SELECCIN DE UN INCULO PARA LA BIODEGRADACIN ANAEROBIA DE LA PULPA DE CAF

Adis Ivonne Terry Brown, Rosa Catalina Bermdez, Suyn Rodrguez Prez, Maikel Fernndez Biozan
Centro de Estudios de Biotecnologa Industrial, Universidad de Oriente

La pulpa de caf es uno de los residuos slidos contaminantes de la industria cafetalera, la misma constituye el 40 % del peso del fruto. En el presente trabajo se estudian tres fuentes de inculos naturales (estircol vacuno, fango sobrenadante y fango sedimentado, provenientes de despulpadora), para la degradacin anaerobia de la pulpa de caf variedad Coffea arabica L. en biorreactores discontinuos. Se valora, adems, la influencia del tratamiento trmico de los inculos a 80 oC por 15 min antes de la incubacin, en la produccin acumulada de metano y en la actividad de las enzimas celulolticas. El estircol vacuno sin tratamiento trmico fue la variante de inculo que muestra los mayores valores de produccin acumulada de metano, actividad metanognica relativa y actividad enzimtica celulosa total, siendo 10,29 L; 0,004 mL CH4/g SV * d y 0,263 7 m moles.min-1mL -1, sus valores respectivos, por lo que se puede plantear que el estircol vacuno es el ms recomendable de los inculos estudiados para la puesta en marcha de digestores que utilizan la pulpa de caf como sustrato. Palabras clave: digestin anaerobia, inculo, celulasa, enzima, pulpa de caf.
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Coffee pulp is one of the polluting solid residuals of the coffee industry, it constitutes 40 % of the weight of the fruit. In the work reported here three sources of inoculum were assayed (bovine manure, supernatant and sedimenting muds coming from humid benefic center), for the anaerobic degradation of pulp of the variety Coffea arabic L. in a bioreactor carrying out a batch fermentation. The influence of each inoculum on methane production and cellulolytic enzymatic activity was tested. The bovine manure without heat treatment showed the biggest value of methane production, relative methanogenic activities and total cellulase activity, this value was 10,29 L; 0,004 mL CH4/ g SV * d and 0,2637 m moles.min-1mL -1 respectively. The results suggested that bovine manure was the most advisable inoculum for the starting of digestors that use the coffee pulp as substrate. Key words: anaerobic digestion, inoculum, cellulase, enzyme, coffee pulp.

Introduccin
La pulpa es un residuo slido generado en la industria del caf. sta causa un olor contaminante y las molestias asociadas a su expansin en los cultivos de caf. Posee numerosos problemas para su distribucin y almacenaje, por lo que ha sido tratado para su potencial uso en la produccin de metano, a travs de la digestin anaerobia. /6, 8, 12/ Este residual se caracteriza por poseer color rojo, tiene caractersticas esponjosas, o sea, que absorbe una gran cantidad de agua. El contenido de humedad de la pulpa de caf fresca es alto, lo que presenta una de las mayores desventajas para su transportacin, manejo y procesamiento. El material ya deshidratado contiene alrededor de un 10 % de protena cruda, 21 % de fibra

cruda, 8 % de cenizas, 4 % de extracto de nitrgeno y una gran variedad de metales. /29/ En la pulpa se encuentran otros compuestos orgnicos tales como taninos, sustancias pcticas, azcares reductores y no reductores, cafena, cido cafeco, carbohidratos y aminocidos. /7/ Las bacterias celulolticas anaerobias son interesantes, no slo debido a que ellos son organismos iniciadores del proceso de digestin, sino tambin porque muchas cepas resultan prometedoras con respecto a la produccin de celulasas a partir de materiales celulsicos complejos. /24/ De esta manera, las bacterias celulolticas pueden ser industrialmente explotadas para la conversin de celulosa a glucosa, y tambin para aumentar la degradacin de residuos que contienen celulosa.

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Estas enzimas, denominadas celulasas, forman un complejo enzimtico, que al menos consiste de cuatro clases de enzimas, que actan sinrgicamente y solubilizan la celulosa cristalina a glucosa: endo-1,4- -glucanasa, exo1,4- glucanasa, celobiosilhidrolasas y celobiasas. En bacterias, las celulasas tienen una alta especificidad, y poseen endoglucanasas, exoglucanasas y celobiasas en buena cantidad. /11, 20-22, 27/ Las bacterias anaerobias celulolticas poseen un nico complejo extracelular multienzimtico, llamado celulosoma. La unin de una protena estructural no cataltica estimula la actividad de las enzimas requeridas para la hidrlisis del polisacrido como es el caso de las enzimas celulasa, celobiohidrolasa, xilanasa, endoglucanasa, quitinasa, etctera. La estructura ms compleja y ms estudiada de celulosoma es la de la bacteria termfila Clostridium thermocellum. /25/ Otro de los microorganismos en los cuales ha sido estudiada esta estructura es en la bacteria Ruminococcus albus. 18 La aplicacin de la digestin anaerobia, ha demostrado ser un modelo de costo efectivo para la transformacin de residuos orgnicos complejos a residuos inocuos, metano y dixido de carbono, logrndose as la reduccin de la carga orgnica contaminante de los mismos. Otras de las ventajas de la digestin anaerobia son: su bajo costo inicial y operacional, necesidad de menos terreno, alta eficiencia en la remocin orgnica, baja produccin de lodos, combinado con un beneficio de energa neta a travs de la produccin de biogs. /14, 15/ Esta tecnologa de tratamiento anaerobio ha sido desarrollada como mtodo para biodegradar residuos slidos y lquidos, entre ellos se encuentran el estircol porcino /3/, pulpa de caf /8/, cachaza /22/, aguas residuales del caf /23/, vinaza de destilera. /28/ La biodegradacin de la materia orgnica a gases se lleva a cabo por un nmero de enzimas; como es el caso de la formato liasa presente en la enterobacteria, responsable de la generacin de hidrgeno a partir de formiato, y su rol fundamental es la remocin del oxgeno. La accin de estas enzimas trae consigo la formacin de una gran variedad de intermediarios de importancia comercial, como es el caso del cido actico, cido

butrico, etctera, y en particular, las enzimas involucradas en la degradacin de la celulosa. Para lograr un adecuado proceso de biodegradacin de la materia orgnica, es obvia la importancia de contar desde el punto de vista microbiolgico de una adecuada fuente de inculo. Es importante que todos los grupos trficos participantes en el proceso se encuentren en una buena proporcin, y sobre todo que persistan en condiciones de operacin. Hasta el presente, dada la complejidad del ecosistema slo se utilizan inculos obtenidos a partir de ambientes anaerobios, es as que se usan inculos naturales como el rumen de diferentes animales y lodos anaerobios de lagunas o fondo del mar. Tambin se emplea el lodo de digestores rurales u otros digestores. Durante la realizacin de este trabajo nos proponemos como objetivo principal: determinar la mejor variante de inculo, para degradar anaerbicamente la pulpa de caf, utilizando tres inculos: estircol vacuno, lodo y fango provenientes de despulpadoras.

Materiales y mtodos
Localizacin de los inculos y residuos utilizados
Pulpa de caf: Se utiliza pulpa de caf variedad Coffea arbica L., colectada en la despulpadora La Zarza del municipio, en la cosecha 19981999. sta fue secada al sol durante 72 h. Fango I: Sobrenadante de la laguna de estabilizacin de la despulpadora Madrugn del municipio Guam, de la provincia Santiago de Cuba. Fango II: Sedimento de la laguna de estabilizacin de la despulpadora La Zarza del municipio III Frente en la provincia Santiago de Cuba. Estircol vacuno: Se utiliz estircol vacuno fresco proveniente de la finca Clotilda, donde la alimentacin del ganado vacuno es fundamentalmente pasto verde. Anlisis qumicos La determinacin de los porcientos de slidos totales (% ST), slidos voltiles (% SV) y slidos fijos (% SF) tanto para los inculos como para la

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pulpa de caf, fueron realizados siguiendo la metodologa recomendada en el Standard Methods /3/ (tabla 1). Para medir el volumen de metano

producido diariamente, a estos biorreactores se les acopl un sistema de desplazamiento lquido y timol azul como indicador (figura 1).

Reactor anaerobio

Gasmetro con NaOH (10%) Colector

Fig. 1 Diseo de digestor anaerobio utilizado en el laboratorio.

Tratamiento trmico de los inculos

Se utilizan biorreactores discontinuos de 1 L, mantenidos a una temperatura entre 28-29 o C. A los mismos se les aaden los inculos por separado, en una cantidad de 20 g de SV/ L y pulpa de caf hasta lograr un 3 % de slidos totales en el arranque. Ya cargados los digestores, a una parte de ellos se les aplic un pretratamiento trmico, el cual consiste en un calentamiento trmico a 80 o C durante 15 min. En el diseo del experimento se emplearon dos tratamientos (muestras con y sin tratamiento trmico) para cada una de las variantes de inculo empleadas y tres rplicas para cada una de stas, quedando de la siguiente forma: - Pulpa de caf + estircol vacuno sin tratamiento (E) - Pulpa de caf + estircol vacuno tratado trmicamente (ET) - Pulpa de caf + fango sobrenadante sin tratamiento (F) - Pulpa de caf + fango sobrenadante tratado trmicamente (FT) - Pulpa de caf + fango sedimentado sin tratamiento ( L) - Pulpa de caf + fango sedimentado tratado trmicamente ( LT)

Ensayo enzimtico
Las actividades enzimticas endoglucanasa, celobiasa y celulasa total, fueron ensayadas acorde con el procedimiento propuesto por Saddler y Khan /14/, siguiendo el desarrollo de la reaccin mediante la determinacin de azucares reductores. /17/ En todos los casos, se define como una unidad de actividad enzimtica la cantidad de enzima que cataliza la liberacin de 1 mol de azcares reductores (expresados como glucosa) por minuto.

Resultado y discusin
La fermentacin anaerobia de residuales provenientes de la agroindustria, bien sea del procesamiento de frutas o vegetales, ha mostrado ser un proceso de costo efectivo para la produccin de energa, en particular el metano. La pulpa de caf tambin puede ser usada como un sustrato adecuado para la produccin de biogs. /1/ Es sabido que los residuales provenientes de la agroindustria cafetalera poseen un alto contenido de material lignocelulsico, lo que hace ms difcil su solubilizacin y biodegradacin, limitando a su vez la fase de hidrlisis y fermentacin en el proceso de digestin anaerobia de estos tipos de residuos. Por lo general, las bacterias son no

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hbiles o impotentes para tomar partculas de material orgnico, y por lo tanto estos contaminantes orgnicos deben ser licuados o solubilizados a polmeros o monmeros de bajo peso molecular, los cuales pueden atravesar las barreras celulares para poder ser metabolizados. Esta licuefaccin ocurre a travs de la accin de las exoenzimas de las bacterias hidrolticas. La velocidad de licuefaccin esta determinada por la composicin qumica del sustrato (es decir, su biodegradabilidad) y la naturaleza fsica (tamao y la porosidad de las partculas separadas, la accesibilidad por las enzimas as como por los factores ambientales, en particular la temperatura), de manera que potenciar el crecimiento de bacterias celulolticas, sera una interesante estrategia para lograr aumentar la velocidad de biodegradacin del sustrato celulsico y disminuir los tiempos de retencin de la biomasa en el reactor. Debido a la complejidad fsico-qumica de los residuos slidos, se ha hecho necesario acelerar la

fase limitante (etapa hidroltica) antes de tratarlos por va anaerobia. Entre los procesos de pretratamientos se encuentran los fsicos o primarios, y dentro del mismo uno de los ms usados es el tratamiento trmico /16/, y aunque su potencialidad para mejorar el proceso de digestin anaerobia no ha sido muy explorada, es una posibilidad de aumentar la solubilidad de determinados compuestos presentes en los desechos slidos, y por ende incrementar la cantidad y velocidad de generacin de metano. /8/ La caracterizacin qumica de cada una de las variantes de inculos probadas, as como de la pulpa de caf (tabla 1) permiti asegurar las condiciones para una adecuada carga y arranque de los reactores discontinuos. Al analizar el comportamiento de cada una de las variantes de inculos empleadas durante el desarrollo de la cintica de produccin de metano (figura 2), se observ una mayor produccin de metano acumulado (PA) en la variante E, siendo ste superior a los 10 L. Tabla 1 Caracterizacin qumica de los inculos y de la pulpa de caf
% ST 16,1 60 27,89 86,3 %SV 12,6 4,91 15,42 78,0 % SF 3,5 55,09 12,47 8,3

Muestras Estircol vacuno Fango I Fango II Pulpa de caf

12

10

Metano Acumulado (L)

0 0 14 E FT 24 ET L 37 F LT 52 84

Tiempo (das)

Fig. 2 Produccin acumulada de CH4 de los inculos, con sus tratamientos.

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Este resultado se corresponde con el hecho de que es esta misma variante de inculo la que muestra los mayores valores de actividad metanognica relativa; ensayo que permite determinar el potencial metanognico de la flora microbiana presente en el inculo, siendo ste de 0,004 mL CH 4 /gSV *d (figura 3). Este resultado se encuentra en el rango de valores reportado por Senz en 1992 para la actividad metanognica especfica aproximada del estircol porcino fresco.
x10 -3 4
3,5 3

El hecho de que el estircol vacuno haya sido la variante que muestre el mayor valor de PA de metano, as como el mayor valor de actividad metanognica relativa, sugiere que las variantes de inculos F y L no sufrieron una adecuada adaptacin al sustrato, a pesar de ser estas dos variantes provenientes de lagunas de estabilizacin, donde se producen descargas diarias de residuos procedentes del proceso de despulpe de caf.

ml de CH4/ gSV

2,5 2 1,5 1 0,5 0

ET

FT

LT

Fig. 3 Actividad metanognica relativa de los inculos.

Para el enriquecimiento de bacterias celulolticas formadoras de esporas es comnmente practicado el tratamiento trmico de 10 min a 80 o C, aunque pudiera suceder que algunas bacterias no desarrollen esporas en el medio luego de este tratamiento. /13, 21/ Investigaciones realizadas por Khan en 1981, empleando cultivos mixtos tomados a partir de digestores para el tratamiento de residuales lquidos, y empleando como nica fuente de carbono la celulosa, con el objetivo de lograr la sntesis de enzimas celulolticas, arrojaron que tiempos de calentamientos de 15 min o ms son requeridos para la eliminacin completa de la produccin de metano. Es bueno destacar que el tratamiento trmico tuvo poca influencia en la produccin de metano, pues a pesar de que las variantes tratadas trmicamente no son las que muestran los mayores valores de PA y de actividad metanognica relativa, stas no fueron nulas. Adems, esto demuestra que no son la bacterias metanognicas

anaerobias formadoras de esporas, el grupo predominante en estos inculos, pues la capacidad de formar metano se vio afectada a causa del calentamiento trmico. Dicho resultado difiere con los obtenidos por Khan /13/ al emplear el tratamiento trmico de 15 min a 80 o C, para eliminar completamente la formacin de metano utilizando cultivos mixtos y estimular el desarrollo de las bacterias esporgenas a expensa de las bacterias no formadoras de esporas . El efecto del tratamiento trmico en las actividades enzimticas de cada una de las diferentes variantes de inculos ensayados, se muestra en las figuras 4, 5 y 6. El comportamiento fue bsicamente el mismo, en lo que respecta al da en que las actividades enzimticas poseen un aumento brusco y al da de mnima actividad, correspondiendo a los das 26 y 74, respectivamente. Para el caso de las actividades endoglucanasa (figura 4) y celulasa total (figura 6), se manifest un pico mximo de actividad el da 46, obtenindose la mayor actividad endoglucanasa en los digestores

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1,2

umo/ min. mL

0,8

0,6

0,4

0,2

0 0 16 26 36 46 74 109

E F.T

E.T L

F L.T

Tiempo (das)

Figura 4: Actividad Enzimtica Endoglucanasa de los Inculos

Fig. 4 Actividad enzimtica endoglucanasa de los inculos.

que tienen como inculo la variante L con un valor de 1,085 5 moles/ min.mL, mientras que la mayor actividad enzimtica de la celulasa total correspondi al estircol vacuno sin tratamiento con un valor de 0,263 7 moles/min. mL. El hecho de que la variante E, la cual no fue tratada trmicamente, muestre el mayor valor de actividad enzimtica celulasa total, nos hace suponer que el tratamiento trmico no influy de forma favorable en la estimulacin de la actividad de las bacterias celulticas formadoras
8 7

de esporas. Similar resultado fue obtenido por Khan en 1981 al emplear el tratamiento trmico de 80 o C, durante 10-30 min, y observ que el mismo tuvo poca o ninguna influencia en la degradacin de la celulosa y la formacin de cidos voltiles. En el caso de la actividad enzimtica de la celobiasa (figura 5), el da de mxima actividad para cada uno de los inculos vara, oscilando ste entre los das 36 y 46. El mayor valor de actividad fue de 7,215 8 moles/ min. mL perteneciendo ste a la variante ET.

Umol/ min. mL

6 5 4 3 2 1 0 0
E F.T

16
E.T L

26
F L.T

36

46

74

109

Tiempo (das)

Fig. 5 Actividad enzimtica celobiasa de los inculos.

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0,3

0,25

Umol/min. ml

0,2

0,15

0,1

0,05

0 0 16 26 36 46 74 109

E F.T

E.T L

F L.T

Tiempo (das)

Fig. 6 Actividad enzimtica de la celulasa total.

Debido a la especificidad de accin de las enzimas que forman parte de este complejo de las celulasas frente a los sustratos especficos, no resulta extrao observar que para las distintas fuentes de inculo, es decir, estircol vacuno, fango (F y L) se hayan manifestado actividades diferentes en cada una de las enzimas. No obstante, a pesar de que los inculos tratados trmicamente tienen una menor actividad celulasa total con respecto al estircol vacuno sin tratamiento, ellos poseen todas las enzimas del complejo de la celulasa necesario para convertir la celulosa nativa a glucosa. Este complejo de enzimas tradicionalmente ha sido clasificado como endoglucanasa, exoglucanasa y celobiasa. Las endoglucanasas preferentemente hidrolizan las regiones amorfas de las fibras, las exoglucanasas liberan celobiosa a partir del extremo terminal de la cadena, y las -glucosidasas hidrolizan la celobiosa u otras celodextrinas con un bajo nivel de polimerizacin. /4, 11, 25-27/

variantes, es decir, al fango sobrenadante y al fango sedimentado. De igual manera fue en el estircol vacuno donde se observ el mayor valor de actividad metanognica relativa (0,004 mL CH 4 /g SV * d), as como la mayor actividad enzimtica de la celulasa total con un valor de 0,263 7 moles/min.mL, por lo que se recomienda sta como la mejor variante por utilizar para la biodegradacin anaerobia de la pulpa de caf, entre todas las variantes ensayadas, en nuestras condiciones de experimentacin.

Bibliografa
1. Anon, M., Fermentation methanique de la pulpe de caf. Institut Francois du caf. Institut francais du caf, du Cacao et autires Plantes stimulantes, Rapport Activit, Chanbery, 1981. 2. APHA, Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th ed., Washington D.C, USA, 1995. 3. Bermdez, R.; Valdez, W., "Influencia de la zeolita natural de Palmarito en el proceso de digestin anaerobia del residual porcino" en Revista Interciencia, vol. XIX, No. 5, 1994. 4. Boopathy, R., "Effect of Particle Size of Coffee Pulp on Anaerobic Digestion", en Asian Environmental, 10, 4, 1988, pgs. 36-44.

Conclusiones
La variante de inculo E (estircol vacuno) posee los mayores valores de produccin acumulada de metano (10,29 L) respecto a las otras dos

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_____, "Inoculum Source for Anaerobic Fermentation of Coffee Pulp", en Applied Microbiology an Biotechnology, 6, 26, 1987, pgs. 588-594. 6. _____, "Anaerobic Digestin of Coffee Pulp", en Asian Environment, 8, 1986, pgs. 21-23. 7. Calzada, J., Biogs de subproductos del beneficio hmedo del caf, ICAITI- Guatemala, 1983. 8. Daz, E., Influencia del pretratamiento en la digestin anaerobia de la pulpa de caf. Tesis en opcin al ttulo acadmico de Master en Biotecnologa, 1999. 9. Diaz, E.; Valdez, W.; Martnez, A., Influencia del proceso de neutralizacin en la digestin anaerobia de la pulpa de caf, II International Symposium on Anaerobic Digestion of Solid Waste, Barcelona, 1999. 10. Daz, L.; Herrera, A., "Estudio sobre el comportamiento de levaduras del gnero Candida , en presencia de materiales celulsicos de la caa de azcar", en Revista Ciencias Biolgicas, 14, 2, 1983. 11. Garcillo, A. M. V.; Di Paolo, S. D, e t a l . , "Hidrolytic Properties of Extracellular Cellulases from Pleurotus ostreatus", en Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, 1994, pgs. 476-481. 12. Gathuo, B.; Ranade, P. Maata, P., Coffee Industrial Wastes, en Water Science and Technology, vol. XXIV, No. 1, 1991. 13. Khan, A. W.; Duncan Wall, "Fermentation Convertion of Cellulose to Acetic Acid and Cellulolytic Enzyme Production by a Bacterial Mixed Culture Obtained from Sewage Sludge", en Applied and Environmental Microbiology, 41, 5, 1981, pgs. 1214-1218. 14. Lalit, K. et al. , "Utilization of Pried Pelletized Anaerobic Sludge for Anaerobic Treatment of Wastewater", en Journal of Fermentation and Bioengineering, 38, 1, 1997, pgs. 91-95. 15. Lalit, K. et al. , "Treatment of Raw Sewage in a Temperature Climate Using a UASB Reactor and The Hanging Sponge Cubes Process", en Wat. Sci. Tech., 36, 6-7, 1997, pgs. 433-440. 16. Lpez, M. y col., Efecto de las variaciones operacionales sobre los procesos de solubilizacin de residuos slidos, V Taller y Seminario Latinoamericano de Tratamiento Anaerobio de Aguas Residuales, Via del Mar, Chile, 1998.

17. Miller, G., "Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugars, en Ana. Chem., 31, 1959, pgs. 426-428. 18. Morrison, M. ; Miron, J., "Minireview: Adhesion t o C e l l u l o s e b y R u m i n o c o c c u s a l b u s: a Combination of Cellulosomes and Pil-Proteins", en FEMS Microbiol. Letts, 185, pgs. 109-115. 19. Olguin, L. P. y Monroy, H. O., Manual de Tcnicas de Anlisis para Aguas Residuales, ORSTOM, 1992. 20. Pierre, B.; Marc Lemaire, The Cellulosome: An Exocellular, Multiprotein Complex Specialized in Cellulose Degradation. Laboratory Manual. Maharashtra Association for the Cultivation of Science, Research Institute, 1996 21. Ranade, D. R.; Gadre, R. V., Microbiologycal Aspects of Anaerobic Digestion, Laboratory Manual, 1988. 22. Rodrguez, S. y col., "Utilizacin de lodo de digestin anaerobia de la cachaza como bioabono para el cultivo de ajo porro", en Revista Interciencia, vol. XXIV, No. 2, 1999. 23. Rodrguez, S.; Prez, R.; Fernndez, M., "Estudio de la biodegradabilidad anaerobia de las aguas residuales del beneficio hmedo del caf", en Revista Interciencia, vol. XXV, No. 8, 2000. 24. Senz, A., Separacin de Etapas en el Tratamiento Anaerobio de Efluentes con Reactores UASB, Tesis en opcin al grado de Doctor, Bilbao, 1992. 25. Schwarz, W., "The Cellulosome and Cellulose Degradation by Anaerobic Bacteria", en Appl. Microbiology and Biotechnology, 56, 2001, pgs. 634-649. 26. S c r i v a s t a b a , S . K . ; A l i , A . ; K h a n n a , S . , "Purification, Characterization and Cloning of Endo-1,4- - Glucanase from Ruminococcus sp ., en Biotechnology Letters, 13, 12, 1991, pgs. 907-912. 27. Sharmila, T.; Krishna N., "Influence of Anaerobic Cellulolytic Bacterial Consortia in the Anaerobic Digesters on Biogas Production", Biogas Forum, 58, 1994. 28. Terry, A. I.; Rodrguez, S.; Daz, E. E., Martnez M. C., Estudio de la influencia de la adicin de nutrientes en la digestin anaerobia de la vinaza de destilera , ISBN: 959-207-083-0, 2002. 29. Traba, J. y otros, "Caracterizacin de residuales slidos del caf, especie Coffeea arbica ", en Revista Ciencia, vol. 45, No. 4, Mxico, 1994.

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