Artigo QPN

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JLIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS CMPUS DE ARARAQUARA
SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI: ESTUDO ANATMICO E HISTOQUMICO DAS FOLHAS E INVESTIGAO DO POTENCIAL FARMACUTICO DO EXTRATO ETANLICO E SUAS FRAES.
ADEMIR SALVI JNIOR

FARMACUTICO INDUSTRIAL
ARARAQUARA - SP 2009
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JLIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS CMPUS DE ARARAQUARA
SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI: ESTUDO ANATMICO E HISTOQUMICO DAS FOLHAS E INVESTIGAO DO POTENCIAL FARMACUTICO DO EXTRATO ETANLICO E SUAS FRAES.
ADEMIR SALVI JNIOR

FARMACUTICO INDUSTRIAL
ORIENTADOR: Prof. Dr. Luis Vitor Silva do Sacramento
Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Cincias Farmacuticas, rea de Pesquisa e Desenvolvimento de Frmacos e Medicamentos, da Faculdade de Cincias Farmacuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obteno do Ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas.
ARARAQUARA - SP 2009
Ficha Catalogrfica
Elaborada Pelo Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao Faculdade de Cincias Farmacuticas UNESP Campus de Araraquara
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Salvi Jnior, Ademir Schinus terebinthifolius Raddi: estudo anatmico e histoqumico das folhas e investigao do potencial farmacutico do extrato etanlico e suas fraes / Ademir Salvi Jnior. - Araraquara, 2009. 81 f. Dissertao (Mestrado) - Universidade Estadual Paulista. Jlio de Mesquita Filho. Faculdade de Cincias Farmacuticas. Programa de Ps Graduao em Frmacos e Medicamentos Orientador: Luis Vitor Silva do Sacramento
1. Schinus. 2. Aroeira-vermelha. 3. Anlise histoqumica. 4. Avaliao farmacognstica. 5. Atividade antibacteriana. I. Sacramento, Luis Vitor Silva do, orientador. II.Ttulo.
CAPES: 4030005
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O mestre que caminha sombra do templo rodeado de discpulos, no d de sua sabedoria, mas sim de sua f e de sua ternura. Se ele for verdadeiramente sbio, no te convidar a entrar na manso de seu saber, mas antes o conduzir ao limiar de tua prpria mente
(Gibran Khalil Gibran)
Dedico todo o meu trabalho, seu prestgio e honra, aos que so a essncia de minha vida.
A Deus, Nosso Senhor, pelo dom da vida e sublime presena em meu ser, pelo privilgio concedido e pela graa de permitir a concluso deste trabalho.
Nossa Senhora Aparecida, pela singular proteo, poderosa intercesso e graas. Consagro sua santidade o meu entendimento.
minha famlia, meu pai Ademir, minha me Terezinha e meu irmo Adriano, enquanto pessoas igualmente belas e admirveis em essncia, por constiturem estmulos e atitudes que bem influenciaram minha pessoa impulsionando-me a buscar vida a cada momento. Guardo-lhes o mais profundo agradecimento por terem aceito a privao da minha companhia em funo dos estudos, concedendo-me a oportunidade de me realizar ainda mais.
minha av e madrinha, Leonora, pelas oraes a mim oferecidas durante toda essa caminhada, pelos seus docinhos de pinga, sua alegria, seu carinho e afeto.
minha noiva Carolina, que com palavras no consigo descrever o quanto significa para mim. Voc, meu amor, minha vida, meu tudo, meu nada, que est ao meu lado em todas as horas, que me compreende, que me faz sorrir, me faz feliz, me faz amar e sentir-me amado. Voc mais do que uma paixo, encanta pela elegante simplicidade, requintada gentileza e nobreza transbordante. Obrigado pelo seu respeito e amor, por existir e estar comigo.
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"Cada um que passa em nossa vida, passa sozinho, pois cada pessoa nica e nenhuma substitui outra. Cada um que passa em nossa vida passa sozinho, mas no vai s nem nos deixa s. Leva um pouco de ns mesmos, deixa um pouco de si mesmo. H os que levam muito, mas h os que no levam nada. Essa a maior responsabilidade de nossa vida, e a prova de que duas almas no se encontram ao acaso"
(Antoine de Saint-Exupry)
A realizao deste trabalho no mrito individual, mas resultado da contribuio de inmeras pessoas que participaram direta ou indiretamente para o seu desenvolvimento. Agradecer sempre necessrio e tambm, um ato honrado de gratido. Ao meu Orientador, Prof. Luis Vitor Silva do Sacramento, pela orientao incondicional. Quando poderia ser simplesmente orientador, foi mestre, transmitindo-me seus conhecimentos e experincias, mostrando o seu profissionalismo e, com isso revelando o seu lado humanista. Quando poderia ser mestre, foi amigo, e em sua amizade entendeu-me ajudando e incentivando a seguir pelos caminhos da vida, das luzes, rumo satisfao plena dos ideais humanos e profissionais. Expresso os meus maiores agradecimentos e o meu profundo respeito, que sero sempre poucos diante do muito que me foi ofertado. Profa. Dra. Tais Maria Bauab, pelo papel fundamental de sua co-orientao, se assim posso dizer; por instruir e repartir comigo os seus conhecimentos, colocando em minhas mos ferramentas novas com as quais, como asas, me abriram novos horizontes. A todos os Professores que fizeram do magistrio um ideal, mesclando a arte de ensinar com o dom da convivncia, tornando-se meus amigos e transmitindo suas experincias que muito ajudaram na minha formao. Aos tcnicos e amigos dos laboratrios de Botnica, Microbiologia e Qumica Orgnica da Unesp, Campus de Araraquara, que participaram das atividades desenvolvidas neste trabalho. Aos Professores que participaram do Exame de Qualificao, Dra. Isabele Rodrigues Nascimento, Dra. Tais Maria Bauab e Dr. Luis Vitor Silva do Sacramento, pelos relevantes apontamentos e preparao para a defesa dessa dissertao. Aos Professores que participaram da Comisso Examinadora de Defesa, Dr. Norberto Peporine Lopes, Dra. Hrida Regina Nunes Salgado e Dr. Luis Vitor Silva do Sacramento, pelas crticas construtivas e importantes sugestes auferidas finalizao do trabalho. Faculdade de Cincias Farmacuticas da UNESP, Seo de Ps-graduao, ao Departamento de Princpios Ativos Naturais e Toxicologia, ao Departamento de Frmacos e Medicamentos, seus professores e servidores, ressaltando o apoio do servidor Luiz Eduardo
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dos Santos (Dudu) do Laboratrio de Farmacognosia, pela seriedade, trabalho e empenho em suas atribuies. Aos amigos e companheiros do Laboratrio de Botnica, em especial a Anglica Barretto (Teka) por todos os momentos vividos neste tempo, pela amizade, cumplicidade, carinho e afeto. Aos amigos que fiz nesta etapa de minha vida, quero agradecer a todos por estarem sempre comigo, dando-me fora e incentivo. Por dizerem algumas vezes, o que eu realmente precisava ouvir, em lugar do que eu gostaria que dissessem, e por ter me mostrado um outro lado a considerar, nos momentos difceis. Por compartilhar tantas coisas boas, criando vrias lembranas. Ter um amigo algo especial, ter vrios sensacional, mas ser amigo de algum ainda melhor.
Escolhe um trabalho de que gostes, e no ters que trabalhar nem um dia na tua vida
(Confcio)
A Escola de Enfermagem Maurcio de Medeiros, pela oportunidade de trabalho ao conceder minha primeira experincia profissional em docncia e pela confiana depositada. Agradeo Direo da Escola, a todos os seus funcionrios, professores e alunos pelo apoio, aprendizado e amizade que me ofereceram. A UniPinhal (Fundao Pinhalense de Ensino) pela confiana e reconhecimento profissional.
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Nascemos para manifestar a glria do universo que est dentro de ns. No est apenas em um de ns: est em todos ns. E conforme deixamos nossa prpria luz brilhar, inconscientemente damos s outras pessoas permisso para fazer o mesmo. A educao a arma mais poderosa que voc pode usar para mudar o mundo.
Nelson Rolihlahla Mandela
SUMRIO Pgina 1. RESUMO ................................................................................................................. 2. ABSTRACT ............................................................................................................. 3. INTRODUO ....................................................................................................... 4. OBJETIVOS ............................................................................................................ CAPTULO I - SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI ................................................ 1. Introduo .................................................................................................................. 1.1. Classificao taxonmica e sistemtica ................................................................. 1.2. Aspectos botnicos ................................................................................................. 1.3. Aspectos fitoqumicos ............................................................................................ 1.4. Aspectos etnobotnicos e farmacolgicos .............................................................. CAPTULO II - ESTUDO ANATMICO E HISTOQUMICO DAS FOLHAS . 1. Introduo .................................................................................................................. 2. Metodologia ............................................................................................................... 2.1. Material botnico .................................................................................................... 2.2. Estudo anatmico ................................................................................................... 2.3. Estudo histoqumico ............................................................................................... 3. Resultados e discusso .............................................................................................. 3.1. Estudo anatmico ................................................................................................... 3.2. Estudo histoqumico ............................................................................................... 4. Concluso .................................................................................................................. CAPTULO III - CONTROLE DE QUALIDADE DA DROGA VEGETAL ....... 1. Introduo .................................................................................................................. 1.1. Estabelecimento dos parmetros da qualidade ....................................................... 2. Metodologia ............................................................................................................... 2.1. Processamento ps-colheita para a obteno da droga vegetal .............................. 2.2. Determinao do resduo slido do vegetal fresco ................................................. 2.3. Obteno da droga vegetal pulverizada .................................................................. 2.4. Caracterizao fsico-qumica da droga vegetal pulverizada originada das folhas de Schinus terebinthifolius ............................................................................................ 2.4.1. Amostragem ........................................................................................................ 2.4.2. Determinao da granulometria da droga vegetal pulverizada ........................... 2.4.3. Estudo e determinao do tamanho mdio das partculas ................................... 2.4.4. Determinao da densidade ................................................................................. 2.4.5. Determinao de gua pela perda por dessecao ............................................... 2.4.6. Determinao do pH ............................................................................................ 2.4.6.1. Determinao potenciomtrica do pH .............................................................. 2.4.6.2. Determinao colorimtrica do pH .................................................................. 2.4.7. Determinao de cinzas totais ............................................................................. 2.4.8. Determinao de cinzas insolveis em cido ...................................................... 2.4.9. Determinao de extrativos no extrato alcolico ................................................ 2.4.10. Determinao do resduo insolvel no lcool ................................................... 3. Resultados e discusso .............................................................................................. 3.1. Processamento ps-colheita para a obteno da droga vegetal .............................. 3.2. Obteno da droga vegetal pulverizada .................................................................. 3.3. Caracterizao fsico-qumica da droga vegetal pulverizada originada das folhas de Schinus terebinthifolius ............................................................................................ 1 2 3 5 6 6 6 8 10 11 14 14 15 15 15 16 17 17 21 24 25 25 26 27 27 28 28 28 28 29 29 29 30 30 30 31 31 31 32 32 32 32 33 33
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4. Concluso .................................................................................................................. CAPTULO IV - ESTUDO FITOQUMICO ........................................................... 1. Introduo .................................................................................................................. 1.1. Anlise fitoqumica preliminar ............................................................................... 1.2. Processo extrativo: consideraes gerais ............................................................... 1.3. Fracionamento por partio .................................................................................... 1.4. Cromatografia em camada delgada ........................................................................ 2. Metodologia ............................................................................................................... 2.1 Triagem fitoqumica preliminar .............................................................................. 2.2. Obteno do extrato etanlico ................................................................................ 2.3. Fracionamento do extrato vegetal .......................................................................... 2.4. Perfil cromatogrfico .............................................................................................. 3. Resultados e discusso .............................................................................................. 4. Concluso .................................................................................................................. CAPTULO V - AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA ............. 1. Introduo .................................................................................................................. 1.1. Pesquisa da atividade biolgica .............................................................................. 1.2. Estudo antibacteriano ............................................................................................. 2. Metodologia ............................................................................................................... 2.1. Extratos vegetais ..................................................................................................... 2.2. Amostras bacterianas .............................................................................................. 2.3. Estocagem e manuteno das cepas ....................................................................... 2.4. Espectro de absoro do extrato etanlico e fraes do extrato vegetal ................ 2.5. Padronizao da suspenso bacteriana ................................................................... 2.6. Preparo do extrato etanlico e fraes do extrato vegetal ...................................... 2.7. Determinao da atividade antibacteriana e concentrao inibitria mnima (CIM) pelo mtodo de diluio em microplacas ........................................................... 2.7.1. Mtodo de diluio em microplacas .................................................................... 2.7.1.1. Leitura espectrofotomtrica das microplacas ................................................... 2.7.1.2. Determinao da concentrao bactericida mnima (CBM) a partir do mtodo de diluio em microplacas .............................................................................. 2.7.1.3. Leitura das microplacas utilizando resazurina como revelador ....................... 3. Resultados e discusso .............................................................................................. 3.1. Determinao da atividade antibacteriana e da concentrao inibitria mnima (CIM) pela tcnica de diluio em microplacas com leitura espectrofotomtrica ........ 3.2. Determinao da atividade antibacteriana e da concentrao inibitria mnima (CIM) pela tcnica de diluio em microplacas utilizando resazurina como revelador 3.3. Determinao da concentrao bactericida mnina (CBM) das amostras vegetais que apresentaram atividade antibacteriana .................................................................... 4. Concluso .................................................................................................................. 5. CONSIDERAES FINAIS .................................................................................. 6. REFERNCIA BIBLIOGRFICA .......................................................................
39 41 41 42 43 43 44 44 44 45 46 46 46 50 51 51 51 52 53 53 54 54 54 54 55 55 55 56 57 57 57 57 60 63 64 65 67
Resumo
1. RESUMO SALVI JUNIOR, A. Schinus terebinthifolius Raddi: estudo anatmico e histoqumico das folhas e investigao do potencial farmacutico do extrato etanlico e suas fraes. Araraquara, 2009. (Mestrado em Cincias Farmacuticas) Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho - UNESP. Schinus terebinthifolius Raddi, pertence famlia Anacardiaceae, popularmente denominada como aroeira-vermelha. Trata-se de uma espcie nativa da Amrica do Sul, especialmente do Brasil, Paraguai e Argentina. No Brasil ocorre ao longo da Mata Atlntica desde o nordeste at o sul do pas. Consta oficialmente na primeira edio da Farmacopeia Brasileira, a qual designa as cascas do tronco como seu farmacgeno, embora estudos revelem que folhas e frutos tambm podem ser utilizados como fonte de substncias ativas e, devido a este fato, desperta um grande interesse para a pesquisa. Na literatura citada como cicatrizante, antiinflamatria, antioxidante, antitumoral e antimicrobiana. Este trabalho teve como objetivos: descrever a anatomia da regio mediana de fololos de Schinus terebinthifolius; realizar testes histoqumicos nas folhas da espcie com fins de caracterizao preliminar de constituintes qumicos de interesse; realizar o estudo granulomtrico da droga vegetal pulverizada proveniente do processo de moagem de folhas de S. terebinthifolius; estabelecer a caracterizao fsico-qumica da droga vegetal; realizar a anlise fitoqumica preliminar do extrato e fraes obtidas; e, avaliar a atividade antimicrobiana do extrato e das fraes utilizando-se a tcnica de microdiluio em placas. Os resultados da anatomia revelaram as formas das estruturas celulares das folhas e os tipos de incluses celulares presentes; na anlise histoqumica e triagem fitoqumica identificou-se a presena de grupamentos fenlicos, flavonoides e taninos, terpenoides e saponinas de interesse farmacolgico; na caracterizao fsico-qumica destacou-se importantes informaes para o estabelecimento dos parmetros referentes ao controle da qualidade da droga; na atividade antibacteriana, o extrato e suas fraes, mostraram-se efetivos frente a Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. Em funo dos resultados encontrados, pode-se concluir que as folhas da aroeira-vermelha apresentam metablitos ativos com potencial para o desenvolvimento de fitoterpicos. Palavras-chave: Schinus, aroeira-vermelha, anlise histoqumica, avaliao farmacognstica, atividade antibacteriana.
Ademir Salvi Jnior
Abstract
2. ABSTRACT SALVI JUNIOR, A. Schinus terebinthifolius Raddi: anatomical and histochemical study of the leaves and research of pharmaceutical potential of the ethanolic extract and its fractions. Araraquara, 2009. (Master in Pharmaceutical Sciences) Univ. Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho - UNESP. Schinus terebinthifolius Raddi, belongs to the Anacardiaceae family, is popularly known as Brazilian pepper. It is native from South America, especially Brazil, Paraguay and Argentina. In Brazil it occurs along the Atlantic Forest from the northeast to the south. Officially listed in the first edition of the Brazilian Pharmacopoeia, which means the bark of the trunk as its pharmacogens, although studies show that fruits and leaves can also be used as a source of active substances, and due to this fact, arouses a great interest for search. The literature cited as healing, anti-inflammatory, antioxidant, antitumor and antimicrobial activities. This study aimed to describe the anatomy of the middle region of leaves of Schinus terebinthifolius; perform tests histochemical in leaflets of the species for purposes of preliminary characterization of chemical constituents of interest; perform the study granulometric to the sprayed drug plant from the process of grinding the leaves of S. terebinthifolius; establish the physical-chemical characterization of the drug plant; perform the preliminary phytochemical analysis of extract and fractions obtained; and, to evaluate the antimicrobial activity of the extract and the fractions using the microdilution plates. The results of the anatomy revealed the forms of cellular structures of the leaves and the types of cellular inclusions present; the histochemical analysis and phytochemical screening could identified the presence of phenolic groups, flavonoids and tannins, terpenoids and saponins of pharmacological interest; in physical-chemical characterization to be detached important information for the establishment of the parameters concerning to quality control of drug; of the antibacterial activity, the extract and the fractions were shown to be effective against the Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.. Given these results, it can be concluded that the leaves of Brazilian pepper shows of active metabolites with potential for the development of a herbal medicine. Keywords: Schinus, Brazilian pepper, histochemical analyses, pharmacognostic assessment, antibacterial activity.
Ademir Salvi Jnior
Introduo
3. INTRODUO A utilizao de produtos naturais como recurso teraputico to antiga quanto civilizao humana e, por muito tempo, produtos minerais, vegetais e animais constituram o arsenal teraputico (EISENBERG et al., 1998). Alm disso, pelo seu paralelo com o desenvolvimento da cultura humana, foi e ainda acompanhada por significados mgicoreligiosos e vises peculiares de sade e doena (RATES, 2001). A utilizao de plantas medicinais vem atingindo um pblico cada vez maior. O retomo medicina natural ou tradicional requer um posicionamento muito firme dos meios acadmicos. fato preocupante, o uso indiscriminado de plantas medicinais sem qualquer conhecimento fitoqumico, farmacolgico e toxicolgico. Isto vem acontecendo com a maioria das espcies vegetais consumidas pela populao (BALLV et al., 1995). A fitoterapia existe principalmente no mercado informal, o que representa grande perigo sade da populao (BENDAZZOLI, 2000). A identificao correta das espcies, sua forma de uso, controle de qualidade e mecanismo de ao, tambm constituem questes a serem resolvidas. A identificao dos vegetais proporciona aos laboratrios especializados (ervanrios, farmcias de manipulao, indstrias de fitoterpicos, estabelecimentos de ensino farmacutico) condies para efetuarem sua preparao, comercializao ou estudo, com segurana alicerada em conhecimento cientfico (BALLV et al., 1995). O uso de plantas medicinais, especialmente na Amrica do Sul, contribui significativamente para os cuidados bsicos com a sade. Para o tratamento de infeces comuns, muitas plantas so utilizadas no Brasil na forma de extrato bruto, infuses ou emplastros, sem nenhuma evidncia cientfica de sua eficcia (PESSINI et al., 2003). Existem casos em que as preparaes utilizando o extrato bruto so mais eficazes do que aquelas preparadas com quaisquer de seus princpios ativos isolados (MATOS, 2000). Inegavelmente, as plantas medicinais e os fitoterpicos apresentam papel importante na sade das pessoas, pois cerca de 25% dos medicamentos prescritos mundialmente so de origem vegetal (OMS, 1991; RATES, 2001). Segundo a OMS, plantas medicinais so todas aquelas silvestres ou cultivadas, utilizadas como recurso para prevenir, aliviar, curar ou modificar processos fisiolgicos, patolgicos ou no, ou ainda empregadas como fonte de frmacos ou de seus precursores/derivados. Os fitoterpicos so produtos medicinais acabados e etiquetados, cujos componentes ativos so molculas obtidas da extrao de drogas vegetais (partes areas ou
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Introduo
subterrneas de plantas, ou outro material vegetal, ou combinaes destes, em estado bruto ou em formas de preparaes vegetais) (OMS, 2000; RATES, 2001). O conhecimento sobre as plantas sempre tem acompanhado a evoluo do homem atravs dos tempos. As primitivas civilizaes cedo se aperceberam da existncia, ao lado das plantas comestveis, de outras dotadas de maior ou menor toxicidade que, ao serem experimentadas no combate doena, revelaram, embora empiricamente, o seu potencial curativo. Toda essa informao foi sendo, de incio, transmitida oralmente s geraes posteriores, para depois, com o aparecimento da escrita, passar a ser compilada e guardada como um tesouro precioso (CUNHA, 2005). O Brasil possui uma das maiores diversidades vegetais do mundo e inmeras experincias vinculadas ao conhecimento popular das plantas medicinais e tecnologia para correlacionar o saber popular e cientfico (ALBUQUERQUE e HANAZAKI, 2006; SANTOS et al., 2009). Com o propsito de se obter as informaes necessrias sobre plantas para fins medicinais, etnofarmacognostas esto atualmente empenhados nesses estudos devido ao risco eminente da perda total de tais conhecimentos empricos, considerando-se o que est acontecendo em diversas regies do globo, onde a rpida mudana do modo de vida de sociedades est provocando o desaparecimento da sua medicina popular, que se apoia, quase sempre, em floras muito importantes. Enquadradas nesta problemtica, h um esforo sistemtico para o estudo de espcies empregadas na medicina popular (CUNHA, 2005). H sistemas teraputicos, de importncia mundial, que empregam plantas no tratamento das doenas (CUNHA, 2005). Em casos especficos, a aplicao depender diretamente da concentrao e composio qumica de metablitos secundrios presentes, os quais podem variar significativamente seu perfil em funo de fatores como estado fitofenolgico, fatores geogrficos (localizao), ecolgicos (habitat), variabilidade gentica (expressa pelos quimiotipos), processo de extrao empregado, entre outros (BANDONI, 2000; MOURA et al., 2007). Os flavonoides, taninos e leos essenciais, metablitos secundrios presentes na S. terebinthifolius, mostram-se de grande valia, destacando-se com aplicao nas indstrias de medicamentos, cosmticos e perfumaria, indstrias de alimentos (como flavorizantes, antioxidantes e corantes de alimentos e bebidas) e indstrias de curtimento de couro (LAWRENCE, 1984; QUEIRES e RODRIGUES, 1998; ALLARDICE et al., 1999; TOSS et al., 2008).
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Objetivos
4. OBJETIVOS Os objetivos foram traados para fornecer informaes teis para a identificao de Schinus terebinthifolius, bem como propor parmetros de controle de qualidade da droga vegetal originada de folhas e, ainda, avaliar o potencial antibacteriano da espcie. Para atingilos foi possvel:
Descrever a anatomia da regio mediana de fololos de Schinus terebinthifolius;
Realizar testes histoqumicos nas folhas da espcie com fins de caracterizao preliminar de constituintes qumicos de interesse;
Realizar o estudo granulomtrico da droga vegetal pulverizada proveniente do processo de moagem de folhas de S. terebinthifolius;
Estabelecer a caracterizao fsico-qumica da droga vegetal;
Realizar a anlise fitoqumica preliminar do extrato e fraes obtidas;
Avaliar a atividade antibacteriana do extrato e das fraes utilizando-se a tcnica de microdiluio em placas.
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Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi
CAPTULO I SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI
1. Introduo Muito conhecida dos brasileiros por suas potencialidades medicinais - e por isso tambm rica em denominaes populares - a aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi) pertence famlia Anacardiaceae e popularmente denominada como aroeira-vermelha. Nativa da Amrica do Sul, ocorre no Brasil em regies de Mata Atlntica, remanescentes ou reflorestadas, desde o Rio Grande do Norte ao Rio Grande do Sul. Consta na primeira edio da Farmacopeia Brasileira, a qual designa as cascas do troco como seu farmacgeno. No entanto, suas folhas tm despertado interesses farmacolgicos como fonte de princpios ativos. Na etnobotnica e em resultados de ensaios farmacolgicos citada como cicatrizante, anti-inflamatria, antioxidante, antitumoral e antimicrobiana. Figueiredo (2009) aponta que na dcada de 60, Geraldo Vandr fez uma citao rvore nos versos de uma cano considerada subversiva, denominada Arrueira, que constou nas listas dos censores do governo ditatorial como uma provocao e estmulo contra o regime militar de ento. Madeira de dar em doido vai descer at quebrar a volta do cip de aroeira no lombo de quem mandou dar
(Arrueira - Geraldo Vandr)
1.1. Classificao taxonmica e sistemtica Ao publicar, em 1673, a Histoire General des Drogues o farmacutico Pierre Pomet, adotou a classificao e a descrio taxonmica, para complementar uma identificao botnica mais precisa e estvel, resolvendo problemas da origem e da descrio dos caracteres das plantas ou dos rgos utilizados, encorajando, a partir desta poca, o estudo das plantas para a aplicao no tratamento de doenas (CUNHA, 2005). Schinus terebinthifolius Raddi pertence famlia Anacardiaceae a qual representada por 70 gneros e cerca de 600 espcies de rvores e arbustos, conhecidos por serem frutferos e apresentarem madeira de boa qualidade (PIO CORRA, 1984). Esta famlia est distribuda principalmente em regies tropicais e subtropicais, com alguns representantes em zonas
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temperadas. Apresenta importncia econmica para a produo de taninos e resinas, bem como de alimentos, com alguns frutos comestveis. Muitas espcies so cultivadas para ornamentao. Alguns membros desta famlia possuem tecidos resinosos, resina esta, s vezes, irritante para a pele. (FAMLIA Anacardiaceae, 2009). O gnero chamado de Schinus, nome grego para a rvore Mastic (Pistacia lentiscus), a qual se assemelha. Compreende cerca de 30 espcies nativas para a Amrica do Sul (FAMLIA Anacardiaceae, 2009). Ao longo dos tempos tem havido um nmero razovel de reclassificaes no mbito deste gnero e anteriores designaes incorretamente continuam a ser utilizada por aqueles desconhecidos das mudanas, inclusive, em alguns casos, os departamentos governamentais e at mesmo livros didticos (SCHINUS, 2008a). Cabe ressaltar que cerca de 25% dos gneros dessa famlia so conhecidos como txicos e causadores de dermatite de contato severa (CORREIA et al., 2006). Entre as aroeiras h algumas que apresentam ao irritante para a pele, porm no esta, a aroeira-vermelha, que tambm conhecida como aroeira-mansa (AROEIRA vermelha, 2009b). Schinus terebinthifolius Raddi uma espcie nativa da Amrica do Sul, especialmente do Brasil, Paraguai e Argentina (DEGSPARI et al., 2005). encontrada em algumas partes da Amrica Central e algumas regies da Europa, frica, sia e, nos Estados Unidos, ocorre no Hava, nos Estados da Califrnia, do Arizona e da Flrida onde foi introduzida para fins ornamentais. No Brasil, ocorre espontaneamente na costa litornea, em reas remanescentes da Mata Atlntica, e em outros tipos de formaes vegetais, devido sua grande plasticidade ecolgica (BAGGIO, 1988; LORENZI e MATOS, 2002; SANTOS et al., 2007; CARVALHO-MACHADO, 2008). A espcie encontrada desde a plancie costeira at altitudes de 1.100 m a 1.200 m (BAGGIO, 1988). Dentro de sua amplitude ambiental, a espcie apresenta distintas formas de crescimento, com ectipos de porte, variando desde pequenos arbustos (50 a 60 cm) at rvores com 15 metros de altura (REITZ et al., 1983). So muitas as plantas conhecidas com o nome de aroeira ou arrueira, nome de vrias espcies de plantas da famlia Anacardiaceae (AROEIRA, 2008), e pelos nomes populares que carregam deixam transparecer que se trata de espcies espalhadas pelo pas afora (AROEIRA brasileira, 2009). Especificamente Schinus terebinthifolius Raddi, a aroeiravermelha, nativa do Brasil e consta oficialmente na Farmacopeia Brasileira de 1929. tambm, conhecida popularmente como: aroeira-brasileira, aroeira-branca, aroeira-negra, aroeira-da-praia, aroeira-do-brejo, aroeira-do-iguap, aroeira-do-campo, aroeira-do-paran, aroeira-do-serto, aroeira-mansa, aroeira-pimenteira, aroeira-precoce, aguar-yba, aguaraba,
Ademir Salvi Jnior
blsamo, cabu, cambu, corneba, fruto-do-sabi e pimenta-rosa (PHARMACOPEIA, 1929; SCHINUS, 2008b; AROEIRA mansa, 2009; AROEIRA vermelha, 2009a). designada tambm pelas de suas sinonmias botnicas: Schinus mucronulata, Schinus weinmanniifolius, Schinus riedeliana, Schinus selloana, Schinus damaziana, Schinus raddiana (AROEIRA mansa, 2009), Astronium juglandifolium Griseb., Astronium urundeuva (Fr. All.) Engl. (AROEIRA vermelha, 2009a). As denominaes internacionais utilizadas so: Brazilian pepper, Brazilian holly, Brazilian pepper tree, Christmas berry e Florida holly (EUA), Mexican pepper, pimienta de Brasil (Porto Rico), faux poivrier e poivre rose (Frana), Rosapfeffer (Alemanha), warui (Ilhas Fiji) (SCHINUS, 2008d).
1.2. Aspectos botnicos A aroeira-vermelha (Figura 1) uma rvore diica, de pequeno porte e de folhas perenes. Ocorre em vrias formaes vegetais, sendo mais comum em beiras de rios, crregos e em vrias vrzeas midas de formao secundria, contudo cresce tambm em terrenos secos e pobres (LORENZI, 2000).
Figura 1: Aspectos morfolgicos de aroiera-vermelha (Schinus terebinthifolius) A: exemplar cultivado em vaso para ornamentao de interiores; B: detalhe da inflorescncia e das folhas; C: frutos maduros.
O fuste geralmente curto e tortuoso, sustentando uma copa arredondada, pouco densa e atraente, principalmente quando h florao (pequenos cachos de flores brancas) e frutificao (cachos de frutos globulosos, vermelhos) (REITZ et al., 1983). Sua madeira, muito pesada (densidade 1,19 g/cm3), de grande resistncia mecnica e praticamente
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imputrescvel (AROEIRA vermelha, 2009a), tem sido utilizada na forma de moures, cercas, lenha e carvo (ALLARDICE et al., 1999). A casca, em sua superfcie externa, de cor pardo-acinzentada, profundamente fendida no sentido longitudinal e um tanto no sentido transversal, muito rugosa, recoberta muito irregularmente de manchas mais claras e apresenta de longo em longo placas de liquens; a face interna estriada longitudinalmente e de cor pardo-avermelhada; esta casca impregnada de matria resinosa, que aparece frequentemente em sua superfcie (AROEIRA, 1929). As folhas so compostas, alternadas, imparipinadas, com 2,5 a 12 cm de comprimento e possuindo de 3 a 13 (normalmente 7 a 11) fololos elpticos-oblongos, com superfcies superiores verde-escuras e superfcies inferiores verde claras e margens dentadas, com nervuras claras; tm, como detalhe principal, rquis aladas. As flores so pequenas e dispostas em inflorescncias axilares e terminais do tipo rcemo, ostentando spalas de formas triangulares a lanceoladas com margens ciliadas. Ambas as flores, masculinas e femininas, ocorrem em pedicelos e tm basicamente a mesma estrutura. O florescimento ocorre principalmente durante os meses de setembro a janeiro, surgindo pequenas flores de colorao branco-esverdeadas, aromticas e melferas, e devido a este fato so muito atrativas para as abelhas, o que as tornam muito importantes para a apicultura. O plen abundante pode provocar reaes alrgicas e irritaes em pessoas sensveis. (REITZ et al., 1983; SANCHOTENE, 1985; FERRITER, 1997; ALLARDICE et al., 1999; LORENZI, 2000; DEGSPARI et al., 2005; SANTOS et al., 2007; SCHINUS, 2008b; SCHINUS, 2008c; AROEIRA brasileira, 2009; AROEIRA mansa, 2009). As rvores de S. terebinthifolius frutificam predominantemente no perodo de janeiro a julho (LORENZI, 2000). Seus frutos so pequenos, possuindo um formato arredondado, do tipo drupa e apresentam colorao verde no incio e depois se tornam rosadas a avermelhadas e brilhante, reunidos em cachos pendentes; apresentam polpa avermelhada e comestvel, tornando a aroeira muito procurada e preferida pela avifauna. Na Flrida, seus frutos so utilizados para decorao de natal, o que lhe conferiu a denominao de Christmas Berry. A pequena semente do fruto da aroeira-vermelha, redonda e lustrosa nica, marrom escura medindo cerca de 3 mm de dimetro. Inscreve-se entre as muitas especiarias existentes e que so utilizadas essencialmente para acrescentar sabor e refinamento aos pratos da culinria universal. O sabor suave e levemente picante e adocicado do fruto da aroeira-vermelha, bem como sua bonita aparncia, de uso decorativo permite o seu emprego em variadas preparaes, podendo ser utilizada na forma de gros inteiros ou modos. No entanto,
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especialmente apropriada para a confeco de molhos que acompanham as carnes brancas, de aves e peixes, por no sobrepor o seu gosto sutil (USP, 2002). Introduzida na cozinha europeia, muito popular na Frana, onde utilizada na ornamentao e como tempero de preparaes culinrias, com o nome de poivre rose (pimenta-rosa); considerado um tipo de pimenta doce (REITZ et al., 1983; SANCHOTENE, 1985; FERRITER, 1997; LORENZI, 2000; DEGSPARI et al., 2005; SANTOS et al., 2007; SCHINUS, 2008b; AROEIRA brasileira, 2009; AROEIRA mansa, 2009). Seu sabor parecido com o da pimenta do reino, sendo um pouco mais suave, aromticos, adocicados e, ao mesmo tempo, levemente apimentados (AROEIRA vermelha, 2009b; FIGUEIREDO, 2009). A propagao se d por sementes e, certamente, por estaquia a partir de segmentos da raiz e do caule. O crescimento relativamente rpido, podendo atingir 1,0 m de altura no primeiro ano (SANCHOTENE, 1985). A aroeira-vermelha uma rvore bastante interessante e muito utilizada para arborizao urbana. Seu porte mdio e a frutificao ornamental, aliadas beleza e rusticidade da planta, fazem com que ela seja uma excelente escolha para o paisagismo, prestando-se como arvoreta e para a formao de cercas-vivas. Ela tambm indicada para reflorestamento de reas degradadas e mata ciliar, pois uma rvore pioneira. A aroeira-vermelha considerada como planta invasora em muitos pases onde extica, devido facilidade de propagao (AROEIRA mansa, 2009; FIGUEIREDO, 2009).
1.3. Aspectos fitoqumicos As principais caractersticas morfo-histolgicas e qumicas da espcie Schinus terebinthifolius Raddi, com vistas ao seu reconhecimento laboratorial como droga, so referentes s partes da planta utilizada e sua relao presena de classes de metablitos secundrios (JORGE e MARKMANN, 1996). Segundo a Farmacopeia Brasileira (1929), a parte do material vegetal a ser utilizado a casca, embora estudos revelem que alm das cascas, folhas e frutos tambm podem ser utilizados como fonte de substncias e, devido a este fato, desperta um grande interesse para a pesquisa. O interesse pela espcie se d pelo seu metabolismo secundrio que produz diversos compostos ativos entre outros compostos. Os estudos fitoqumicos de S. terebinthifolius detectaram a presena de compostos fenlicos simples, flavonoides e taninos, leos essenciais, esterides, triterpenos, antraquinonas e saponinas na espcie (LAWRENCE, 1984; JORGE e MARKMANN, 1996; QUEIRES e RODRIGUES, 1998; LIMA et al., 2006).
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Estudos j desenvolvidos detectaram que tanto as cascas como as folhas revelaram-se igualmente ricas em taninos e em leos essenciais. A nica diferena substancial entre a composio qumica de ambas no que se refere presena de flavonoides e saponinas, as quais se destacaram nas cascas (JORGE e MARKMANN, 1996). Verificou-se tambm a presena de compostos fenlicos nos frutos; extratos obtidos a partir destes apresentaram quantidade significativa de flavona apigenina (o qual justifica a colorao amarelada), cido elgico e tambm flavanona naringina (DEGSPARI et al., 2005). Os leos essenciais so ricos em mono e sesquiterpenos e apresentaram diferenas na proporo relativa dessas substncias. Estudos apresentaram, com a obteno do leo essencial de folhas, compostos qumicos majoritrios distintos, como sabineno, -pineno, pineno, cariofileno, germacreno-D, biciclogermagreno, trans-cariofileno e limoneno (MOURA et al., 2007; SANTOS et al., 2007). Sendo tambm identificados, em relao ao leo essencial obtido de frutos maduros, predominantemente, os monoterpenos: -3-careno e -pineno, e os sesquiterpenos: -gurjuneno, cis--guaieno, trans--guaieno, -muuroleno, trans-calameno, cubenol e epi--muurolol (GEHRKE et al., 2007).
1.4. Aspectos etnobotnicos e farmacolgicos As investigaes etnofarmacolgicas e etnobotnicas tm sido a principal abordagem reconhecida por cientistas em todo o mundo, como uma estratgia de seleo de plantas medicinais (ALBUQUERQUE e HANAZAKI, 2006; SANTOS et al., 2009). Quase todas as partes de S. terebinthifolius, incluindo folhas, cascas, frutos, sementes, resinas, e oleoresina (ou blsamo), tm sido utilizada medicinalmente pelos povos indgenas em todas as regies tropicais (PANETTA e MCKEE, 1997). As partes utilizadas de S. terebinthifolius que apresentam propriedades medicinais so as cascas, as folhas e os frutos e, o seu emprego correto para fins teraputicos pela populao em geral, requer o seu uso selecionado por sua eficcia e segurana teraputicas, baseadas na tradio popular ou cientificamente validadas como medicinais. fundamental que a escolha do material a ser utilizado, das formas corretas de preparaes e administrao de seus produtos sejam destinados para o seu uso, conforme o caso, em preparaes diversas para serem ingeridas, ditas de uso interno e em outras preparaes para uso na pele ou nas mucosas das cavidades naturais, ditas como uso externo (LORENZI e MATOS, 2002).
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A literatura etnobotnica cita o uso das cascas, com base na tradio popular, na forma de cozimento (decocto), especialmente pelas mulheres, em banhos de assento aps o parto e como anti-inflamatrio e cicatrizante, ou como medicao caseira contra febre e para o tratamento de doenas do sistema urinrio e do aparelho respiratrio, bem como nos casos de hemoptise (expectorao sangunea ou sanguinolenta), afeces e hemorragias uterinas (BRAGA, 1960; LORENZI, 1992; GRUENWALD et al., 2000). Da casca, extrai-se o leo empregado contra tumores e doenas da crnea (DEGSPARI et al., 2005). Segundo Santos e colaboradores (2009), em um estudo etnobotnico de plantas medicinais para problemas bucais, destacou-se a aroeira dentre as mais vendidas pelos raizeiros, devido aos relatos de uso sobre a atividade cicatrizante e anti-inflamatria em afeces bucais. Com base no uso tradicional e farmacolgico e clnico o extrato das cascas pode ser usado no tratamento tpico de ferimentos da pele, de mucosas em geral e nos casos de cervicites (ferida no colo do tero) e cervicovaginites (WANICK e BANDEIRA, 1974) e tambm de hemorroidas inflamadas; na forma de gargarejos ou bochechos com o decocto para afeces gengivais e da garganta, podendo ser ingerido para combater a azia e a gastrite (MATOS, 2002). Esta atividade pode ser til para estudos qumico-estruturais e farmacolgicos, bem como sntese de novos anti-inflamatrios como alternativa aos que provocam irritao gstrica (JORGE e MARKMANN, 1996). Alm das cascas, as folhas tambm so usualmente preparadas na forma de decocto com finalidade expectorante, antissptica, antidiarrica e cicatrizante (PACIORNIK, 1990; RODRIGUES e CARVALHO, 2001; DI-STASI, 2002; LORENZI e MATOS, 2002; MATOS, 2002). Em muitos estudos in vitro, extratos de folhas da aroeira brasileira demonstram ao antiviral contra vrus de plantas e apresentam ser citotxicos contra alguns tipos de cnceres (AROEIRA brasileira, 2009). As folhas e frutos so adicionados gua de lavagem de feridas e lceras, para limpeza de pele e de ao bactericida, embora a eficcia e a segurana do uso destas preparaes no tenham sido, ainda, comprovadas cientificamente (BRAGA, 1960; LORENZI, 1992; GRUENWALD et al., 2000). Em anlises laboratoriais, assim como o extrato das folhas, os leos essenciais, tanto das folhas quanto do fruto, tm demonstrado ao fungicida - contra cndida (in vitro) - e, uma atividade antimicrobiana em estudos clnicos. O leo essencial das folhas e dos frutos indicado em distrbios respiratrios, pois contm alta concentrao de monoterpenos. eficaz em micoses, candidase (uso local) e alguns tipos de protozorios intestinais. Age tambm como auxiliar no tratamento de alguns tipos de tumores/cnceres (carcinoma, sarcoma, dentre
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outros) e como agente antiviral e anti-bactericida. Possui ao regeneradora dos tecidos e til em escaras, queimaduras e problemas de pele (DEGSPARI et al., 2005; AROEIRA brasileira, 2009). O leo essencial tambm indicado, externamente na forma de gel, loes ou sabonetes, para limpeza de pele, coceiras, espinhas (acne), manchas, desinfeco de ferimentos, micoses e para o banho dirio (AROEIRA brasileira, 2009). Os resultados dos ensaios farmacolgicos de S. terebinthifolius, em diferentes modelos, registraram a existncia de propriedades cicatrizantes, anti-inflamatrias (GAZZANEO et al., 2005), antioxidante (VELSQUEZ et al., 2003; EL-MASSRY, 2009), antitumoral (QUEIRES et al., 2006) e antimicrobiana incluindo nesta ao Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus e Candida albicans (WANICK e BANDEIRA, 1974, MARTNEZ et al., 1996; GUERRA et al., 2000; MELO-JNIOR et al., 2002; DEGSPARI et al., 2005; SCHMOURLO et al., 2005; LIMA et al., 2006; SOARES et al., 2007; EL-MASSRY, 2009). A ao cicatrizante e anti-inflamatria da droga pode estar relacionada presena de taninos, que podem apresentar tambm ao antimicrobiana, antiviral, antioxidante e antitumoral. A presena dos flavonoides pode indicar uma potencializao da ao cicatrizante de S. terebinthifolius, devido aos flavonoides serem geralmente anti-inflamatrios, embora podem apresentar tambm ao antiviral e anticarcinognica. Os leos essenciais podem estar tambm relacionados sua ao anti-inflamatria e antibacteriana (JORGE e MARKMANN, 1996). O uso das preparaes de aroeira deve ser revestido de cautela por causa da possibilidade do aparecimento de fenmenos alrgicos na pele e nas mucosas (LORENZI e MATOS, 2002). Em todas as partes da planta foi identificada a presena de pequena quantidade de alquil-fenis, substncias causadoras de dermatite alrgicas em pessoas sensveis (REICHERT e FRERICHS, 1945; GRUENWALD et al., 2000). O amplo emprego desta planta na medicina popular motivo para a sua escolha como tema de estudos, visando o seu emprego como fonte de ativos para o desenvolvimento de um medicamento (fitoterpico ou fitofrmaco) eficaz e seguro.
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Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas
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CAPTULO II ESTUDO ANATMICO E HISTOQUMICO DAS FOLHAS
1. Introduo A tarefa de identificar os seres vivos surgiu com a necessidade humana de individualiz-los para estudos e utilizaes diversas. Identificar uma espcie vegetal significa oferecer-lhe meios seguros para que seja reconhecida por suas caractersticas morfolgicas. Trata-se de uma tarefa rdua partindo-se do pressuposto que os indivduos so semelhantes no nvel intraespecfico, principalmente (SACRAMENTO, 2009). A rea farmacutica necessita de material certificado quanto sua identificao botnica para relacionar seguramente o perfil qumico dos princpios ativos com uma identidade vlida e reconhecida pela comunidade tcnico-cientfica (SACRAMENTO, 2009). As espcies vegetais apresentam inmeras caractersticas morfolgicas que podem ser estudadas e correlacionadas sua identidade, dentre elas o arranjo dos tecidos anatmicos. Aquelas que ainda guardam em seu repertrio gentico-fisiolgico evolutivo um metabolismo intrnseco e rico de possibilidades bioqumicas so prdigas em fabricar muitas substncias, as quais podem ser identificadas quando ainda presentes no interior dos tecidos (SALVI JNIOR et al., 2008; SOUZA et al., 2008; CEZAR-JUNIOR et al., 2008). As plantas, principalmente as de uso medicinal podem apresentar sinonmias vulgares e tambm cientficas dificultando os trabalhos de identificao e aumentando as incertezas do processo. Diversos equvocos de identificao vegetal ocorrem quando no so observadas as tcnicas mais apropriadas para o intento (SACRAMENTO, 2009). Numa investigao criteriosa esgotam-se as possibilidades de erro quando so executadas anlises complementares que associam os caracteres anatmicos com a ocorrncia dos princpios ativos caractersticos de uma espcie determinados pela histoqumica e pelos ensaios fitoqumicos preliminares (SALVI JNIOR et al., 2009; SOUZA-MOREIRA et al., 2009). importante ressaltar que o estudo macro da morfologia vegetal deve tambm estar relacionado s prticas de investigao para nortear a anlise dirimindo a dependncia de equipamentos que muitas vezes podem ser de difcil acesso (SACRAMENTO, 2009). Em estudos farmacobotnicos objetiva-se caracterizar e identificar espcies de interesse medicinal, bem como as drogas vegetais originadas de suas partes, garantindo assim
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uma autenticidade para a matria-prima fornecedora de princpios ativos. Nem sempre caracterizar somente a droga vegetal se faz necessrio. Conhecer microscopicamente outros rgos da planta fornecedora da droga eleita torna-se, num processo de identificao complementar ou assessor, importante (SACRAMENTO, 2009). Inmeras experincias com este ramo podem ser encontradas na literatura. Destaca-se os trabalhos de Alberton et al., 2001 e Sanches et al. 2007. Os conhecimentos relacionados Farmacobotnica so desta forma exercitados pelo agente identificador, pois para entender os processos tcnicos inerentes s atividades de investigao anatmica e histoqumica, ele ter que ter percorrido uma srie de experincias tericas e prticas relacionadas sobretudo Anatomia Vegetal e Qumica (SACRAMENTO, 2009).
2. Metodologia
2.1. Material botnico As folhas de Schinus terebinthifolius Raddi foram colhidas ao amanhecer, em agosto de 2008, no incio do perodo de florao, de plantas localizadas no Horto de Plantas Medicinais e Txicas da FCF, no municpio de Araraquara, Estado de So Paulo, nas coordenadas 21 48 53.7S e 48 12 07,6W, com altitude de 656 metros. Na mesma ocasio, foram amostrados ramos frteis do mesmo exemplar para a confeco de exsicatas e depositados no Herbrio Rioclarense sob o nmero HRCB 51.668 e HRCB 51.669.
2.2. Estudo anatmico Para a anlise anatmica de Schinus terebinthifolius, foram selecionadas folhas maduras de ramos desenvolvidos. O limbo dos fololos amostrados foi dividido em trs regies: tero superior, mediano e inferior. Os teros superior e inferior foram desprezados e tero mediano do limbo foliar foi sub-amostrado em aproximadamente 9 mm2 da rea prxima nervura central, tendo-se o cuidado de amostrar tambm a frao adjacente nervura. Em seguida, o material foi fixado em soluo de glutaraldedo (2,5%) e formaldedo (4%), por imerso, durante 12 horas, sob condies de vcuo a temperatura ambiente.
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Aps a fixao, o material foi desidratado e submetido pr-infiltrao e infiltrao para polimerizao em resina sinttica glicol metacrilato, segundo Kraus e Arduin (1997), sendo observadas as recomendaes do fabricante da resina (Leica). Os blocos contendo o material includo foram cortados em micrtomo de rotao para obteno de seces com 7 m de espessura. Aps a secagem e aderncia em lminas de vidro, as seces foram coradas com azul de toluidina (0,05%) em tampo fosfato (pH 6,8) (KRAUS e ARDUIN, 1997). Aps a colorao, as seces foram montadas em resina sinttica Permount. Procedeu-se o estudo anatmico com o auxlio de microscpio com captura de imagens (Leitz DMRXE). Para anlise dos estmatos, fragmentos do tero mdio foram submetidos dissociao com HNO3 (10%) durante 72 horas em estufa a 65 C. Em seguida foram executadas trs lavagens sucessivas em gua destilada, e neutralizao com NaOH (0,1%) e novamente lavagem em gua destilada. Clarificou-se os fragmentos obtidos em hipoclorito de sdio (2%) durante trs minutos, e duas lavagens em soluo de cido actico (0,002%). Foi aplicado azul de astra (1%) durante trs minutos. Fez-se uma lavagem rpida em etanol (50%), procedendo-se em seguida a montagem em lminas de vidro contendo soluo de glicerina:gua (1:1) (adaptado de GHOUSE e YUNUS, 1972; RUZIN, 1999).
2.3. Estudo histoqumico Em relao ao estudo histoqumico, cortes transversais mo foram realizados em fololos frescos, examinados e fotografados com auxlio do microscpio de captura de imagens. Os testes foram realizados de acordo com as recomendaes propostas por Ascenso (2003), tanto para identificao de substncias apolares como para as polares. Os reagentes empregados para evidenciar as substncias apolares foram: Sudan III (JOHANSEN, 1940) para lipdios totais; sulfato azul do Nilo (CAIN, 1947) para diferenciao de lipdios cidos e neutros; tetrxido de smio (GANTER e JOLLS, 1969-1970) para a identificao de lipdios insaturados; reagente de Nadi (DAVID e CARDE, 1964) para identificao de leos essenciais e leo-resinas; tricloreto de antimnio (HARDMAN e SOFOWORA, 1972; MACE e HOWELL, 1974) para identificao de esteroides; cido sulfrico para a identificao de lactonas sesquiterpnicas (Geissman e Griffin, 1971) e 2,4-dinitrofenilhidrazina (GANTER e JOLLS, 1969-1970) para identificao de terpenoides com grupo carbonila. Para substncias polares foram empregados: cloreto frrico (GANTER e JOLLS, 1969-1970) e dicromato de
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potssio (GABE, 1968) para a identificao de compostos fenlicos totais; vanilina clordrica (MACE e HOWELL, 1974) para a identificao de taninos, reagente de Dragendorff (SVENDSEN e VERPOORTE, 1983) para identificao de alcaloides; lugol (JENSEN, 1962) para a identificao de amido; vermelho de rutnio (JOHANSEN, 1940) para identificar pectinas e azul brilhante de Comassie (FISCHER, 1968) para identificar protenas totais. Neste trabalho, para a deteco das lactonas sesquiterpnicas, foi adotado o procedimento descrito por Geissman e Griffin (1971) modificado por Higuchi (2007), que recomenda a reao com uma soluo de cido sulfrico concentrado:glicerina 1:1 (v/v). Como controle para identificao de substncias apolares, as seces foram tratadas por dez minutos em cada passagem da srie etanlica (25%, 50%, 75% e 100%) e cetnica (50% em etanol e 100%), seguida de reidratao gradual (LEWINSOHN et al., 1998). Como controle para identificao de substncias polares, as seces foram tratadas com banho em soluo comercial de hipoclorito de sdio (mximo de 2%) por 15 minutos, seguido de trs banhos consecutivos em soluo gua destilada:cido actico (1:500). De acordo com Kraus e Arduin (1997), os testes usados nos estudos anatmicos para o reconhecimento de classes de metablitos celulares, em geral, reagem a mais de uma substncia, gerando a necessidade de testes complementares, com controle, para garantir correta interpretao. Em razo dessa recomendao, foram realizadas de uma a trs repeties para cada substncia, sendo considerados passveis de testes complementares aqueles compostos determinados por apenas uma reao de colorao.
3. Resultados e discusso
3.1. Estudo anatmico A Figura 2 mostra os principais caracteres verificados no estudo anatmico dos fololos de S. terebinthifolius. As seces transversais do tero mdio da lmina foliolar revelam uma epiderme uniestratificada, com as clulas da face adaxial maiores que as da face abaxial e com um formato tabular bem definido. Adjacente a camada de clulas da face adaxial, pode-se encontrar uma hipoderme, contendo clulas que variam quanto ao aspecto tabular, as quais so maiores que as clulas epidrmicas (Figura 2A). Observa-se que o mesofilo apresenta uma organizao dorsiventral, constituda por duas camadas de clulas de parnquima palidico, que ocupa aproximadamente 75% da
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ep
ep
pp
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pl
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pl
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fl xl pm
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Pm
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Figura 2. Aspectos anatmicos do fololo de S. terebinthifolius. A: regio do mesofilo observando-se epiderme, hipoderme (seta), parnquima clorofiliano composto pelo parnquima palidico (pp) e parnquima lacunoso (pl) e estmato (ponta de seta); B: mesofilo com destaque para a ocorrncia de cavidade secretora (asterisco), idioblasto cristalfero na hipoderme contendo drusas (ponta de seta) e estmato; C: idioblastos drusferos dispersos no parnquima clorofiliano, sob luz polarizada (pontas de seta); D: viso da face adaxial da nervura principal mostrando a disposio celular do parnquima medular (pm), cavidades secretoras (asterisco), floema (fl) e xilema (xl); E: viso da face abaxial da nervura principal mostrando colnquima angular (seta), drusas (ponta de seta preta), cavidades secretoras (asterisco), idioblastos fenlicos (ponta de seta branca), floema (fl), xilema (xl) e parnquima medular (pm); F: regio de transio do limbo para a nervura principal mostrando a transio discreta do parnquima clorofiliano para o parnquima fundamental. Barras: A, B e C: 50 m; D, E e F: 100 m.
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espessura do mesofilo. Dentre as clulas desse parnquima, prximo a hipoderme, encontramse clulas que possuem aglomerados de cristais de oxalato de clcio do tipo drusas (Figura 2C). O parnquima lacunoso apresenta arranjos compactos com poucos espaos intercelulares e clulas de formas variadas. Observa-se que em algumas das clulas desse parnquima, localizadas prximas a epiderme abaxial, h uma grande quantidade de drusas (Figura 2C). No mesofilo podem ser encontradas grandes cavidades secretoras, possuidoras de clulas epiteliais e endodrmicas. A nervura central na regio do tero mediano do limbo foliolar, cncava nas superfcies abaxial e adaxial. A epiderme mostra clulas pouco menores que as do mesofilo, mais arredondadas. Na face abaxial verifica-se colnquima angular, onde podem ser observadas 5 a 7 estratos de clulas, contendo grande quantidade de drusas. A nervura possui um parnquima medular discreto com clulas de formato polidrico e com vacolo grande (Figura 2E). Cavidades secretoras aparecem na regio floemtica do sistema vascular, sendo distribudas acompanhando a tendncia circular deste ltimo (Figuras 2D e 2 E). Na regio de transio do parnquima clorofiliano com a nervura central, clulas parenquimticas da nervura aparecem entremeadas s do parnquima clorofiliano interrompendo-lhe uma sequncia na nervura, consolidada pelo colnquima angular na rea central (Figura 2D e 2F). O sistema vascular formado por feixes colaterais, ocorrendo interrupes de clulas parenquimticas que avanam em direo | regio medular. No xilema, os elementos de vaso dispem-se radialmente regio central. A Figura 3 mostra os aspectos verificados nas seces transversais da rquis foliar: um formato cncavo na regio abaxial e plano na regio adaxial, onde duas expanses laterais aparecem. Estas possuem epiderme uniestratificada com clulas de formato tabular e s vezes arredondado, dois estratos na hipoderme, parnquima clorofiliano (palidico e lacunoso) e um colnquima na extremidade do bordo. O estelo da rquis possui um parnquima medular constitudo por clulas isodiamtricas, de paredes delgadas, observando-se a ocorrncia de idioblastos fenlicos dispersos (Figura 2A). Na regio do floema, cavidades secretoras aparecem dispostas radialmente acompanhando o cilindro vascular (Figuras 2A e 2D). Na regio superior plana um colnquima interrompe a continuidade circular do parnquima fundamental na rquis; h ocorrncia de fibras nesta regio e que tambm acompanham o cilindro do feixe vascular anficrival. Neste, o xilema possui elementos de vaso dispostos radialmente e o floema, acompanha uma regio cambial; fibras separam uma regio
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pf
pf
pp
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pl
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Figura 3. Aspectos anatmicos do fololo de S. terebinthifolius. A: viso geral da rquis apresentando as expanses laterais (setas) e idioblasto fenlico (ponta de seta); B: regio superior da rquis mostrando a disposio do parnquima fundamental (pf) e colnquima (co) e, evidenciando a presena de fibras (seta); C: aspecto da expanso lateral da rquis mostrando a organizao dos tecidos semelhante a do limbo observando-se dois estratos na hipoderme (seta); parnquima palidico (pp); parnquima lacunoso (pl), colnquima (co); D: detalhe da cavidade secretora (asterisco) e dos tecidos adjacentes; E: regio inferior da rquis evidenciando a organizao do xilema (xl), floema (fl) e das fibras (fb); F: regio da rquis apresentando detalhes das fibras (fb) e de idioblastos cristalferos com monocristais (ponta de seta). Barras: A: 200 m; B, C, D e E: 50 m; F: 32 m.
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cortical discreta formada por clulas de parnquima e colnquima anelar (Figura 3D), onde podem ser encontrados idioblastos contendo monocristais e drusas, ambos de oxalato de clcio, prevalecendo em ocorrncia os monocristais (Figura 3F).
3.2. Estudo histoqumico Um fator importante para a diagnose de drogas vegetais corresponde s incluses celulares tanto de natureza orgnica ou inorgnica. As substncias sintetizadas no metabolismo vegetal pode-se ser evidenciadas por reaes histoqumicas, com as quais podemos identificar um grupo de substncias de interesse do ponto de vista farmacutico associando-os s caractersticas de identificao da espcie. O estudo histoqumico realizado para as folhas de S. terebinthifolius e seus resultados esto apontados na Tabela 1 e podem ser visualizados nas Figuras 4 e 5.
Tabela 1. Estudo histoqumico realizado em folhas de Schinus terebinthifolius.
Polaridade da substncia substncias apolares
Grupo de substncias lipdios totais lipdios cidos e lipdios neutros leos essenciais e oleoresinas esteroides lactonas sesquiterpnicas terpenoides c/ grupo carbonila compostos fenlicos totais taninos alcaloides amido protenas totais
Reativo histoqumico sudan III sulfato azul do Nilo reagente de Nadi tricloreto de antimnio cido sulfrico 2,4-dinitrofenilhidrazina cloreto frrico vanilina clordrica reagente de Dragendorff lugol azul brilhante de Comassie
Resultado Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo Positivo
substncias polares
A Figura 4 mostra os resultados positivos obtidos para as substncias apolares. Os lipdios totais evidenciados pelo sudan III ocorrem em pequenos lipossomos dispersos em todo o domnio mesoflico dos fololos, havendo uma concentrao maior no parnquima clorofiliano em relao regio da nervura principal. Nesta ltima, os lipdios aparecem evidentes nas cavidades secretoras principalmente em suas clulas epiteliais (Figuras 4B e 4C). O sudan III ao tambm evidenciar as ceras cuticulares mostrou que as clulas epidrmicas dos fololos apresentam suas paredes celulares bastante cutinizadas conferindo adequada impermeabilizao perda hdrica e proteo contra agentes patognicos (Figuras 4A, 4B e 4C).
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Figura 4. Resultados positivos para as reaes histoqumicas em fololos de S. terebinthifolius para as principais classes de metablitos apolares: aspectos gerais da regio do mesofilo e da nervura principal. A, D, E, H e I: controle negativo (srie hidroetanlica e cetnica, seguida de reidratao gradual, com colorao especfica para cada classe de metablito) para lipdios totais (A), lipdios cidos e lipdios neutros (D e E) e terpenoides (H e I); B e C: lipdios totais (sudam III); F e G: lipdios cidos (colorao azul) e lipdios neutros (colorao rsea) (sulfato azul do Nilo); J e L: terpenoides com grupo carbonila (2,4-dinitrofenilhidrazina). Barras: A, B, E e I: 100 m; C, D, G, H e L: 50 m; F e J: 32 m.
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Figura 5. Resultados positivos para as reaes histoqumicas em fololos de S. terebinthifolius para as principais classes de metablitos polares: aspectos gerais da regio da nervura principal e do mesofilo do limbo foliar. A e B: controle negativo para classes de compostos polares (soluo de hipoclorito de sdio, seguido de banho em soluo de gua destilada:cido actico (1:500)); C e D: compostos fenlicos totais (cloreto frrico); E e F: taninos (vanilina clordrica); G e H: protenas (azul brilhante de Comassie).
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Os lipdios cidos e neutros aparecem evidenciados pelo sulfato azul do Nilo, que por ser um corante alocromtico permite esta distino. Nas Figuras 4F e 4G podem ser visualizados os lpides neutros (gorduras) marcados de colorao rsea, concentrados prximos s cavidades secretoras e os lpides cidos (fosfolipdicos) marcados de azul concentrados no clornquima. De acordo com o resultado negativo obtido com o reagente de Nadi no se pode afirmar que os lpides evidenciados pelo sudan III sejam leos essenciais ou oleoresinas. Os terpenoides com grupamentos carbonlicos aparecem evidenciados pela colorao alaranjada no teste com 2,4-dinitrofenilhidrazina nas Figuras 4J e 4L. A Tabela 1 mostra que os testes histoqumicos para as classes dos metablitos polares apontam resultados positivos para a ocorrncia de compostos fenlicos, tnicos e proteicos. Na Figura 5 pode-se observar os caracteres visuais referentes a estas reaes. Os compostos fenlicos como um todo foram evidenciados com cloreto frrico nas regies parenquimticas dos fololos, destacando-se que esta ocorrncia se deu em maior intensidade no parnquima palidico, quase que exclusivamente em seu primeiro estrato celular (Figura 5D). Num desdobramento da classe fenlica foi testada a ocorrncia de taninos sendo evidenciado que estes podem ser encontrados no primeiro estrato de clulas do parnquima palidico (Figura 5F). Os compostos proticos esto distribudos nas regies parenquimticas da nervura, bem como localizados no parnquima palidico (no estrato celular adjacente a face adaxial) e nas clulas do parnquima lacunoso mais prximo a epiderme da face abaxial.
4. Concluso Os caracteres anatmicos descritos para S. terebinthifolius contribuem para a identificao da espcie e auxiliam na identificao desta droga vegetal. Os fololos de aroeira-vermelha podem ser indicados como fonte de princpios ativos de diferentes classes, passveis de serem extrados e podem ser utilizados como fonte potencial para fitoterpicos, indicando diretrizes mais definidas para estudos fitoqumicos de prospeco. Embora estudos mais aprofundados devam ser realizados acerca do estudo fitoqumico desta espcie.
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Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal
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CAPTULO III CONTROLE DE QUALIDADE DA DROGA VEGETAL
1. Introduo Considerando a participao crescente de plantas medicinais e de medicamento de origem vegetal no arsenal teraputico, cresce a necessidade de efetuar o controle de qualidade utilizando de tcnicas modernas e eficientes. As plantas medicinais, que constituem matriaprima para a produo de fitoterpicos e/ou fitofrmacos, apresentam variaes no teor de seus constituintes e podem sofrer deterioraes e contaminaes. Assim, o controle de qualidade de matrias-primas assume particular importncia (SHARAPIN et al., 2000). Entende-se por qualidade o conjunto de critrios que caracterizam a matria-prima para o uso ao qual se destina. A partir do estabelecimento dos parmetros de qualidade para a matria-prima, e considerando-se um planejamento adequado e um controle do processo de produo do medicamento, a qualidade do produto final estar, em grande parte, assegurada. A qualidade da matria-prima vegetal a determinante inicial da qualidade de um fitoterpico (FARIAS, 2001). A qualidade das matrias-primas vegetais no garante, por si, a eficcia, a segurana e a qualidade do produto final. A eficcia dada pela comprovao, atravs de ensaios farmacolgicos, dos efeitos biolgicos preconizados para esses recursos teraputicos. A segurana determinada pelos ensaios que comprovam a ausncia de efeitos txicos, bem como pela existncia de contaminantes nocivos sade. A segurana e a eficcia dependem de diversos fatores, como a metodologia de obteno, a formulao e a forma farmacutica e, devem ser definidas para cada produto, estabelecendo parmetros de controle de qualidade do produto final (FARIAS, 2001). A qualidade adequada das matrias-primas deve ser realizada de acordo com bases cientficas e tcnicas. Nos procedimentos rotineiros de anlise de qualidade, geralmente preconizado o emprego de metodologias qumicas, fsicas ou fsico-qumicas e biolgicas, sendo necessria a correlao entre os parmetros analisados e a finalidade que se destina (FARIAS, 2001).
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Estabelecido esses critrios, o emprego de protocolos de anlise, permitindo o acompanhamento e a documentao de todos os procedimentos, fundamental para assegurar e/ou gerenciar a qualidade (FARIAS, 2001). Embora haja no pas uma legislao que estabelea critrios para a qualidade, e normas para produo e comercializao, os produtos fitoterpicos ainda tm sido comercializados fora dos padres estabelecidos, sem garantia da eficincia teraputica desejada ou da ausncia de riscos sade do consumidor. Soma-se a isto, ainda, a venda de produtos a base de plantas medicinais sem nenhuma comprovao pr-clnica nem clnica de sua eficcia e segurana (YUNES et al., 2001) e a ausncia de farmacovigilncia (BRANDO et al., 2002).
1.1. Estabelecimento dos parmetros da qualidade Os parmetros da qualidade para fins farmacuticos so estabelecidos nas Farmacopeias e Cdigos oficiais (FARIAS, 2001). Um mtodo de anlise prescrito na Farmacopeia no necessariamente o nico nem o mais avanado sob o ponto de vista cientfico. , no entanto, o mtodo oficial no qual sero baseadas as decises em casos de dvidas ou litgio (SHARAPIN et al., 2000). As farmacopeias so cdigos oficiais ou oficialmente adotados onde so descritos os padres de qualidade dos medicamentos e os mtodos para a sua anlise, os quais a monografia deve ser considerada como um todo, capaz de assegurar qualidade adequada ao produto a que se destina (SHARAPIN et al., 2000). No caso das matrias-primas vegetais oriundas de plantas clssicas, ou seja, aquelas estudadas tanto do ponto de vista qumico, quanto farmacolgicos, existem monografias definindo critrios de identidade, de pureza e de teor de constituintes qumicos. Dependendo da origem do vegetal, podem ser utilizadas Farmacopeias de diferentes pases, alm de monografias complementares, como as elaboradas pela Organizao Mundial de Sade (FARIAS, 2001). No caso das plantas medicinais brasileiras, a grande maioria encontra-se descrita apenas na primeira edio da Farmacopeia Brasileira, editada em 1929, sendo que partes das monografias foram suprimidas na segunda edio ou destinadas ao Formulrio Nacional (FARIAS, 2001). Quando uma droga vegetal no consta em uma Farmacopeia atualizada, essencial que se elabore uma monografia estabelecendo padres de qualidade dessa planta como matria-prima.
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Alguns parmetros essenciais para a qualidade das matrias-primas vegetais podem variar dependendo da procedncia do material. As variaes, principalmente na composio qumica, ressaltam a importncia dos estudos de caracterizao farmacognstica, correlacionados com a atividade farmacolgica. Assim sendo, a origem geogrfica exata e as condies do cultivo, estgio de desenvolvimento, colheita, secagem e armazenamento, bem como de tratamentos com agrotxicos, descontaminantes e conservantes devem ser conhecidos (FARIAS, 2001). O estabelecimento de parmetros quantitativos, para matrias-primas vegetais, normalmente determinado pelo teor de um conjunto de substncias, preferencialmente correlacionadas com a finalidade de uso. Para as plantas estabelecido um teor mnimo, baseado em anlises sistemticas. Nos ensaios quantitativos devem ser consideradas as caractersticas qumicas e fsico-qumicas dos constituintes, evitando-se erros analticos ou problemas de abrangncia analtica ou limites de aceitabilidade (FARIAS, 2001). As anlises realizadas com a amostra tm por objetivo definir se a matria-prima poder ser empregada na elaborao de medicamentos. Portanto, durante todo o procedimento de anlise, a matria-prima dever permanecer armazenada separadamente, em quarentena, aguardando o laudo tcnico e, consequentemente, a sua liberao. Segundo as normas de boas prticas de fabricao, deve-se guardar como contraprova uma quantidade da amostra utilizada na anlise, caso seja necessrio repetir os ensaios. Alm disso, todo processo analtico deve ser validado e variaes nos resultados devero ser consideradas estatisticamente. Nas anlises de matrias-primas preconizada a realizao de ensaios em triplicata (FARIAS, 2001). O objetivo final em todos os casos fazer com que um produto oferecido como substncia medicamentosa satisfaa um padro de qualidade, enquadrando-se nas exigncias da monografia, quando analisado pelos mtodos preconizados pela Farmacopeia ou Cdigos oficiais (SHARAPIN et al., 2000).
2. Metodologia
2.1. Processamento ps-colheita para a obteno da droga vegetal As folhas frescas colhidas foram examinadas e separadas manualmente.
Sequencialmente, as folhas foram submetidas lavagem com gua corrente e, em seguida, a desinfeco em soluo de hipoclorito de sdio (0,2% de cloro ativo) durante 20 minutos.
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Aps a retirada do excesso de gua procedeu-se a secagem em estufa com ar circulante (Marconi MA 035) aquecido a temperatura de 40 C, at a obteno de massa constante, quando ento foram armazenadas em local seco e ao abrigo da luz (SHARAPIN et al., 2000).
2.2. Determinao do resduo slido do vegetal fresco Tomou-se uma amostra das folhas frescas (10 g), a qual foi fragmentada o suficiente e em seguida transferida para uma estufa com circulao de ar a temperatura de 40 C, at massa constante. Calculou-se a porcentagem do resduo slido na amostra e os resultados foram expressos pela mdia de trs determinaes (DETERMINAO, 1997, p.X-1.).
2.3. Obteno da droga vegetal pulverizada A metodologia utilizada para a moagem das folhas secas foi por seccionamento atravs de moinho de facas (Tecnal) seguidas pelo mtodo que combina impacto e atrito pelo emprego de moinho de bolas (Fabbe). Este processo duplo objetivou a reduo do tamanho das partculas de modo a aumentar, posteriormente, seu contato com o lquido extrator (AULTON, 2005).
2.4. Caracterizao fsico-qumica da droga vegetal pulverizada originada das folhas de Schinus terebinthifolius Os mtodos de avaliao da droga vegetal foram desenvolvidos segundo normas farmacopeicas, descritas nas seguintes obras de referncia: Farmacopeia Brasileira, 1977 e 1988; e, outras tcnicas no farmacopeicas descritas por Ansel et al., 2000; Costa, 2001, Martins e Sacramento, 2004; Aulton, 2005.
2.4.1. Amostragem Do total obtido para a droga pulverizada, retiraram-se vrias amostras utilizando a tcnica de quarteamento conforme a necessidade para a execuo das anlises (AMOSTRAGEM, 1988, p.V.4.2.1.).
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2.4.2. Determinao da granulometria da droga vegetal pulverizada Para padronizar a granulometria da droga vegetal pulverizada amostrou-se 25 g de p. Colocou-se a amostra sobre um jogo de tamises (Granutest), operados por dispositivos mecnicos (Produtest), de abertura nominal da malhas correspondentes a 1,180; 0,840; 0,590; 0,420; 0,250; 0,177 mm, provido de tampa e recipiente coletor. O processo foi executado em tamisador vibratrio, de ao mecnica uniforme, durante um perodo de trinta minutos (a F. bras. IV preconiza 20 minutos no mnimo), na escala de 100 vibraes/min de acordo com as instrues do fabricante do equipamento. Posteriormente, foram pesados, cuidadosamente, os ps recolhidos do coletor e a frao remanescente sobre cada tamis (DETERMINAO, 1988, p.V.2.11.). Os resultados foram transpostos para o software Excel e expressos de acordo com o termo utilizado e, representados pela mdia de trs determinaes.
2.4.3. Estudo e determinao do tamanho mdio das partculas Pela distribuio apresentada na determinao da granulometria e por estudos de passagem e reteno da droga vegetal a partir da quantidade de ps utilizada, realizada pelo mtodo de tamisao, pode-se construir planilhas e grficos para a determinao do tamanho mdio das partculas e distribuio do tamanho das partculas utilizando o software Excel. A distribuio de tamanho de partcula foi desdobrada em intervalos de tamanhos diferentes, representados na forma de histograma, gerado a partir de dados da faixa granulomtrica, o qual permitiu que o percentual de partculas apresentadas num dado dimetro equivalente fosse determinado (AULTON, 2005). O tamanho mdio das partculas da droga vegetal pulverizada foi quantificado por mtodo de tamisao, quanto s suas propores de faixa granulomtrica e assim determinado pelo clculo do dimetro mdio das partculas (dav), sendo o resultado obtido pela mdia de trs determinaes (ANSEL et al., 2000).
2.4.4. Determinao da densidade Para a determinao da densidade aparente da droga vegetal pulverizada foram tomadas trs amostras de 25 g obtidas por quarteamento e separadas em frascos plsticos independentes.
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Cada amostra foi transferida para encapsulador onde foram dispostos trs grupos de vinte e cinco cpsulas gelatinosas duras de tamanho 0 (zero), que individualmente possuem volume conhecido de 0,688 mL; a massa das cpsulas vazias referente a cada grupo foi determinada anteriormente. Aps o preenchimento dos grupos de cpsulas com a droga vegetal pulverizada, a massa foi determinada e, descontada a massa das cpsulas vazias a densidade aparente foi calculada dividindo-se os valores obtidos por exatamente 17,20 mL (25 x 0,688 mL) (MARTINS e SACRAMENTO, 2004). Os valores de densidade considerados resultaram da mdia calculada de trs determinaes para cada amostra.
2.4.5. Determinao de gua pela perda por dessecao Mtodo gravimtrico: colocou-se cerca de 10 g da droga pulverizada, preparada e exatamente pesada, em cpsula de evaporao, tarada. Secou-se em estufa (Fanen) a 105 C por cinco horas e pesou-se. Continuou-se a dessecao, pesando a intervalos de uma hora, at que a diferena entre duas pesagens sucessivas no fosse superior a 0,25% (MTODO, 1977, p.914). A porcentagem da perda por dessecao foi calculada pela equao segundo Farmacopeia Brasileira (DETERMINAO, 1988, p.V.2.9.) e expressa pela mdia de trs determinaes.
Pu Ps x 100 Pa Pa = massa da amosta; Pu = massa da cpsula de evaporao contendo a amostra antes da dessecao; Ps = massa da cpsula de evaporao contendo a amostra aps a dessecao.
2.4.6. Determinao do pH 2.4.6.1. Determinao potenciomtrica do pH
Pesou-se 99,0 g de gua destilada e, aps aquecimento e ebulio durante 5 minutos, verteu-se a gua destilada fervente sobre exatamente 1,0 g da droga vegetal pulverizada. Em seguida, tampando-se o recipiente, deixou-se o material em infuso por 15 minutos. Decorrido este perodo, foi realizada uma filtrao utilizando-se algodo. Aguardou-se o arrefecimento da soluo extrativa obtida para a verificao do pH da soluo-problema em peagmetro
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(Analion pH-metro), previamente calibrado. Para uma melhor reprodutibilidade deste teste o valor do pH da gua tambm foi verificado (DETERMINAO, 1988, p.V.2.19.). O resultado foi expresso pela mdia de trs determinaes.
2.4.6.2. Determinao colorimtrica do pH
Baseou-se no emprego de papeis indicadores, que tem a propriedade de mudar de colorao conforme a variao de pH. A determinao foi levada a efeito umedecendo-se o papel indicador (Universalindikator - Merck) com a soluo-problema e observando-se a mudana de colorao (DETERMINAO, 1988, p.V.2.19.2.).
2.4.7. Determinao de cinzas totais
Calcinou-se previamente o cadinho de porcelana em mufla (Quimis) a temperatura de 450 C por um perodo de 30 minutos. O mesmo foi resfriado em dessecador e sua massa-tara foi determinado em balana analtica (Tecnal Mark 1300). Posteriormente, amostrou-se exatamente trs gramas da droga pulverizada, a qual foi distribuda uniformemente no cadinho, incinerou-se o material e, em seguida, submeteu-se a calcinao em mufla a temperatura de 450 C por um perodo de duas horas, at a que todo o carvo fosse eliminado. Aps procedimento, o cadinho foi deixado em dessecador para arrefecimento seguindo-se a determinao da massa at que o valor atingisse uma massa constante (DETERMINAO, 1988, p.V.4.2.4.). Os resultados calculados foram expressos em porcentagem de cinzas em relao droga seca e representados pela mdia de trs determinaes.
2.4.8. Determinao de cinzas insolveis em cido
O resduo obtido na determinao de cinzas totais foi aquecido a fervura durante cinco minutos com 25 mL de cido clordrico (70 g/L) em cadinho coberto com vidro de relgio. Aps procedimento, lavou-se o vidro de relgio com cinco mL de gua quente, juntando esta gua ao cadinho. Recolheu-se o resduo insolvel em cido, por filtrao, sobre papel de filtro isento de cinza (Nalgon 3550), lavando-o com gua quente at que o filtrado se mostrasse lmpido. Transferiu-se o papel de filtro contendo o resduo para o cadinho original, secou-se sobre chapa quente (Tecnal TE 018) e incinerou-se a cerca de 500 C at massa constante (DETERMINAO, 1988, p. V.4.2.5.). Os resultados calculados foram expressos em
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porcentagem de cinzas insolveis em cido em relao droga seca e representados pela mdia de trs determinaes.
2.4.9. Determinao de extrativos no extrato etanlico
Num balo volumtrico de 50 mL de capacidade juntou-se 2,5 g de droga pulverizada (tamis com malhas de 0,22 mm de largura) e o etanol diludo, a 70 GL, at perfazer o volume indicado. Arrolhou-se e agitou-se o balo durante duas horas. Filtrou-se. Para um balo de boca larga, munido de rolha, seco e tarado, mediu-se, utilizando-se pipeta volumtrica, 25 mL do filtrado, promoveu-se a evaporao da soluo etanlica at a secura por aquecimento em banho-maria, deixou-se depois arrefecer num exsicador, onde permaneceu durante 48 horas, pesou-se e calculou-se a percentagem de extrato solvel (COSTA, 2001).
2.4.10. Determinao do resduo insolvel no etanol
Aqueceu-se em balo cnico de 250 mL de capacidade, munido de condensador vertical, a banho-maria fervente durante 15 minutos, exatamente, 1 g de droga pulverizada com 50 mL de etanol. Deixou-se arrefecer durante uma hora, com agitaes ocasionais. Filtrou-se por um filtro de papel, pequeno, seco na estufa a 105 C e tarado. Lavou-se o balo e o resduo retido no filtro com etanol, frio, at que este passou-se a incolor. Secou-se o filtro e o resduo, a 105 C, at massa constante. Com este valor calculouse a percentagem do resduo insolvel no etanol (COSTA, 2001).
3.1. Processamento ps-colheita para a obteno da droga vegetal
O processamento ps-colheita tem por objetivo a conservao das caractersticas fsicas, qumicas, organolpticas e farmacolgicas da droga vegetal. O processamento inadequado resulta em matria-prima de baixa qualidade, com perda de princpios ativos, aumento da carga microbiana e m apresentao comercial (SHARAPIN et al., 2000). As folhas frescas colhidas foram selecionadas de modo a se obter amostras em condies adequadas para a utilizao, conforme descrito no item 2.1.
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O processamento ps-colheita trata-se de um procedimento que suscita controvrsias, pois se a lavagem com gua retira da droga a terra e a areia aderidas, pode retirar, tambm parte de princpios ativos e, seguramente, aumenta a umidade do material, que necessitar de mais tempo para secar. A lavagem com hipoclorito reduz a carga bacteriana, entretanto, como o hipoclorito oxidante, h o risco de oxidar, tambm, os princpios ativos. A etapa mais importante do processamento ps-colheita , sem dvida, a secagem. O processo de secagem interrompe o processo de degradao pela inativao enzimtica e processos fermentativos, impede o desenvolvimento de micro-organismos e as reaes de oxidao e hidrlise quando conduzidos adequadamente (SHARAPIN et al., 2000). Paralelamente ao processo de secagem executou-se a determinao do resduo slido
de vegetal fresco, determinao esta que indica a perda de gua e/ou de substncias volteis
durante o processo de secagem da espcie vegetal. A estabilizao da droga vegetal, com a obteno de uma massa constante, deu-se aps decorrido 72 horas do incio do processo de secagem e, os resultados da anlise apresentaram um valor mdio de 40,96% 0,49 de resduo slido do vegetal fresco. Dessa forma, pode-se correlacionar, a um valor mdio de 59,04% 0,49, a perda de gua e/ou de substncias volteis durante o processo de secagem.
3.2. Obteno da droga vegetal pulverizada
O procedimento de moagem possibilitou reduzir mecanicamente o material vegetal a fragmentos de pequenas dimenses, preparando-o assim, para as prximas etapas de desenvolvimento de anlises e, posteriormente, um processo adequado de extrao.
3.3. Caracterizao fsico-qumica da droga vegetal pulverizada originada das folhas de Schinus terebinthifolius
O controle de qualidade e a padronizao de um fitoterpico envolvem vrias etapas, entretanto, a fonte e a qualidade das matrias-primas vegetais tm um papel central na obteno de produtos com constncia de composio e propriedades teraputicas reprodutveis (CALIXTO, 2000). Tendo em vista as exigncias atuais por parte da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (BRASIL, 2004) e a ausncia de estudos farmacognsticos para a espcie Schinus terebinthifolius, buscou-se colaborar com o estudo desta espcie. Para isso foram realizados ensaios com o objetivo de estabelecer parmetros de qualidade do material botnico. As
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anlises foram desenvolvidas por processos descritos anteriormente e seus resultados esto elencados conforme se segue. Para que os resultados dos mtodos de anlise da qualidade da droga vegetal expressassem valores representativos da quantidade total da droga disponvel, foi imprescindvel recorrer a tcnicas de amostragem definidas e uniformes. O procedimento de amostragem especificado levou em considerao o grau de diviso da droga e a quantidade de droga disponvel. A avaliao granulomtrica do material vegetal pulverizado um parmetro imprescindvel a ser estabelecido. Ao determinar a granulometria do p resultante da reduo de folhas de S. terebinthifolius, pode-se estimar a eficincia dos processos de moagem utilizados, correlacionando-os ao grau de diviso da droga vegetal obtido ao seu enquadramento as caractersticas granulomtricas expressas em farmacopeias e cdigos oficiais e, tambm, deduz-se que o maior grau de pulverizao da droga vegetal representa uma influncia direta sobre a eficincia no processo extrativo e mistura. A granulometria do p obtido a partir das folhas pulverizadas de S. terebinthifolius em moinhos de facas e bolas, permite afirmar que a maior parte das partculas encontra-se entre a faixa granulomtrica de 0,250 mm a 0,840 mm como apresentado na Tabela 2 e Figura 6. Segundo a classificao dos ps proposta pela Farmacopeia Brasileira IV (1988), o p de folhas de S. terebinthifolius obtido nesse processo de moagem, pode ser classificado como p grosso, o qual se refere quelas partculas que passam em sua totalidade pelo tamis com abertura nominal de malha de 1,7 mm e, no mximo, 40% pelo tamis com abertura nominal de malha de 355 m (DETERMINAO, 1988, p.V.2.11.).
Tabela 2: Anlise granulomtrica por tamisao de folhas de S. terebinthifolius pulverizadas Tamis N ABNT Faixa granulomtrica Massa retida (g) Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Mdia Porcentagem amostral (g) retida Desvio padro
16 - 20 20 - 30 30 - 40 40 - 60 60 - 80 80 - coletor
1,180 0,840 0,840 0,590 0,590 0,420 0,420 0,250 0,250 0,177 0,177 0,000
0,241 4,859 8,392 5,478 2,845 3,053
0,245 4,640 8,190 5,755 2,900 3,349
0,352 4,901 9,082 5,183 2,559 3,013
0,279 4,800 8,555 5,472 2,768 3,138
1,12 19,19 34,20 21,88 11,07 12,55
0,063 0,140 0,468 0,286 0,183 0,184
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35
10 9
8,555
Mdia de massa retida (g)
8 7 6 5 4 3 2 1 0
0,000 0,1 77 0,177 0,250 0,250 0,420 0,420 0,590 0,590 0,840 0,840 1 ,1 80 0,279 3,138 2,768 5,472 4,800
Faixa granulomtrica (mm)
Figura 6: Distribuio da faixa granulomtrica de folhas pulverizadas de S. terebinthifolius
Pela distribuio apresentada na determinao da granulometria e por estudos de passagem e reteno da droga vegetal a partir da quantidade de ps utilizada, realizada pelo mtodo de tamisao, pode-se determinar o tamanho mdio das partculas e a distribuio do tamanho das partculas de folhas pulverizadas de S. terebinthifolius. O tamanho mdio das partculas da droga vegetal pulverizada foi quantificado por mtodo de tamisao, quanto s suas propores de faixa granulomtrica, devido dificuldade em determinar uma nica dimenso de partcula, uma vez que o processo de moagem resulta em partculas irregulares. O valor do tamanho mdio das partculas apresentado foi de 0,4292 mm, sendo determinado pelo clculo descrito em micromertica, segundo Ansel et al. (2000) e representados na Tabela 3.
Tabela 3: Clculo de tamanho mdio das partculas de folhas de S. terebinthifolius pulverizadas, segundo Ansel et al. (2000)
Tamis N 16 20 20 30 30 40 40 60 60 80 80 - coletor
Abertura mdia (mm) 1,01 0,715 0,505 0,335 0,2135 0,0885
Massa retida* (g) % retida 0,279 1,12 4,800 19,19 8,555 34,20 5,472 21,88 2,768 11,07 3,138 12,55 25,012 100,00
% retida x Abertura mdia 1,13 13,72 17,27 7,33 2,36 1,11 42,92
* Mdia de trs determinaes
d ( av ) =
(% retida) . (abertura mdia) 100
d ( av ) =
42,92 = 0,4292 mm 100

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Como a maioria dos ps contm partculas com um nmero elevado de dimetros equivalentes diferentes, a distribuio de tamanho de partcula foi desdobrada em intervalos de tamanhos diferentes, representados na forma de histograma (Figura 7), gerado a partir de dados da faixa granulomtrica (Tabela 2), o qual permitiu que o percentual de partculas apresentadas num dado dimetro equivalente fosse determinado.
40 35
Moda
34.20
Massa percentual (%)
30 25 20 15 10 5 0
0,000 0,1 77 0,177 0,250 0,250 0,420 0,420 0,590 0,590 0,840 0,840 1 ,1 80 1.12 12.55 11.07 21.88 19.19
Dimetro do tamanho da partcula (mm)
Figura 7: Histograma da distribuio do tamanho de partcula e curva de distribuio de massa percentual do tamanho da partcula de folhas pulverizadas de S. terebinthifolius
O valor do maior percentual de partculas apresentadas num dado dimetro equivalente - representado como moda - separa a curva normal em duas metades iguais, uma vez que a distribuio simtrica, mas nem todas as populaes de partculas so caracterizadas por uma curva de distribuio normal, de modo que as distribuies de partculas dessas populaes exibem assimetria, como neste caso. Dessa forma, foi possvel classificar a curva de distribuio de massa percentual ao tamanho de partcula das folhas pulverizadas de S. terebinthifolius, a qual apresentou uma assimetria negativa, caracterstica esta, por apresentar uma curva com um alongamento da cauda no sentido das faixas de tamanho menor (AULTON, 2005), conforme disperso apresentada na Figura 7. A densidade empregada como sinnimo de massa especfica. Salvo determinao contrria, a densidade adotada a aparente a 25/25, isto , representa a relao entre a massa aparente de uma substncia (droga vegetal) ao ar a temperatura de 25 C e a massa de igual volume de gua destilada nas mesmas condies de temperatura e presso (DENSIDADE, 1977, p.38).
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A densidade aparente para as partculas obtidas, na pulverizao de folhas de S. terebinthifolius pelo processo de moagem realizado, foi avaliada segundo metodologia descrita na Farmacopeia Brasileira (1977). A mdia dos resultados das anlises desenvolvidas apresentou o valor de densidade de 0,5085 g/mL 0,003. Vale ressaltar que tal ensaio constitui-se numa exigncia estabelecida pela RDC 48/2004 (BRASIL, 2004). A droga vegetal contm, naturalmente, uma certa quantidade de gua, que subsiste desde a secagem da planta. importante que se conhea esse valor, pois um ndice relacionado sua preparao e garantia de sua conservao (COSTA, 2001). Da a necessidade do estabelecimento de limites de umidade para drogas vegetais (DETERMINAO, 1988, p.V.2.9.). A determinao do teor de gua pela perda por
dessecao do material vegetal pulverizado de S. terebinthifolius foi conduzida conforme
estabelecido, por mtodo gravimtrico, segundo Farmacopeia Brasileira (1977, p.914). Amostras do material pulverizado foram submetidas temperatura de 105 C e, dessa forma, dessecadas at peso constante, quando o ensaio foi dado por concludo. Este ensaio visa determinar a quantidade de substncia voltil de qualquer natureza expelida nas condies especficas (DETERMINAO, 1988, p.V.2.9.). Uma quantidade residual excessiva de gua pode indicar a possibilidade de a matria-prima vegetal ter sido mal preparada ou de se encontrar acondicionada inconvenientemente (COSTA, 2001). Portanto em circunstncias capazes de propiciar o desenvolvimento de insetos e de micro-organismos, como bactrias e fungos e, permitir a ocorrncia de reaes enzimticas, como hidrlise, as quais promovem alteraes e/ou degradao dos seus constituintes ativos e, consequentemente acarretando a deteriorao da droga vegetal. Para assegurar a qualidade da matria-prima vegetal, a Farmacopeia Brasileira (1988, p.V.4.2.3.) estabelece limites de umidade para drogas vegetais, em geral, na faixa de 8 a 14%. A mdia dos resultados obtidos na determinao por dessecao de folhas pulverizadas de S. terebinthifolius foi dada por concluda quando duas pesagens sucessivas no diferiram entre si por mais de 5 mg, conforme estabelecido pela Farmacopeia Brasileira (1988, p.V.4.2.3.) e, apresentaram um valor de 5,3% 0,1 de umidade contida na droga vegetal. Valor este situado fora da faixa percentual estabelecida, mas segundo assegura a Farmacopeia Brasileira (1977, p.38), toda vez que na descrio de um produto no for indicada a percentagem da perda por dessecao, tolerado um mximo de cinco por cento. Portanto, alicerado neste contedo, pode-se afirmar que o teor de umidade encontrado na determinao por dessecao de folhas de S. terebinthifolius amostradas, encontra-se dentro das normas adequadas. Como resultado,
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a determinao da gua importante para demonstrar a concordncia com os padres das farmacopeias. Outro parmetro utilizado para a caracterizao de um material vegetal referente concentrao hidrogeninica do extrato, ou seja, a determinao do pH da soluo extrativa. Encontram-se, nas plantas, diversos cidos minerais, mas particularmente orgnicos pertencentes s diversas sries, aromticas, terpnicas, heterocclicas, em geral combinados sob a forma de sais, steres, lactonas, amidas, nos lipdios, essncias, resinas, glicdios, protenas e em outros constituintes naturais. Uma parte destes cidos encontra-se tambm no estado livre, solubilizada no citoplasma, e por tal motivo pode dosear a acidez total das suas solues extrativas. Em solues aquosas, os cidos dissociam-se parcialmente em ons, e essa acidez pode ser medida pela concentrao dos hidrognios na soluo (COSTA, 2001). Para a determinao do pH do extrato de folhas de S. terebinthifolius, primeiramente, para uma melhor reprodutibilidade da anlise, o valor do pH da gua destilada tambm foi verificado, devido ao fato desta ser utilizada no procedimento para a obteno da soluo extrativa. Desenvolveu-se, para a determinao do valor do pH, segundo Farmacopeia brasileira (1988, p.V.2.19.-V.2.19-2.), os mtodos de potenciometria e de colorimetria. A determinao colorimtrica do pH baseou-se no emprego do papel indicador, indicando como resultados o valor mdio para a gua destilada de 5 unidades de pH e, para o extrato de folhas de S. terebinthifolius o valor mdio de 4 unidades de pH, o qual foi levado a efeito pela ocorrncia da mudana de colorao do papel indicador. A determinao potenciomtrica do pH foi obtida, pela leitura em peagmetro indicando como resultados o valor mdio para a gua destilada de 5,32 0,03 unidades de pH e, para o extrato de folhas de S. terebinthifolius o valor mdio de 3,94 0,02 unidades de pH, o que sugere a presena de substncias cidas no farmacgeno analisado. O contedo de cinzas nas drogas vegetais constitui, dentro de certos limites, um ndice individual simultaneamente de identificao e pureza, mas logo que ultrapasse um mximo de limite estabelecido, pode considerar-se como presena de contaminantes. H, portanto, necessidade de marcar um mbito de variao dentro do qual se considere normal o contedo de cinzas (COSTA, 2001). Para tal, procedeu-se a determinao de cinzas totais, seguido da
determinao de cinzas insolveis em cido. As cinzas resultantes da incinerao do
material vegetal podem derivar de constituintes minerais e de organo-metlicos integrantes da planta, o qual se denomina como cinzas fisiolgicas e, aquele que deriva da matria estranha, principalmente solo e areia que adere superfcie da droga, recebe a designao de cinzas no fisiolgicas (FARMACOPEIA, 1988; SHARAPIN et al., 2000; COSTA, 2001).
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A determinao de cinzas totais envolve a determinao tanto da cinza fisiolgica quanto da no fisiolgica e consiste em medir a quantidade do resduo no volatilizado aps a calcinao da droga, o que permite a verificao de impurezas inorgnicas no volteis que podem estar presentes como contaminantes (DETERMINAO, 1988, p.V.4.2.4.; SHARAPIN et al., 2000). A determinao das cinzas insolveis em cido preconizada no caso de farmacgenos, permitindo a verificao de slica, principalmente areia e terra silcea e constituintes silicosos presentes na droga vegetal (DETERMINAO, 1988, p.V.4.2.5.; SHARAPIN et al., 2000; COSTA, 2001; FARIAS, 2001). As mdias das anlises desenvolvidas apresentaram os valores de 18,33% 1,53 para cinzas totais e, 0,33% para cinzas insolveis em cido. As substncias extrativas obtidas de drogas vegetais dependem de sua prpria natureza e/ou da classe das substncias de interesse e, do solvente utilizado no processo de extrao dessas substncias. A determinao do extrato etanlico e do resduo insolvel no etanol so processos quantitativos relacionados aos constituintes qumicos presentes na espcie vegetal. Estes ensaios destinam-se determinao do teor de substncias ativas presentes nas drogas vegetais e, seus resultados so complementares e possuem o mesmo significado analtico. A mdia dos resultados obtidos nas determinaes do extrato etanlico e do resduo insolvel no etanol referente aos processos extrativos de folhas pulverizadas de S. terebinthifolius apresentaram os valores de 30% 2,31 do teor de extrativos obtido nas circunstncias estabelecidas e, de 62,1% 1,02 de resduo, valor este que representa as substncias insolveis retidas por filtrao.
4. Concluso
A qualidade da droga vegetal pode interferir diretamente na ao farmacolgica da espcie. Pesquisas avaliando a qualidade da matria-prima e de produtos a base de plantas medicinais e, com o estabelecimento de parmetros de qualidade juntamente com prioridades de conservao e armazenamento de derivados de plantas medicinais, so suportes que apresentam grande importncia dentre a avaliao farmacognstica para assegurar a qualidade de uso a que se destina. Segundo Carvalho e colaboradores (2009), a falta de mtodos de controle adequados tem limitado a comercializao de produtos com alta qualidade, especialmente aqueles derivados de espcies nativas, como Schinus terebinthifolius. Destaca-se a importncia dessas informaes para o incio do estabelecimento dos parmetros referentes ao controle da qualidade das folhas de S. terebinthifolius, com a
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realizao de futuros estudos para essa espcie vegetal, garantindo com isso, a confiabilidade nos resultados, para que sejam utilizadas com finalidade fitoterpica. Como os mtodos so convencionais e de resultados reprodutveis e, conduzem a resultados teis de anlise, reiterase o estudo de amostras oriundas de vrios locais para verificar a repetncia das informaes, bem como determinar-se os desvios pertinentes.
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Captulo IV - Estudo Fitoqumico
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CAPTULO IV ESTUDO FITOQUMICO
1. Introduo
O metabolismo vegetal compreende o conjunto de reaes qumicas, que visam ao aproveitamento de nutrientes e, que continuamente esto ocorrendo em cada clula. Os compostos qumicos formados, degradados, ou simplesmente transformados por essas reaes so chamados de metablitos (SANTOS, 2001). Os processos metablicos que esto envolvidos na produo de macromolculas, como, carboidratos, lipdeos, protenas e cidos nuclicos, os quais apresentam um elevado grau de similaridade entre os organismos e, por serem considerados processos essenciais envolvidos na transformao de molculas de nutrientes nas unidades constitutivas essenciais vida do organismo e comuns aos seres vivos, so designados de metabolismo primrio (SANTOS, 2001). A partir dos produtos do metabolismo primrio, atravs de rotas biossintticas diversas e custa de energia, as espcies vegetais so capazes de produzir, transformar e acumular inmeras substncias de natureza qumica e propriedades bastante diversas, denominadas de micromolculas, como flavonoides, taninos, antraquinonas, cumarinas, terpenos, saponinas, alcaloides, as quais geralmente apresentam estrutura complexa e com marcantes atividades biolgicas. Estas substncias, cuja produo e acmulo esto restritas aos vegetais, sendo seu metabolismo especfico e nico, caracterizam-se muitas vezes como elementos de diferenciao, pelo fato dos compostos encontrarem-se geralmente presentes nas plantas em pequenas quantidades e, por vezes, em clulas especializadas, caracterizando-as especificamente. Embora no essenciais para a manuteno da vida do organismo, garantem vantagens para a sua sobrevivncia e perpetuao, em seu ecossistema. A este processo, que originam o segundo grupo de compostos qumicos, d-se a denominao de metabolismo secundrio (VON POSER, 2001; SANTOS, 2001; PARANHOS, 2005). Os estudos fitoqumicos compreendem as etapas de extrao, fracionamento, isolamento, elucidao estrutural e identificao dos constituintes mais importantes do vegetal, principalmente de substncias originrias do metabolismo secundrio, responsveis ou no - pela ao biolgica. Esses conhecimentos permitem identificar a espcie vegetal e,
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conjuntamente com ensaios de atividade biolgica, analisar e caracterizar fraes ou substncias bioativas (SONAGLIO et al., 2001). A pesquisa fitoqumica tem por objetivos conhecer os constituintes qumicos de espcies vegetais ou avaliar a sua presena. Quando no se dispe de estudos qumicos sobre a espcie de interesse, a anlise fitoqumica preliminar pode indicar os grupos de metablitos secundrios relevantes na mesma. Caso o interesse esteja restrito a uma classe especfica de constituintes ou as substncias responsveis por uma certa atividade biolgica, a investigao dever ser direcionada para o isolamento e a elucidao estrutural das mesmas (FALKENBERG et al., 2001).
1.1. Anlise fitoqumica preliminar
A triagem fitoqumica ou screening fitoqumico uma das etapas iniciais da investigao de plantas medicinais, atravs de um conjunto de tcnicas, para o desenvolvimento da pesquisa fitoqumica (LCIO, 2000). A triagem fitoqumica preliminar consiste na caracterizao de um determinado grupo de substncias presentes em uma espcie vegetal, desenvolvida a partir do processo extrativo de substncias presentes na planta com a utilizao de um solvente adequado e posteori caracterizao dessas substncias no extrato. Em anlises fitoqumicas, quando no se conhece previamente o contedo do material a ser analisado, costuma-se submeter o material vegetal a sucessivas extraes, com solventes de polaridade crescente, conseguindo-se uma extrao fracionada, em que as diferentes fraes contm compostos de polaridades tambm crescentes (FALKENBERG et al., 2001). Classicamente, a caracterizao dos principais grupos de substncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realizao de reaes qumicas que resultem no desenvolvimento de colorao e/ou precipitado caracterstico (FALKENBERG et al., 2001). Mtodos estes, que devem permitir avaliao rpida, com reaes sensveis, reprodutveis e de baixo custo e, que permitem determinar qualitativamente a presena dos principais grupos de constituintes qumicos de uma planta, tanto livres, quanto na forma conjugada e, a partir da, orientar a extrao e/ou fracionamento dos extratos para o isolamento dos grupos de maior interesse (LCIO, 2000). A utilizao de material vegetal fresco pode ser indispensvel para a deteco de alguns componentes especficos, visto que seu emprego traz a vantagem de evitar a presena de substncias provenientes do metabolismo de fenecimento vegetal. No caso de execuo da
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anlise fitoqumica em tempo distante da coleta, o material deve ser tratado, visando: a sua estabilizao, de forma a impedir a ao enzimtica e, assim, evitar a alterao dos compostos qumicos originalmente presentes no vegetal e; a retirada de gua, atravs da secagem, tendo por finalidade impedir reaes de hidrlises e de crescimento microbiano (FALKENBERG et al., 2001). Para algumas reaes, o extrato pode ser empregado diretamente, enquanto que, em outras, o solvente deve ser previamente eliminado. Usualmente, estas reaes so realizadas em tubo de ensaio ou placa de toque, podendo tambm ser utilizada a deteco cromatogrfica com reagentes especficos (FALKENBERG et al., 2001). A realizao das reaes de caracterizao diretamente no extrato bruto pode eventualmente mascarar o resultado. O fracionamento do extrato e a realizao dos testes com as fraes obtidas possibilitam geralmente reaes mais ntidas (FALKENBERG et al., 2001).
1.2. Processo extrativo: consideraes gerais
Antes de executar uma extrao, deve-se considerar uma srie de fatores que interferem nessa operao, tais como as caractersticas do material vegetal, o seu grau de diviso, o meio extrator e o processo extrativo (FALKENBERG et al., 2001). O solvente utilizado deve ser o mais seletivo possvel para extrair apenas as substncias de interesse ou em maior quantidade. Como a seletividade depende da polaridade, o grau de polaridade do grupo de substncias que se deseja extrair determina o solvente ou mistura de solventes que se aproxima do timo de seletividade para a extrao (FALKENBERG et al., 2001). Os fatores relacionados aos mtodos de extrao dizem respeito agitao, temperatura e ao tempo de execuo. Na escolha de um mtodo extrativo, deve-se avaliar a eficincia, a estabilidade das substncias extradas, a disponibilidade dos meios extratores e o custo do processo escolhido, considerando a finalidade do extrato que se deseja preparar (FALKENBERG et al., 2001).
1.3. Fracionamento por partio
O fracionamento de um extrato vegetal pode se iniciar pelo processo de partio por solventes orgnicos de polaridade crescente. O fracionamento por partio implica numa dissoluo seletiva e distribuio entre as fases de dois solventes imiscveis. Este fenmeno
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pode ser aplicado com vistas separao de componentes de uma mistura de substncias presentes em um extrato vegetal (FALKENBERG et al., 2001).
1.4. Cromatografia em camada delgada
A cromatografia um mtodo fsico-qumico que permite a separao de misturas de substncias em seus componentes individuais. Esta tcnica permite tambm obter informaes quantitativas e qualitativas sobre as substncias contidas em uma mistura (ROCHA, 2000). A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica amplamente utilizada para fins de anlise, tanto de extratos vegetais quanto para avaliar o resultado de um processo de separao (FALKENBERG et al., 2001). Esta tcnica consiste na separao dos componentes de uma mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada fina de adsorvente, retido sobre uma superfcie plana (ROCHA, 2000). Utiliza-se o desenvolvimento dessa tcnica com maior freqncia na anlise vegetal, em virtude da simplicidade e facilidade de compreenso, rapidez de execuo, sensibilidade, versatilidade, reprodutibilidade e baixo custo oferecido pela tcnica e, ainda, pelos resultados apresenatdos. Assim, algumas farmacopias empregamna como processo habitual na identificao de substncias (ROCHA, 2000; COSTA, 2001). H, porm, necessidade de fixar as circunstncias experimentais, em virtude de vrios fatores modificarem os resultados, como os adsorventes, espessura das camadas, umidade, eluente (COSTA, 2001).
2. Metodologia
2.1. Triagem fitoqumica preliminar
A caracterizao dos principais grupos de substncias vegetais de interesse foi conseguida pela realizao de reaes qumicas (Tabela 4), que resultaram no desenvolvimento de colorao e/ou precipitado caracterstico, conforme descritos em Costa (2001) para a caracterizao de taninos, flavonoides, cumarinas, heterosdeos cardiotnicos e cianogenticos, saponinas, antraquinonas, alcaloides e metilxantinas.
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Tabela 4: Reaes qumicas de caracterizao de grupos de substncias presentes na droga pulverizada de folhas de S. terebinthifolius
Grupo de substncias de interesse Taninos
Flavonoides Saponinas Alcaloides - Alcaloide de ncleo tropano - Alcaloides quinlicos Heterosdeos cardiotnicos Heterosdeos cianogenticos Antraquinonas Cumarinas Metilxantinas
Mtodo de reao Gelatina Sais de ferro (FeCl3) Acetato de chumbo cido nitroso Shinoda (cianidina) Taubock (oxalo-brica) Pew (zinco metlico) Cloreto frrico Cloreto de alumnio ndice de espuma Dragendorff Mayer Bertrand Vitali Grahe Liebermann-Burchard Kedde Keller-Kiliani Tira de papel de picrato de sdio Antraquinnicos livres Antraquinnicos combinados - O-heterosdeos - C-heterosdeos Tcnica do anel associada a radiaes ultravioletas Amnia
2.2. Obteno do extrato etanlico
O extrato etanlico foi obtido por processo de turblise (FALKENBERG et al., 2001) adotando-se a proporo de 10% (m/v) entre a droga vegetal pulverizada e o lquido extrator. Realizou-se a extrao por agitao em alta velocidade concomitante a elevadas foras de cisalhamento pelo turbo-extrator, com uma soluo etanlica a 70 GL, por um perodo total de 15 minutos, realizando uma sequncia de trs sries de cinco minutos com intervalos de trs minutos de repouso. A soluo extrativa obtida foi filtrada em papel filtro quantitativo (Quanty poros de 8 m) e aps, o filtrado concentrado em evaporador rotatrio sob presso reduzida (Marconi MA 120) com temperatura mxima de 40 C at completa eliminao do solvente orgnico e posteriormente, concentrada at a secura. O rendimento da extrao foi calculado com base na massa de resduo seco assim obtido.
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2.3. Fracionamento do extrato vegetal
O extrato bruto obtido foi solubilizado em mistura de metanol:gua (7:3 v/v) conduzindo-se o fracionamento por partio lquido-lquido com os solventes: hexano:metanol/gua (1:1 v/v); acetato de etila:gua (1:1 v/v); butanol:gua (1:1 v/v), obtendo-se a frao hexnica, frao acetato de etila, frao butanlica e frao aquosa. As fraes obtidas foram concentradas em evaporador rotatrio sob presso reduzida (Heidolph Laborota 400) com temperatura mxima de 40 C at completa eliminao do solvente orgnico e posteriormente, concentrada at a secura em capela. O rendimento das fraes foi calculado com base na massa de resduo seco assim obtido.
2.4. Perfil cromatogrfico
Aps a obteno das fraes do extrato, realizou-se a triagem por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) do extrato e das fraes obtidas. A CCD foi desenvolvida com fase estacionria em placas de slica gel comerciais (Sorbent technologics Slica G - UV 254 200 m), utilizando como fase mvel dois sistemas de solventes: CHCl3:MeOH:n-PrOH:H2O (5:6:1:4 v/v/v/v, fase orgnica) e CHCl3:MeOH:H2O (43:37:20 v/v/v, fase orgnica), aos quais as placas foram eludas. Em seguida, as cromatoplacas foram reveladas com anisaldedo/H2SO4 e aquecidas em estufa (Marconi MA 033) a 100 C, para observar a presena de classes de metablitos de interesse. As classes de substncias foram determinadas pela comparao das coloraes das manchas observadas nas placas quando reveladas, com as coloraes das classes descritas na literatura (WAGNER et al., 1984).
Com a finalidade inicial de investigao e de avaliao da presena de grupos de metablitos secundrios relevantes em folhas de S. terebinthifolius, desenvolveu-se, por um conjunto de tcnicas apropriadas, a triagem fitoqumica preliminar da droga vegetal em questo. Os resultados da anlise fitoqumica preliminar do extrato e fraes deram-se referentes ao desenvolvimento de colorao e/ou precipitado caracterstico para a caracterizao de grupos de substncias presentes na droga vegetal. Os resultados das anlises esto apontados na Tabela 5.
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Tabela 5: Resultado referente triagem fitoqumica preliminar da droga vegetal pulverizada de folhas de S. terebinthifolius
Grupo de substncias de interesse Taninos Flavonoides Saponinas Alcaloides Heterosdeos cardiotnicos Heterosdeos cianogenticos Antraquinonas Cumarinas Metilxantinas
Resultado da anlise Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo O-heterosdeos negativo C-heterosdeos negativo Negativo Negativo
Dentre os grupos de substncias pesquisadas no screening fitoqumico, cujos resultados esto elencados na Tabela 4, foi possvel detectar, pela positivao da reao, atravs de reaes inespecficas (ocorrendo atravs de grupos funcionais ou estruturas comuns as substncias) e de reaes especficas (ocorrendo somente com algumas estruturas tpicas de uma nica classe de substncia), a presena de taninos, a partir do desenvolvimento da reao com gelatina, pela formao de precipitado e, reao com sais de ferro (FeCl3), pela colorao azul dada, indicando a presena de taninos piroglicos (taninos hidrolisveis) e, tambm pelo desenvolvimento da reao com acetato de chumbo, pela formao de precipitado esbranquiado indicando a presena de galotaninos (unio entre unidades de cido glico via ligaes meta-depsdicas) e, reao com cido nitroso, pela formao imediata de colorao rsea que passa a prpura, indicando a presena de taninos do cido elgico; a
presena de flavonoides, a partir do desenvolvimento da reao de Shinoda (reao da
cianidina), pelo desprendimento de hidrognio nascente e formao de colorao vermelha a rsea, indicado pela reduo de derivados flavnicos em antocinicos, reao de Pew (reao com zinco metlico), pela formao de colorao vermelha, pela presena de flavonoides, reao de Taubock (reao oxalo-brica), pelo aparecimento de fluorescncias amareloesverdeadas, indicando a presena particular de flavonis, reao com o cloreto frrico, pela colorao varivel verde-castanha, consoante a flavonis e/ou flavononas; reao com o cloreto de alumnio, pela manifestao de fluorescncia verde amarelado intenso caracterstica, indicando a presena de compostos flavnicos; a presena de saponinas, a partir do desenvolvimento do ndice de espuma, pela formao, persistente, de um anel de espuma; a presena de heterosdeos cardiotnicos, a partir do desenvolvimento da reao de Liebermann-Burchard, obtendo-se um colorao castanha esverdeada, caracterizando o
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ncleo fundamental de esteride e triterpenides, reao de Kedde, pela colorao fugaz, de castanho avermelhado a vermelho violeta, atribudo a presena do anel lactmico insaturado, reao de Keller-Kiliani, pelo desenvolvimento de um anel de colorao castanhoavermelhada na interface dos lquidos e juntamente a colorao azul-esverdeada, adquirida gradualmente, pela camada actica, particularidade esta, das desxioses frequentes nos heterosdeos. Ceruks e colaboradores (2007), em seu estudo fitoqumico dos constituintes fenlicos polares de S. terebinthifolius, desenvolveram o fracionamento cromatogrfico do extrato em etanol das folhas de S. terebenthifolius, guiado pelo ensaio para deteco do potencial anti radicalar, que resultou no isolamento de cinco compostos fenlicos ativos, galato de etila, galato de metila, miricetrina, quercitrina e miricetina, cujas estruturas foram identificadas com base na anlise dos dados obtidos dos espectros de RMN. Farag (2008), em seu estudo sobre compostos fenlicos de folhas de S. terebinthifolius isolou e identificou pela primeira vez dois steres de cido qunico: 5-O-cido cafeoilqunicos e 5-O-cido cumaroilqunicos; trs glicosdeos miricetina: miricetina-3-O-alfa-Lramnopiranosil (1'''-> 6'') beta-D-galactopiranosdeo, miricetina-3-O-beta-D-glicurondeo e miricetina 3-O-beta-D-galactopiranosdeo; 1,6-digalloyl-beta-D-glicose e (+)-catequina. El-Massry e colaboradores (2009), estudando a composio qumica, no extrato etanlico, de folhas de S. terebinthifolius identificaram os compostos fenlicos: cido cafico, cido sirngico, cido cumrico, cido elgico, cido galico e catequina (trao). Tomando-se como base os estudos de Ceruks et al. (2007), Farag (2008) e El-Massry et al. (2009) e, correlacionando esses dados triagem fitoqumica preliminar desenvolvida neste trabalho, com a positivao referente aos grupos de substncias fenlicos no extrato, pode-se prever a existncia dessas substncias na amostra estudada. Carvalho e colaboradores (2009), em seus estudos, desenvolveram um mtodo de cromatografia lquida (simples, preciso, especfico e sensvel) para quantificao de cido glico, como marcador, a partir de matrias-primas e produtos finais, de Schinus terebinthifolius. O extrato etanlico foi obtido por processo de turblise, conforme metodologia descrita no item 2.2., adotando-se a proporo de 10% (m/v) entre a droga vegetal pulverizada e o lquido extrator, utilizando-se uma soluo etanlica a 70 GL. Graduao etanlica esta, escolhida pelo fato que, segundo Falkenberg (2001), praticamente todos os constituintes de interesse para a anlise fitoqumica apresentam alguma solubilidade em misturas etanlicas, de tal modo que estas costumam ser empregadas com frequncia.
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O fracionamento do extrato vegetal foi desenvolvido pelo processo de partio por solventes orgnicos de polaridade crescente, iniciando-se pelo solvente hexano, e sequencialmente pelos solventes acetato de etila, n-butanol e gua, conforme metodologia descrita no item 2.3. Com base na massa de resduo seco assim obtido, foram calculados os valores de rendimento dos processos extrativos e, os seus valores esto apresentados na Tabela 6.
Tabela 6: Rendimento referente massa de resduo seco obtido no processo extrativo da droga vegetal
Rendimento
Extrato EtOH 31,12%
Fr. Hex 0,56%
Extrato e fraes Fr. AcOET 12,75%
Fr. BuOH 2,86%
Fr. H2O 13,64%
Empregou-se para a anlise dos extratos obtidos da droga vegetal, a tcnica de

cromatografia em camada delgada, um mtodo clssico para a identificao dos grupos de
constituintes qumicos presentes no extrato etanlico e fraes obtidas, assim como avaliar o resultado do processo desenvolvido de separao. A anlise foi desenvolvida conforme metodologia descrita no item 2.4. Buscou-se caracterizar a presena dos constituintes majoritrios presentes em S. terebinthifolius, tanto no extrato quanto nas fraes, por dois sistemas eluentes de fase orgnica de diferentes polaridades: um sistema (quaternrio) composto de CHCl3:MeOH:n.PrOH:H2O (5:6:1:4), de maior polaridade e, um outro sistema de menor polaridade, composto de CHCl3:MeOH:H2O (43:37:20). Sistemas estes utilizados para a avaliao da separao dos componentes da mistura atravs da migrao diferencial das substncias sobre uma camada adsorvente da placa de CCD. Os perfis cromatogrficos por CCD esto apresentados na Figura 8.
Figura 8: Perfil cromatogrfico por CCD de extrato e fraes de folhas de S. terebinthifolius. Amostras: 1extrato etanlico, 2- frao hexano, 3- frao acetato de etila, 4- frao n-butanol, 5- frao aquosa. 3a) Sistema eluente (quaternrio): CHCl3:MeOH:n.PrOH:H2O (5:6:1:4); 3b) Sistema eluente CHCl3:MeOH:H2O (43:37:20).
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Pela anlise do perfil cromatogrfico, apresentado na Figura 8 e, pela comparao das
coloraes das manchas observadas nas placas quando reveladas, com as coloraes das classes descritas na literatura (WAGNER et al., 1984), foi possvel observar e inferir quanto as
classes de metablitos secundrios presentes no extrato etanlico e nas fraes provenientes de folhas de S. terebinthifolius, tais como taninos, caracterizados pela colorao caramelo localizada no ponto de aplicao; compostos fenlicos (flavonoides), caracterizados pela colorao amarela; saponinas e terpenos, caracterizados pela colorao arroxeada e diferenciados pelo ndice de reteno (Rf), o
qual as saponinas apresentam Rf menor que os terpenos. Deve-se ressaltar que as caractersticas apresentadas pela amostra funo das condies estabelecidas (do tipo de suporte empregado e do sistema eluente utilizado). Os resultados da triagem fitoqumica constituem, apenas, uma orientao e devem ser interpretados em conjunto com os resultados do triagem farmacolgica. Assim, quando uma planta revela uma dada ao durante uma triagem farmacolgica e presena de um dado grupo de substncias na triagem fitoqumica, bastante provvel que a ao farmacolgica seja devida frao da substncia ou associao delas (LCIO, 2000).
4. Concluso
A pesquisa de constituintes qumicos de espcies vegetais est relacionada com perfis fitoqumicos que verificam a ocorrncia de grupos de metablitos secundrios de interesse. Um modo de fracionar extratos por partio inicia-se com solventes de polaridades crescentes, implicando numa dissoluo seletiva e distribuio entre as fases, aplicada separao dos componentes da mistura. A cromatografia em camada delgada (CCD) uma tcnica amplamente utilizada para fins de anlise, tanto de extratos brutos quanto para avaliar o resultado de um processo de separao. As folhas de aroeira-vermelha podem ser indicadas como fonte de princpios ativos de diferentes classes, passveis de ser facilmente extrados e que podem ser utilizados como fonte potencial para novos fitoterpicos, embora estudos mais aprofundados devam ser realizados acerca do estudo fitoqumico desta espcie. Esses resultados permitem estabelecer uma estratgia para o isolamento das substncias presentes no extrato hidroalcolico das folhas de S. terebinthifolius. A identificao e/ou isolamento das substncias ativas ser empregado em ensaios futuros direcionados pelos resultados da avaliao das atividades biolgicas.
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Captulo V - Avaliao da Atividade Antibacteriana
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CAPTULO V AVALIAO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA
1. Introduo
As plantas sempre foram o principal meio a que a humanidade recorreu para tratamento das doenas. Inicialmente, de modo emprico, foi pela experimentao, selecionando e conhecendo, para muitas, a sua atividade e toxicidade, como foi o caso de tantas plantas que ainda hoje so utilizados na medicina tradicional e na medicina clssica (CUNHA e ROQUE, 2005). O homem sempre utilizou os produtos naturais, em particular, como meio de tratamento das suas doenas, e, ainda hoje, o emprego de medicamentos base de plantas muito importante em muitas regies do mundo (CUNHA e ROQUE, 2005). Deve-se destacar o importante emprego das plantas na teraputica nos pases em desenvolvimento, onde a populao, devido sua grande ligao a costumes ancestrais, continua a us-las como principal fonte de medicamento (CUNHA e ROQUE, 2005). Segundo a Organizao Mundial da Sade, 80% da populao mundial faz uso de medicamentos derivados de plantas medicinais. No Brasil pesquisas demonstram que mais de 90% da populao j fez uso de alguma planta medicinal (CORRA e ALVES, 2008). A riqueza da diversidade vegetal brasileira contribuiu para que a utilizao das plantas medicinais seja considerada uma rea estratgica para o pas. No mundo Ocidental, principalmente nas ltimas dcadas, tem-se vindo a assistir um renovado interesse pelo uso das plantas medicinais na teraputica, constituindo, em certas circunstncias, uma ajuda nos cuidados primrios a sade e um excelente complemento teraputico, compatvel com a medicina clssica (CUNHA e ROQUE, 2005).
1.1. Pesquisa da atividade biolgica
A pesquisa da atividade biolgica com extratos de plantas visa descobrir aqueles que apresentam finalidades teraputicas. A triagem deve ser cuidadosamente padronizada, para que seja segura e reprodutvel. A quantidade do material em teste, necessria para efetivar essa triagem, deve ser pequena e os procedimentos planejados podendo-se utilizar o material
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bruto como extratos de plantas, ou fraes de extratos. Seja geral ou especfica, a triagem produz somente suposies sobre a atividade que a amostra possa vir a ter no ser humano enfermo (LCIO, 2000). O estudo fitoqumico bioguiado, feito a partir dos diferentes tipos de extratos, so desenvolvidos por anlises realizadas por um painel de testes de atividade biolgica escolhida de acordo com a anlise dos dados etnobotnicos, a bibliografia e os objetivos a atingir (triagem de atividade). Os resultados dessa fase so determinantes para estudos mais aprofundados da espcie vegetal em questo.
1.2. Estudo antibacteriano
As substncias antimicrobianas ou antibiticas representam talvez o maior avano da farmacoterapia nas ltimas cinco dcadas ou mais, com progresso sem limites dentro da teraputica medicamentosa. O referido grupo de medicamentos condiciona, de forma efetiva, o efeito de espcies microbianas patognicas e oportunistas responsveis pelas mais variadas patologias que tanto provocaram e provocam a incapacidade prolongada ou bito de seres humanos, sem restrio de faixa etria, situao financeira ou estado da sade do individuo atingido. Os antimicrobianos constituem um grupo especial de agentes teraputicos, geralmente produzidos e obtidos a partir de organismos vivos. So substncias que, em pequenas concentraes, devem possuir atividade letal ou inibitria contra muitas espcies microbianas, prevenir o desenvolvimento de micro-organismos resistentes, ausncia de efeito indesejveis ao hospedeiro, estabilidade qumica, entre outras. A atividade antimicrobiana um item relevante na caracterizao de extratos vegetais, dada importncia e o nmero bastante grande de doenas infecciosas que acometem o homem (COWAN, 1999; LIMA et al., 2000). A partir da dcada de 80, o interesse em encontrar agentes antimicrobianos naturais para o emprego em produtos alimentcios ou para uso farmacutico tem aumentado consideravelmente (RAUHA et al., 2000). Em um amplo estudo sobre plantas medicinais, avaliando a atividade antimicrobiana de extratos vegetais contra bactrias Gram-positivas, Gram-negativas, micobactrias, leveduras e fungos filamentosos, confirmaram, quanto ao potencial antimicrobiano apresentado em baixas concentraes de extrato, a ocorrncia de inibio sobre o crescimento de micro-organismos. O que confirma a grande importncia que tais produtos possuem como perspectiva para produo de novos e eficientes produtos farmacuticos que possam ser
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utilizados na medicina para teraputica de processos infecciosos e, de modo geral, os agentes antimicrobianos podem manifestar sua atividade por vrios mecanismos, como leso da parede celular, alteraes da permeabilidade celular, alterao das molculas de protenas e cidos nuclicos, e inibio da sntese de cidos nuclicos (LIMA et al., 2000). O conhecimento sobre determinadas substncias presentes em espcies vegetais com propriedades antimicrobianas tem sido revisto e ampliado, devido aos crescentes problemas associados ao uso de diversos antibiticos (LIMA et al., 2000). Entre as vrias atividades biolgicas referentes s substncias fenlicas, a atividade antimicrobiana uma das mais estudadas. A toxicidade dos taninos para com os micro-organismostem sido bem documentada. Tais estudos envolvem vrios campos de pesquisas, entre eles destacam-se o de alimentos, plantas, solos, patologia de plantas, farmacologia e nutrio humana e animal (SCALBERT, 1991). Vrios mtodos podem ser utilizados para a determinao da atividade antimicrobiana in vitro, sendo aplicados em estudos de triagem de novas substncias ativas. A tcnica de difuso em gar e mtodos de diluio em tubos e/ou microplacas podem ser utilizados para avaliao da atividade antimicrobiana de compostos qumicos. Contudo, o mtodo de diluio em microplacas permite a anlise de vrios compostos e diferentes espcies bacterianas concomitantemente (ELOFF, 1998). Pelo fato das plantas medicinais representarem um papel muito importante na sade pblica, principalmente em pases em desenvolvimento e, devido s possibilidades de aplicao de extratos de plantas na teraputica e o envolvimento de espcies vegetais em diferentes doenas, fez-se fato importante, a avaliao do potencial das substncias presentes em Schinus terebinthifolius, como agentes antibacterianos.
2. Metodologia
2.1. Extratos vegetais
Para o desenvolvimento dos estudos de atividade antibacteriana foram utilizados o extrato e fraes do extrato vegetal de Schinus terebinthifolius obtidos conforme a metodologia descrita no captulo IV.
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2.2. Amostras bacterianas
As cepas utilizadas para a avaliao da atividade antibacteriana constaram de espcies Gram-positivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212 e Bacillus subtilis ATCC 19659, e Gram-negativas: Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
2.3. Estocagem e manuteno das cepas
As amostras bacterianas foram mantidas em Caldo Muller-Hinton (MH) acrescido de 20% de glicerol e conservadas em freezer a -20 C. Para o uso, as cepas foram repicadas em caldo Muller-Hinton, incubados (Fanen CB 002) durante 24 horas a 37 C, as quais foram utilizadas na padronizao do inculo.
2.4. Espectro de absoro do extrato etanlico e fraes do extrato vegetal
Na observao do extrato vegetal e suas fraes a serem testadas, foi avaliado a absoro de cada amostra em espectrofotmetro (Pharmacia LKB Ultrospec III) num intervalo de leitura de 400 a 655 nm, para a determinao do comprimento de onda possivelmente absorvvel (interferente). Foi realizado o espectro de varredura do extrato vegetal e fraes do extrato na concentrao de 1000 g/mL, utilizando-se como branco a gua purificada. Para determinao da avaliao de absoro de cada amostra foi observada tambm a absorvncia do meio de cultura (caldo MH), por apresentar colorao amarelada. As anlises permitiram avaliar o melhor comprimento de onda, o qual foi utilizado nos ensaios de atividade antibacteriana com leitura espectrofotomtrica.
2.5. Padronizao da suspenso bacteriana
A suspenso bacteriana foi padronizada adicionando-se uma cultura preparada a partir do crescimento bacteriano decorrido de 24 horas em caldo MH a temperatura de 37 C e, posteriormente, aps agitao e consequente repouso, uma alquota da suspenso foi transferida para outro tubo contendo tampo PBS estril at atingir uma turvao comparvel ao tubo da Escala McFarland correspondente 0,5 unidade (aproximadamente 1,5 x 108
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UFC/mL) e seguida de leitura espectrofotomtrica a 620 nm com absorvncia de 0,10 a 0,15 (corresponde at a 1,5 x 108 UFC/mL). Para utilizao na microplaca, o inculo foi diludo a 1:10 em tampo PBS estril (obtendo-se uma suspenso correspondendo a 1,5 x 107 UFC/mL) (SANCHES, 2004).
2.6. Preparo do extrato etanlico e fraes do extrato vegetal
O extrato vegetal e as fraes do extrato foram preparados em soluo estoque de 2000 g/mL. As amostras de extrato etanlico 70 GL e, fraes aquosa, butanlica e acetato foram preparadas em gua destilada estril, e, a frao hexnica foi preparada em soluo de metanol com 20% de Twen 80 e gua estreis. As amostras foram preparadas em momento antes da realizao dos testes.
2.7. Determinao da atividade antibacteriana e concentrao inibitria mnima (CIM) pelo mtodo de diluio em microplacas
Foi determinada a CIM utilizando diluio em microplaca, segundo a Norma M7-A6 do National Committee for Clinical Laboratory Standards, porm com modificaes descritas neste item (NCCLS, 2003).
2.7.1. Mtodo de diluio em microplacas
Os mtodos para determinao da CIM foram realizados adaptando-se as tcnicas propostas por Ellof (1998). O teste foi realizado em microplacas (Costar 3595) estreis de 96 orifcios, de fundo plano, com tampa. Foi utilizado caldo MH como meio de cultura. O extrato etanlico e fraes do extrato foram preparados como soluo estoque conforme descrito no item 2.6. Para cada bateria de testes foi testada uma cepa padro, conforme apresentado no item 2.2. Os 96 orifcios da microplaca, das linhas de A a H e das colunas de 1 a 12 (Figura 9), foram preenchidos com 80 L de meio lquido (caldo MH) estril. Foram reservados orifcios para controle, sendo: os orifcios das linhas de A a H da coluna 1 para o controle do meio de cultura; os orifcios das linhas de A a H da coluna 2 para o controle de crescimento bacteriano; aos orifcios das linhas de A a H da coluna 3 foram adicionados 100 L de cloridrato de ciprofloxacino, na concentrao de 35 g/mL, para o controle positivo; aos
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orifcios das linhas de A a H da coluna 10 foram adicionados 100 L do solvente utilizado para o preparo da soluo estoque (item 2.7.), para o controle negativo; e, aos orifcios das linhas de A a H das colunas 11 e 12 foram adicionados, a cada orifcio, 100 L dos extratos testados para o controle destes, sendo a coluna 11 para um extrato e a coluna 12 para um outro extrato testado. Os orifcios iniciais das colunas 4, 5 e 6 foram reservados para a aplicao, em triplicata, de 100 L de um dado extrato e, nos orifcios iniciais das colunas 7, 8 e 9 foram reservados para a aplicao, em triplicata, de 100 L de um outro extrato. A partir desses orifcios (4, 5 e 6; 7, 8 e 9), com o auxlio de pipeta, foram feitas diluies seriadas das linhas A at H. Aps as diluies seriadas, as concentraes finais na microplaca para as amostras vegetais foram de 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,62; 7,81 g/mL. Sequencialmente, foram adicionados 20 L da suspenso bacteriana (107 UFC/mL) aos orifcios das colunas de 2 a 10. Posteriormente, as microplacas foram levadas estufa incubadora a temperatura de 37 C, durante 24 horas.
Figura 9: Esquema de microplaca de 96 orifcios, mostrando a distribuio das linhas e colunas, utilizada para a avaliao da CIM. Coluna 1: meio de cultura Muller Hinton; Coluna 2: controle de crescimento (meio de cultura com bactrias); Coluna 3: controle positivo (meio de cultura com antibitico e bactrias); Colunas 4 a 6: amostra teste 1 (meio de cultura com extrato vegetal 1 e bactrias); Colunas 7 a 9: amostra teste 2 (meio de cultura com extrato vegetal 2 e bactrias); Coluna 10: controle negativo (meio de cultura com o solvente utilizado e bactrias); Colunas 11 e 12: controle dos extratos 1 e 2, respectivamente.
2.7.1.1. Leitura espectrofotomtrica das microplacas
Ao trmino da incubao, as microplacas foram submetidas leitura em leitor de microplacas (Bio-Rad 550) a 595 nm, onde tiveram seus valores registrados, para a avaliao da atividade antibacteriana e CIM (ELLOF, 1998; NCCLS, 2003).
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2.7.1.2. Determinao da concentrao bactericida mnina (CBM) a partir do mtodo de diluio em microplacas
Aps a leitura espectrofotomtrica e registro dos dados, as misturas contidas nos orifcios das microplacas, que apresentaram turvao caracterstica, foram utilizadas para a realizao da semeadura em placas de gar Muller-Hinton para a determinao da CBM das amostras vegetais.
2.7.1.3. Leitura das microplacas utilizando resazurina como revelador
Aps a leitura espectrofotomtrica e semeadura em placas para a determinao da CBM, foi desenvolvido o mtodo de resazurina para a determinao da atividade antibacteriana e CIM. Para isto, foram adicionados aos 96 orifcios das microplacas, 50 L do corante resazurina (fenoxazin-3-ona), preparados na concentrao de 0,1 mg/mL em gua purificada. Utilizada como indicador de xido-reduco, a resazurina apresenta-se de colorao azul em meio oxidado e de colorao rsea em meio reduzido. Posteriormente, as microplacas foram incubadas em estufa temperatura de 37 1 C, por no mximo duas horas, para a viragem de colorao. A CIM foi ento determinada e definida como a menor concentrao da amostra vegetal capaz de impedir a mudana de cor, ou seja, de inibir o crescimento celular (PALOMINO et al., 2002; MONTEJANO et al., 2005).
3.1. Determinao da atividade antibacteriana e da concentrao inibitria mnima (CIM) pela tcnica de diluio em microplacas com leitura espectrofotomtrica
Os testes de diluio em microplacas foram realizados conforme descritos na metodologia para a avaliao da atividade antibacteriana (item 2.8.) As amostras avaliadas foram representadas pelo extrato etanlico, frao hexnica, frao de acetato de etila, frao butanlica e frao aquosa. A atividade antibacteriana e a CIM do extrato e fraes do extrato vegetal testados podem ser observados pela leitura espectrofotomtrica no comprimento de onda a 595 nm. O valor da CIM preconizada pelo National Committee for Clinical Laboratory (NCCLS) frente a
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bactrias descrito como a menor concentrao de um agente antibacteriano que impede o crescimento visvel de um micro-organismo em testes de sensibilidade. As Figuras 10 a 14 revelam os perfis de susceptibilidade ou resistncia das cepas de referncia S. aureus, E. faecalis, B. subtilis, E. coli e P. aeruginosa s amostras vegetais testadas e os valores das CIMs esto representadas na Tabela 7.
1,000 0,900 0,800 Absorvncia 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 Cipro 1000 500 250 125 62,50 31,25 15,63 7,81 Concentrao ( g/m L) Cipro EtOH Hex AcOET BuOH H2O
Figura 10: Atividade antibacteriana do extrato etanlico e fraes obtidas frente a S. aureus
Figura 11: Atividade antibacteriana do extrato etanlico e fraes obtidas frente a E. faecalis
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Figura 12: Atividade antibacteriana do extrato etanlico e fraes obtidas frente a B. subtilis
Figura 13: Atividade antibacteriana do extrato etanlico e fraes obtidas frente a E. coli
1,000 0,900 0,800 0,700 Absorvncia 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 Cipro 1000 500 250 125 62,50 31,25 15,63 7,81 Concentrao ( g/m L) c Cipro EtOH Hex AcOET BuOH H2O
Figura 14: Atividade antibacteriana do extrato etanlico e fraes obtidas frente a P. aeruginosa.
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Tabela 7: Determinao da atividade antibacteriana e da Concentrao Inibitria Mnima (CIM) em g/mL, pela tcnica de diluio em microplacas com leitura espectrofotomtrica
Micro-organismos S. aureus E. faecalis B. subtilis E. coli P. aeruginosa
Microdiluio da amostra vegetal (g/mL) Extrato etanlico 125 62,5 1000 62,5 125 Fr. Hexano 1000 250 250 > 1000 125 Fr. Acetato 62,5 31,25 250 > 1000 62,5 Fr. Butanol 500 250 1000 500 1000 Fr. Aquosa 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
A concentrao inicialmente testada foi de 1000 g/mL indicando que se no houve atividade antibacteriana nesta concentrao, o que no quer dizer que a amostra vegetal no tenha atividade contra as bactrias testadas em concentraes superiores a esta ou em outras que no foram testadas. Os melhores resultados observados foram obtidos com a frao acetato de etila frente s bactrias: E. faecalis (CIM = 31,25), S. aureus e P. aeruginosa (CIM = 62,5), B. subtilis (CIM = 250) e, com o extrato etanlico frente s bactrias: E. faecalis e E. coli (CIM = 62,5), S. aureus e P. aeruginosa (CIM = 125) e, ainda, com a frao hexano frente s bactrias: P. aeruginosa (CIM = 125), E. faecalis e B. subtilis (CIM = 250).
3.2. Determinao da atividade antibacteriana e da concentrao inibitria mnima (CIM) pela tcnica de diluio em microplacas utilizando resazurina como revelador
Segundo PALOMINO et al. (2002) e MONTEJANO et al. (2005), a resazurina um corante diferencial que permite avaliar de forma relativa a viabilidade, contaminao bacteriana e a atividade antimicrobiana em funo da mudana de cor no corante. A manuteno da cor azul nos orifcios foi interpretada como ausncia de crescimento bacteriano e o desenvolvimento de cor rosa, como presena de crescimento bacteriano. A CIM foi ento determinada e definida como a menor concentrao da amostra vegetal capaz de impedir a mudana de colorao azul para a colorao rsea. A viragem da colorao de resazurina na microplaca pode ser observada nas Figuras 15 a 17 e, os resultados das anlises frente s cepas testadas esto apresentados na Tabela 8 com os valores da CIM correspondentes.
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Figura 15: Teste de diluio em microplacas utilizando resazurina como revelador, na determinao da atividade antibacteriana e concentrao inibitria mnima (CIM), para o extrato etanlico (4, 5 e 6) e frao aquosa (7, 8, e 9), frente as cepas referncias S. aureus, E. faecalis, B. subtilis, E. coli e P. aeruginosa
Figura 16: Teste de diluio em microplacas utilizando resazurina como revelador, na determinao da atividade antibacteriana e concentrao inibitria mnima (CIM), para a frao butanlica (4, 5 e 6) e frao acetato de etila (7, 8, e 9), frente as cepas referncias S. aureus, E. faecalis, B. subtilis, E. coli e P. aeruginosa
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Figura 17: Teste de diluio em microplacas utilizando resazurina como revelador, na determinao da atividade antibacteriana e concentrao inibitria mnima (CIM), para a frao de hexano (4, 5 e 6), frente as cepas referncias S. aureus, E. faecalis, B. subtilis, E. coli e P. aeruginosa
Tabela 8: Determinao da atividade antibacteriana e da Concentrao Inibitria Mnima (CIM) em g/mL, pela tcnica de diluio em microplaca utilizando resazurina como revelador
Microdiluio da amostra vegetal (g/mL) Extrato etanlico 250 1000 1000 > 1000 > 1000 Fr. Hexano 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000 Fr. Acetato 62,50 1000 250 > 1000 > 1000 Fr. Butanol 500 > 1000 1000 > 1000 1000 Fr. Aquosa 1000 > 1000 > 1000 > 1000 > 1000
De acordo com os resultados obtidos (Tabela 8) pode-se dizer que a frao de acetato de etila de S. terebinthifolius apresentou uma melhor atividade contra S. aureus (CIM = 62,5) e tambm para B. subtilis (CIM = 125) em relao aos outros extratos testados, sendo observado uma ao tambm do extrato bruto para S. aureus (CIM = 250). Uma das vantagens da CIM que esta pode ser ampliada para determinar a CBM, a menor concentrao de amostra vegetal capaz de destruir o micro-organismo. Para tal, as
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amostras vegetais diludas (CIM) foram subcultivadas em placas contendo gar MullerHinton e incubadas durante 24 horas temperatura de 37 C.
3.3. Determinao da concentrao bactericida mnina (CBM) das amostras vegetais que apresentaram atividade antibacteriana
Este teste consiste verificar em quais concentraes as substncias que possuem atividade antibacteriana so bacteriostticas ou bactericidas. Os resultados para esta determinao esto apresentados de acordo com a Tabela 9. De acordo com os resultados obtidos para CBM (Tabela 9) pode-se dizer que o extrato etanlico, a frao de acetato de etila e a frao butanlica apresentaram ao bactericida para as bactrias Gram-positivas: S. aureus, E. faecalis, B. subtilis na concentrao indicada na Tabela 8 sendo que, em concentraes diferentes a esta e, juntamente com as fraes aquosa e hexnica, so consideradas como bacteriosttico para as bactrias testadas.
Tabela 9: Determinao da Concentrao Bactericida Mnina (CBM) das amostras vegetais que apresentaram atividade antibacteriana

* Ao bacteriosttica
CBM da amostra vegetal em gar Muller-Hinton (g/mL) Extrato etanlico

500
Fr. hexano * * * * *
Fr. Acetato
1000
Fr. Butanol
250 500 250
Fr. aquosa * * * * *
*
1000
*
1000
* *
* *
* *
Os resultados de atividade antibacteriana obtidos com a anlise dos dados da leitura espectrofotomtrica no foram idnticos aos obtidos com a anlise dos dados utilizando a resazurina como revelador. Os resultados das anlises de leitura espectrofotomtrica revelaram uma maior sensibilidade do teste, apresentando uma melhor atividade das amostras vegetais, em relao aos resultados do teste obtidos com a resazurina. Isso possivelmente ocorre devido ao ponto de viragem do revelador que influenciado pelo pH e consequentemente pelo nmero de bactrias que h em cada orifcio da microplaca.
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Em linhas gerais as amostras vegetais apresentam atividade antibacteriana promissora, destacando-se a atividade da frao de acetato de etila, o que justifica a continuidade destes estudos.
4. Concluso
Embora o mecanismo de ao da atividade antimicrobiana dos compostos presentes em Schinus terebinthifolius no seja conhecido, sugere-se enfatizar, para a frao de acetato de etila, um mecanismo de ao, como sendo este exercido pela sua atividade bacteriosttica e no bactericida, em funo dos resultados do CBM. A atividade antibacteriana est relacionada aos compostos bioativos da planta, os quais foram caracterizados pelas anlises histoqumica, conforme item 3.2. do captulo II e, triagem fitoqumica, conforme item 3. do captulo IV. Mas, no se pode afirmar, neste caso, quais desses compostos qumicos, isolados ou em associao, exercem a atividade antimicrobiana. Embora, observou-se a inexistncia de uma ao sinrgica, para S. aureus, E. faecalis, B. subtilis e P. aeruginosa, pois o extrato etanlico apresentou atividades diferentes s suas fraes ou, pode ser que, estes compostos, do extrato etanlico, estejam diludas o suficiente para no demonstrar atividade. Entretanto, observou-se, para E. coli, uma ao sinrgica do extrato etanlico s suas fraes. O uso de extratos vegetais, tanto na medicina quanto na indstria farmacutica, para o controle dos micro-organismos, um fato real. Isso mostra que pode haver outras vias de obteno destes agentes em vegetais superiores, alm da via comum, que so os antibiticos. Assim, essa uma das possveis alternativas existentes, para que num futuro prximo, a aroeira-vermelha possa vir a ser empregada para o controle teraputico de bactrias, que a cada dia tornam-se mais resistentes ao dos muitos antibacterianos empregados atualmente.
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Consideraes Finais
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5. CONSIDERAES FINAIS
O estudo inicial para a caracterizao anatmica dos fololos, para o controle de qualidade da droga vegetal e determinao da sua composio em metablitos secundrios, tanto histoqumica quanto fitoqumica, bem como no subsequente potencial farmacutico desses componentes, executado em Schinus terebinthifolius, de uso em medicina tradicional, contribuiu para o aumento destas informaes na literatura, bem como para o arsenal teraputico mundial. Fato este firmado pelo interesse demonstrado pelo Ministrio da Sade, com a incluso e divulgao, em fevereiro de 2009, da espcie S. terebinthifolius na Relao Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (Renisus). O interesse pelo estudo das folhas de S. terebinthifolius surgiu primeiramente pelo fato da sua utilizao popular na teraputica seguir a indicao farmacopeica, a qual designa a casca do tronco como farmacgeno e, pelo impacto ambiental decorrente deste fato, despertando a preocupao, sobre a coleta incorreta do material vegetal, o que pode dificultar a permanncia da espcie em sua rea de domnio. A utilizao de drogas vegetais requer um rigoroso controle de qualidade. Esse controle est definido nas Farmacopeias e tambm na literatura assessora, indicando mtodos analticos para tal. O estudo anatmico faz-se necessrio para garantir e confirmar da identidade da espcie avaliando, por exemplo, seus caracteres, incluses celulares, bem como seus constituintes ativos. Os estudos fsico-qumicos possibilitaram a verificao da autenticidade e da pureza da droga vegetal. Correlacionando as informaes obtidas da triagem fitoqumica preliminar para os grupos de metablitos secundrios caracterizados no extrato etanlico e nas fraes do extrato, com os dados obtidos da anlise histoqumica de folhas de S. terebinthifolius pode-se constatar a relao de positivao existente entre as anlises executadas para ambos. Portanto, uma anlise histoqumica bem executada pode nortear os estudos fitoqumicos de forma robusta. A avaliao do potencial antibacteriano demonstrado nesse estudo refora a utilizao dessa espcie vegetal na medicina popular e, justifica ainda, a continuidade desta investigao
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utilizando-se outros grupos de micro-organismospara a contribuio cientfica de seu perfil biolgico. A investigao at agora realizada, culmina numa pequena parte do que, at o momento, ainda est por se fazer, j que grande o nmero de plantas ainda no estudadas, tanto no sentido de uma utilizao direta, como da obteno de novos constituintes bioativos, ou de novas molculas que possam servir para semi-snteses de compostos farmacologicamente ativos. As metodologias utilizadas, bem como os resultados at este momento obtidos, serviro como base para orientar futuras investigaes no estudo da espcie Schinus terebinthifolius Raddi, bem como colaborar com estudos voltados para plantas medicinais e drogas vegetais, visando obteno de novos fitomedicamentos.
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JLIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS CMPUS DE ARARAQUARA

ADEMIR SALVI JNIOR

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ORIENTADOR: Prof. Dr. Luis Vitor Silva do Sacramento

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Descrever a anatomia da regio mediana de fololos de Schinus terebinthifolius;

Estabelecer a caracterizao fsico-qumica da droga vegetal;

Realizar a anlise fitoqumica preliminar do extrato e fraes obtidas;

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Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi

CAPTULO I SCHINUS TEREBINTHIFOLIUS RADDI

Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi

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Captulo I - Schinus terebinthifolius Raddi

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Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas

CAPTULO II ESTUDO ANATMICO E HISTOQUMICO DAS FOLHAS

Captulo II - Estudo Anatmico e Histoqumico das Folhas

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Polaridade da substncia substncias apolares

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Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal

CAPTULO III CONTROLE DE QUALIDADE DA DROGA VEGETAL

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Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal

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Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal

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Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal

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2.4.6. Determinao do pH 2.4.6.1. Determinao potenciomtrica do pH

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Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal

2.4.6.2. Determinao colorimtrica do pH

2.4.7. Determinao de cinzas totais

2.4.8. Determinao de cinzas insolveis em cido

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal

2.4.9. Determinao de extrativos no extrato etanlico

2.4.10. Determinao do resduo insolvel no etanol

3.1. Processamento ps-colheita para a obteno da droga vegetal

Captulo III - Controle de Qualidade da Droga Vegetal

3.2. Obteno da droga vegetal pulverizada