de la cerveza nueva a menos que se remueva para remediar la situacin. En la industria de levadura de panadera es altamente indeseable la sedimentacin muy rpida de las clulas de levadura en la suspensin acuosa preparada para incorporacin a la masa.
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Las levaduras se pueden clasificar de acuerdo a su tendencia de floculacin. Razas pulvurentas, arenosas o no floculantes son las que permanecen muy uniformemente dispersas en el mosto durante todas las fases de fermentacin primaria. En oposicin a estas se encuentran las fuertemente floculantes, que tienden a separarse pronto durante la fermentacin. Otras razas de levaduras poseen caractersticas intermedias. (25) En la produccin de levadura se suelen emplear variedades seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae en la industria de panificacin. Lo que se busca en estas razas es estabilidad bioqumica, capacidad para fermentar la masa de harina vigorosamente, fcil dispersabilidad en agua, buenas cualidades de conservacin y buena apariencia durante un periodo razonable a las temperaturas normales de manipulacin. (25) Durante la fermentacin algunos de los factores que debemos de cuidar son la concentracin de azcar que se debe mantener a un nivel bajo en el tanque de propagacin para as favorecer su utilizacin en la proliferacin de las clulas de levadura mas que en la produccin de alcohol etlico. El pH del caldo de propagacin debe mantenerse bastante uniforme a lo largo de todo el proceso, con unos valores comprendidos entre 3.5 y 4.5. La aireacin adecuada para la masa es uno de los factores ms importantes en la fabricacin de levadura de pan. (25) Para el almacenamiento de levaduras comprimidas es necesario el empleo de temperaturas bajas. Se han propuesto varios mtodos para mejorar las cualidades de conservacin de las levaduras, como podra ser el lavado de la levadura durante una hora con una solucin de alcohol etlico, proplico, isoproplico, butlico o amlico, antes del prensado; tambin el empleo de coloides como pectina,
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL agar, gelatina, goma tragacanto, dextrina, extracto de algas, para separar el agua de la levadura; seguido de desecacin hasta un grado definido de humedad, a una temperatura que no perjudique la levadura. (25) Algunos otros mtodos de obtencin de levadura son: Procedimiento de melazas-amonio En este las materias primas son generalmente una mezcla de melazas de remolacha y de cana; amoniaco acuoso, sulfato amnico y fosfato monoamnico; fosfato disdico, cido fosfrico u otra fuente de fosfato, y ocasionalmente sulfato magnsico heptahidratado. Las cantidades relativas de melazas de remolacha y de caa empleadas dependern de las disponibilidades y costos respectivos. En una relacin 60:40 suelen producir buenos resultados. Por supuesto, las melazas de remolacha se pueden utilizar sin adicin de melazas de caa. (25) Se obtendrn rendimientos ptimos, dentro de una igualdad en los restantes factores, si se determinan cuidadosamente las necesidades de nitrgeno, fsforo y magnesio. Se puede tambin aadir un 1.8% de nitrgeno calculado sobre el peso de las melazas de remolacha con un contenido del 50% de azcar total, se adiciona fsforo en un 0.8% sobre la misma base; las necesidades exactas de una masa determinada en relacin con un determinado ingrediente, pueden calcularse solamente tras un anlisis qumico de las melazas. (25) Antes de utilizarlas, las melazas se tratan trmicamente, clarifican y diluyen. Se ajusta el pH usualmente a 4.5-5.0, y despus se calienta hasta cerca del punto de ebullicin. Cuando se utilizan lquidos de remojo de maz se adicionan las melazas antes del tratamiento trmico. El calentamiento destruye un elevado porcentaje de los microorganismos presentes y ayuda al subsiguiente proceso de clarificacin. El calentamiento se puede efectuar por cambiadores de calor, por circulacin de vapor a travs de serpentines o de la camisa del tanque o por inyeccin directa de vapor. La clarificacin se realiza utilizando centrifugas, filtros o decantacin seguida de filtracin. Las melazas clarificadas se diluyen con agua de elevada pureza, y con ello se constituye el mosto concentrado de alimentacin. (25) Un cierto numero de acciones se inician y tienen lugar en el propagador, el cual debe ser cuidadosamente lavado e higienizado entre cada dos operaciones. Se introduce agua en el propagador; en una porcin de ella se puede disolver el fosfato o parte de l, as como tambin algo de sulfato amnico y todo el magnesio que se precise. El mosto concentrado se aade en pequeas porciones para dar una concentracin glucdica muy baja, preferentemente de unas dcimas por ciento. El volumen total de lquido en este punto puede representar el 70% o mas del volumen final total. Se aade la levadura de siembra y se comienza la aireacin. El mosto concentrado y las sustancias qumicas (agua amoniacal y los otros productos no introducidos al comienzo) se van agregando en forma exponencial al propagador a lo largo de un periodo de 8 a 12 h. La velocidad de aireacin se incrementa segn va creciendo la cantidad de levadura. Se deja una hora adicional para la maduracin de las clulas de levadura; durante este periodo no se aade mosto ni sustancias qumicas y se disminuye mucho la aireacin. (25) Durante la propagacin se deben controlar cuidadosamente la temperatura, pH y formacin de espuma. No se debe permitir que la temperatura rebase los treinta grados centgrados. El pH y la formacin de espuma se regulan manualmente o mediante dispositivos automticos. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL El tiempo de propagacin viene determinado por la naturaleza del sustrato, la velocidad de alimentacin, calidad y cantidad de la levadura de siembra, temperatura, aireacin y agitacin (una de ambas) y otros factores. (25) Tras la propagacin, las levaduras se deben refrigerar rpidamente, separndolas del caldo agotado y lavndolas varias veces. La separacin se realiza en centrifugas, que tienen capacidad hasta de varios miles de litros por hora. La crema de levadura se mezcla con agua potable en un tanque de lavado, mientras que el lquido agotado se descarga al sumidero. La suspensin de levadura se separa de nuevo en crema de levadura y agua de lavado. Esta operacin se repite varias veces como se desee, hasta obtener un producto limpio. La levadura lavada se pasa a filtros prensa, usualmente del tipo placa y armadura, y se recoge en forma slida. La levadura se desmenuza y se mezcla con un plastificante. Finalmente se moldea en bloques, corta y envuelve, empaquetndola en cajas que se conservan refrigeradas. (25) Procedimiento empleado en Alemania Las melazas de remolacha se diluyen a 300 B, y se ajusta el pH a 4.5. Se esteriliza por calefaccin a 105C durante 1 h. La solucin se deja reposar durante 4 6 h, con lo cual los slidos en suspensin se sedimentan y la temperatura desciende a 90 C. Se filtra a continuacin y se agregan al lquido los nutrientes necesarios, en forma de 110 kg de sulfato amnico y 250 kg de superfosfato por cada 7,000 kg de levadura producida. La mezcla se mantiene en tanques de almacenamiento, y de ellos se pasa despus, a una velocidad lenta predeterminada, al tanque de fermentacin. (25) El inocu1ante se prepara de la forma siguiente: se desarrolla en tubo inclinado una raza de S. cerevisiae, especialmente indicada para el tipo de melazas a usar. Este cultivo se emplea para inocular una masa de un litro. La cantidad de inoculante se aumenta progresivamente a masas de 50, 200, 1,000 y 15,000 litros. Finalmente se prepara un inoculante de 90,000 litros, que se emplea para inocular grandes fermentadores. (25) Los tanques de fermentacin (propagacin) se construyen de acero y tienen una capacidad de 2,000 Hl. Para iniciar la fermentacin se hacen pasar 200 Hl de agua en el tanque. Al agua se agregan a continuacin melazas nutrientes esterilizados hasta que el contenido de azcar alcanza el 1.5 %. Se aade entonces el inoculante y comienza la aireacin. La entrada de las melazas estriles de 30 B se ajusta de forma que la concentracin de azcar se mantenga en el 1.5 %. La temperatura se mantiene entre 25 y 30 C. La fermentacin termina a las 10-11 h. (25) El sistema de aireacin consta de una serie de tubos de cobre perforados en el fondo del fermentador. Por kilogramo de levadura producida se suministran 16 m3 de aire. Se requieren 4,000 m3 de aire por hora para 7,000 kg de melazas. Como agente antiespumante se emplea lanolina sin refinar. (25) La levadura se separa del caldo agotado mediante centrfugas tipo Westfalia. La crema que de esta forma se obtiene se lava dos veces, se enfra a 8-9C y se prensa entre placas y bastidores. La pastilla resultante contiene 31 % de slidos. Se diluye con agua hasta un contenido de 25 % de slidos antes de empaquetada. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Levadura a partir de Lejas sulfticas, por el mtodo de Heijkenskjld Las lejas sulfticas, mezcladas con una pequea cantidad de melazas, son la fuente de materia prima para fabricar la levadura por el mtodo de Heijkenskjld. (25) El primer paso del proceso consiste en ajustar la leja sulftica caliente a un pH de 6.0 a 6.5 con cal apagada, carbonato clcico pulverizado o carbonato sdico, mientras que se airea la leja de las cubas. Despus de neutralizado se deja reposar el lquido para que sedimenten los precipitados. (25) Se separa el lquido por decantacin, se enfra de 28 a 30 C pasndolo por refrigeradores y queda ya en condiciones de ser empleado en la fabricacin de levaduras. (25) El mosto inicial contiene melazas mezcladas con leja sulfitica para producir una concentracin de azcar del 3 al 5 %. Si se quiere se pueden aadir grmenes de malta para abastecer de nitrgeno orgnico y otras sustancias nutritivas. A continuacin se inocula el mosto con la levadura tipo, una variedad de Saccharomyces cerevisiae. (25) Despus que la levadura ha empezado a desarrollar nuevas clulas se aade al mosto la leja sulftica. Durante el transcurso del proceso se aaden sulfato y fosfatos de amonio como materias nutritivas para mantener la reaccin deseada. Se hacen pasar grandes cantidades de aire filtrado para expulsar el dixido de carbono y otros gases formados, adems de desempear otras funciones. Cuando se ha formado una cantidad grande de levadura se lava esta repetidas veces. El producto final, que tiene un color claro, es de gran pureza y de sabor neutro. La leja sulftica empleada en este proceso contiene aproximadamente 25 kg de azcar por tonelada de lejas, y de estos, unos 16 kg son de azcar fermentable. La concentracin glucidica es, por consiguiente, muy pequea y no favorece la produccin de alcohol en grandes cantidades. (25) Sobre la base del azcar fermentable se obtiene una produccin media de un 160 %, y las cantidades varan de 20 a 25 kg por tonelada de leja sulfitica. (25) Levadura desecada activa La levadura desecada activa es un producto desarrollado para su uso en comarcas o lugares donde no se dispone de depsitos de levadura fresca. La levadura desecada activa no precisa refrigeracin, es uniforme y estable durante los periodos requeridos de tiempos, muy conveniente para pesar, se rehidrata fcilmente y resulta econmica. (25) Se usa una raza o dos razas especiales de Saccharomyces cerevisiae en la preparacin de levadura desecada activa. De igual modo se utiliza un procedimiento especial para el desarrollo de la levadura, que despus se lava y concentra de forma usual. La torta prensada se dispersa en forma de bolitas o grnulos para su desecacin. (25) La desecacin de la levadura debe realizarse con gran cuidado a fin de preservar su fisiologa y evitar la degradacin de las enzimas. En las actuales condiciones de desecacin resulta conveniente un contenido final de humedad del 8% aproximadamente. A un nivel de humedad del 10% la levadura no se conserva bien, y con un contenido de humedad del 5 a 6% hay una reducida actividad de levadura durante su uso. La levadura desecada activa se envasa en recipientes sin precaucin alguna especial en lo referente a la eliminacin de aire, tras sustituir el aire por nitrgeno, o bien se envasa al vaco. Los dos ltimos procedimientos se usan en el caso de que la
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL levadura deba exportarse o se destine a un largo almacenamiento. (25) La levadura desecada activa se debe rehidratar aadiendo una parte de ella en peso a unas cuatro partes de agua, a una temperatura de 43 C. Se precisan unos 5 min para la rehidratacin. (25) El valor nutritivo de la levadura nos indica que la levadura seca tiene un alto contenido de protenas, siendo deficiente en metionina y cistina, pero a pesar de esto se le considera como un valioso suplemento protenico. (25) En algunos estudios realizados en C.utilis se encontr que en medios de melazas se producen 18 microgramos de tiamina, 36 microgramos de riboflavina y 610 microgramos de niacina por gramo de levadura en seco; y en medios de jugo de frutas 22 microgramos de tiamina, 44 microgramos de riboflavina y 535 microgramos de niacina por gramo de levadura en seco. (25) Levadura alimenticia y de forraje Tambin conocida como levadura nutricia, es una levadura propagada esencialmente para su uso en la alimentacin. La levadura producida especialmente para forraje de animales se denomina levadura pienso. Ambas se propagan en condiciones semejantes, si bien la levadura alimenticia se refina y manipula generalmente en condiciones ms cuidadas. La levadura de cerveza, desecada y privada de sustancias amargas, se utiliza como subproducto de la industria cervecera para fines alimenticios y farmacuticos. (25) La levadura alimenticia es una fuente importante de vitaminas del complejo B y de protenas. En forma seca, contiene cerca del 50 % de protena, y empleada en proporciones adecuadas con otros alimentos, representa un suplemento satisfactorio y nutritivo de la dieta para las personas que viven en condiciones deficitarias en protenas de origen animal y en vitaminas del grupo B. (25) La fabricacin de levadura para forraje interesa en los casos en los que se desee convertir derivados glucdicos de bajo costo o residuales en productos valiosos para alimentar ganado vacuno o de cerdo u otros animales domsticos. La utilizacin, por ejemplo, de lquidos sulfticos residuales para la produccin de levadura de forraje tiene por resultado un aumento de los alimentos animales disponibles y al mismo tiempo ayuda a aliviar el problema de la contaminacin de las corrientes.
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Forrajes especiales y levaduras pienso se producen en gran nmero de pases, constituyendo en todo el mundo una industria bien establecida. Existen industrias importantes en Estados Unidos, Suecia, Gran Bretaa y otros pases. En Alemania se produjeron y consumieron cantidades relativamente grandes de levaduras alimenticias durante la primera y segunda guerras mundiales. (25) Detalles generales de produccin Microorganismos empleados Se debe tener presente una serie de factores al seleccionar una levadura alimenticia. La levadura debe poseer elevado valor nutritivo, sabor agradable, estabilidad bioqumica y de cultivo, capacidad para asimilar un nmero relativamente grande de productos carbonados y nitrogenados, posibilidad de desarrollarse rpidamente con elevado rendimiento, fcil recuperacin y buena apariencia. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL La levadura comnmente usada para fines comerciales es una cepa de Candida utilis, conocida como levadura torula y denominada a veces Torulopsis utilis. Otras levaduras usadas comercialmente o estudiadas en forma extensa en el laboratorio son: C. arborea, C. tropicalis, C. pukherrima y C. reukaufii; Hansenula anomala y H. suaveolens; Trichosporon pullulans, y, por supuesto, Saccharomyces cerevisiae. Otras levaduras han sido estudiadas a causa de su valor como, C. utilis destaca por su capacidad para asimilar una amplia variedad de substratos carbonados y nitrogenados, entre los que se incluyen galactosa, xilosa y los cidos actico, acetoactico, fumrico, mlico, lctico, pirvico y succnico. Es capaz, por consiguiente, de utilizar hexosas, pentosas y otros constituyentes presentes en los hidrolizados cidos de madera y otros materiales celulsicos. Resulta particularmente deseable a causa de su elevado contenido protenico y de vitaminas del complejo B. (25) C. utilis es una levadura esporgena. Hay un cierto nmero de razas de C. utilis. una, conocida como C. utilis major, produce clulas bastante grandes; otra, C. utilis thermophila, crece a temperaturas ms elevadas que la mayor parte de las levaduras. S. cerevisiae es frecuentemente la levadura de eleccin cuando la materia prima empleada para propagacin son las melazas. Esta levadura es incapaz de asimilar galactosa y xilosa. (25) Magnitud del inoculante Por lo general, la concentracin de clulas en el inoculante es de una magnitud capaz de dar un rendimiento de 100 a 200 millones de clulas por mili1itro en el medio de propagacin. (25) Materias primas En la produccin de levaduras alimenticias es conveniente emplear materiales que sean a la vez fcilmente asequibles, asimilables y de bajo costo. Sobre una base comercial, se han utilizado con xito lejas sulfiticas, melazas y azcares de madera. Sin embargo, con una preparacin apropiada, se pueden utilizar tambin hidrolizados de cereales, jugo de prensado de frutos ctricos, otros jugos de frutas, lquidos protenicos residuales de fbricas de almidn, hidrolizados de las tortas de expresin de aceitunas y otros materiales. (25) Fuentes de nitrgeno Las fuentes usuales de nitrgeno para la propagacin de levaduras alimenticias son amonaco, sulfato amnico, fosfato diamnico, urea y aminocidos de cereales hidrolizados. (25) Fuentes de fsforo En Alemania se utilizaron comercialmente fosfato diamnico y superfosfatos. En Estados Unidos se han empleado con xito fosfato potsico cido y superfosfato. (25) Otras sustancias nutricias A las materias primas que los contengan en cantidad insuficiente se puede agregar cloruro potsico y sulfato o cloruro magnsico. Fuentes especiales de sustancias de crecimiento accesorias se suelen adicionar a los medios en los que se cultiva S. cerevisiae. (25) Produccin a partir de azcar de madera En 1944 se produjeron en Alemania 8,985 ton de levadura por las 5 plantas industriales que empleaban el azcar obtenido por hidrlisis cida de la madera. Este azcar se produca por los mtodos de Bergius y Scholler. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL El proceso, segn se efectuaba en la instalacin de Regensburg Vogelbusch, era el siguiente: la propagacin se realizaba en 6 fermentadores Vogelbusch de 250 m3, equipados todos ellos con tubas refrigerantes internos y un motor de 20 KVA que mueve el agitador a 8 r.p.m. (25) El organismo usado era C. utilis. El inoculante para cada fermentador se obtena por una fermentacin previa. Sobre la base del azcar usado, se empleaba una cantidad de levadura seca equivalente al 10 a 20 % en peso. La propagacin se realizaba a 35 C, por kilogramo de levadura producida se suministraban 20 m3 de aire. (25) La suspensin de levadura se centrifugaba en una batera de centrfugas Westfalia del tipo de transmisin directa. La crema as obtenida se lava por dilucin con agua, se vuelve a centrifugar, se concentra hasta pastillas del 20 % con un filtro rotatorio y se deseca en secaderos Oschatz de doble tambor. El rendimiento de levadura era de 45 a 48 % en relacin con el azcar. (25) El ms satisfactorio de los mtodos de hidrolizados de madera para la fermentacin es el siguiente: Las cantidades de los diversos materiales usados se basan en contenidos de 5 a 6 % de azcar reductor. Se agrega carbonato clcico al hidrolizado hasta pH 5 (aproximadamente 0.75 g/5 g de azcar reductor). Despus se aade 0.05 % de suIfito sdico. El lquido se calienta hasta ebullicin con vapor, y una vez enfriado se filtra hacindolo pasar por una almohadilla de Hy-Flo Supercel. Las necesidades nutricias se satisfacen por adicin de 0.06 g de urea y 0.05 g de fosfato monopotsico por gramo de azcar reductor presente. El medio se diluye a continuacin hasta la concentracin deseada. (25) Produccin a partir de melazas, jugo de caa azucarera y jugo de caa bruto La produccin comercial de levadura alimenticia a partir de melazas, jugo de caa y azcar de caa bruto ha sido realizada en instalaciones localizadas en Frome, Jamaica. Este proyecto fue impulsado por el Departamento Colonial de la Gran Bretaa como resultado de la necesidad de este producto y de la informacin y experiencia obtenida en una planta piloto instalada en Teddiogton, Inglaterra, por el Departamento de Investigacin Cientfica e Industrial. (25) Produccin a partir de flemas de alambique procedentes de azcar de madera Esta mezcla glucdica denominada stillage (flemas de alambique) es el producto remanente de la fermentacin y subsiguiente desti1acin de azcares procedentes de la hidrlisis de la madera, y contiene pentosas (xilosa y arabinosa), cidos (actico y frmico, etc.), cenizas y otros constituyentes. (25) Las levaduras empleadas son: C. utilis nm. 3, Mycotorula lipolytica P-13 y Hansenula suaveolens Y-838. Se cultivaron repetidamente en medios de residuo de alambique procedentes de madera para aumentar su velocidad de crecimiento. Son convenientes como inoculantes concentraciones de levadura prximas a los 100 millones de clulas por mililitro. (25) Las condiciones de la fermentacin son las siguientes: el medio contiene residuo de alambique de azcares de madera de pino Douglas reforzado por la adicin de urea y fosfato diamnico en concentraciones del 0.05 %. El pH se mantiene entre 5 y 6.5 con amonaco. Tras la inoculacin, el lquido se airea. Las velocidades del crecimiento de la levadura y del consumo del azcar resultan afectadas por la intensidad de aireacin. Se descubri tambin la importancia del empleo de pequeas burbujas de aire para obtener los mejores resultados. Con aireacin adecuada, el azcar
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL asimilable se consume en 18 h o menos. La velocidad de consumo de azcar aumenta con el incremento de la temperatura entre 24 y 34 C. (25) Levadura forrajera a partir de jugo de expresin de desperdicios ctricos Este jugo se obtiene por expresin de residuos (cscara, pulpa y semillas), que han sido encalados y molidos. Contiene 4.08 a 8.58 % de azcares totales, con una media de 6.63 %. Es deficiente en fosfatos y nitrgeno. (25) Antes de su uso, el jugo se prepara filtrndolo, calentando a la temperatura de ebullicin durante 5 min y aadiendo despus auxiliares de filtracin, tras lo cual se filtra, se diluye con agua y se ajusta el contenido total de azcar al 1 %; finalmente se enfra a 30 C. Se aade al jugo fosfato trisdico y sulfato amnico en proporcin de 90 % respecto al azcar total de la masa. Dado que se requiere ms cantidad de sulfato amnico, se aade durante el proceso al final de la primera hora, y luego, al fin de las tres siguientes, a una velocidad de 1.75 % por hora. Se aade suficiente carbonato sdico para mantener el pH entre 4.4 y 6.5. (25) El jugo ctrico nutriente se inocula con 4 % en volumen de un cultivo de 2 das de C. utilis en infusin de malta (que contiene 6 % de glcidos totales en el momento de la inoculacin). El medio se airea intensamente con aire filtrado y se mantiene a una temperatura de 29 o 30 C. El proceso se completa generalmente en 8 h. La levadura se separa por centrifugacin y se lava. Los rendimientos, a partir de jugos ctricos con 1 % de glcidos totales, son de 44.3 a 48.0 % de levadura seca (177 a 191.9 % de levadura hmeda que contiene 25 % de slidos) sobre la base de la cantidad de azcares totales del jugo. (25) Produccin a partir de aguas residuales protenicas Basndose en los resultados de experiencias de laboratorio se ha demostrado que se puede producir levadura alimenticia, con un contenido protenico del 55 %, a partir de las aguas residuales protenicas de las fbricas de almidn de patata, con un 60 % de incremento en el B. O. D. a los 5 das, cuando se ha recuperado el 40 % de los slidos totales. La levadura, C. utilis NRRL y -900, era capaz de utilizar hasta el 40 % de la materia slida de las aguas residuales protenicas sin adicin de complementos nutricios. Entre las condiciones que favorecen un ptimo rendimiento de levadura se incluyen el uso de un pH de 5, una temperatura de 30 a 32 C, aireacin, agitacin y antiespumante Swift nm. 1000. (25) Produccin a partir de hidrolizados de tortas residuales de aceituna Se puede producir eficazmente levadura alimenticia (en escala de laboratorio) a partir de hidrolizados neutralizados de tortas de expresin de aceite de oliva. Las tortas se pulverizan y tratan dos veces con cido sulfrico al 3.5 % (relacin lquido/slidos de 5 : 1) a una temperatura de 120C, durante 3 h. El hidrolizado que as se obtiene se neutraliza con carbonato clcico anhidro, efectuando ebulliciones y filtraciones intermitentes. (25) Como suplemento nutricio se emple extracto de levadura o de malta (o ambos). La levadura se desarrolla en el hidrolizado nutricio en el siguiente orden aproximado decreciente de eficacia: C. utilis, Pichia membranaefaciens, Geotrichum, S. carlsbergensis y C. krusei. Se obtuvieron rendimientos del 50 al 65 % de levadura seca, sobre la base del azcar utilizado. Se estim que del 4.5 al 5.5 % del residuo de aceituna se puede convertir en protena por este mtodo. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Produccin de levadura para forraje en proceso continuo La instalacin usada es una modificacin del fermentador de Waldhof usado en Alemania durante la segunda guerra mundial para la propagacin de la levadura alimenticia en lejias sulfticas. (25) Consiste en un tanque abierto de una capacidad de 34 litros de medio de fermentacin; un agitador mecnico, de 15 cm de dimetro, que desarrolla una velocidad de 1100 r.p.m., y sirve como una combinacin de aireador y agitador al enviar hacia abajo el lquido de fermentacin a travs de un tubo de succin, e impulsndolo despus hacia arriba y hacia los lados; una bomba de reparto para regular la alimentacin continua, y un tubo de descarga, colocado un poco ms arriba del tubo de succin, que regula la descarga continua. (25) La propagacin se realiza de la siguiente forma: se colocan en el fermentador 2 litros de una solucin que contenga 100 millones de clulas de levadura por mililitro (C. utilis nm. 3). Se pone en marcha el agitador y se agrega entonces el hidrolizado de madera, diluido a una concentracin de 2.5 % de azcares reductores y adicionado de los nutrientes necesarios, a una velocidad de 2 litros por hora. Se introduce aire a una velocidad de 15 litros por minuto. El lquido agotado, con la levadura que contiene, se empieza a extraer del fermentador por el tubo de descarga al cabo de unas 5 horas. La levadura se separa del lquido por centrifugacin y se devuelve al fermentador hasta que el volumen de levadura hmeda en este sea de un 7 %, o 1.8 % de levadura. En este momento se admite hidrolizado de madera sin diluir de una concentracin de 4.5 a 5 %, y la velocidad de paso del aire se aumenta a 21 litros por minuto. La temperatura de fermentacin es de 30 a 32 C y se regula mediante serpentines de enfriamiento y un calefactor elctrico. Con el tipo de aireador empleado no se necesita agente antiespumante. El pH inicial del medio de fermentacin es de 4.7 a 6.6, y del medio de alimentacin, 4.2 a 4.5. (25) Valor nutritivo El valor nutritivo de la levadura como alimento ha sido estudiado por gran nmero de investigadores, particularmente en Alemania, Gran Bretaa y Estados Unidos. Estos estudios han abarcado temas como la digestibilidad de la levadura en la nutricin humana; su contenido en vitaminas cuando crece en medios diversos; su contenido protenico; sus aminocidos constituyentes; su valor como constituyente de la alimentacin de los nios y de los adultos y como suplemento alimenticio para perros, ganado, aves de corral, ratas y otros animales. (25) Parecen existir ciertas indicaciones de que la protena de la levadura es deficiente en los aminocidos metionina y cistina . A pesa de ello, la levadura alimenticia puede ser consderada como un valioso suplemento protenico. (25) Tratamiento de la levadura de cerveza para su uso como alimento En la levadura de cerveza hay que eliminar los amargos y tratarla adecuadamente antes de su uso como constituyente de los alimentos. (25) En uno de los procesos, la crema de levadura (10% de levadura seca) se lleva impulsada por una bomba, a un tanque de pesada antes de transferirla a un tanque de desamarrado. La levadura se lava primero con agua, aadiendo 5,000 kg de agua a 2,500 kg de levadura y lquido residual, pasndola a travs de un separador de levadura Alpha Laval. La levadura se lava a continuacin con una solucin de sosa custica a un pH alrededor de 12.1. se emplean dos partes en peso de solucin alcalina por parte de levadura. La mezcla se pasa por un separador. Despus se lava la levadura con una solucin que contiene 0.05% de sosa custica (2.5 kg de NaOH en 5000 litros de agua) y la
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL mezcla se pasa por un separador. Finalmente se lava con agua fra y se concentra otra vez en el separador. (25) Tras el tratamiento para eliminar los amargos, se aade sal de mesa al concentrado en proporcin de 2% respecto al peso seco de la levadura. Se adiciona tambin suficiente cido fosfrico para rebajar el pH hasta 5.5 - 5.7. (25) El preparado de levadura se puede enriquecer, si se desea, por adicin de una solucin de tiamina, riboflavina y niacina. El concentrado se agita para homogenizar y se seca en un secadero de tambor doble. El producto final se pulveriza y se envasa. (25) Para prevenir prdidas en el contenido de vitaminas durante el tratamiento es esencial velocidades y temperaturas tales que la temperatura no rebase los 4 C. Estas precauciones son especialmente importantes durante el tratamiento para eliminacin de amargos. (25) Produccin de grasa por levaduras Solamente en condiciones de necesidades nacionales extraordinarias habrn de producirse grasas por medio de microorganismos, pues la demanda normal de un pas puede atenderse con la produccin domstica a partir de los animales y las plantas superiores o por medio de las importaciones. (25) La levadura contiene glicridos de cidos grasos, fosfolpidos y esteroles. Entre sus cidos grasos se encuentran el mirstico, palmtico, esterico, hexadecanoico, oleico, linoleico, linolnico, as como otros. Los fosfolpidos normalmente constituyen solo del 1 al 2% del peso total de levadura seca y estn integrados por un 75% de lecitina y un 25% de cefalina. Entre los esteroles se incluyen el ergosterol y en pequeas cantidades de zimosterol y cerevisterol. (25) Aunque se puede producir grasa con muchos microorganismos cultivados en condiciones especiales, existen algunos capaces de producirla en grandes cantidades. Algunos ricos en grasa que han sido estudiados extensamente o se han utilizado industrialmente durante las dos Guerras Mundiales. (25) Produccin de grasa por Rhodotorula glutinis Esta levadura es particularmente interesante por su alto contenido de grasa (hasta el 63% del peso en seco); alto coeficiente lipdico (gramos de grasa producidor a partir de 100 g de azcar); capacidad para desarrollarse fcilmente en cultivo sumergido, formando rpidamente grasa; y facilidad de recuperacin desde el medio de propagacin. (25 Aunque R.glutinis es capaz de utilizar diversos azucares como fuente de carbono, los mejores para la produccin de grasa son: azcar invertido, glucosa, fructosa, manosa, sacarosa y los de melezas de caa, la xilosa, aunque menos adecuada, puede ser utilizada por esta levadura, previa adaptacin. Ordinariamente se utilizan concentraciones de azcares del 4 al 8% para la formacin de grasa. El aumento del contenido glucdico del medio hasta el 20% carece de efecto sobre el contenido de grasa de la levadura, e incluso las concentraciones superiores reducen la proporcin de grasa. Una deficiencia de nitrgeno induce mas bien la formacin de grasa que la de protenas en la
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL levadura. Han hallado que resulta ptima una concentracin de 1g de sulfato amnico por litro. Se ha observado que un suministro insuficiente de sulfato amnico y fosfato potsico cido en un medio de melazas de caa (banda negra) daba por resultado la incompleta utilizacin del azcar. Cuando se agregaron estas dos sustancias en una cuanta de 0.5 g/litro se obtuvo una completa utilizacin del azcar y un elevado coeficiente lipdico. Una concentracin de 1 g/lt de sulfato amnico solamente dio resultados similares. (25) Una deficiencia de azufre o de hierro en el medio puede inducir un aumento en la formacin de grasa. La velocidad de formacin de grasa vara en relacin lineal con el pH entre 3 y 8.5, y aumenta desde 2.1 a 3.1 g de grasa por 100 g de levadura no grasa por hora. La temperatura ptima para la produccin de grasa es de 28 C. (25) La levadura crece en un cilindro de acero inoxidable de 25 cm de dimetro y 225 de altura provisto de un dispositivo de aireacin en el fondo y de un supresor de espuma rotatorio, el tiempo de cultivo es de 68 h aprox. Dando un volumen de 47 litros sembrando un volumen de cultivo de 5.5 litros conteniendo estos 46.0 de levadura en seco, habiendo aadido 1,880 g de azcar dando un rendimiento la levadura de 29.1%; el contenido de grasa bruta en la levadura seca 56.6 g; la grasa formada 326 g, el coeficiente lipdico 17.3, el grado de reproduccin 12.9. (25) Produccin de grasa por Lipomyces lipoferus El contenido de grasa de las clulas es mayor cuando las levaduras se desarrollan en un medio glucdico deficiente de nitrgeno. Se produce una gran cantidad de lpidos en una solucin aireada que contena 3% glucosa, 0.05% de sulfato de amonio y 0.01% de extracto de levadura. La conversin de glucosa en lpidos (coeficiente lipdico) vari entre el 10 y el 14%, el contenido graso de las clulas (referido a peso seco) oscil entre 50 y 63%.(25) Produccin de grasa por Trichosporum pullulans Esta variedad de levaduras crece como un velo sobre la superficie de los medios lquidos. Para que se produzca grasa es necesario oxgeno. Sin embargo no es beneficiosa la agitacin del medio.
(25)
Varios hidratos de carbono son asimilados, pero no fermentados. Como lo que se desea es la produccin de grasa, este es un aspecto favorable del organismo. Pueden emplearse como materias primas: melazas, residuos de celulosa, madera hidrolizada y otros medios que contengan glcidos asimilables. (25) Tambin es una materia prima favorable la leja sulftica residual, fortalecida con sustancias nitrogenadas y las sales necesarias. Entre las primeras podemos aadir agua de levaduras, sales amoniacales, urea, orina, residuos de destilera y extractos de cereales; y entre las sales, cloruro amnico, fosfato potsico primario y sulfato de magnesio. (25) Es esencial para una produccin ptima de grasa la abundancia de carbohidratos adecuados. La temperatura ptima de desarrollo es de 15 a 20 C, con un lmite de 10 grados. (25) En la produccin de grasa se pueden distinguir dos fases en el periodo de incubacin: en la primera de 2 a 3 das en las condiciones ptimas, tiene lugar el mayor desarrollo del microorganismo, a continuacin viene una etapa de formacin de grasa que requiere de 6 a 8 das, calificada como de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL generacin de protenas, durante ella puede utilizarse el microorganismo para inocular otros cultivos. La generacin de protenas puede efectuarse en un medio pobre de hidratos de carbono y rico en nitrgeno; pero en la segunda etapa es necesaria la abundancia de hidratos de carbono. Esto es una demostracin de la diferencia existente entre las condiciones optimas para el desarrollo y las convenientes para la obtencin de un producto final adecuado. (25) Aunque se han realizado mltiples esfuerzos para hallar mtodos satisfactorios de produccin de grasa, para este microorganismo solo dos mtodos se han desarrollado en gran escala: el mtodo del suelo y el de bandejas. (25) Mtodo del suelo: en este procedimiento se impregnan con el medio nutritivo paja picada o aserrn grueso, despus de lavados. Este material impregnado se extiende sobre el suelo en montones planos y se inocula con una suspensin fina de T.pullulans. los montones se remueven varias veces al da y de cuando en cuando se riegan con agua. A 11 C la reaccin se completa en unos 12 das. A 20 grados en unos 8 o 10 das. (25) La cantidad de azcar convertida a grasa por este procedimiento era pequea, adems se encontraban dificultades en la separacin del hongo del material inerte, era necesaria una atencin muy grande al desarrollo del organismo e inevitable infeccin, obtenindose sin embargo una adecuada exposicin superficial. (25) Procedimiento de bandejas: el crecimiento del organismo se efecta en bandejas planas con un espesor de 1 a 2 cm de solucin glucdica nutriente esterilizada. Con el fin de ahorrar espacio y facilitar el manejo, las bandejas se disponen unas sobre otras en marcos, sin cubierta alguna. (25) Una vez que el desarrollo superficial es intenso se reemplaza una parte del caldo de cultivo por una solucin fresca de azcar. Despus de alcanzada la produccin mxima de grasa (en 7 u 8 das) se separa el caldo agotado, lavando varias veces las capas de organismos con agua. Los velos as tratados forman una pasta, y tal y como se emplean con el nombre Evernal o Myceta, tienen un contenido de protenas muy apreciable. (25) En este proceso es casi completa la utilizacin del azcar, pero la cantidad elevada de mano de obra a emplear aumenta el costo, y al mismo tiempo la infeccin con levaduras, mohos y bacterias puede constituir un serio problema. (25) La recuperacin de grasa de T.pullulans puede hacerse por varios mtodos: extraccin con ter, proceso autoltico o tcnicas qumicas. En este ultimo mtodo, de rendimientos muy elevados, se trata la capa de hongos con cido clorhdrico caliente para descomponer las clulas, y la grasa, separada en forma neutra, puede emplearse como alimento. (25) Para la extraccin con ter hay que hacer una trituracin previa de las clulas con el fin de desintegrarlas. El rendimiento no es tan elevado y la grasa obtenida se emplea solo para fines industriales. Para el proceso autoltico se deja efectuar la autodigestin durante 2 o 3 das a 50C, recuperndose despus la grasa. La grasa se conserva en buenas condiciones fuera del contacto del aire. (25)
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Recuperacin de grasa con levaduras Es necesaria la oxigenacin del medio si quieren obtenerse cantidades mayores que las normales, esta demostrado que pueden obtenerse del 5 al 12% el contenido de grasa de las levaduras y mohos si estos se desarrollaban en medios bien oxigenados, abundantes en hidratos de carbono y nitrgeno. (25) La adicin de fosfatos alcalinos (fosfato de sodio y fosfato de calcio) a un medio bien oxigenado con un 4% de glucosa produjo un aumento de la grasa almacenada en una suspensin de levadura de cerveza. (25) Por lo general la velocidad de formacin de grasa es mayor al principio, disminuyendo luego. Cuando aumenta la concentracin de azcar aumenta tambin la cantidad de fosfato absorbida por las clulas de la levadura. (25) Se ha demostrado que la oxigenacin en una solucin que contenga azcar de manera adecuada aumenta la cantidad de grasa almacenada en la levadura en suspensin. Si se suspende en agua oxigenada una levadura que contenga una reserva de hidratos de carbono, parte de este hidrato se convierte en grasa. (25) Tabla 3. Algunos microorganismos capaces de producir cantidades relativamente grandes de grasa(25): Levaduras Mohos Bacterias
Gnero Geotrichum: G.candidum (Odum lactis) Gnero Lipomyces: (Oospora lactis) L.lipoferus G.wallroth (Torulopsis lipofera) (Ooidium wallroth) L.starkeyi (levadura del suelo de Starkey) (Oospora wallroth) Gnero Rhodotorula: R.glutinis (R.gracilis) Gnero Trichosporon: T.pullulans Gnero Mucor Gnero Penicillium: P.javanicum P.lilacinum P.spinulosum
Gnero Candida C.pulcherrina (Torula pulcherrina) (Torulopsis pulcherrina) C.reukauffi (Nectaromyces reukaffi) C.utilis (Torula utilis) (Torulopsis utilis)
Gnero Aspergillus: A.fischeri A.nodulans Gnero Fusarium: F.lini F.lycopersici
Gnero Aerobacter: A.cloacae
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL (Endomyces vernalis) (Endomycopsis vernalis) P.soppi
Tabla 4 Contenido de vitaminas de la levadura (microgramos por gramo de levadura seca) (25) Melazas Lansing (remolacha) S.cerevisiae Tiamina Riboflavina Niacina cido Flico C.utilis Tiamina Riboflavina Niacina cido Flico C.arborea Tiamina Riboflavina Niacina cido Flico G.candidum Tiamina Riboflavina Niacina cido Flico Mason City (remolacha) Ovid Hawaii (remolacha) (caa de negra banda)
37.6 43.8 414.3 21.6
35.7 50.4 443.3 21.4
32.7 45.4 442.8 19.6
40.8 49.1 563.1 19.1
37.5 54.2 520.6 15.2
36.7 62.0 600.0 10.6
38.1 54.8 511.3 11.7
35.4 58.6 531.4 10.7
32.7 69.5 503.1 14.8
33.1 52.3 492.3 16.0
31.3 53.0 512.3 17.6
33.1 60.0 580.2 15.0
20.1 55.0 192.8 7.7
28.9 39.9 212.6 5.6
27.2 42.6 247.5 7.6
29.0 43.0 242.4 7.8
El empleo ms conocido de las levaduras y uno de obtencin del alcohol etlico a partir de los hidratos fermentativo se usa en (25) Cervecera, Destilera, Panificacin, Vinicultura,
los ms importantes en la prctica es la de carbono fermentescibles. Este proceso Fabricacin de productos qumicos y Otras muchas aplicaciones industriales y domsticas.
Fermentaciones alcohlicas El alcohol, despus del agua, es el disolvente y materia prima ms comn de los que se utilizan en el laboratorio y en la industria qumica. Los aspectos microbiolgicos del proceso de obtencin del alcohol etlico pueden resumirse como sigue (25):
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Sustrato El alcohol etlico puede obtenerse de todo hidrato de carbono fermentescible por las levaduras. Cuando se utilizan como materia prima productos amilceos, como el almidn de maz y otros hidratos de carbono complejos, es necesario hidrolizarlos primero para desdoblarlos en azcares sencillos. La hidrlisis se realiza por enzimas, de la malta de cebada o por mohos, o sometiendo a la accin del calor el material acidificado. Entre las materias primas ms empleadas en todo el mundo con este fin, se encuentran el maz, las melazas, la pulpa de remolacha azucarera, las papas y las uvas. (25) Organismo En la fermentacin se utilizan comnmente razas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae. Es necesario que el cultivo elegido se desarrolle vigorosamente, que presente una alta tolerancia hacia al alcohol y que d un gran rendimiento. (25) Reaccin La transformacin bioqumica realizada por la levadura es la siguiente (25):
C6H12O6 ---------
Otro proceso muy importante de fermentacin por levaduras, en el cual es el alcohol etlico el principal producto final, es la elaboracin de bebidas alcohlicas (cerveza, vino, whisky, ron, (25) ginebra).
2C2H5OH
+ 2CO2 + Calor
Fig. 108 Levaduras empleadas en la elaboracin de cerveza.
Levadura para panificacin El empleo de la levadura para fermentar o "levantar" la masa en la elaboracin del pan, se remonta a los tiempos primitivos de la historia de los judos, egipcios, griegos y romanos. En las prcticas modernas de panificacin se mezclan a la masa del pan cultivos puros de razas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae, que llevan a cabo transformaciones que le comunican la textura y sabor deseados. El CO2 que se desprende durante el proceso produce el esponjamiento de la masa. La calidad del producto obtenido depende de la seleccin conveniente de las levaduras, las condiciones de incubacin, as como la seleccin de materias primas. (25)
Fig. 109 En la industria de panificacin se emplean levaduras.
Fig. 110 Algunos hongos se emplean para la produccin de quesos.
Levadura para alimento El cultivo en masa de bacterias, hongos y algas ofrece una posible fuente de alimento, suplementario para el hombre y los animales. En este aspecto son ms interesantes las levaduras por la facilidad con que se cultivan y su elevado valor nutritivo. El contenido de nitrgeno de las levaduras vara del 7 al 9%, en su mayor parte como constituyente de protena. Entre otros compuestos nitrogenados estn aminocidos, nucletidos, purinas, pirimidinas y muchas vitaminas del complejo B. Tambin contienen cantidades importantes de hidratos de carbono y de grasas. La especie y raza, as como las condiciones de cultivo, ejercen efecto significativo sobre la composicin de cada cultivo particular de levadura. (25) Levadura de cerveza seca Como producto secundario de la elaboracin de cerveza se obtiene la levadura de cerveza seca que se utiliza como suplemento alimenticio o en la preparacin de extractos de levadura. (25)
Fig. 111
Diferentes variedades de cerveza.
El aspecto ms importante en produccin de levaduras para alimentacin, consiste en el hecho de que el proceso metablico sinttico en la levadura, convierte el nitrgeno inorgnico en protenas y en otros valiosos productos nutritivos. (25)
Fig. 112 Tanque de fermentacin.

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL UNIDAD IV BIOCINTICA 4.

Log de nmero de bacterias

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL 4.2 MTODOS PARA MEDIR EL CRECIMIENTO CELULAR

Fig.82 Cmara de recuento.

Fig. 84 Esquema de un contador electrnico.

ELEMENTOS DE UN PROCESO BIOTECNOLGICO

ESTERILIZACIN DEL MEDIO

PURIFICACIN FORMULACIN DEL MEDIO EMPAQUE Constituyentes del medio

Figura 86 Fases de una curva Batch de crecimiento microbiano.

IV: Fase de desaceleracin V: Fase de meseta VI: Fase declinatoria

3 2 1 0 0 0.001 0.002 0.003

Figura 87 de la dependencia de la temperatura en el crecimiento microbiano utilizando la ecuacin de Arrhenius.

Fig. 90 Tipos de reactores de flujo continuo.

Fig. 91 Reactor con distribucin de gas.

4.8.1 REACTORES FERMENTACIN AEROBIA

Fig. 92 Reactores con distribucin de gas.

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Fig. 94 Lecho fluidizado.

Fig. 95 Lecho empacado.

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Fig. 96 Lecho de goteo.

Fig. 98 Filtro profundo

Fig. 99 Filtro profundo, corte transversal

Centrfuga de filtro o tamiz. Centrfuga con deflectores.

Fig. 101 Tipos de centrfuga continua.

UNIDAD IV BIOCINTICA 100

UNIDAD IV BIOCINTICA 101

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL y con buen rendimiento en el medio de propagacin.

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Gnero Aspergillus: A.fischeri A.nodulans Gnero Fusarium: F.lini F.lycopersici

Gnero Aerobacter: A.cloacae

UNIDAD IV BIOCINTICA 118

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL (Endomyces vernalis) (Endomycopsis vernalis) P.soppi

37.6 43.8 414.3 21.6

35.7 50.4 443.3 21.4

32.7 45.4 442.8 19.6

40.8 49.1 563.1 19.1

37.5 54.2 520.6 15.2

36.7 62.0 600.0 10.6

38.1 54.8 511.3 11.7

35.4 58.6 531.4 10.7

32.7 69.5 503.1 14.8

33.1 52.3 492.3 16.0

31.3 53.0 512.3 17.6

33.1 60.0 580.2 15.0

20.1 55.0 192.8 7.7

28.9 39.9 212.6 5.6

27.2 42.6 247.5 7.6

29.0 43.0 242.4 7.8

UNIDAD IV BIOCINTICA 119

UNIDAD IV BIOCINTICA 121