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UNIVERSIDAD DE CARTAGENA.

FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERIA PROGRAMA INGENIERIA DE ALIMENTOS


Nombre de la asignatura: MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
Carrera: INGENIERA DE ALIMENTOS Modalidad : Presencial Horas teora- Horas prctica: 3-3 Semestre: VI Docente : Marlene Duran Lengua Especialista Bioquimica Bacteriloga MSc Candidato Ph.D

MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de los medios de cultivo es comercializada en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparacin de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en autoclave. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:

1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. 2. Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa. 3. Extractos. Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. 4. Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas animales o vegetales.

5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma, suero sanguneo leche son aadidos a los medios empleados para el cultiv Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de los medios de cultivo es comercializada en forma de liofilizados que es preciso rehidratar. La preparacin de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en autoclave. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: 1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. 2. Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa. 3. Extractos. Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. 4. Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas animales o vegetales. 5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma, suero sanguneo leche son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patgenos. 6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisdicos o bipotsicos. 7. Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio.

8. Agentes reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ej. cistena y tioglicolato.

9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares entre otros que a determinadas concentraciones en el medio actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos, o de algunos microorganismos patgenos. 10. Sistemas amortiguadores. Son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos bisdicos o bipotsicos. 11. Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio. 12. Agentes reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes

microaerfilos o anaerobios. Ej. cistena y tioglicolato. 13. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares entre otros que a determinadas concentraciones en el medio actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

1.1. CLASIFICACION Se pueden clasificar de varias maneras as: Segn su consistencia: Lquidos y Slidos. Segn el mtodo para esterilizarlos: Autoclavables,Tindalizables y Filtrantes Segn su uso: Medios de aislamiento, Medios de mantenimiento de cepas, Medios de conservacin y Medios de identificacin Segn su modo de preparacin y su composicin: Medios Sintticos: Poseen una composicin qumica definida, para proporcionar minerales, fuentes de carbono, nitrgeno y factores de crecimiento. Medios Semisintticos: En estos, los factores de crecimiento se aportan a travs de extractos orgnicos complejos (extracto de levaduras, tejidos, etc).

Medios Empricos Naturales: Son ciertos tejidos o lquidos biolgicos que pueden ser utilizados tal cual o con pocos cambios (suero sanguneo, leche, bilis de buey, huevo, papa). Medios Empricos de base ordinarios: Son los medios elementales de aislamiento y conservacin de cepas. Se preparan a partir de tejidos de animales de los que se extraen los principios nutritivos por extraccin simple o por hidrlisis enzimtica ( caldos, agua de peptona y agares nutritivos). Medios Enriquecidos: Son los que permiten el crecimiento de ciertas bacterias exigentes, por adicin de sangre u otros productos biolgicos que aportan los factores de crecimiento o neutralizan los inhibidores. Medios Especiales: Son los usados por ciertas bacterias particulares: Micobacterias, Leptospira, etc. Medios Selectivos: Se usan en el cultivo preferencial de ciertas bacterias, contenidas en una poblacin polimicrobiana, favorecen el crecimiento de unas y frenan el de otras (agar SS). Medios de Identificacin: Se usan para reacciones bioqumicas o enzimticas (agar citrato, urea, etc).

1.2. PREPARACION 1.2.1. Disolucin 1.2.1.1. Materiales 1.2.1.1.1.Agua El agua usada en la preparacin de los medios de cultivo debe ser limpia, recin destilada o recin desmineralizada, su reaccin debe ser lo ms cercana posible a la neutralidad, por lo tanto antes de utilizarla para la preparacin de medios verifique si el pH corresponde a lo establecido. 1.2.1.1.2. Recipiente de disolucin. Usar material de vidrio de borosilicato muy bien lavado y enjuagado con agua destilada desionizada. El tamao del recipiente debe ser lo suficientemente grande para que el medio que se prepara pueda agitarse con facilidad y a conciencia. Antes de pesar los medios se debe verificar la fecha de recepcin en la etiqueta respectiva. No abrir un nuevo lote hasta agotar o descartar el anterior. Si en un frasco no hay cantidad suficiente de medio deshidratado para satisfacer el pedido del laboratorio no mezclar el lote viejo con el nuevo. Si es necesario preparar un segundo lote con la nueva partida para atender el pedido, fechar el frasco del nuevo lote. Los medios deshidratados, que son muy higroscpicos, deben pesarse rpidamente pero con precisin en un cuarto de poca humedad.

Pese en el recipiente de disolucin la cantidad que sea necesaria teniendo en cuenta lo que desee preparar y las indicaciones que aparecen en la parte de preparacin en la resea de cada medio, tambin puede guiarse por las indicaciones de la etiqueta del envase. Cerrar hermticamente el envase y gurdese con el fondo hacia arriba. Aada aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y agite suficientemente hasta obtener una suspensin homognea, posteriormente incorpore la cantidad de agua restante, aprovechando esto para incorporar las partculas de medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a las paredes internas del recipiente. Aquellos medios que no contienen ni agar ni gelatina pueden disolverse en agua fra o con un ligero calentamiento. Los que tienen alguno de estos dos componentes deben calentarse para conseguir su disolucin, este calentamiento puede hacerse en bao Mara. Tener en cuenta que todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento por lo tanto no se debe calentar ms de lo estrictamente necesario. Los medios que no puedan ser esterilizados en autoclave deben prepararse con agua estril y pesarse ya sea en cabina de flujo laminar o utilizando un mechero, los implementos que se usen en la pesada deben ser estriles ( ej.esptula, bajalenguas, cucharillas, etc ) y para verificar su disolucin completa verifique que al agitar no se adhiera a la pared interna del recipiente alguna partcula del agar y que la solucin viscosa, resbale libremente. Hay ciertos medios de cultivo que presentan una turbidez inevitable y por lo tanto en ellos hay que procurar una turbidez homognea, distribuyendo lo mejor posible las partes insolubles. Si es imprescindible preparar ms de dos litros proceda de la siguiente forma: Disolver el medio de cultivo en 1/10 aproximadamente de la cantidad prevista de agua y dejarlo remojar durante 15 minutos. Calentar a ebullicin el agua restante. Reunir esta agua hirviente, bajo constante agitacin, con el medio de cultivo remojado. Calentar adicionalmente hasta su completa disolucin. 1.2.2. Esterilizacin Antes de ser esterilizado el medio debe repartirse en los recipientes en que va a permanecer hasta su uso. Cada recipiente debe etiquetiarse con el nombre del producto, la fecha, la cantidad de producto, nmero de autoclavado. Si las normas de preparacin no indican lo contrario, la esterilizacin se lleva a cabo a 121C durante 15 minutos. Durante el comienzo de la fase de calentamiento del autoclave deje fluir ampliamente la corriente de vapor manteniendo abierta la vlvula de purga durante el comienzo de la fase de calentamiento del autoclave. Tras la esterilizacin para evitar la sobrecarga trmica, saque inmediatamente los medios de cultivo del autoclave y enfrelos rpidamente a la temperatura de vertido o de almacenamiento (temperatura ambiente), para enfriarlos utilice agua corriente.

Todos los anteriores cuidados son necesarios debido a que temperaturas muy altas y calentamientos ms prolongados perjudican la integridad del medio de cultivo. Antes de su esterilizacin, el medio de cultivo puede ser almacenado por un lapso mximo de 12 horas, en refrigeracin. El exceso de autoclavado es un error ms grave que la subesterilizacin ya que se pueden alterar las caractersticas bioqumicas, las propiedades nutritivas y deteriorar la calidad del medio. Tambin se debe evitar el almacenamiento prolongado en Bao Mara de los medios fundidos. 1.2.3. Ajuste del pH Se recomienda comprobar el pH sobre todo cuando se trata de lotes no recientes, este ajuste (no mayor de 0.5 unidades de pH), se hace despus de la esterilizacin, ya que la temperatura durante la pesada del medio, el proceso de disolucin y la esterilizacin son factores que influyen en el pH final del medio. Para realizar el ajuste se utiliza un aparato medidor de pH (pHmetro, potencimetro ). Si el pH difiere en ms de 0.5 unidades descarte el lote. Valores de pH incorrectos pueden indicar un problema con la calidad del agua desionizada, deterioro del medio o preparaciones incorrectas. Revisar las instrucciones para la preparacin y chequear el pH del agua. Si el pH del agua no es el correcto, prepare el nuevo lote de medio usando agua de una nueva fuente. Si el pH de agua es satisfactorio, prepare nuevamente el medio y si el pH sigue incorrecto, prepare el medio de otro frasco. Para medios de cultivo slidos, la medicin y si es preciso la correccin de pH se realiza a 45 - 50C y en los medios nutritivos lquidos se hace a temperatura ambiente. Para el ajuste se utiliza solucin de cido clorhdrico o hidrxido de sodio 1N o 1/10N.

1.2.4. Procedimiento de correccin de pH Esterilizar el medio de cultivo preparado. Extraer estrilmente una muestra exactamente medida. Para medios slidos, hacer una papilla del medio en un vaso de precipitado. Medir el pH de la muestra, preferentemente a la temperatura indicada (25C), utilizando electrodo de superficie o electrodo corriente; si se emplea otra temperatura para medir el pH, hacer la correccin. En caso necesario, ajustar por titulacin el pH al valor correcto. Realice los clculos para la cantidad total de medio de cultivo y aada la solucin de ajuste, sta debe ser lgicamente estril ( la esterilizacin del cido clorhdrico o hidrxido de sodio se hace en autoclave). 1.2.5. Vertido en placas Para realizar el vertido en placas proceda de la siguiente manera: El vertido debe hacerse en la cabina de flujo laminar, excepto cuando el volumen del material es excesivo.

La cabina de aire estril debe comenzar a funcionar por lo menos 30 minutos antes de que se inicie el proceso de distribucin. Si se utilizan mesas en el cuarto estril, humedecerla antes de la distribucin con alcohol del 70. Los recipientes con medio estril deben estar cubiertos durante el procedimiento de distribucin. Durante todo el tiempo de distribucin, mantener condiciones estrictas de aspsia en la manipulacin del material. El analista debe vestirse con una bata de laboratorio limpia. De ser posible, llevar una gorra de cirujano. Las manos deben lavarse muy cuidadosamente antes de iniciar la distribucin de un lote de material. El medio de cultivo debe estar a una temperatura de 45- 55C (soportable al contacto con el recipiente). Remueva previamente el medio haciendo oscilar en sentido circular el recipiente. Si quedaron burbujas de aire en la superficie de la placa elimnelas rote ligeramente las cajas de Petri si an estn hmedas. Si ya estn solidificadas, se pueden eliminar, abanicando brevemente la superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Antes de sembrar las placas seque la superficie hmeda del agar en estufa a 30-40C, para ello coloque la parte inferior de la placa de Petri, con su cara interna hacia abajo, algo desplazada sobre la tapa que ahora le sirve de apoyo durante 20-30 minutos. Otra forma, es colocar las cajas cerradas, con el agar hacia arriba, en la incubadora a 35 C durante 12 a 24 horas. PRACTICAS INTRODUCTORIA

*ANALISIS DEL AIRE POR SEDIMENTACION. Placas de agar para recuento en placa (PCA).

*ANALISIS DE SUPERFICIES PLANAS Y NO PLANAS. Agar para recuento en placa (PCA). Agar violeta rojo bilis glucosa (VRBG) Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGY) Escobillones estriles Tubos con 10 mL de solucin salina 0.85% o agua peptonada. Papel de aluminio estril con abertura central de 9 cm 2

*ANALISIS DE MANIPULADORES Escobillones estriles Placas de agar (PCA Manitol salado, VRBG) Incubadora a 37 0 C

1. ANLISIS DEL AIRE El aire, adems de partculas en suspensin, es portador de bacterias o sus esporas. Por ello, puede ser causa tanto de contaminacin de alimentos y superficies como de infecciones en el hombre (patologas respiratorias, etc.). Existen distintos mtodos para el anlisis del aire: sedimentacin, filtracin, choque en lquidos y precipitacin electrosttica, entre otros. El mtodo de sedimentacin en placa es uno de los ms sencillos para la determinacin de microorganismos del aire. A pesar de ello, los resultados obtenidos son orientativos de las cifras de microorganismos presentes en el aire, ya que estos niveles varan en funcin de las corrientes de aire y del tamao de las partculas en suspensin.

1.2 DETERMINACION DEL TIPO DE MICROORGANISMOS MS FRECUENTES EN MANIPULADORES, AREAS Y AMBIENTE DEL LABORATORIO. ANALISIS DEL AIRE 1.2.1 PROCEDIMIENTO. 1. Destapar la placa de PCA en el lugar cuyo nivel de contaminacin se desee examinar durante diferentes intervalos de tiempo: 0,5; 1; 1,5 horas.

2. Tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 37 C.

3. Determinar el nmero de aerobios mesfilos totales ambientales.

4. Determinar la presencia de Mohos (utilizando agar OGY) hacer el procedimiento correspondiente al primer tem. (1) e incubar a temperatura

ambiente durante 8 das.

Para llevar a cabo una correcta manipulacin de los alimentos es necesario mantener una limpieza adecuada tanto en las superficies de trabajo como en los utensilios, a no ser que los alimentos hayan sido esterilizados, todos los productos llevarn microorganismos. En la manipulacin, el envasado y el almacenaje de los alimentos, estos microorganismos deben mantenerse en todo momento en niveles que aseguren la calidad microbiolgica del alimento. El objetivo de los anlisis microbiolgicos de superficies es comprobar el estado higinico del lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminaciones cruzadas durante el procesado de los alimentos. Existen distintos mtodos para el examen microbiolgico de las superficies: mtodo del hisopo, de la placa de contacto, de la jeringa de agar, de la lengeta (o pelcula pegajosa), etc. 1.3 ANALISIS DE SUPERFICIES NO PLANAS (mtodo del hisopo) Este sistema es el ms antiguo y el ms utilizado en el examen microbiolgico de superficies, ya que sirve para el anlisis tanto de superficies planas como no planas. Es especialmente recomendado para analizar superficies de aparatos y utensilios (mquinas picadoras de carne, cubiertos, etc.). Adems, se pueden estudiar superficies muy contaminadas, ya que a partir de la solucin salina estril es posible realizar las diluciones decimales precisas. 1.6.1 Material Plantilla de papel de aluminio estril Hisopo estril 10 ml de solucin salina estril Placa de PCA.

1.3.2. Mtodo 1. Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel de
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aluminio estril con una abertura de dimensiones conocidas (ej. 9 cm ). 2. Humedecer el hisopo estril en una solucin de 10 ml de solucin salina estril y restregar varias veces sobre la superficie delimitada por la plantilla. 3. Introducir de nuevo el hisopo en el tubo con solucin salina estril y dejar durante 15-30 minutos de manera que los microorganismos se liberen del algodn al caldo o solucin salina.

4. Sembrar 0,1 ml de dicho caldo en una placa PCA..


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5. Incubar durante 24-48 horas a 37 C. El resultado se expresa en UFC/9 cm

1.4 ANLISIS DE MANIPULADORES

OBJETIVOS Detectar la presencia de Estafilococos aureus en faringe, fosas nasales, manos mediante la realizacin de frotis y cultivos. Determinar la eficacia del lavado usual de manos mediante el nmero de UFC antes y despus del mismo.

1.5 INTRODUCCION. El manipulador juega un papel importante como fuente de contaminacin en reas de procesado de alimentos

Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador quien lo contamine durante el procesado. Consideramos normal que el manipulador tenga una abundante carga microbiana en su piel, pero nunca debern aislarse de ella bacterias patgenas o que indiquen poca higiene. Por lo tanto, resulta evidente la necesidad de que el manipulador mantenga unas perfectas condiciones de higiene durante el procesado de los alimentos. El objeto de un anlisis de manipuladores es comprobar que la persona que procesa el alimento no es una fuente de contaminacin de ste. Se pueden estudiar: manos, uas y fosas nasales.

Staphylococcus aureus es el microorganismo mas importante a analizar ya que debido a su resistencia a condiciones medioambientales, es posible que contamine el producto y dado su fcil deteccin en el laboratorio, ha sido utilizado como indicador de contaminacin por manipuladores. Este microorganismo reside en fosas nasales, tracto nasofaringes y se encuentra asociado a heridas y abrasiones en la piel. La nasofaringe puede estar colonizada por Streptococcus viridans y

ocasionalmente Hemophilus influenzae, Klebsiella Pneumoniae bacterias que

son importantes debido a su resistencia y capacidad de crecimiento en mltiples sustratos.

1.5.1 PROCEDIMIENTO 1. Para realizar esta prctica el estudiante no se lavar las manos. Pasar los dedos por la mitad de la superficie de una placa de VRBG.

2. Lavarse las manos con un desinfectante y volver a pasar los dedos por la mitad restante de la placa.

3. Tomar con un hisopo estril muestra del interior de la nariz, faringe y sembrar el hisopo sobre la placa de Agar Manitol Sal.

4. Incubar durante 24 horas a 37 C.

5. Observar el crecimiento de las colonias caractersticas en cada medio de cultivo: colonias violetas con halo del mismo color en el caso de Enterobacteriaceae en placas de VRBG y amarillas en el de Staphylococcus aureus en placas de agar manitol sal (Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus dan lugar a colonias blancas).

2. PREPARACION DE DILUCIONES PARA MUESTRAS DE ALIMENTOS Debido a que los microorganismos que se encuentran presentes en los alimentos slidos, estn atrapados en el interior de los mismos o en las superficies secas o gelatinosas; se necesita hacerles un tratamiento especial para liberarlos a un medio lquido, de modo que permita fcilmente la enumeracin o la deteccin de dichos microorganismos. En caso de alimentos lquidos o semilquidos no se requiere tratamiento especial. El tratamiento consiste en romper mecnicamente el tejido del alimento a analizar, con el fin de preparar una suspensin homognea de alimento y microorganismos. En dicho proceso se pueden lesionar las clulas microbianas, tanto por el efecto mecnico como por el calor producido al tratar de triturar el alimento, lo que nos podra llevar a un recuento inferior al realmente presente. Por el contrario, una homogenizacin y trituracin deficientes implica una liberacin no real de todas las bacterias o una distribucin no uniforme. La suspensin obtenida luego del tratamiento de la muestra ser utilizada en la elaboracin de las diluciones para los diversos mtodos de recuento o deteccin.

El rango de diluciones preparadas y sembradas puede modificarse en funcin a la cifra de microorganismos esperada. De todos modos, siempre deben sembrarse tres diluciones consecutivas. La importancia de realizar diluciones de la muestra es que permite facilitar la lectura de los microorganismos que se estn investigando. Entre los diluyentes ms utilizados estn el agua destilada, agua desionizada, solucin salina, solucin de tampn fosfato, solucin Ringer; sin embargo, la de mayor uso general es el agua de peptona al 0.1% . 2.1. MATERIALES Balanza con sensibilidad 0,1/g. Homogeneizador, licuadora o mortero estril. Pipetas de 10 y 1 ml estriles. Frasco de dilucin con 90 ml de agua peptonada 0,1% estril, pH = 7.2. Cuchillos, tijeras, cucharas, esptulas estriles Tubos de ensayo con 9 ml de diluyente estril 2.2. PROCEDIMIENTO Pese o mida exactamente, segn el estado fsico de la muestra 10 g de la misma, en el frasco de dilucin previamente tarado. Agite vigorosamente o licue por 2 minutos, deje en reposo por diez minutos. Esta 1 mezcla ( 10- ) constituye la suspensin madre. Para productos lquidos ( leche, agua, etc. ) la suspensin madre es el mismo producto (100) . Transfiera un mililitro de la suspensin madre a un tubo con 9 ml de diluyente -2 estril, para obtener la dilucin 10 , agite vigorosamente. Deseche la pipeta usada. -2 De la dilucin 10 tome 1 ml y pselo a un tubo con 9 ml de diluyente estril, para -3 obtener la dilucin 10 . Repita esta operacin hasta alcanzar la dilucin necesaria, segn la naturaleza de la muestra.

3. REGLAS PARA CONTEO DE COLONIAS

3.1. RANGOS ESTABLECIDOS Entre 30-300 colonias por placa. Entre 20-200 colonias por placa. Entre 10-100 colonias por placa. Estos rangos dependen de las caractersticas de las colonias que forma el microorganismo analizado. 3.2. PROCEDIMIENTOS PARA EL CONTEO 3.2.1. Conteo Estandar

Seleccione las cajas que se hallen dentro del rango para el microorganismo o grupo de microorganismos a contar. Tome el promedio aritmtico. Multiplique por el inverso del factor de dilucin. Reglas para casos especiales: Si las cajas de dos diluciones consecutivas dan recuentos menores y mayores de los lmites del rango establecido, cuente todas las cajas, haga el clculo de los recuentos y saque el promedio entre las dos diluciones. Ejemplo:
-1:

10

a) 370 b) 330 370+330 x 10 = 7000 = 3500 2 2

10

-2:

a) 17 b) 23 17+23 x 100 = 4000 = 2000 2 2

Recuento total: 3500+2000 = 2700 UFC /g o ml 2 UFC = Unidades formadoras de colonia Placas sin crecimiento en la dilucin de mayor concentracin, informar el recuento como menor de 1 multiplicado por el inverso del factor de dilucin.

Ejemplo: 10 = Ausencia de colonias. Resultado = Menor de 10 UFC/ g o ml. Si se sembr 0,1 ml de esa dilucin, entonces el resultado es: Menor de 100 UFC/ g o ml. Cuando en dos diluciones consecutivas, despus de hacer los recuentos, el mayor de estos contiene dos veces o ms al menor, se reporta el menor recuento. Ejemplo: 10 : 220 180 220+180 x 10 = 2000 2 10 : 45
-2 -1 -1

55 45+55 x 100 = 5000 2 Relacin = 5000= mayor de 2 2000 Resultado = 2000 UFC/ g o ml. 3.2.2. Conteo estimado: Cuando las cajas de la dilucin a contar, estn fuera de los rangos establecidos, entonces se consideran algunas reglas para determinar un conteo estimado: Divida la caja en secciones radiales (2, 4, 6, 8, etc) y cuente las colonias en una o ms secciones. Multiplique por el factor correspondiente para estimar el conteo en toda la caja. Saque el promedio entre las cajas de la misma dilucin y multiplique por el inverso del factor de dilucin. Existen algunos aspectos que hay que tener en cuenta en los recuentos: Cuando se obtienen colonias difusas o spreader, se consideran como una colonia. Se deben elegir cajas donde la distribucin sea homognea. Reportar slo los dos primeros dgitos, seguidos de cero o la potencia correspondiente y en UFC/ g o ml. Ejemplo: 36 x 10 UFC/g en vez de 36.000 UFC/g. Si despus de dividir la caja de mayor dilucin en ocho secciones, el nmero de colonias es mayor que 200 en cada seccin, informe: Mayor o igual a 1.600 x 10n UFC/ g o ml. Siendo n el inverso de la mayor dilucin. Ejemplo: 10-1 = mayor de 300 10-2 = mayor de 300 10-3 = mayor de 300 Recuento: mayor o igual a 16 x 105 UFC/g o ml ( 1600 x 103 )
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PRACTICA N 1: RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS

1. INTRODUCCION

El recuento de este grupo incluye a las bacterias que crecen en aerobiosis, con temperaturas de incubacin entre 15 y 40C pudiendo detectar su presencia despus de incubacin a 35C 2C por 48 horas en un agar de recuento. En conjunto, esta flora incluye grmenes patgenos y no patgenos. El recuento de estos microorganismos se considera indicador del grado de contaminacin de los alimentos en cualquier etapa del proceso de produccin. A pesar de tener un valor limitado para juzgar el riesgo que pueda tener un alimento como medio de transmisin de enfermedades, este recuento da informacin sobre la eficacia de la higiene en el proceso, temperatura de conservacin, grado de alteracin del alimento o la vida til del mismo. Lo anterior no es aplicable a los productos fermentados o que tienen un proceso de maduracin. Adems de los mesfilos, existen los microorganismos psicrotrficos y termfilos. Para investigarlos, la siembra se hace en los mismos medios que se utilizan para los mesfilos, solo que se incuban a una temperatura diferente. Los microorganismos psicrotrficos se desarrollan a temperaturas entre 0 -15C. Tienen importancia, porque causan alteracin de los alimentos que se conservan bajo refrigeracin, aunque sin patogenicidad para el ser humano. Producen colonias visibles a los 7-10 das de incubacin a una temperatura de 5-7C, independientemente de su temperatura ptima de desarrollo. Los microorganismos termfilos tienen una temperatura ptima de crecimiento que supera los 45C, soportando un mximo de unos 75C. Se recomienda este recuento para controlar la eficiencia de ciertos procesos trmicos a que son sometidos algunos alimentos como los embutidos, leche, etc. 2. OBJETIVO Al finalizar la prctica, el alumno estar en capacidad de determinar la calidad microbiolgica de un alimento mediante el recuento de la flora aerobia mesoflica. 3. MATERIALES Incubadora a 35C 2C. Cajas de petri (100 * 15 mm) estriles. Pipetas de 1 ml estriles. Frasco y Tubos con diluciones de la muestra. Agar Plate Count Contador de colonias. Gradilla. 4. PROCEDIMIENTO Seleccione un mnimo de tres diluciones de la muestra y transfiera un ml de cada dilucin a las cajas de petri estriles, previamente marcadas. Agregue 15 ml de Agar Plate Count fundido y mantenido a 45C, a cada una de las cajas de petri, teniendo cuidado de no permitir un tiempo mayor de 15 minutos despus de la siembra. Mezcle el agar con el inculo suavemente, as:

Mueva la caja de arriba abajo cinco veces. Rote la caja cinco veces en el sentido de las agujas del reloj. Mueva la caja cinco veces haciendo ngulo recto respecto a la posicin inicial. Rote la caja en contra de las agujas del reloj cinco veces. Coloque una caja con medio de cultivo sin inocular y otra con diluyente sin muestra, como control de esterilidad. Deje solidificar el agar. Invierta las cajas e incube a 35C 2C por 48 horas. 5. LECTURA Transcurrido las 24 horas, revisar las cajas, marque las colonias existentes, descarte las cajas con un nmero de colonias mayor del rango superior e incube el resto de cajas. La lectura correspondiente, una vez transcurrido el tiempo de incubacin se hace de la siguiente forma: Seleccione las dos cajas correspondientes a la misma dilucin que presenten entre 30 y 300 colonias por caja, y proceda a realizar el recuento con las reglas indicadas para ello. Para calcular el nmero de UFC/g o ml se multiplica el nmero de colonias obtenidas por el inverso de la dilucin correspondiente a las placas elegidas para el recuento. Se reportan los dos primeros dgitos.

6. PREGUNTAS 1. En qu tipo de productos no es aconsejable realizar el recuento de aerobios mesfilos como indicador de la calidad de un alimento? 2. Qu otros modelos de siembra se pueden emplear para este anlisis ( recuento de mesfilos aerobios )? 3. Qu grmenes son capaces de crecer y sobrevivir a las temperaturas de refrigeracin y qu tipo de alteraciones pueden provocar en los alimentos contaminados por ellos? 4. Establezca las diferencias entre microorganismos termodricos y termfilos. 5. Qu gneros bacterianos son representativos de este tipo de microorganismos (termodricos y termfilos)? 6. Defina que es un microorganismo indicador. Cmo microorganismos indicadores y en qu se basa esa clasificacin? se clasifican los

7. Haga el reporte correcto de los resultados del recuento de aerobios mesfilos,

realizado a la muestra de alimento. 8. Teniendo en cuenta el recuento de aerobios mesfilos obtenido, definir si el alimento se acepta o rechaza para consumo humano y el porqu de su respuesta. Para ello compare los resultados obtenidos en el laboratorio con los estndares microbiolgicos que expide el Ministerio de Salud para el correspondiente alimento.

PRACTICA N 2: DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA TECNICA DEL NUMERO MS PROBABLE
1. INTRODUCCION

El grupo de microorganismos conocido como Coliformes est constituido por algunos gneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae que se caracterizan por su capacidad de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 30-37C en incubacin por 48 horas. Todas las enterobacterias, son bacilos gram negativos, no esporulados, anaerobios facultativos, habitantes del intestino del hombre y animales con un potencial patgeno limitado y tambin pueden encontrarse en ciertos ambientes como suelo, plantas, etc. Un nmero considerable de estas bacterias indica: Tratamiento inadecuado y/o contaminacin posterior al tratamiento. Multiplicacin microbiana que pudiera haber permitido el crecimiento de toda la serie de microorganismos patgenos y toxignicos, por deficiente higiene y desinfeccin de las plantas y manipuladores. Debido a la poca especificidad del grupo para indicar contaminacin fecal, es necesario aislar de los Coliformes totales a los Coliformes fecales, por ser estas ltimas, bacterias huspedes constantes del intestino humano y animal, cuya presencia en los alimentos se asocia, con una contaminacin fecal reciente. Para esto se han tenido en cuenta ciertas caractersticas propias de las bacterias de origen fecal como son la Escherichia coli y otros Coliformes fecales. Estas caractersticas son : Presentar crecimiento en medio Lactosado biliado. Ser capaces de multiplicarse a 43,5C - 45,5C. Producir Indol. La presencia de coliformes fecales en los alimentos, indica falta de higiene en la preparacin. La Contaminacin fecal directa e indirectamente, representa un riesgo potencial por la posible presencia de patgenos. Existen diferentes mtodos para su determinacin a saber: recuento en medio slido, enumeracin en medios lquidos mediante la tcnica de los tubos mltiples de fermentacin o NMP. 2. OBJETIVO Al finalizar la prctica, el alumno estar en capacidad de determinar la calidad higinica de muestras de alimentos estableciendo la presencia de bacterias coliformes por la tcnica del nmero ms probable (NMP). 3. MATERIALES Diluciones de la muestra

Pipetas de 1 ml estriles Gradillas Tubos de 180 X 15 mm con 10 ml de caldo Lactosa Bilis Verde Brillante al 2% ( Caldo Brilla ) con tubos de fermentacin invertidos Asas bacteriolgicas Agar Eosina azul de metileno segn Levine, E.M.B Agar Violeta Rojo Neutro Bilis, VRBA, Incubadora a 35 C 2 C Asas bacteriolgicas Bao serolgico a 45 C 0.5 C Agua de triptona Reactivo de Indol segn Kovacs 4. PROCEDIMIENTO 4.1. TECNICA DEL NUMERO MS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES Consta de dos partes, la prueba presuntiva y la prueba confirmativa. 4.1.1. Prueba presuntiva Inocule de cada una de las tres diluciones a utilizar, 1 ml en los tubos de caldo Brilla al 2%, empleando tres tubos por dilucin. Incube los tubos a 35 C 2 C por 24 - 48 horas. Anote como tubos positivos para la prueba presuntiva aquellos tubos que presentan produccin de gas y turbidez del medio. Si a las 24 horas todos los tubos dan respuesta positiva, continuar con la prueba confirmativa. 4.1.2. Prueba confirmativa De cada tubo positivo en la prueba presuntiva, siembre por estra una asada en cajas con Agar EMB o VRBA. Incube las placas invertidas a 35 C 2 C por 24 horas. Observe el crecimiento de colonias caractersticas en agar E.M.B. o V.R.B.A. y anote el nmero de tubos confirmados como positivos para organismos coliformes en cada dilucin. 4.1.3. Interpretacin de los resultados. Para obtener el NMP proceda as: Determine para cada una de las tres diluciones seleccionadas el nmero de tubos con respuesta positiva en la prueba confirmativa. Busque en la tabla del NMP de McCrady y anote el resultado correspondiente al nmero anterior.

Para obtener el NMP de organismos coliformes por gramo o mililitro emplee la siguiente frmula: NMP de la tabla X factor de dilucin intermedia 100 4.2. NUMERO MAS PROBABLE ( NMP ) DE COLIFORMES FECALES: TEST DE MAC-KENZIE A partir de los tubos positivos para coliformes totales, pase una asada a un tubo con caldo brilla y un tubo con agua de triptona. Incubar los tubos por pareja en bao de agua a 45C 0.5C por 24 - 48 horas. 5. LECTURA Leer los tubos como sigue: Observar la produccin de gas en la campana de Durham y la aparicin de turbidez en el caldo Brilla. Revelar el tubo con caldo Triptfano, correspondiente a la misma dilucin del tubo con caldo Brilla que present la prueba de la lactosa positiva, adicionando 0.2 ml del reactivo de Kovacs, agitar suavemente y observar la presencia de un anillo de color rojo cereza en la superficie de la capa de alcohol amlico cuando la prueba es positiva o el color original del medio cuando la prueba es negativa. Los tubos con produccin de gas y reaccin de Indol positiva, se tienen como coliformes fecales. La determinacin del NMP de coliformes fecales por gramo o mililitro, confrontado los resultados con la tabla del NMP de McCrady que aparece al final de este manual. 6. PREGUNTAS 1. Cuales son los gneros representativos del grupo coliforme? 2. Explique el fundamento de cada una de las etapas de la tcnica para determinacin del NMP de coliformes totales 3. En que se basa la reaccin del indol y por qu es determinante para la diferenciacin de los coliformes fecales? 4. Investigue qu diferencias hay entre las tcnicas para determinar NMP de coliformes totales y fecales en alimentos y las tcnicas para NMP de coliformes totales y fecales en aguas. 5. Haga el reporte correcto de los resultados del NMP coliformes totales y del NMP de coliformes fecales, realizado a la muestra de alimento. 6. Teniendo en cuenta el NMP de coliformes totales y el NMP de coliformes fecales, obtenido, definir si el alimento se acepta o rechaza para consumo humano y el porqu de su respuesta. Para ello compare los resultados obtenidos en el laboratorio con los

estndares microbiolgicos que expide el Ministerio de Salud para el correspondiente alimento.

ANEXO 3 TABLA DE McCRADY


TECNICA DE TUBOS MULTIPLES NMP Y LIMITES DE CONFIANZA DEL 95% PARA DIVERSAS COMBINACIONES DE RESULTADOS POSITIVOS, CUANDO SE USAN TRES TUBOS DE CADA DILUCION CON VOLUMENES DE 1 MLS.*
NUMERO DE TUBOS POSITIVOS DE : TRES TRES TRES TUBOS TUBOS TUBOS -1 -2 -3 DE 10 DE 10 DE 10 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 LIMITES DEL NMP INFERIOR SUPERIOR

NMP POR 1 GR <3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29 9.1 14 20 26 NMP POR 1 GR

0 9

0.085

13

0.085 0.87

20 21

0.88

23

2.7

36

2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 NUMERO DE TUBOS POSITIVOS DE : TRES TRES TRES TUBOS TUBOS TUBOS -1 -2 -3 DE 10 DE 10 DE 10

1.0 2.7

36 37

LIMITES DEL NMP INFERIOR SUPERIOR

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3

0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 1 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3

15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 > 2400

2.8

44

3.5

47

3.5 6.9

120 130

7.1 14 30

210 230 380

15 30 35

380 440 470

36 71 150 460

1300 2400 4800

*Para valores no especificados, los lmites aproximados inferior y superior se pueden estimar como del 31 por 100 del NMP para el inferior y del 395 por 100 del NMP para el superior. Los lmites de confianza que se presentan son las cifras de clculos ms exactos para los resultados que son ms probables; los resultados para los que no se precisan los lmites de confianza es probable que no ocurran en ms del 1 por 100 de los resultados que se observen comnmente.

12 DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS LIPOLITICOS EN ALIMENTO

12.1. OBJETIVOS Que el estudiante conozca los fundamentos alimentos por de la degradacin de los en el

microorganismos lipoliticos, y adquiera la destreza

recuento de lipoliticos en muestras de alimentos.

12.2. Introduccin

El recuento de microorganismos lipliticos en alimentos no es un anlisis rutinario; generalmente se hace cuando se presenta un problema de

rancidez en productos con elevados contenido de grasas como mantequilla, margarinas, cremas, ensaladas con aderezos grasos, carnes grasas y quesos.

Los

lpidos

simples

son

esteres

de

cidos

grasos

superiores con

alcoholes, en este grupo se incluyen las grasas, los aceites y las ceras. Se modifican por reacciones de hidrlisis y oxidacin, de origen qumico y microbiano. La estructura o composicin de los lpidos en el alimento

determinan si pueden o no ser metabolizados por los microorganismos.

Las grasas y los aceites como esteres, son hidrolizados con produccin de glicerina y uno o mas cidos grasos. Estos ltimos, a su vez, se oxidan

dando como resultado una serie de aldehdos, cetonas y cidos de olor rancio. El concepto d e rancio se fundamenta siempre en la presencia de un grupo completo de sustancias La hidrlisis y oxidacin tiene y no precisamente de una sola de ellas. lugar en forma espontnea, aunque

lentamente y en presencia de humedad, luz y oxigeno del aire.

La

autooxidacion de las

grasas

es una reaccin

autocataltica de de

cadenas de radicales que afecta a los grupos alkilicos de los restos cidos grasos con tanta

y se ve favorecida por la presencia de oxigeno. Se inicia mayor es el numero de enlaces dobles

facilidad cuanto

existentes por resto cidos grasos en el triglicrido. As, se originan hidroperoxidos de cidos grasos que por su parte y en presencia de cada vez mas el proceso.

metales pesados forman radicales y difunden

A partir de los hidroperoxidos , inodoros e inspidos se forman aldehdos y cetonas , que son responsables de las alteraciones de olor

caractersticos de la grasas descompuesta.

El enranciamiento es acelerado

por la accin

de microorganismos

productores de lipasas enzimas que hidrolizan lpidos, produciendo a partir de triglicridos, digliceridos y monogliceridos, glicerina y cidos grasoso sucesivamente.

Las lipasas son generalmente muy estables grasos por largos periodos congelacin, por lo tanto

y continan liberando cidos de las de el deterioro

aun a temperatura por debajo esta frena pero no detiene

enzimtico ya iniciado y la deshidratacin mantenga lipasas. en

alteracin se da aunque la congelacin o dormancia las especies productoras de

Entre los grupos bacterianos productores de lipasa encontramos: Bacillus, Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Corynebacterium, Enterobacter,

Staphylococcus, Lactobacillus, Micrococcus Pseudomona y serratia). Entre los Mohos estn Alternaria, Aspergillum, Cladosporium, Endomyces

Mucor Geotrichum, Neuropospora, Penicillium y Rhizopus. Entre las levaduras encontramos la candida y ocasionalmente Hansenula Rhodotorula Sacharomyces y Torulopsis. Algunas veces en alimentos grasos deteriorados no se aslan microorganismos lipoliticos debido a que la gran mayora de lipasas microbianas son exocelulares y pueden actuar en ausencia de clulas viables. Pichia,

12.3. MATERIALES 1- Muestra de alimento 2- Frascos y tubos de ensayo con diluyentes 3- Cajas de petri

4- Agar tributirina (Base + glicerol tributirato) 5- Pipetas estriles 6- Bao, balanza e incubadora. 12.4. PROCEDIMIENTO Realice diluciones igual que para mesofilos aerobios. Marcar las cajas con fecha, numero de grupo y dilucin correspondiente Realice siembra en profundidad (1 mL) Adicionar 15 mL de agar tributirina y homogenizar perfectamente, pues las lipasas solo actan en la interfase lpido- agua. Dejar solidificar las cajas e invertir. Incubar de 2 a 3 das. Sembrar controles negativos positivos y del medio de cultivo.

12.5. RESULTADOS Transcurrido el periodo de incubacin evaluar el crecimiento y los controles realizados. Si no existen inconvenientes para las lecturas realizar el recuento, aplicando las reglas de conteo. El agar tributirina, correctamente preparado tiene el aspecto de una emulsin turbia homognea, los microorganismos lipoliticos formacin de un halo claro sobre el medio opaco. Informe el resultado como UFC de lipoliticos por gramo o mL no olvide utilizar el factor de dilucin de acuerdo a las cajas contadas. crecern en el con la

13 RECUENTO DE MICROORGANISMOS PROTEOLITICO VIABLES 13.1. Objetivos - Se informe de la importancia de la determinacin en alimentos de bacterias proteoliticas. - Use y reconozca los medios microorganismos proteoliticos. - procese y enumere en una muestra de alimentos los microorganismos proteoliticos. de cultivo y el crecimiento de

13.2. Introduccin

Comnmente

las

protenas

no son atacadas

por microorganismos; las

especies con esta

capacidad son denominadas proteoliticas. Su presencia

en alimentos, adems de producir alteraciones en olor y sabor, posibilitan la proliferacin de otros microorganismos no o dbilmente proteoliticos que utilizan el nitrgenos de los compuestos de degradacin originales por el

ataque a las protenas.

Si bien, en alimentos como leche, productos de mar, huevos, la actividad proteolitica es indeseable, en productos carnicos, hace parte del procesos de maduracin pero rpidamente se pasa a putrefaccin y en quesos son francamente deseables, definitiva para sabor, cuerpo y textura. Por esto, las opiniones difieren en cuanto a la utilidad de recuento de proteoliticos para evaluar perdida de calidad. En algunos casos es de valor para evaluar la vida til en almacenamiento refrigerado.

Las especies proteoliticas son comunes

entre

los

gneros

bacillus,

clostridium, pseudomonas y proteus. Hay tambin levaduras y mohos. Los microorganismos fermentacin que llevan a cabo hidrlisis de protenas y

acida son llamados acido-proteoliticas, como, streptococcus

faecalis var liquefacieus y micrococcus casolyticus. Se han identificado proteasas estables al calor, con actividad despus de procesos de esterilizacin en leche; su accin es mejor a 40c , pero continua aun en refrigeracin. Las especies proteoliticas frecuentemente son psicrotroficas , favoreciendo el deterioro a bajas temperaturas.

13.3. Materiales Muestra de alimento (segn grupo) Frascos y tubos de ensayo con diluyente. Cajas de petri con agar caseinato de calcio o cajas vacas o agar en fiola. Balanza Pipetas estriles Licuadora o mortero estriles. Incubadora.

14.4. Mtodos - realice las disoluciones a su muestra segn especificaciones dadas en diluyente igual que para mesoaerobicos - marque las cajas de petri con la fecha, numero de grupo, muestra de dilucin correspondiente. - marque una caja como control de diluyente y una como control de medio. - para la siembra puede usarse la tcnica en superficie (o.1 ml ) en profundidad ( 1 mL) - incube su serie de cajas a 21c por 72 horas invirtalas. Si se desea enumerar proteoliticos psicrotroficos, incube a 7c por 10 das.

14.5. Resultados - transcurrido el periodo de incubacin, sacar las cajas y evaluar el control de diluyente y el de medio. - si no existen inconvenientes para la lectura, proceder a aplicar las reglas de recuento. El agar caseinato de calcio contiene como sustancia para determinar los organismos proteoliticos, la casena.

El medio del cultivo y al crecer en el microorganismo con capacidad para degradarla , alrededor de su UFC se producen halos de aclaracin por lo tanto, estos sern los UFC a contar. Para un mejor reconocimiento de los halos las cajas de petri pueden inundarse durante 1 minuto con un

precipitante de protenas: una solucin al 1% de HCl o de 5-10% de acido actico. Descartar el exceso de acido y contar. Despus de este tratamiento las colonias de las cajas no pueden usarse para otros anlisis. Como este medio no contiene inhibidores, simultneamente, se puede recuento total y proteolitico. realizar en el

- informar el resultado como UFC de proteolitico por gramo o ml del alimento. No olvide corregir su resultado por la dilucin donde realice la lectura y en caso de ser necesario por la siembra (superficie).

14.6. Interpretacin Consultar valores de referencia o estndares segn el alimento analizando. Idealmente la actividad de los microorganismos proteoliticos en un alimento, debera medirse contra una protena especifica del producto analizado; sin embargo, la conveniencia y estandarizacin en los mtodos, ha limitado los medios de cultivo principalmente a los que contienen casena o gelatina . se prefieren los primeros por que la capacidad de hidrolizar casena esta mejor correlacionada con la de desdoblar protena animal. En la carne refrigerada, los fenmenos proteoliticos conducen a limosidad superficial por la coalescencia de colonias constituidas por bacilos

psicrotroficos gram negativos no fermentadores. En los huevos, pescado y carne de aves hay formacin de compuestos finales, oloroso que evidencia la putrefaccin. Las proteasas estables al calor quedan activas despus de la esterilizacin de la leche a sper Alta temperatura (UHT) y su accin se manifiesta por

sabores amargos. Tambin pueden afectar adversamente el sabor de otros alimentos que contengan productos lcteos. En la carne de caza y en los quesos madurados blandos, la proteolisis hace parte de los procesos madurativos y por lo tanto es deseable y beneficioso.

15. DETERMINACION DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ACIDO

15.1. Objetivos - detectar la presencia de microorganismos productores de acido mediante el recuento total en placa. - evaluar la importancia de los microorganismos productores de cido en diversos tipos de alimentos

15.2. INTRODUCCIN

Gran variedad de microorganismos productores de acido, se encuentran en el suelo, productos agrcola y ciertos alimentos procesados. Entre los ms importantes grupos de encuentran LAS ACIDO LACTICAS. Las bacterias acido lcticas son cocos o bacillos gram positivos no bacterias productoras de cidos se

esporulados, catalasa negativas, usualmente no mviles, fermentadores obligados que producen principalmente cido lctico y en ocasiones cidos voltiles y Co2 el grupo de bacterias acido lcticas est constituido por los gneros:

-streptococcus -leuconostoc -pediococcus -lactobacillus Dentro de estos gneros existen especies homofermentativas las cuales tienen como producto principal el cido lctico y heterofermentativas quienes adems del cido lctico producen cido actico, etanol y CO2. Las bacterias acido lcticas tienen especial importancia en productos carnicos, lcticos y vegetales. Especies de PROPIONIBACTERIUM Y ACETOBACTER de son productoras

cido que juegan papel importante en varios procesos industriales como

elaboracin del queso y vinagre. Para la determinacin de bacterias productoras de acido pueden utilizarse y la acidez titulable; la cual tiene el

mtodos indirectos como el pH

inconveniente que la neutralizacin depende de la capacidad taponadora que tenga el alimento. Para los recuentos en placa se utilizan medios adicionados de indicadores como el prpura de bromocresol. Para organismos que producen

cantidades considerables de acido preferible el verde de bromecresol o el azul de bromofenol y para los moderados el rojo del fenol. Existen medios especiales que pueden utilizarse para la diferenciacin de ciertas especies ; sin embargo la mayora de estos medios puede crecer

otros microorganismos. La azida puede adicionarse para hacerlos mas selectivos.

15.3. Materiales - todo lo necesario para la preparacin y dilucin de los homogenizados de alimentos. - caja de petri adicionadas de prpura de bromocresol (PCA-BCP) agar plate count-prpura de bromocresol - pipetas de 1 ml estriles - incubadora a 37c

15.4. Mtodos - preparar homogenizado y diluciones segn muestra - marcar las caja de agar prpura de bromocresol con fecha, numero de grupo muestra, y dilucin correspondiente. - pipetear a 0.1 mL de cada dilucin sobre cajas de petri con medio PC prpura de bromocresol y esparcir el inoculo con varilla de vidrio. - incubar las cajas a 37c por 48 horas.

15.5. Resultados - transcurrido el tiempo de incubacin sacar las cajas - hacer el conteo de la unidades formadores de colonias que presenten un halo amarillo alrededor. - reporte como unidades formadoras de colonias de organismos productores de cido por gramo del producto.

EXAMEN DE EMPAQUES Y CONTENEDORES PEQUEOS

18.2 OBJETIVOS Verificacin de las condiciones microbiolgicas por parte del estudiante de diversos empaques de alimentos. Familiarizar al estudiante con mtodos para verificar la poblacin microbiana de los empaques. Interpretar valores de referencias en el ensayo de diferentes empaques

18.3 INTRODUCCION Los empaques, materiales indispensables en la industria de alimentos, tirar como funcin principal es aislar al alimento de la accin nociva de agentes externos como humedad, luz gases y agentes biolgicos. Es por lo tanto lgico que el material utilizado para el envase de alimentos deba ser controlado para asegurar que no aporte microorganismos alterantes al producto durante su transporte y/o almacenamiento.

Un empaque deficiente puede deshacer todo lo obtenido por buenas prcticas de manufactura. Los empaques se clasifican en primarios, secundarios y terciarios. Los primarios son los que estn en contacto directo con el alimento (envase). Los secundarios son los que brindan proteccin al envase y una vez cumplida esta funcin son desechados. Los terciarios, son cajas o envolturas exteriores que contienen alimentos ya envasados y por lo tanto no entran en contacto con el alimento, constituyen el embalaje.

Son mltiples los materiales usados para empacar alimentos en Colombia se usan tradicionales e industriales. Los materiales para empaques industriales comprenden: Metales aceros recubiertos por cromo en muy pequeas cantidades, aceros recubierto con estao o aluminio. Vidrio. -Polmeros: Polietileno, polipropileno (PP) cloruro de polivinilo (PVC) cloruro de polivinilideno (PVDC) poliestireno, resinas de acrilonitrilo butadieno polister, nylon, resinas alquilitas, oleoresinasas y acrlicos.

-Papel, cartulina y cartones. -Madera. En ocasiones estos solo elementos resultan insuficientes para dar proteccin al alimento, se crean entonces empaques constituidos por hojas de capas mltiples plsticos y laminados metlicos. El poliestireno y otros plsticos no pueden ser degradados por los microorganismos por lo tanto resultan mas higinicos que empaques de papel y derivados de madera. Es una practica comn impregnar los empaques con soluciones bacteriostticas o fungistticos ejemplo de estos son las envolturas de queso las cuales son tratadas con acido srbico o caprilico.

18.4 MATERIALES Empaques a analizar. Soluciones de enjuague. (Solucin salina, agua peptonada, ringer buferada caldo nutritivo 20- 100mL) Incubadora a 35 o C Pipetas de 5 y 10 mL Bao de agua a 45 -50 o C. 9 cajas de petri Agar PCA Agar OGY, Mycosel o agar patata glucosa Agar violeta cristal rojo neutro (VRBG).

METODO Aadir 20 mL de solucin ringer (diluyente) para contenedores de ms de un galn usar 100 mL de solucin. Agitar vigorosamente, gire el empaque 90 grados y agite nuevamente, invierta y repita. Marque 2 cajas de petri estriles por cada microorganismo que desee investigar, y deposite 1 mL del enjuague del empaque en cada caja. Tambin puede usa 3 cajas de petri y distribuir 10 ml por las tres cajas, vierta en las cajas el medio de cultivo indicado de acuerdo al microorganismo a investigar. Dejar solidificar e incubar a 37o C por 24 horas.

18.5 LECTURA Transcurrido el tiempo de incubacin contar el numero de UFC de cada caja sacar un promedio para cada microorganismo estudiado de acuerdo al medio de cultivo utilizado.

Si usa 20 mL de solucin diluyente el resultado y usa 19 mL el resultado ser multiplicado por 2. El nmero de colonias de las cajas que fueron sembradas con 1 mL ser multiplicado por 10 para hallar el nmero de UFC por empaque o contenedor.

Es necesario tener en cuenta el nmero y tipo de microorganismos, el tipo de microorganismo es importante ya que algunos pueden causar deterioro del empaque. Normalmente son encontrados en pequeo nmero o son inofensivos de igual manera el nmero de microorganismo aadido por empaque es menor que el aadido por el propio alimento. Sin embargo un alimento estril debe ser envasado en un empaque estril confederando esto como un punto crtico de control.

Referencias: Empaques para leche pasteurizada solo es permitido 1 UFC /mL o no ms de 1 colonia por cm2 No debe existir la presencia de coliforme en ningn empaque. Para recipientes de uso repetido como botellas de bebida es de 1 por cm2 En estados Unidos el papel para envasado no debe sobrepasar 250 microorganismo por gramo, y los recipientes y tapas para leche no ms de 1 por cm2

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