INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES Prcticas 1 y 2: Efecto de los reguladores de crecimiento

en un cultivo de callos de zanahoria (Daucus carota) Cultivo de Clulas vegetales en suspensin 4FM2 Equipo: The Avenger - Poison INTEGRANTES: Garca Martnez Vctor Manuel Martnez Guerra Mara de Jess Montes Nito Isa Sandoval Reyes Juan Carlos

PROFESORES: Karen Moreno Guerrero Donaj Ariadna Ramrez Lpez MXICO, DISTRITO FEDERAL A 16 de abril del 2013

Contenido

1. Prctica 1: EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO DE CALLOS DE ZANAHORIA (Daucus carota) ............................................................................................................. 1 2. 3.1 3.2 3.3 4 5 6 7 8 9 10 11.1 11.2 11.3 12 13 14 15 16 Objetivos ..................................................................................................................................... 1 Metodologa ............................................................................................................................ 2 Preparacin del medio MS .................................................................................................. 2 Desinfeccin del explante e introduccin al medio de cultivo ........................................... 3

Resultados experimentales ......................................................................................................... 4 Anlisis de Resultados ................................................................................................................. 7 Conclusiones.............................................................................................................................. 10 Referencias ................................................................................................................................ 11 Anexo 1: Cuestionario prctica 1 .............................................................................................. 11 Prctica 2: Cultivo en suspensin .......................................................................................... 15 Objetivos ............................................................................................................................... 15 Metodologa .......................................................................................................................... 16 Preparacin del medio MS ................................................................................................ 16 Siembra de callos en medio lquido .................................................................................. 16 Resultados ............................................................................................................................. 17 Anlisis de resultados ............................................................................................................ 20 Conclusiones.......................................................................................................................... 22 Referencias ............................................................................................................................ 23 Anexo 2. Cuestionario prctica 2 .......................................................................................... 23

1. Prctica 1: EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO DE CALLOS DE ZANAHORIA (Daucus carota) 2. Objetivos
GENERAL: Analizar el efecto de los reguladores de crecimiento, logrando la generacin de callos de un cultivo de zanahoria (Daucus carota) ESPECFICOS: Llevar a cabo la preparacin de medios de cultivo (MS) y analizar los puntos crticos de su preparacin. Observar las caractersticas de el callo de zanahoria (Daucus carota) Realizar de forma correcta un protocolo de desinfeccin al explante de zanahoria (Daucus carota) Toma de un explante de zanahoria (Daucus carota) en condiciones aspticas, y cultivo del explante en el medio MS. Observar el comportamiento de los reguladores empleados en los cultivos vegetales a diferentes concentraciones, a travs de los callos obtenidos.

3.1
3.2

Metodologa
Preparacin del medio MS
Suplementar con los reguladores de crecimiento. 2,4-D y BAP, ANA

Pesar el medio basal MS (Cada equipo ocupo 125 mL, para 5 frascos Gerber)

Disolver con agitacin en l de agua destilada

Agregar 1.0502 g de agar y completar el volumen total del medio

Ajustar el pH del medio con NaOH 1N o H2SO4 1N a 5.8

Agregar 20g/l de sacarosa y disolver

Homogenizar y clarificar el medio

Vaciar cada frasco gerber con el volumen requerido

Esterilizar a 121C durante 15 minutos

Enfriar y tapar con polipropileno cada tapa de cada frasco y rotular.

Figura 1.Frascos empleados para el medio MS.

3.3

Desinfeccin del explante e introduccin al medio de cultivo

Se lavo la zanahoria con una solucin de agua y jabn , y enjuagar con agua. Se Sumergio en una solucin de etanol al 70% por 30 seg.

Se selecciono una zanahoria a utilizar en el cultivo

Se enjuago con agua estril , y con el agitador.

Se sumergio la zanahoria en una solucin de hipoclorito por 10 min. (Se realiz en la campana)

Se enjuago con agua destilada y se retiro.

Se corto la zanahoria en trozos de 1cm maximo de grosor (no se usaron las puntas)

Cada trozo se corto en 4, procurando obtener la mayor cantidad de cambium posible.

Se colocaron 4 trozos en cada frasco que contenia ya el medio MS estril.

Se Incubarn a 2426C con un fotoperiodo de 16 horas de luz por ocho de obscuridad.

Se taparn con polipropileno cad auno de los frascos.

Figura 2. Material empleado en la desinfeccin del explante y su introduccin al medio MS

4 Resultados experimentales
En el cuadro 1 se muestran los resultados obtenidos de cada equipo despus de una semana de haber cultivado los explantes de zanahoria. Cuadro 1. Datos de explante a la semana de haber cultivado.

Equipo Biorreactor

Frascos Viables 2

Apariencia Explantes con aparente deshidratacin Explantes con deshidratacin ,apariencia blanquecina en la superficie. Prdida parcial del pigmento y deshidratacin. -

Num. de frascos no viables 4

Tipo de contaminacin 2-Hongos 2-Bacteria

Poison

Bacteria

H. de UPIBI

2-Bacteria 2-Oxidacin 1-Bacteria 1-Levadura 4-Oxidacin

Avenger

En la figura 2 se muestra uno de los frascos contaminados despus de una semana de haber sido sembrados, lo cual indica mala tcnica asptica.

Figura 3. Contaminacin en frasco de cultivo de explante de zanahoria.

4

En el cuadro 2 se muestran los resultados de los equipos despus dos semanas de edad de los cultivos en slidos de los explantes de zanahoria. Cuadro 2. Registro de crecimiento de callos en explantes de zanahoria.

Equipo

Friabilidad Frascos Viables 5

Concentracin de Reguladores Auxina Citoquinina Crecimiento Caractersticas (ANA) (BAP) de callo de callo 0.5 x 1x-.125 0.0062mg/L mg/L 0.5x0.5x0.0175mg/L 0.0175mg/L 1x0.175mg/L 2x-0.35 mg/L No Si Blanco

Semana de aparicion 2 semanas(20 callos) 14 dias (6 callos) *7 dias(6callos) 3 semanas (8 callos) 2da siembra 1semana (3callos)

Avenger Poison

H.de UPIBI

Si

Pequeos Verdosos

Biorreactores

1.5x0.15mg/l

1.0x-1mg/L

Si

Abultado Blanquecino Hidratado

En el cuadro 3 se muestra la formulacin del medio MS, las vitaminas MS se encuentran en un Stock a 10,000x. Cuadro 3. Formulacin del medio MS.

ANA 1 mg/mL

BAP 1 mg/mL

Vitaminas MS 10,000 x

Sales MS 4.6 g/L

Sacarosa 30 g/L

Agar 6 g/L

Vitaminas MS--------------10,000 x-----------10x/L------------------1x 1.5 mL/L ANA 2,4D-------------0.1mg/L--------------1x----------------------0.1mg/mL BAP--------------------1 mg/L----------------1x----------------------1mg/mL Soluciones madre

ANA 10 mL sol. madre C1V1=C2V2 V1=1x(700mL)/1000X= 0.7 mL = 700 L

Calculo de la concentracin de los reguladores de crecimiento de equipo Avengers: ANA 0.5mg/mL BAP 1 mg/mL Para 0.5x de Auxina 0.05mg-----------1000mL x-------------125 mL x= 0.00625 mL x= 6.25 L Para 1x de citoquinina 1mg----------------1000mL x------------------125 mL x=0.125 mL x=125 l

5 Anlisis de Resultados
Lo que se analiz en esta parte de la experimentacin es el crecimiento de callos en medio slido. Para que se observara un crecimiento real de un callo se debi haber preparado el medio de cultivo, que en este caso fue el medio MS (Murashige Skoog) , ya que este se utiliza para provocar la desdiferenciacin en plantas , tambin en el medio de cultivo se encuentran las sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo de los tejidos vegetales como sales minerales que deben aportar los elementos esenciales como Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono, generalmente la sacarosa la cual fue la que se utiliz en este caso , esto debido a que hay una escasa actividad fotosinttica en los tejido in vitro. Adems, el medio puede ser enriquecido con Aminocidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento (en este caso se empleo ANA y BAP). Se prepararon 150 mL del medio MS , pero este procedimiento debe tener ciertos cuidados que son fundamentales para que el crecimiento fuera exitoso , uno de ellos es haber ajustado el pH del medio de 5 -6.5 ya que este es un factor fisicoqumico que afecta al cultivo de tejidos , por otra parte el pH despus del proceso de esterilizacin puede disminuir y ocasionar las siguientes complicaciones: Las hormonas se hacen menos sensibles , el agente gelificante puede perder su rigidez, las vitaminas pueden hacerse menos estables , entre otras que como la temperatura ideal para el crecimiento segn la bibliografa debe ser alrededor de 25 a 27 0C otro factor que es importante es haberlo mantenido a una buena humedad que tambin se indica que es en un promedio de 30% ya que si se eleva esta humedad puede inducir a una contaminacin del medio y esto afectara el crecimiento del cultivo. En algunos medios de cultivo del equipo Avengers se observaron contaminaciones, la humedad pudo ser un factor, el cual se debe de tener en cuenta al realizar este tipo de cultivos. Ya que el medio de la mayora de los equipos no se observ ninguna contaminacin del medio se procedi a la eleccin del vegetal para poder extraer el explante el cual deba tener ciertas caractersticas , como , deba ser una zanahoria joven que tuviera un color naranja brilloso , no estuviera daada con cortes, que estuviera firme, y que al hacer el corte mostrara un cambium que fuera de tamao considerable ya que de ah obtendramos clulas meristematicas que estas nos dice que son tejidos embrionarios capaces de diferenciarse o perpetuarse; es decir, se multiplican activamente para formar los tejidos adultos diferenciados (crecimiento y especializacin) y a su vez originan nuevas clulas meristemticas. , al ser joven tejido este podra soportar las condiciones del medio de cultivo que busca estresar a las clulas meristematicas . Esto se llev de igual manera que en la elaboracin del medio en condiciones aspticas con la desinfeccin del vegetal, con Etanol al 70% e Hipoclorito de sodio al 10%, el agregar hipoclorito de sodio para algunos equipos afecto ya que en principio se dej el tiempo para agragar en 10 min. pero algunas zanahorias no resistieron el tratamiento, esto pudo ser causado porque la zanahoria no estaba en buenas condiciones ( no era joven ) o tambin que el cloro que se utilizo estaba muy concentrado y se debi hacer otra solucin con otras concentraciones ms bajas para que los explantes resistieran el tratamiento. Este punto es crtico ya que si
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se deja una cantidad de tiempo mayor a la que se requiere para desinfectar a la zanahoria, esta se puede morir, esto se observa por que la zanahoria toma un color blanco; adems de que se debe de realizar en la campana ya limpia.Otra fuente de contaminacin puede provenir de la zanahoria ya que esta probablemente no se desinfecto completamente. Al realizar la eleccin del vegetal y haberlo limpiado se trabaj en la campana de flujo laminar que esta debe estar estril al igual que el material que se utiliz en la campana (Bistur , pinzas, cajas Petri , agua destilada), al desinfectar el rea de trabajo con etanol al 70% , se procedi a realizar el corte de la zanahoria para poder obtener del cambium las clulas meristematicas , el corte deba ser considerable para que abarcara el cambium esto dependiendo de las zanahorias, al ver los resultados de la Tabla1 y Tabla2. Se observa que para nuestro equipo Avengers no se mostr ningn crecimiento esto pudo ser que al hacer los cortes no se supo manejar bien el bistur , se utilizaron dos hojas de bistur lo cual se vio reflejado en el resultado de nuestros cultivos al haber contaminacin , ya que como se dijo anteriormente uno de los objetivos del CTV es tener nuevos cultivos sin contaminacin por lo que en las dos sesiones que se realiz este procedimiento se tuvo el mismo problema , viendo los dems comparaciones los que obtuvieron mejor obtencin fue el equipo de Biorreactores y Poison los cuales independientemente de las condiciones de asepsia que se usaron que si son importantes , aqu el objetivo es comparar las diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento que se aplicaron al medio de cultivo , la bibliografa muestra unos datos sobre la concentracin de auxinas la cual se us en el medio solido Ms , de 1 a 2 m/gL de 2,4-D y 30 mg/L de sacarosa en este punto de comparacin es importante decir que nosotros ocupamos ANA como regulador , y se sabe que la mayora de los sistemas embriognicos requieren , para la induccin de los embriones de una alta concentracin de auxinas (generalmente 2-4-D) en el medio esto porque las auxinas como se dijo anteriormente tienden a llevar a una modificacin a las clulas modificando su funcionamiento celular y activan su metabilismo y como consecuencia la divisin celular y el crecimiento celular . El cido naftalenacetico (ANA) se usa normalmente para inducir la formacin de races adventicias, que sera uno de los beneficios que tendramos con el uso de ANA. Comparando con otra referencia, se realiz un estudio para crecimiento de callos en zanahoria donde presentan varios tratamientos en los cuales se muestran:

Como se ve uno de los mejores tratamientos que se mostro fue el 7 en el cual se muestra un parecido con el tratamiento de bieorreactores que se muestra en la Tabla2 que fue de auxina(ANA) 0.15mg/L y de citoquinina (BAP) 1mg/L , comparando con el estudio realizado se us una menor concentracin de BAP que el de Biorreactores sabiendo que
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las citoquininas que promueven la divisin y la diferenciacin celular , es por eso que se mostr un mejor crecimiento de callo en ese equipo , se duplico el uso de BAP produciendo este efecto . Las condiciones de incubacin deben ser adecuadas, debe de incubarse el medio tapndolo con polipropileno, incubar a una temperatura de 24-26C con un fotoperiodo de 16 horas de luz por ocho de obscuridad.El medio debe de estar bien tapado, esta puede ser una fuente de contaminacin de algunos de nuestros medios.

6 Conclusiones
Algunos de los puntos criticos de la preparacin del medio MS es la humedad que hay en l, debe tener un pH dentro del rango aceptable, y se deben de esterilizar y tapar de forma adecuada para evitar contaminaciones. La desinfeccin de un explante de zanahoria (Daucus carota), debe ser con una solucin de hipoclorito de sodio que tenga una concentracin adecuada, adems se require de un tiempo necesario para desinfectar los explantes, y no matarlos. Se tomaron explantes de zanahoria en condiciones aspticas, y se cultivaron en medio MS. Se observo el comportamiento de los reguladores empleados en los cultivos vegetales a diferentes concentraciones, a travs de los callos obtenidos. Hubo mayor obtencin de callos a la concentracin de 0.5x (0.0175mg/L) de ANA y 0.5x (0.0175mg/L) de BAP, en menos tiempo. Los reguladores presentan diferentes comportamientos dependiendo de su concentracin y de lo que se quiere obtener en el medio de cultivo. El callo de zanahoria (Daucus carota) que es capaz de diferenciarse se debe de observar friable, de un color blanco y verdoso.

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Referencias

Salvador Rojas Gonzlez , Jairo Garca Lozano, Propagacin Asexual de plantas, Edit. Corpoica, pag-10-12.
William M. Roca, Luis A. Mroginski, Cultivo de tejidos en la agricultura: fundamentos y aplicaciones,Edit.CIAT.1991.pag.433.

8 Anexo 1: Cuestionario prctica 1

1. Investiga y clasifica los componentes del medio de cultivo MS

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2. Elabora un diagrama de bloques que describa como es preparar

Pesar el medio basal MS 3.01g para 700 ml

Disolver con agitacin en 50 ml de agua destilada

Suplementar con los reguladores de crecimiento. 2,4-D y BAP, ANA

Agregar 20g/l de sacarosa y disolver

Vaciar cada frasco gerber con el volumen requerido

Homogenizar y clarificar el medio

Agregar 0.25 gr de agar y completar el volumen total del medio

Ajustar el pH del medio con NaOH 1N o H2SO4 1N a 5.8

Esterilizar a 121C durante 15 minutos

Enfriar y colocar mega-pack a cada tapa de cada frasco.

3. Define que es totipotencialidad Del latn totuspotens, "totus" (todo) y "potens" (poder o habilidad), el trmino clula totipotencial es utilizado en biologa para refrirse a clulas que poseen la capacidad de dar origen a otros tipos celulares, incluso pudiendo una sola de estas clulas dar origen a millones de clulas, tejidos, rganos, hasta incluso embriones. Diferenciacin en cualquier tipo de clula La mayora de especies vegetales mantienen esta caracterstica de totipotencialidad en gran parte de sus clulas, y de llevar a buen trmino la generacin de un nuevo espcimen, asexualmente As mismo, muchos animales poseen regiones corporales con este tipo de clulas y pueden regenerar tejidos. Las "clulas madre" son un ejemplo de clulas totipotenciales. Tambin la totipotencialidad es una caracterstica que posee la mrula, que luego de la blastulacin comienza a dar origen a nuevas clulas con distintas funciones. 4. Qu es un tejido meristemtico? De la palabra griega meristos que significa divisible, este se caracteriza por su activa divisin celular y es el encargado del crecimiento del vegetal. Se encuentran en Apicales, Laterales e Intercalarios
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5. Qu es un callo vegetal? Tejido desorganizado formado por una masa de clulas vegetales tumorales debido a que stas crecen de manera descontrolada. La mayora de estas clulas estn en estado diferenciado salvo algunas que revierten al estado indiferenciado

6. Qu es el cambium? Realiza un esquema que ilustre el cambium de una zanahoria Es un tejido vegetal meristemtico especfico de las plantas leosas, situado entre la corteza y el leo, compuesto normalmente por una capa nica de clulas embrionarias. Cada ao el cmbium origina dos capas de clulas adultas. La primera, hacia el interior, es de leo (xilema); stas son las que forman la madera y se reconocen luego como anillos de crecimiento. La segunda, hacia afuera, es otro tipo de tejido el floema, que transporta savia elaborada en direccin a las rac

7. Qu es una solucin stock o solucin madre y como se prepara? Son composiciones concentradas de nutrientes las cuales estn formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al elevado nmero de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentracin, resulta ms prctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Para prepararlo se utilizan para la preparacin de las 4 soluciones que componen al medio de cultivo para la propagacin de plantas in vitro es por ello que al momento de querer preparar dicha solucin se deben de hacer clculos dependiendo la cantidad de plantas que se deseen cultivar, de acuerdo a esto mediante los clculos ya que por medio de estos
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se indicara cuanto se pesara de cada componente del MS; con el fin de poder obtener un buen manejo y por lo tanto esto permite que se tenga una buena propagacin.

8. Cules son los disolventes comnmente empleados para preparar 2,4-D, ANA, BAP y ZINETINA? Sacarosa, agua, glicerol, etc. 9. Qu es la tcnica asptica? El trmino asptico significa "sin microorganismos." La tcnica asptica se refiere a las prcticas que reducen la posibilidad de que los microorganismos entren en el cuerpo durante procedimientos clnicos, reduciendo as a su vez el riesgo de que los usuarios se infecten ms tarde. Algunas de estas prcticas tambin disminuyen la posibilidad de que los profesionales de salud tengan contacto con sangre y tejidos infecciosos durante los procedimientos clnicos. 10. Qu es el fotoperiodo? En qu unidades se mide?Cules son los rangos de intensidad y duracin de luz mas comunes? Son los cambios de iluminacin que reciben las plantas, que pueden modificar su germinacin. Siendo un lapso de tiempo en horas y fraccin que dura el da civil ms la duracin de los crepsculos matutino y vespertino.

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9 Prctica 2: Cultivo en suspensin 10 Objetivos

GENERAL: Conocer el procedimiento para el cultivo de clulas vegetales en suspensin con el medio Murashige and Skoog (MS)

ESPECFICOS: Realizar los procedimientos para los cultivos de clulas vegetales en suspensin. Analizar las diferentes concentraciones de citosinas y auxinas en cada uno de los equipos y comprobar los resultados En base a anlisis y resultados ver la eficiencia del medio en suspensin y las deficiencias del mismo y las posibles mejoras.

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11.1 Metodologa
11.2 Preparacin del medio MS
Pesar el medio basal MS Disolver con agitacin en l de agua destilada Suplementar con los reguladores de crecimiento. 2,4-D y BAP, ANA

Homogenizar el medio

Ajustar el pH del medio con NaOH 1N o H2SO4 1N a 5.8

Agregar 20g/l de sacarosa y disolver

Vaciar en dos matraces Erlenmeyerde 500 mL el volumen requerido

Esterilizar a 121 C durante 15 minutos

Enfriar cada matraz y rotular

11.3 Siembra de callos en medio lquido

Se pesaron los matraces con medio MS

Se tom el explante con callo en condiciones de esterilidad

Se coloc el explante en caja petri estril con papel filtro

Se coloc el matraz en agitacin a 150 rpm

Se pes el matras con medio MS y callo

Despus , el callo se coloc en el matraz con medio MS

Se cort el callo

Se incub a 25 C

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12 Resultados
Las citoquininas ms usadas en cultivo de tejidos son quinetina, benziladenina y zeatina Se las adiciona en relativamente bajas del orden de 0,1 a 1 mg/L. Son solubles en HCl 1 N. En el cuadro 1 se muestran las concentraciones utilizadas por cada equipo en la prctica de cultivo en medio slido. Cuadro 1. Concentracin obtenida por los equipos EQUIPO Poison Avenger Hijos de UPIBI Biorreactores Auxinas 0.5 x0.0125 mg 0.0125 mg 6.25x10-3 ml 0.5 x 1x 1.5 x Citocinas 0.5 x0.0125 mg 6.25x10-3 ml 1x 2x 1x

En el cuadro 2 se muestran los pesos obtenidos de los matraces antes y despus de inocular con los callos obtenidos previamente en la prctica de cultivo en medio slido. Cuadro 2. Peso de la biomasa obtenida Cultivos en suspensin Matraz pesos (antes de inocular) g Avenger-poison Avenger-bio 122.2864 g 113.2929 g Matraz pesos (despus de inocular)g 125.4395 g 116.6303 g
Peso del callo inoculado 3.1531 g 3.3374 g

En el cuadro 3 se muestra los resultados obtenidos de la observacin de cada equipo del cultivo de clulas vegetales en medio lquido a las 4 semanas de edad, describiendo si se present crecimiento o no de clulas vegetales, si se present diferenciacin en alguno de los cultivos o no.

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Cuadro 3. Observaciones del cultivo en medio lquido. Medio Liquido Equipos Edad (inoculo) Estado del Estado del cultivo cultivo (1 semana) (3 semana) contaminacin Altamente contaminado Diferenciacin Crecimiento Regeneracin (+) y Efecto (-) esperado Las mismas en solido se esperaba un crecimiento medio y alta disgregacin. Se esperaba un crecimiento y mucha disgregacin +++ Clulas disgregadas Mayor produccin de clulas totipotenciales

Bioreactores

no

Hijos de Upibi

4 semanas 2 semanas Avenger - 4 Poison semanas

Poca turbidez Sin turbidez Poca turbidez

Turbio

no

Turbio

si

En la figura 1 se muestra el matraz del medio de cultivo en medio lquido.

Figura 1. Matraz con clulas vegetales de 4 semanas de edad con callos del equipo Poison (matraz del lado izquierda) y con callos del equipo biorreactores (matraz del lado derecho).
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En la figura 2 se muestra uno de los matraces del cultivo en suspensin a las 4 semanas de edad, en ste se muestra una disminucin del medio de cultivo.

Figura 2. Se observa una disminucin del medio se toma una muestra para tincin de Gram Y otra de azul de tripano. Muestra avenger-bio en la fecha 26 /03/2013

Figura 3. Tincin1. En la muestra no se observa muestra de clulas vegetales o contaminacin con otra cepa bacteriana

Figura 4. A la 3 semana se toma otra muestra 9/04/2013 del medio poison avengers.
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Figura 5. Tincin 4 y 5. En la imagen del lado izquierdo, se observan clulas de azul las muertas (tincin con azul de tripano). En la imagen del lado derecho se observ un conjunto de clulas vegetales a 10X. Tincin 6

Figura 6. Tincin 5. Se observa el aglomerado de las clulas 40X.

13 Anlisis de resultados
Los resultados de la tabla 1 se utilizaron para decidir a qu concentracin se iba a trabajar con los reguladores de crecimiento vegetal (citocininas y auxinas) para el cultivo en medio lquido, se eligi la concentracin utilizada por el equipo de biorreactores despus de hacer un anlisis de la friabilidad del callo obtenido por ste equipo, dndonos como resultado la concentracin de citocinina de 1 mg/l y una concentracin de auxinas de 0.15mg/l. En el medio se utilizaron ms auxinas que citocinas ya que con las citocinas logra el crecimiento celular de los callos obtenidos y as logramos un mayor proceso de crecimiento ya que al llegar a la clula provoca dos respuesta en esta una rpida y otra lenta. La primera hay un crecimiento rpido de las vesculas de la clula donde los genes ya estimulados que sintetizan las ATP asas y enzimas hidroliticas en la pared celular de nuestras clulas. Las ATP asas tienden a bombear protones donde hay enzimas hidroliticas donde rompen la pared celular.

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Y en el otro caso la respuesta lenta es en el aplazamiento o regresin de los que logran la generacin de nuevos compuestos de la pared celular de nuestras clulas. Y en el caso de las citocininas promueven la divisin de nuestras clulas y la divisin de estas pero en nuestro caso queramos un aumento mayor en biomasa y no el surgimiento de nuevos rganos de la clula ya sea en tallos y races si nuestro objetivo era el de obtener un planta o generar varias plantas en cultivo in vitro pero en nuestro caso no era. Ya que con el conjunto de estas era la de favorecer el ciclo celular ya que lo que queramos era mejorar el rendimiento de la clula y as lograr un mayor produccin de biomasa. En ese caso se utiliz un medio lquido ya que la clula tendra mayor libertad de desplazamiento y as aprovechar los nutrientes en el medio y favorecer al crecimiento necesario y en otro caso la de incubacin ya que se pude agitar y mantener en eses estado y distribuirlos en su medio y las condiciones de temperatura y estrs al cual fue sometidas al tapar con aluminio el matraz. Cabe mencionar que el matraz Avenger-poison se inocul con 3.1531 g de callo aproximadamente debido a que se pudo haber sembrado parte del explante de la zanahoria debido a la inexperiencia por parte de los alumnos para extraer slo al callo. El matraz Avenger-biorreactores se inoculo con 3.3374 g de de callo pudiendo ocurrir el mismo error ya explicado.

Figura 7. Para un mejor resultado se estres a las clulas y se les coloc papel aluminio a los matraces, se volvi a incubar se revise una semana despus de vacaciones. En el caso de viabilidad, se realizaron tinciones de Gram para cada uno de los matraces por duplicado y tambin se realiz por duplicado, tincin en fresco con azul de tripano donde se comprob que el medio estaba libre de patgenos. En la tabla 3, se presenta una prueba de contaminacin por medio de las tinciones de Gram y con la tincin de azul de tripano en dnde algunos equipos anotaron que sus
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cultivos casi no tenan turbidez esto debido a que se encontr en bibliografa que como norma general, los cultivos se inoculan con una densidad celular relativamente elevada (2x105 clulas/mL), durante la incubacin esta densidad se eleva hasta 4x10 6 clulas/mL, lo que se supone que 4 a 6 divisiones en 21- 28 das de incubacin (Coll, 1993), por lo tanto fue normal no encontrar mucha turbidez en los matraces hasta las 3 semanas de edad del cultivo en lquido. En la tabla 3, tambin se analiz si las clulas en suspensin presentaron diferenciacin celular, en dos de tres 3quipos no se presento est diferenciacin, pero en el equipo Poison-Avenger se encontr gracias a la profesora, diferenciacin celular, la cual pude apreciarse en la figura 6 de la presente prctica. En la figura 4 observamos que los matraces de medio de cultivo liquido con clulas en suspensin disminuyeron su volumen por evaporacin de agua y consumo de nutriente en el medio. En cuanto a la diferenciacin de clulas vegetales encontradas en nuestro medio de cultivo, en bibliografa se encontr que debido a la adicin de ANA a un medio con bajo BAP, favorece el crecimiento de races con o sin callo; y que a mayores niveles de ANA el crecimiento del callo aumenta (A. Rodrguez et al., 1980), eso podra explicar el porqu de la diferenciacin presentada en nuestros cultivos, una hiptesis con respecto al por qu no se present diferenciacin en los cultivos de los otros equipos, pudiera ser por la contaminacin que se present en sus matraces, impidiendo as la proliferacin de las clulas vegetales.

14 Conclusiones
Se realizaron los procedimientos para los cultivos de clulas vegetales en suspensin con xito, debido que en el matraz con medio lquido se consigui la produccin de clulas vegetales sin contaminacin cmo se mostro en la figura 6, aunque cabe mencionar que el objetivo original de la prctica es la produccin de carotenoides. Se analiz las diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento vegetal, citocinas y auxinas en cada uno de los equipos y comprobar los resultados, se utiliz la concentracin de reguladores del equipo de biorreactores; de citocininas se utiliz una concentracin de 1 mg/l y de auxinas una concentracin de en un volumen de 0.15mg/l. Se concluyo que debido a la adicin de ANA a un medio con bajo BAP, favorece el

crecimiento de races con o sin callo; y que a mayores niveles de ANA el crecimiento del
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callo aumenta segn lo reportado por A. Rodrguez et al., 1980, y que debido a la contaminacin de los otros equipos, ste efecto slo se presento en nuestro cultivo.

15 Referencias
A. Rodrguez J., Beltrn J. Ceballos, L. F.& M. Roca, W (1980) Gua de estudios. El cultivo de meristemos de Yuca. Cali, Colombia: Centro internacional de agricultura tropical, CIAT. Coll Morales, J. (1993) (Vol. 1) Tcnicas de diagnostico en virologa. Madrid: Ediciones Daz de Santos. Eichhorn, Evert, Raven (1992) Biologa de las plantas. Barcelona: editorial Revert. Vol. 46, (1998) Cultivo y uso del bamb en el Neotrpico. Revista de biologa tropical. Universidad de Costa Rica.

16 Anexo 2. Cuestionario prctica 2

1.- Que funcin tiene el BAP? Estimulan la divisin celular y crecimiento Inhiben el desarrollo de races laterales Promueven las organognesis en los callos celulares Promueven el desarrollo de los cloroplastos Retrasan la secuencia o envejecimiento de los rganos vegetales

2.- Qu funcin tiene el 24-D? Es un inhibidor del crecimiento al imitar a la hormona auxina de la planta
3.- Que es la friabilidad? Grados de disgregacin de una clula 4.- Menciona, por lo menos una estrategia para incremental la friabilidad de las clulas? Para aumentar la friabilidad (callo disgregable) del tejido calloso, se incrementa la concentracin de auxinas o se disminuye la concentracin de citoquininas en el medio de cultivo.

5.- investiga y comenta un ejemplo de la aplicacin de cultivo de clulas en suspensin aplicado a la farmacologa. El cultivo de clulas, (suspensiones celulares) permite un manejo similar al que se realiza con microorganismos, lo cual nos sirve para la obtencin de metabolitos secundarios de inters farmacutico, un ejemplo de esto es la obtencin de antraquinonas de Morinda Citrifolia, la cual se ha utilizado para tratar el cncer, infecciones, artritis, diabetes, asma, hipertensin, dolor, dificultades menstruales y cecfaleas. 6.- Menciona al menos un mtodo de recuperacin de la biomasa o de algn metabolito
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Cromatografa o afinidad Produccin de un biocatalizador

7.- Menciona las ventajas que tiene el cultivo de clulas vegetales frente a los cultivos microbianos y de clulas animales Ventajas Recuperar biomasa Obtener subproductos Mayores productos Desventajas Costos Tiempo de obtencin del metabolito Equipo caro Crecimiento lento

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