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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas

BLACPMA
ISSN 0717 7917

Gota de agua sobre hoja de Nelumbo nucifera (Gaertn.)

Volumen 8, Nmero 4, Julio de 2009


Editorial Flores. A la Memoria de Fernando Cabieses Molina (1920-2009). Homenaje y Semblanza Debate | Opinion Huerta-Reyes and Aguilar-Rojas. Protection of inventions derived from plant research in a megadiverse country: the case of Mexico Revisiones Schlie-Guzmn et al. Las acetogeninas de Annonaceae: efecto antiproliferativo en lneas celulares neoplsicas Artculos Casado Martn et al. Diseo y desarrollo de una formulacin con Bixa orellana L. como revelador de placa dentobacteriana Oliveira et al. (Brasil) Phytochemical screening and anticonvulsant property of Ocimum basilicum leaf essential oil. Zari and Al-Logmani. Longterm effects of Cinnamomum zeylanicum Blume oil on some physiological parameters in streptozotocin-diabetic and non-diabetic rats Rimada et al. Isolation, characterization and quantification of artemisinin by NMR from Argentinean Artemisia annua L.. Soares Dos Reis et al. Preparacin de un protector solar y evaluacin de la accin fotoprotectora del propleo verde del Vale do Ao, Minas Gerais, Brasil Prez Gutirrez. An antibacterial sesquiterpene lactone from fresh-water alga Vaucheria sessilis Hernndez et al. Composition and antibacterial activity of essential oil of Lippia graveolens H.B.K. (Verbenaceae) Comunicaciones Pino Bentez et al. Composicin qumica y actividad antibacteriana del aceite esencial de hojas de Piper lanceaefolium, planta usada tradicionalmente en Colombia Varela et al. Presencia de salvado de cereal en "organos" comercializados en la ciudad de Buenos Aires (Argentina) Wernert et al. Estudio de polifenoles de infusiones y cocimientos de hojas de Cedrn (Aloysia citrodora Palau) y Poleo (Lippia turbinata Griseb.) -Verbenaceae Agudelo et al. Anlisis microgrfico de rizomas de Canna coccinea Mill. (Cannaceae)

Publicada por | Published by: Cooperacin Latinoamericana y Caribea en Plantas Medicinales y Aromticas Indexada por | Indexed by: Science Citation Index Expanded (SCISEARCH), Journal Citation Reports/Science Edition, Biological Abstracts y BIOThomson Reuters Master Journal List , Chemical Abstracts (CAS), NAPRALERT, CAB International (CAB Abstracts), GlobalHEALTH, Index Copernicus, IMBIOMED, LATINDEX, QUALIS, REDALYC, Biblioteca Virtual da Saude (BVS).

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Comit Editorial | Editorial Board


Fundadores Jos L. Martnez (Chile) - Jorge Rodrguez (Cuba) Editores Jos L. Martnez Escuela de Kinesiologa, Universidad Santo Tomas, Talca, Chile. Jos M. Prieto School of Pharmacy, London University, Reino Unido. Gabino Garrido Facultad de Ciencias, Universidad Catlica del Norte, Antofagasta, Chile. Editores Ejecutivos Damaris Silveira Facultade de Cincias da Sade, Universidade de Braslia, Brasil. Peter Taylor Centro de Medicina Experimental, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, Caracas, Venezuela. Carla Delporte Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de Chile. Editores de Eventos Mara Ins Isla Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad Nacional de Tucumn, Argentina. Marcelo Wagner Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Co - Editores Brbara Arias Facultad de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales Universidad Nacional de Crdoba, Argentina. Rosa Degen Universidad Nacional de Asuncion, Instituto de Investigaciones Interdisciplinarias, Paraguay. Jeannette Gavillan Universidad de Puerto Rico. Harold Gmez Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas, Universidad de Cartagena, Colombia. Vicente Martnez Escuela de Agricultura, Universidad de San Carlos, Guatemala. Edgar Pastene Facultad de Farmacia, Universidad de Concepcin, Chile. Janet Piloto Ferrer Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos La Habana, Cuba, Edison Osorio Universidad de Antioquia, Colombia Edgar Puente Centro de Toxicologa y Biomedicina, Santiago de Cuba, Cuba, Gabriela Ricciardi Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, Universidad Nacional del Nordeste, Corrientes, Argentina, Gloria Saavedra Centro de Tecnologa Agroindustrial, Universidad Mayor de San Simn, Cochabamba, Bolivia. Luiz Simeoni Universidad de Brasilia, Brasil Editores Asesores Arnaldo Bandoni Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Armando Cceres Universidad de San Carlos, Guatemala, Norman Farnsworth College of Pharmacy, University of Illinois at Chicago, Estados Unidos. Michael Heinrich The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Peter Houghton Pharmaceutical Sciences Research Division, King's College, London, Reino Unido. Leonora Mendoza Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Francisco Morn Laboratorio Central, Universidad de Ciencias Mdicas de La Habana, Cuba. Patrick Moyna Facultad de Qumica, Universidad La Repblica, Montevideo, Uruguay. Pulok K. Mukherjee School of Natural Product Studies, Jadavpur University, Kolkata, India. Lionel Robineau Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de las Antillas y Guyana (UAG), Pointe Pitre, Guadalupe. Elisabeth Williamson School of Pharmacy, University of Reading, Reino Unido. Consejo Editorial Talal Aburjai, Faculty of Pharmacy, University of Jordan, Amman, Jordan Christian Agyare, College of Health Sciences, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Department of Pharmaceutics, KNUST, Kumasi, Ghana. Julio Alarcn, Departamento de Ciencias Bsicas, Universidad del Bio Bio, Chilln, Chile. Roco Alarcn, The School of Pharmacy, University of London, Reino Unido. Jorge Alonso, Asociacin de Fitoterapia de Argentina, Buenos Aires, Argentina. Giovanni Apendino, DISCAFF, Universidad del Piemonte Oriental, Novara, Italia. Elizabeth Barrera, Seccin Botnica, Museo Nacional de Historia Natural, Santiago, Chile. Bhaskar Behera, Agharkar Research Institute, Plant Science Division, Pune, India

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Salvador Caigueral, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Espaa. Sergio Castro, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Geofrey Cordell, College of Pharmacy, Illinois University at Chicago, Estados Unidos. Rene Delgado, Centro Nacional Coordinador de Ensayos Clnicos, La Habana, Cuba. Saikat Dewanjee, Department of Pharmaceutical Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Jenny Duran, Facultad de Ciencias Qumico Farmacuticas y Bioqumicas, Universidad Mayor Real y Pontificia de San Francisco Xavier de Chuquisaca, Sucre, Bolivia. Josean Fechine Tavares, Laboratorio de Tecnologa Farmacutica, Universidade Federal da Paraiba, Brasil. Elena Fornet, Instituto Cubano de Meteorologa, Holgun, Cuba. Mildred Garca, Escuela de Medicina, Universidad de Costa Rica. Martha Gattusso. rea de Biologa Vegetal, Universidad Nacional de Rosario, Argentina. Alejandra Gil, Facultad de Agronoma, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Ileana Gonzlez, Universidad Catlica del Maule, Talca, Chile. Rodolfo Juliani, School of Environmental and Biological Sciences, Rutgers University, New Jersey, Estados Unidos. Luis Kanzaki, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidade de Brasilia, Brasil. Ana Ladio, Departamento de Ecologa, Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Argentina. Patricia Landazuri, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad del Quindio, Armenia, Colombia. Claudio Laurido, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Suzana Leitao, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. Olga Lock de Ugaz, Departamento de Ciencias, Pontificia Universidad Catlica del Per. Victor Lpez, Facultad de Farmacia, Universidad de Navarra, Espaa. Subhash C. Mandal, Faculty of Engineering and Technology, Jadavpur University, Kolkata, India. Abdul Manan Mat-Jais, Department of Biosciences, University of Putra, Putra, Malasia.

Pedro Melillo de Magalhaes, Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Qumicas e Biolgicas, UNICAMP, Campinas, Brasil. Fabian Michelangeli, Centro de Biofisica y Bioquimica, Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas, Caracas, Venezuela. Brenda Modak, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Miguel Morales, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. John A.O. Ojewole, Faculty of Health Sciences, University of KwaZulu-Natal, Sudfrica. Horacio Olivo, Division of Medicinal and Natural Products Chemistry, Iowa University, Estados Unidos. Mahendra Rai, Department of Biotechnology, Amravati University, Maharashtra, India. Luca Rastrelli, Dipartamento di Scienze Farmaceutiche, Universita de Salerno, Salerno, Italia. Elsa Rengifo, Instituto de Investigaciones de la Amazona Peruana, Iquitos, Per. Jos Lus Ros, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Espaa. Alicia Rodrguez, Universidad de La Habana, Cuba. Chaiyong Rujjanawate, School of Health Science, Mae Fah Luang University, Chiangrai, Tailandia. Aurelio San Martn, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. Guillermo Schinella, Facultad de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de La Plata, Argentina. Andrew Scholey, Brain Sciences Institute, Melbourne, Australia. Natasa Skalko-Basnet, Department of Pharmacy, University of Troms, Noruega. Nilka Torres, Centro Regional Universitario de Azuero, Universidad de Panam. Ren Torres, Facultad de Qumica y Biologa, Universidad de Santiago de Chile. Anglica Urbina, Facultad de Agronoma, Universidad de Concepcin, Chile. Beatriz Varela, Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. Carlos Vicente, Editor Revista Biodiversidad, Argentina. Mohammad Zafarullah, University of Montreal, CHUM-NotreDame Hospital, Montreal, Canada. Talal Zari, Faculty of Science, King Abdulaziz University, Arabia Saudita.

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas


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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), iii BLACPMA ISSN 0717 7917 Nota Editorial | Editorial Note

ELSEVIER y homenaje pstumo a Fernando Cabieses


Jos Luis MARTNEZ Editor BLACPMA

Estimados amigos: Durante la realizacin de este nmero BLACPMA ha continuado creciendo; desde el punto de vista humano hemos incorporado a la Dra. Rosa Degen de la Universidad Nacional de Asuncin, Paraguay y al Dr. Edison Osorio de la Universidad de Antioquia, Colombia como nuevos Co-editores de BLACPMA. Tambin se ha incorporado el Dr. Ariel Rodolfo Quevedo de la Universidad Nacional, Bogot, Colombia como miembro del Comit Editorial. Por otro lado, hemos recibido gustosamente la invitacin de ELSEVIER para la incorporacin de BLACPMA a Scopus, novedosa herramienta de navegacin que engloba la mayor coleccin multidisciplinar a nivel mundial de resmenes, referencias e ndices de literatura cientfica, tcnica y mdica. Qu mejores novedades para este nuevo nmero!

En este nmero pretenda hacer un gran homenaje pstumo al Dr. Fernando Cabieses, amigo ejemplar en torno a las plantas medicinales, si bien su formacin como neurofisilogo le permiti desdoblarse hacia el tema que a todos nos apasiona. Lamentablemente solo encontr eco en la Dra. Olga Lock de Ugaz de Per a travs de quien se incluye la Editorial de este prestigioso mdico peruano, escrita como una semblanza por la Dra. Diana Flores. En forma muy sencilla he querido entregar un pequeo testimonio sacado principalmente de diferentes medios de comunicacin de la Repblica de Per; as como algunas vivencias de mi relacin con el Dr. Cabieses. Por otro lado, deseo agradecer a todos los que han confiado en nuestras pginas y que esperamos no defraudarles.

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), iv-v BLACPMA ISSN 0717 7917 Homenaje | Tribute

DR. FERNANDO CABIESES MOLINA (1920 2009)


Jos Lus MARTNEZ
Editor BLACPMA

El Prof Cabieses (izquierda) con Jose L. Martinez (derecha) en 1995 durante el desarrollo del Tercer Congreso Internacional de Plantas Medicinales de Chile, realizado en la ciudad de San Bernardo, Santiago, Chile. Fuente: Archivo personal

El neurlogo, neurocirujano y catedrtico de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM) y fundador de la Universidad Cientfica del Sur, adems de muy buen amigo, Fernando Cabieses, falleci el 13 de enero de 2009, por causas naturales a los 89 aos de edad. Cabieses naci en Mrida (Yucatn) el 20 de abril de 1920, hijo de Eduardo Cabieses Valle-Riestra y Alicia Molina Font. En la UNMSM curs estudios de ciencias biolgicas y medicina, de 1937 a 1945. Se perfeccion en neurologa y neurociruga en universidades de Estados Unidos. A su regres al Per, en 1950, introdujo el tratamiento quirrgico de los aneurismas cerebrales y la ciruga de la epilepsia. En 1956, recibi el grado de doctor en medicina por la UNMSM. Dict cursos de su especialidad en la universidad de Miami y fue distinguido como profesor honorario por las universidades nacionales de Trujillo (1962), Cajamarca (1963), Cusco (1982) y Lambayeque (1985). Adems, se le concedi el grado de Doctor Honoris Causa por la Universidad Inca Garcilaso de la Vega (2006). El 21 de agosto del ao 2008, al cumplir 100 das de haberse creado el Ministerio del Ambiente, el

Presidente de la Repblica Alan Garca lo premi en mrito a su destacada trayectoria cientfica. De esta manera, el Estado peruano reconoca con el Premio Ministerio del Ambiente a uno de los hombres ms ilustres que entreg gran parte de su vida a los estudios del Per, y su enorme contribucin con la preservacin del medio ambiente y la biodiversidad del pas. Fue nombrado Amauta por dos universidades en el Ecuador y en el Per que le fueron concedidas las Palmas Magisteriales en el grado de Amauta. Premio Roussel en 1988 por su ensayo: "Las plantas mgicas del Per primigenio". Su personalidad creativa se mostr desde su tesis para obtener el ttulo de mdico cirujano, en la que plante por primera vez que la forma tradicional indgena de consumir coca no produca dependencia y favoreca el trabajo en grandes alturas sobre el nivel del mar. Public ms de 20 libros y cerca de 300 trabajos cientficos sobre las ciencias mencionadas. Entre sus obras se encuentran "Los dioses vinieron del mar: ensayo etnohistrico", "La coca: dilema trgico", "La ua de gato y su entorno", "Apuntes de medicina tradicional: la racionalizacin de lo irracional", "Cien

Martnez

Dr. Fernando Cabieses Molina (1920-2009)

siglos de pan: 10,000 aos de alimentacin en el Per", "La maca y la puna", "Antropologa del aj". En Chile tuve la oportunidad de conocerlo cuando lo invitamos a uno de los Congresos de Plantas Medicinales, posteriormente siempre en Chile tuve la fortuna de compartir muchas veces con l, destacando su caballerosidad y su gran humor, muy liviano y simptico que hacia que todos los que le rodeamos en cada reunin pudiramos, independiente de los modismos propios de nuestros pases, entender sus bromas y chistes, destacaba siempre su gran sabidura y el conocimiento que aunque era mdico y neurocirujano posea acerca de los orgenes antropolgicos y arqueolgicos de su querido Per, de sus aborgenes. Con l se fue un gran hombre y quizs una gran enciclopedia de conocimientos propios investigados como ningn otro de un pas tan grande como Per. El Dr. Cabieses destac en uno de sus libros que El Per fue conquistado cuando llegaron los espaoles, pero no fue descubierto. Incluso las concepciones que encontraron aqu sufrieron cierto desprestigio. Recin hacia los siglos XVIII y XIX se comenzaron a descubrir y explorar las maravillas de la civilizacin incaica. Tantas frases que fueron recordadas por la prensa peruana, de innumerables entrevistas y pginas dedicadas tanto en vida como luego de su sensible deceso acerca de esta hombre virtuoso que dedic gran parte de su vida al estudio de la flora peruana. Pienso, que como en ningn otro pas de habla hispana se le ha rendido un homenaje a este hombre, desde el momento en que el Presidente

de la Repblica y la mayora de sus ministros de la nacin, asistieran a rendir un homenaje a este destacado cientfico.
Hemos querido rendir homenaje a este gran peruano, pues sabemos de su enorme valor y el ejemplo que significa para las generaciones futuras
Dr. Alan Garca, Presidente de Per 14 de enero de 2009 durante el velatorio del Dr. Cabieses, Iglesia Santa Mara Reina, distrito de San Isidro, Lima junto a un numeroso grupo de ministros del Gobierno de Per que acudi a rendir un homenaje pstumo.

El Presidente de la Repblica del Per, Alan Garca Prez, saluda y felicita al Dr. Fernando Cabieses por la edicin de su nuevo libro. Fuente: Universidad Cientfica del Sur (Per)

A Fernando siempre le recordaremos por sus conocimientos, su espritu peruano a flor de piel as como de su buen humor.
Fuente: Archivo personal.

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), vi-vii BLACPMA ISSN 0717 7917 Editorial | Editorial

A la Memoria de FERNANDO CABIESES MOLINA (1920-2009) Homenaje y Semblanza


Diana FLORES MBA/QF, Consultora Internacional para los proyectos; Leishmaniasis (Per-Japn), Latinpharma CCI (UNCTAD/WTO); PDRS-GTZ Proyecto Perubiodiverso, OEA-Universidad de Panam E-mail: dianaflores@latinpharma.net

El Prof Cabieses en 1995. Fuente: Archivo BLACPMA

Fernando Cabieses Molina naci el 20 de Abril de 1920 en Mrida (Mxico), hijo de padres peruanos, recibi el titulo de Mdico Cirujano el ao 1946, en la Universidad Mayor de San Marcos y el grado de Doctor en Medicina en la misma Universidad, el ao 1956. Su tesis para obtener el ttulo de Mdico Cirujano comprob que en el Per y el resto del mundo la forma tradicional indgena de consumir coca no era narcodependiente y no produca dao alguno. Hizo sus estudios de especializacin Neurociruga en Filadelfia, Estados Unidos de Amrica, desde 1945 a 1950 y fue unos de los pioneros de esta especialidad en Amrica del Sur, obteniendo el American Board of Neuro Surgery en el ao 1959. Realiz estudios de Biologa, Antropologa, Historia y Arqueologa, lo que le permiti ocupar una alta posicin entre las autoridades mundiales de Etnomedicina. Organiz y presidi el primer y segundo Congreso Mundial de Medicina Tradicional (1979 y 1988). Fue fundador y presidente del Instituto Nacional de Medicina Tradicional. De 1980 a 1986 fue profesor de Etnomedicina en la Universidad Nacional Federico Villarreal; Director del Museo Peruano de Ciencias de la Salud;

Presidente del Instituto de Medicina Tradicional; Presidente y Fundador del Museo de la Nacin; Jefe del Instituto Nacional de Cultura; Presidente de la Comisin Organizadora de la Universidad Cientfica del Sur y, posteriormente, Rector y Rector Emrito. Paralelamente a su intensa y continuada labor de campo, ha dedicado largos periodos de estudio a la botnica mdica, promocion los productos nativos del Per, especialmente del reino vegetal, habiendo escrito treinta y cuatro libros y ms de cuatrocientos artculos cientficos entre los que figuran ttulos como Tronco enceflico (1957), La trepanacin del crneo en el antiguo Per, en colaboracin con B. Lastres (1960), Los dioses vinieron del mar: ensayo etnohistrico (1972), Dioses y enfermedades, La medicina en el antiguo Per ( 2 Vols., 1974), Narracin de una conquista ( 2 Vols., 1988), La coca: dilema trgico (1992), La ua de gato y su entorno (1994), Apuntes de medicina tradicional, La racionalizacin de lo irracional(1993), Cien siglos de pan, 10,000 aos de alimentacin en el Per (1995), La maca y la puna (1997), Ayer y hoy (Las plantas medicinales) (2003), La salud y los Dioses (La medicina del antiguo Per) (2007).

Flores

A la Memoria de FERNANDO CABIESES MOLINA

El Presidente de la Repblica del Per, Alan Garca Prez, saluda y felicita al Dr. Fernando Cabieses por la edicin de su libro La Salud y los Dioses. Fuente: Universidad Cientfica del Sur (Per)

Durante su vida acadmica ha sido fundador de muchas sociedades cientficas del Per, ocupando destacados cargos directivos y honorarios y miembro de nmero de cuarenta y cuatro Sociedades Cientficas de todo el mundo. Su contribucin a las buenas relaciones culturales entre el pueblo peruano y norteamericano se tradujo en la fundacin de la Asociacin Mdica Peruano Norteamericana, de la que fue el Primer Presidente; en la fundacin del Captulo Peruano del American College of Surgeons. Su participacin como ponente en el evento Latinpharma 2003, por el lanzamiento oficial del Programa Nacional de Bicomercio, mostr una vez ms su capacidad potica con una excelente presentacin llamada El Servinacuy de los Medicamentos por la convivencia natural de la medicina holstica y tradicional, as como el uso de ambas medicinas en la salud de los pueblos. El 13 de enero del 2009, falleci en Lima, apaciblemente, en su domicilio, su prdida fsica fue muy sentida por el mundo mdico cientfico y social del pas que conocan y apreciaban su contribucin profesional, cientfica y cultural. Haba sido designado, en fecha cercana a su muerte, Acadmico Honorario de la Academia Nacional de Medicina. Aunque haba tenido reiterados accidentes cerebro vasculares, que le fueron limitando fsicamente, su capacidad intelectual, se mantuvo inclume, lo que le permiti contribuir personalmente, hasta muy cercanamente a su fallecimiento, a sus importantes compromisos, entre ellos el de Rector Emrito de la Universidad Cientfica del Sur. Ocupando, en tal condicin, la Direccin del Proyecto de

Investigacin, en bsqueda de nuevas alternativas teraputicas provenientes de plantas medicinales peruanas para el tratamiento de la leishmaniasis tegumentaria (UTA), enfermedad tropical mutilante que tiene gran importancia sanitaria en el Per y cuyo control teraputico todava no se ha logrado satisfactoriamente. Hasta pocas semanas antes de su sensible fallecimiento, particip personalmente como responsable del proyecto, asistiendo a las reuniones y colaborando en cada una de las decisiones, proyecto multidisciplinario en el que participamos investigadores mdicos, qumico farmacuticos y bilogos de la Universidad Mayor de San Marcos, conjuntamente con investigadores universitarios y del Instituto Nacional de Salud del Japn. Este Proyecto contina desarrollndose en beneficio del pas y cumpliendo el compromiso establecido por el Dr. Cabieses. Para todos los que lo conocimos como discpulos, colegas, colaboradores y amigos, su sensible desaparicin representa una prdida importante por sus reconocidas condiciones y capacidades personales en beneficio de la Salud Pblica, la Ciencia, la Cultura Peruana y todas aquellas manifestaciones a las que se entreg con absoluta liberalidad. La que suscribe esta nota expresa pblicamente su pesar por la prdida del Dr. Cabieses y, a la vez, el elogio por una experiencia de vida ofrecida al pas como ejemplo a seguir para lograr que la medicina tradicional, pueda utilizarse como aportacin a la investigacin farmacutica moderna, pero tambin como una fuente de tratamientos eficaces por s misma. Cabe resaltar las profundas reflexiones que hizo en su libro Ayer y Hoy (Las Plantas Medicinales) Un amor ilcito de un neurocirujano con la botnica y la farmacologa, en un pas de magos, brujos, hechiceras, curanderos, hierberas e impertinentes sabios de coctel. Amor ilcito escondido en un pas descoyuntado por la tradicin torturante de cuatro fuerzas desorientadas en graves desencuentros: la ciencia, la tradicin, la poltica y la ignorancia. Los cuatro salvajes potros de Tupac Amaru

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 239 - 244 BLACPMA ISSN 0717 7917 Debate | Opinion

Protection of inventions derived from plant research in a megadiverse country: the case of Mexico
[Proteccin de invenciones derivadas de la investigacin en plantas en un pas megadiverso: el caso de Mxico]
Maira HUERTA-REYES1* and Arturo AGUILAR-ROJAS2
1

Centro de Investigacin Biomdica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social. Argentina No. 1, Col. Centro, 62790, Xochitepec, Morelos, Mxico.

Unidad de Investigacin Mdica en Medicina Reproductiva, Unidad Mdica de Alta Especialidad (UMAE) en Ginecologa y Obstetricia No. 4 Dr. Luis Castelazo Ayala, Instituto Mexicano del Seguro Social. Av. Ro Magdalena No. 289, Col. Tizapn San ngel, 01090, Mxico D.F., Mxico.

Abstract
This paper examines the current situation concerning the poor protection of industrial property in Mexico, a country rich in plant species. In addition, plant species have been employed medicinally by indigenous communities, and an important plant products research has been developed. The protection of industrial property remains an issue of recent introduction in the Mexican economy. The lack of a federal policy regarding science and technology appears to be the main point in increasing patent filing and promoting technology transfer of inventions, as well as natural resources protection. It is also discussed the possible measures and outlines that could contribute to create a better situation for involving patenting procedure, specially in the protection of inventions derived from traditional plant knowledge. All suggestions could be useful for placing Mexico as a competitive country with the capacity of confronting the present-day challenges of society. Keywords: Mexico; Invention; Patent; Industrial property.

Resumen
Esta contribucin examina la situacin actual concerniente a la pobre proteccin de la propiedad industrial en Mxico, pas rico en especies de plantas. Diversos grupos indgenas del pas han utilizado las plantas debido a sus propiedades medicinales y al mismo tiempo, se ha desarrollado una importante investigacin cientfica en el rea de los productos derivados de plantas. La ausencia de una poltica de estado referente a ciencia y tecnologa luce como uno de los puntos cruciales para el incremento en el nmero de solicitudes de patente y la promocin de la transferencia tecnolgica respectiva, as como para la proteccin de los recursos naturales. En este artculo tambin se discuten las posibles medidas y acciones para mejorar la situacin en el proceso de patentamiento. Estas sugerencias podran ser tiles para posicionar a Mxico como un pas competitivo con capacidad de enfrentar los retos de la sociedad actual. Palabras Clave: Mxico; Invencin; Patente; Propiedad industrial.

Recibido | Received: March 25, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: July 01, 2009. Publicado en Lnea | Published Online July 22, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This study wasnt supported This article must be cited as: Maira Huerta-Reyes and Arturo Aguilar-Rojas. 2009. Protection of inventions derived from plant research in a megadiverse country: the case of Mexico. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4):239 244. {EPub July 22, 2009 }.

*Contactos | Contacts: Email chilanguisima@yahoo.com Tel. ++52 777 3 61 21 55; Fax ++52 777 3 61 21 94

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Huerta-Reyes and Aguilar-Rojas

Protection of inventions derived from plant research in Mexico

INTRODUCTION For many decades in the field of plant products research, many investigations have been focused on developing new alternatives for advancement in providing solutions for unresolved problems, particularly in the health sector, through the generation of medical or pharmaceutical knowledge. Generation of this knowledge comprises the origin of patentable inventions. Within this context, it can be supposed at first glance that countries with important natural resources and technological development would be able to produce numerous patents directed toward solving their own health problems. Even more so, it appears that countries with indigenous communities practicing mainly plant-based medicine could generate patentable inventions due to the crucial role that traditional medicine has demonstrated in access to biological and genetic resources, particularly during the last 15 years. However, some countries with these characteristics have no presence in the industrial property system, especially Latin American countries (Alcorta and Peres, 1998). This situation can be translated as a great loss, in those economic and social benefits to inventors and indigenous communities have not been retrieved, but even worse, the possible enormous benefits on quality of daily life and health are not exerting an impact on society. The complex mixture of relationships among Research and Technology (R&T), natural resources, indigenous communities, and governments is currently demanding the creation of policies and a solid organization to face the challenges involved in patent protection of plant research-derived inventions. To date, some efforts have been carried out on the international scene; nevertheless, even at the interior of a country as the case of Mexico there are differences in the perception and definition of priority problems in patent protection, which combined with certain previous failures, offer a complicated panorama. Definitions related with patent protection Protection of industrial property (PIP) involves the patent as one of the legal devices that is regulated by the Industrial Property Law in Mexico (LPI) for the protection of inventions derived from technical and scientific knowledge. A patent is an exclusive right of exploitation of an invention that confers the following prerogatives upon its owner: the right to
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prevent others from manufacturing, using, selling, offering for sale, or importing the patented invention without his/her consent for a period of 20 years. In order to consider it as an invention and as such, susceptible to be protected by a patent, inventions must fulfill the following patentability criteria: novelty (meaning anything not in existence in prior art); inventive step (the creative process or the results of which are not obviously deducible from prior art by a person skilled in the relevant art), and industrial application (the possibility of an invention being produced or used in any branch of economic activity) (WIPO, 2009). In many countries, and particularly in Mexico, the theoretical or scientific principles, the essential biological processes for obtaining, reproducing, and propagating plants and animals, the biological and genetic material as found in nature, and the plant varieties are not patentable according the LPI (LPI, 2009). The categories of patent protection contemplated by the LPI include products, processes, uses, or apparatuses. Perhaps with the exception of strict studies on systematic taxonomy and ecology, any other area of plant research is able to generate potential knowledge susceptible to be protected by patent in all of these categories. Thus, Mexican inventors are presented with the possibility for filing patent applications related to inventions that involve plant research-derived products, processes, and/or uses. The current panorama of protection of plant research-derived inventions in Mexico Mexico is considered a megadiverse country in which between 26 000 and 30 000 plant species thrive, ranking as fourth worldwide, and in first place regarding cactus varieties (SEMARNAT, 2009). The use of Mexican medicinal plants is extensive from pre-Hispanic times and has been widely documented elsewhere (Bye and Linares, 1999). Some studies reveal that traditional Mexican knowledge utilizes approximately 5000 medicinal plants, of which 25% are native from Mexico. Only 16 of these native species were studied by means of a pharmacological approach during the 20th century (Lozoya and Rivera, 1999). Nevertheless, natural products research focused on plants maintains a strong tradition in Mexico; for example, the National Autonomous University of Mexico (UNAM), the most important research public institution in the country, has had specialized research units on natural products for 65 years. Another example is the case of

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Mexican Institute of Social Security (IMSS), which has incorporated a full-time research center dedicated exclusively to Mexican medicinal plants 20 years ago. At present, the IMSS personnel conducts multidisciplinary plant research ranging from traditional knowledge to clinical studies for validating the therapeutic effects of Mexican medicinal plants. Consequently, numerous manuscripts have been published on the plant products research area, especially on native plants. But, had this knowledge been protected by patent? Between 2000 and 2008, according to the Mexican Institute of Industrial Property (IMPI), a total of 117 319 patent applications were filed, of which 61 982 were granted in Mexico. It is calculated that approximately <3% of these patent applications are filed by Mexican inventors each year. In contrast, only in 2006 certain countries such as the U.S., obtained 173 770 nationally granted patents, Japan 141 399, and Germany, 21 034 (IMPI, 2008). Mexican applications have been especially focused on areas related with chemistry and metallurgy, diverse industrial techniques, and the food industry (Urquidi, 2005), but no data are available about the number of patent applications involving plant research-derived products, processes, and/or uses that are filed or granted. Nevertheless, it could be assumed that there are few patent applications related with this technical area, because other reports have shown that 85% of Mexican applications are utility models. According to these data, Mexican inventors are, in practice, not protecting their inventions. Inventors, IMPI and research funding Researchers who become inventors One of the most important problems regarding to the PIP in Mexico is that researchers and potential inventors simply are not acquainted with the patenting procedure. There is a total absence of any link to the Industrial Property System during the researchers academic training. Consequently, they carry out their research activities from undergraduate- to post-doctoral-degree levels is closing total knowledge generated, which affects possibilities for protecting patentable inventions because, in the first instance, these do not fulfill the novelty criteria. Even worse, sometimes these disclosures also affect inventive-step criteria, because some predictions and suggestions for future research are settled in the discussion sections of their own papers. In other cases, in which inventors receive specialized
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assistance on the patenting procedure from the IMPI, these find that the majority of their investigations do not fulfill requirements for consideration as inventions according to the LPI. After these primary aspects, researchers who possess patentable matter in their investigations begin to deal with the patenting procedure itself; the latter is a legal procedure with very strict deadlines and legal terminology that researchers find difficult to understand and manage. Researchers also consider that the patenting procedure is very risky, because the majority of public research institutions do not recognize and accept patents as an instrument of productivity. Several research institutions employ the publication and citation impact factor count in the Science and Social Sciences Citation Indexes produced by the Institute of Scientific Information (ISI) to monitor and score the performance of their researchers as the base for awarding raises, promotions, and grants. However, these measurements also result in notable limitations, because patents, books, or publications in certain journals do not form part of ISI (GonzlezBrambila and Veloso, 2007). Compared with papers in internal productivity evaluations, patents are devaluated; consequently, Mexican researchers prefer to publish in ISI-indexed journals rather than filing patents. Otherwise, researchers who have been interested in filing patents in Mexico have had to suffer from learning the patenting procedure to obtain any type of recognition for their effort, because in many cases, the patent application can be refused in the end. Inventors experience with unpleasant results disappointed with the procedure and results. Moreover, in the case of researchers who were successful in obtaining a patent, these are unaware of how to transfer their technology to industry. In this respect, as patent applicants and technologists, Mexican researchers perceive themselves as completely lost in the Industrial Property System; therefore, patents can represent, from this point of view, a great waste of time. The Situation of the IMPI The IMPI was formally created in 1993 as an autonomous concern (Amigo, 1996). Enormous efforts have been made by the IMPI to promote itself and the patenting procedure. Over the past 2 years, the IMPI has been imparting free training courses and workshops to train and inform the public on all topics related to the industrial property system and all of the services offered by the IMPI (IMPI, 2008).

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Additionally, the IMPI has been active in providing consultancy in scientific symposia and to individual research groups, universities, and industry. Thus, many potential inventors have begun to know the IMPI and to show interest in the PIP. However, the IMPI remains an institution with the need for consolidation. For instance, since its creation the IMPI has employed an important number of scientific staff as examiners. These in turn left these positions after a brief time because these positions are not recognized efforts. There is a total absence of salary, recruitment, promotion, and training policies, as well as an excess of pending work that creates professional frustration and low morale (Alcorta and Peres, 1998). Several permanent and qualified examiners remain a basic necessity of the IMPI to support and offer efficient service. In the field of plants, the IMPI requires examiners trained in industrial property and in ethnobotanical and ethnomedical topics and who are able to evaluate patent applications under an integral perspective (Cordell, 2000; Kartal, 2007). In addition, the reorganization of the IMPI based on models from other countries appears to be a contribution to create successful institutional policies. Research funding One crucial aspect that influences low interest in filing patents in Mexico is related with that the majority of public research institutions are not linked with industry, which implicates an absence of financial support for developing new products and filing patent applications. The few research institutions that indeed are linked with industry have dealt mainly with foreign industry; one of the conditions for obtaining financial support is to return their results to the mentioned industry (Estrada and Heijs, 2006). Furthermore, industry does not consider research and development in Mexico a top priority nor an attractive long-term investment. Rather, industry tends to acquire a substantial amount of technology based on products or processes from other industrialized countries, therefore limiting the possibilities to create, develop, and innovate high technology and relegating Mexican scientists to the improvement of already existing technology (Wagner, 1998). Precarious Mexican-government investment from R&T over the past 20 years is directly reflected in the low number of Mexican patents, an indicator that not only takes into account creativity, inventiveness, and
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innovation, but also the capability for cognitive production in industrial applicability, which allows discerning a clear difference between developed economies and advanced countries (Sandoval and Valladares, 2008). Government has not identified areas that are particularly useful to development according to its own needs and resources (Estrada and Heijs, 2006). Taking together all of this previous data, it is clear that in Mexico, there is no state policy with regard to science and technology sectors. Consequently, Mexico has not been a competitive country, and it possesses an inability to face the challenges of society. Additionally, the protection of industrial property remains a recent introduction in the Mexican economy (Amigo, 1996); therefore, there is no culture related with patent protection. However, Mexico possesses one of the most difficult things to replace: natural resources (especially in plants), and human resources. Some successful isolated cases show that Mexicans have the capacity to increase the protection of their inventions by filing patent applications and contributing to forge better conditions for the population of this country. Other cases in Mexican industry, such as tequila-producing companies, demonstrate that a global technological strategy that involves researchers, industry, and academics results in successful inventions that produce and share benefits at all these levels (Casas, 2006). Therefore, the missing link existing in Mexico between research institutions and industry is one of the central points to solve for improving the current conditions under which patents and technology transfer represents an enormous and unproductive effort. Possible measures to increase the industrial property culture? Future considerations There is a vast number of aspects to consider for improving protection of knowledge by patent in Mexico. Mainly, it would appear that informing and about promoting the industrial property interest in terms of potential inventors comprises an indispensable and primary task. For this purpose, the incorporation of basic industrial property-associated concepts into scientific-technological careers requires implementation, from the undergraduate university degree itself to topics related with international treaties and national laws. The writing of a patent application based on experimental thesis work could be validated as thesis work for obtaining a degree,

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even at postgraduate levels. With these aspects, new researchers could begin to be trained in industrial property, and would be able to direct their own research lines to obtain patentable matter. In this manner, they would be skilled in industrial property issues and could be employed in, for example, patent offices, firms, industry, or universities. These actions can be incentives for scientist to pursue more generalized projects by cooperating not only with other researches from different disciplines, but also with industrials to obtain diverse funding sources. In this regard, pure science, directly related with the most frequently encountered mentality of Mexican researchers, where there prevails a negative and pejorative attitude toward patentability due to the supposed mixing of pure science with business, may result in a positive patenting attitude, one that permits the emergence of scientist-entrepreneurs (Wagner, 1998). As a positive aspect in this regard, researchers can consider that projects of great importance to Mexico will attract increased interest and promote collaboration with foreign colleagues and industry. The latter idea is accompanied by the need for research institutions to create a full-time dedicated office in industrial property and transfer technology. One of the most relevant attempts in Mexico has been the creation of the Center for Technological Innovation (CIT) within the UNAM in 1983. At the time, CIT provided several services, which entertained the priority that researchers be involved in all patent and technology-transfer issues in order to sensitize them concerning the field of innovations (Waissbluth et al., 1988). However, the CIT was unable to consolidate its presence. At present, very few Mexican research institutions have an office dedicated to industrial property: only nine patentability centers exist in universities, and two additional centers are in the process of being created (IMPI, 2007). With these numbers, it is noteworthy that interest in industrial property and transfer technology is on the rise among Mexican researchers. Traditional knowledge and access to biological and genetic resources comprise another decisive aspect. Certain international efforts have been made with the Trade-related aspects of Intellectual Property Rights (TRIPS) agreement, where standards for the protection of intellectual property rights are pretended to be incorporated into the national legislation of each member country. However, the TRIPS agreement deals with well-specified private
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rights that do not contemplate an integral form of intellectual property, creating an important gap (Timmermans, 2003). On the other hand, the Biological Diversity Convention (BDC) considers principles regarding the conservation and use of biological and genetic resources and defining conditions for their access. BDC contemplates sharing benefits among countries, indigenous or local communities, and users in the modern sector, including innovations and practices (Bertha, 1996; Boyd, 1996; Cordell, 2000; Timmermans, 2003). Nevertheless, concepts of protection and matter susceptible to be protected continue to be discussed in an international scenario due to the lack of clarity of the objectives and the intrinsic complications of these topics. Thus, actions have been limited, especially in some mega diverse countries (Boyd, 1996; Mays and Mazan, 1996; Turner, 1996). In this respect, Mexico has no clear position. Perhaps, a first step of inventors in all scientific research disciplines involving plants could become involved in the complex, expensive, and time-consuming task of protecting our natural plant resource by means of offering the integral approaches and patentable results of their investigations, not only as an option, but also as a responsibility (Sandoval and Valladares, 2008). Another critical consideration is the role of the Mexican Government, which through the National Council of Science and Technology (CONACyT) must create a state policy in science and technology that involves not only 1% of the Gross domestic product (GDP) (CONACyT 2007), but also an integral strategy that permits to utilize natural resources as a priority for research focused on public health, developmental technology, and conservation. The understanding of the patents impact on the national economy (Sandoval and Valladares, 2008) and attention directed toward the needs of industry linked with research will be the key in the formulation of a commitment to invest in and to finance the projects that could generate knowledge and patentable products (Alcorta and Peres, 1998). Finally, the quality and availability of local resources, government policies, research and technology institutions, industrial investment, and commercial regulations comprise the main aspects to be taken into account in establishing a solid competitive organizational structure that could be of benefit to all the persons involved in the protection of plant research-derived inventions by patent in a mega

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diverse country such as Mexico. Notwithstanding this, a change of attitude by Mexicans appears basically to be the priority. CONCLUSION As we have presented here, Mexico is a rich country in natural sources, especially in plants. No patent-associated culture has limited economic, social, political, and natural conservation benefits. Enormous efforts have been exerted by inventors and research institutions; however, these efforts have been diluted because these are individual efforts, and the majority of them receive no remuneration. The absence of a policy in science and technology is a great challenge, not only in the plant products research area, but also in Mexican science in general. Government, industry, research institutions, inventors, and society must actively participate in the creation of a patent culture that allows for protection of the patentable knowledge generated and to provide an impulse for technology, the creation of employment, the protection of natural resources, and social and economic rewards, the very basis of a patent: an agreement between inventors and the government to benefit and improve the everyday life of the society. REFERENCES
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 245 - 257 BLACPMA ISSN 0717 7917 Revisin | Review

Las acetogeninas de Annonaceae: efecto antiproliferativo en lneas celulares neoplsicas


[Acetogenins from Annonaceae: antiproliferative effect on neoplasic cell lines]
Maria Adelina SCHLIE-GUZMN*, Alma Rosa GONZLEZ-ESQUINCA, Lorena Mercedes LUNA-CAZRES Facultad de Ciencias Biolgicas. Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas, Libramiento Norte Poniente s/n, CP 29039, Tuxtla Gutirrez, Chiapas, Mxico.

Abstract
Acetogenins from the Annonaceae family are a group of secondary metabolites, which are considered the most potent group of mitochondrial complex I inhibitors. These molecules exhibit an antiproliferative effect on cancerous cell lines, including those with multiresistance to drugs; as such, they could be relevant in the development of new antineoplasic drugs. This paper presents a review of their knowledge, in particular about their in vitro and in vivo inhibitory activity and apoptosis induction in human tumor lines. Keywords: Acetogenins; Annonaceae; Antiproliferative; Apoptosis.

Resumen
Las acetogeninas de la familia Annonaceae son metabolitos secundarios considerados como el grupo ms potente de inhibidores del complejo I mitocondrial. Estas molculas muestran un efecto antiproliferativo sobre lneas celulares cancerosas, aun en aquellas con multi-resistencia a las drogas, por lo que pudieran ser relevantes en el desarrollo de nuevos frmacos antineoplsicos. Este trabajo presenta una revisin sobre su conocimiento, en particular sobre su actividad inhibitoria in vitro e in vivo y la induccin de la apoptosis en lneas tumorales humanas. Palabras Clave: Aceogeninas, Annonaceae, Antiproliferacin, Apoptosis.

Recibido | Received: January 27, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 9, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: July 22, 2009 Declaracin de Intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: Non declared This article must be cited as: Maria Adelina Schlie-Guzmn, Alma Rosa Gonzlez-Esquinca, Lorena Mercedes Luna-Cazres. 2009. Las acetogeninas de Annonaceae: efecto antiproliferativo en lneas celulares neoplsicas. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4):245 257. {EPub July 22, 2009}.

*Contactos | Contacts: adeymac@hotmail.com Telfono y Fax (+52) (961) 1 21 08 94

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Comn Creativa-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Schlie-Guzmn et al.

Acetogeninas de Annonaceae: Efecto antiproliferativo

INTRODUCCIN Con el fin de combatir las diversas enfermedades del hombre, la medicina ha estado vinculada al uso de compuestos provenientes de plantas, animales o microorganismos y en las ltimas dcadas, los avances en los mtodos de aislamiento y purificacin, as como los anlisis espectromtricos, han permitido la caracterizacin de los principios activos para su uso farmacutico, ya sea como productos naturales o como molculas derivadas de ellos (Butler, 2005). En el rea oncolgica esto no ha sido una excepcin y hoy se cuenta con medicamentos antineoplsicos provenientes de compuestos naturales, entre los que se destacan los alcaloides de Vinca (Catharantus roseus) como la vincristina y la vinblastina, el taxol de Taxus brevifolia, y los antibiticos doxorubicina (adriamicina) de Streptomyces peucetius y la bleomicina de Streptomyces verticillus, entre otros (Itokawa et al., 2008). Durante el tratamiento y control de las clulas malignas, stas pueden desarrollar diversos mecanismos que les permiten evadir la accin de uno o varios agentes oncolgicos, denominados en conjunto resistencia mltiple a los frmacos (Multiple Drug Resistance o MDR) (Lage, 2003) y que tiene consecuencias letales para los pacientes sometidos a quimioterapia, por lo que la bsqueda y el desarrollo de nuevos frmacos, es un rea de investigacin prioritaria y en donde las acetogeninas de la familia Annonaceae constituyen molculas relevantes. Las acetogeninas de la familia Annonaceae En 1982 se report al primer miembro de una nueva clase de metabolitos secundarios en plantas, la uvaricina, aislada de las races de Uvaria acuminata (Annonaceae) (Alali et al., 1999) y que actualmente comprende a un grupo de ms de 430 compuestos naturales, encontrados nicamente en la familia Annonaceae (Makabe et al., 2008) denominados comnmente acetogeninas de anonceas (ACG). El descubrimiento de que presentan un amplio rango de actividad biolgica como la antiparasitaria, insecticida, antimicrobiana, antifngica y antitumoral ha dado un impulso importante a las investigaciones bioqumicas y farmacolgicas de estas molculas (Zafra-Polo et al., 1998; Cav et al., 1997). Estructuralmente, la mayora de las acetogeninas poseen una cadena aliftica de 35 37 tomos de carbono con uno, dos o tres anillos tetrahidrofurnicos (THF) adyacentes o no, as como
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substituyentes oxigenados (hidroxilos, cetonas y epxidos) localizados a lo largo de sta. En uno de sus extremos presentan un anillo lactnico metil sustituido, , insaturado, en ocasiones saturado o rearreglado como cetolactona. Tambin se han descrito compuestos con dobles enlaces en la cadena aliftica, compuestos con anillos epoxi o tetrahidropirano (THP) as como lineales (Bermejo et al., 2005) (Fig. 1).
Figura 1. Ejemplos de tipos estructurales de acetogeninas de anonceas

Aunque su biosntesis an no ha sido descrita, las ACG parecen derivar de la ruta de los polictidos y se sugiere que los anillos THF, THP y epxidos se producen mediante la epoxidacin y ciclacin de dobles enlaces. El descubrimiento de acetogeninas lineales no saturadas como las muridienina, chatenaitrieninas (Gleye et al., 1998) y la annojahnina (Colman-Saizarbitoria et al., 1998), plantean que estos compuestos pueden derivar de cidos grasos como el laceroico (C-32) y el geodoico (C-34), que se unen enzimticamente con una unidad de tres carbonos (Alali et al., 1999). Esta propuesta es favorecida por la presencia en la misma planta de diversos tipos de acetogeninas, incluyendo las lineales, aunque los cidos grasos mencionados an no han sido aislados en ellas. Las acetogeninas como inhibidores del complejo I mitocondrial Se han propuesto mecanismos para explicar la actividad biolgica de las acetogeninas, describindose dos sitios blanco en la clula: el complejo I (NADH:ubiquinona oxidoreductasa) mitocondrial (EC 1.5.6.3) y la NADH oxidasa de las

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Acetogeninas de Annonaceae: Efecto antiproliferativo

membranas plasmticas (Ahammadsahib, et al., 1993; Morr et al., 1995). Actualmente a las ACG se les considera como uno de los grupos de inhibidores mas potentes del complejo I mitocondrial (Degli Esposti 1998; Tormo et al., 1999). En los estudios sobre el complejo I utilizando partculas submitocondriales, se ha observado que las ACG naturales o sus derivados semisintticos pueden retener su actividad inhibitoria a pesar de introducir modificaciones en su molcula. La variacin estereoqumica de las unidades tetrahidrofurano (Miyoshi et al., 1998), de los grupos hidroxilos que los flanquean (Abe et al., 2004), del tipo de lactona terminal (Takada et al., 2000; Yabunaka et al., 2003) o de las substituciones en los grupos a lo largo de la cadena aliftica (Gallardo et al., 2000) no parecen ser restrictivas para su actividad. La nica restriccin pudiera ser la cadena espaciadora entre los grupos THF y la lactona terminal, en donde un largo de 13 carbonos parece ser el ptimo; los compuestos con el espaciador mayor o menor a 13 tomos de carbono presentan decrementos en su actividad (Abe et al., 2005; Motoyama et al., 2002). El complejo I mitocondrial tiene un papel importante en la sntesis de ATP a partir de las molculas reducidas que se producen en el metabolismo central celular y se especula que debido a la rpida proliferacin de las clulas cancerosas, stas requieren de niveles altos de energa, por lo que pudieran ser ms sensibles a su descenso y presentar cambios fisiolgicos importantes. Confirmando la actividad de las ACG, se ha reportado que las clulas de carcinoma de mama MCF-7 expuestas a esquamocina presentan una reduccin importante en los niveles de ATP (Reynaud et al., 1999), las clulas de hepatocarcinoma 2.2.15 tratadas con bullatacina muestran decrementos en la incorporacin de [3H]timidina y en los niveles de AMPc y GTPc (Chih et al., 2001; Chiu et al., 2003), en tanto que las lneas cancerosas de vejiga T24 y de leucemia K 562 expuestas a annonacina y esquamocina exhiben una interrupcin del ciclo celular (Lu et al., 2006; Yuan et al., 2003, 2006). Algunos inhibidores del complejo I mitocondrial, reproducen varios signos de las enfermedades del complejo I. Por ejemplo, la rotenona y la piericidina promueven la generacin de radicales superxido (Lambert y Brand, 2004); la rotenona induce parkinsonismo con degeneracin de las clulas dopaminrgicas en roedores (Sherer et al., 2003) y el modelo experimental de Caenorhabditis elegans con
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mutacin en la protena de 51 kDa de la NADHubiquinona oxidoreducta, muestra acidosis lctica, decremento en la respiracin mitocondrial e hipersensibilidad al estrs oxidativo (Grad y Lemire, 2004). Estos estudios son importantes debido a que en la Isla de Guam y en la Isla de Guadalupe se ha relacionado el uso y consumo de A. muricata con formas de Parkinsonismo resistentes a levodopa (CaparrosLefebvre et al., 1999; 2005); la annonacina que se encuentra en cantidades importantes en esta planta, disminuye los niveles de ATP en las clulas dopaminrgicas derivadas del mesencfalo de embriones de ratones (Lannuzel et al., 2003) y produce degeneracin en clulas del cerebro de ratas (Champy et al., 2004). Tambin se ha observado que los extractos de A. squamosa generan especies reactivas de oxgeno (ROS) en clulas MCF-7 y K-562 (Pardhasaradhi et al., 2005). Estudios in vitro sobre la inhibicin de la proliferacin celular Las ACG poseen una fuerte actividad inhibitoria sobre la proliferacin de las lneas celulares neoplsicas, por lo que una de las reas ms activas de investigacin, ha sido buscar la estructura ptima de la molcula que permita su mayor actividad (Oberlies et al., 1995; Landolt et al., 1995; Nakanishi et al., 2003). Debido a que los estudios han sido realizados con diversas lneas celulares o que las condiciones en ellos han sido diferentes, es difcil establecer comparaciones con todas las molculas. Sin embargo, el cotejo de la actividad de 53/433 de ellas (aproximadamente 12% del nmero reportado de ACG) (3/41 lineales, 0/16 epoxi, 26/215 mono-THF, 20/ 133 bis-THF adyacentes, 7/19 bis-THF no adyacentes, 0/1 tris-THF, 3/8 THP) analizadas in vitro en las lneas celulares de tumores slidos humanos de pulmn (A-549), mama (MCF-7), colon (HT-29), rin (A-498), prstata (PC-3) y pncreas (PaCa-2) y como control el frmaco antineoplsico adriamicina (Tabla 1), permite corroborar algunas observaciones hechas por otros autores, entre ellas, que la mayora de las ACG son citotxicas y algunas presentan una potencia mayor a lo encontrado con otros frmacos, aunque tambin existen diferencias notables de susceptibilidad a ellas (Bermejo et al., 2005; Alali et al., 1999; Tormo et al., 1999). As, en la Tabla 1 se observa que la mono-THF, longifolicina tuvo una dosis efectiva media (DE50) de 4,22 x 10-13 g/mL en las clulas de pncreas, en tanto que en las

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Acetogeninas de Annonaceae: Efecto antiproliferativo

Tabla 1. Dosis efectivas medias (g/mL) de acetogeninas de anonceas en lneas celulares de tumores slidos humanos.
Acetogeninas lineares Acetogenina Carbonos del espaciador Posicin de OH A-549a MCF-7 b HT-29 c A 498 d PC-3 e PaCa-2 f Ref.

Dosis efectivas medias (DE50)* Annojahnina Venezinona Longanina 17,18 10,17,18 4,10,18 1,5 1,04 x 10-1 4,9 x 10-2 2,8 1,24 3,4 0,06 1,55 6,0 x 10-1 4,9 3,48 3,9x10-2 0,016 2,50 x 10-1 4,0 x 10-1 0,023 2,22 1,1 x 10-2 Colman-Saizarbitoria et al., 1998 Colman-Saizarbitoria et al., 1996 Alali et al., 1999

Acetogeninas Mono-THF Goniotrionina Muricoreacina Murihexocina C Muricatetrocina C Annopentocina A Annopentocina B Annopentocina C Longifolicina Goniotalamicina Longicina Gigantransenina-A Gigantransenina-B Gigantransenina-C Murisolina Longicoricina Asitrilobina B Annonacina 4-acetil annonacina 4-Acetil xilomaticina Annomolona A Annomolona B 4-desoxi annomontacina Asitrilobina A Annomontacina Asitrilobina C Asitrilobina D 7 9 9 9 9 9 9 11 11 11 11 11 11 13 13 13 13 13 13 13 13 15 15 15 17 17 4,14,16 4,8,10,16, 20 4,7,8,16, 19,20 4,16,19, 20 4,10,16, 19,20 4,10,16, 19,20 4,10,16, 19,20 10,13,18 4,10,13,18 4,10,13,18 10,13,18,23 10,13,18,23 10,13,18,21 4,15,20 10,15,20 4,10,15,20 4,10,15,20 (OAc-4), 10,15,20 (OAc-4), 10,15,20 15,20,34 4,15,20,34 10,17,22 4,10,17,22 4,10,17,22 4,15,17,22 10,17,19,24 7,7 x 10-3 0,23 1,1 5,5 x 10-6 1,71 x 10-1 2,74 x 10
-2

5,3 x 10-6 1,3 3,8 3,19 17,93 3,56 2,97 x 10-1 1,23 x 10
-5

3,4 x 10-1 0,57 1,3 1,98 1,63 1,64 1,24 1,23 1,1 x 10-3 2,4 x 10 1,5 1,4 1,3 6,16 x 10
-8 -5

2 x 10-3 0,71 2,5 3,9 x 10-2 6,07 x 10-1 3,79 x 10


-1

3,6 x 10-1 0,025 0,86 1,5 x 10-7 1,14 2,12 x 10


-1

5,4 x 10-3 2,3 0,49 5,69 x 10-7 3,58 x 10-2 1,62 x 10


-1

Alali et al., 1998 Kim et al., 1998 Kim et al., 1998 Shi et al., 1996 Zeng et al., 1996a Zeng et al., 1996a Zeng et al., 1996a Ye et al., 1996a Ratnayake et al., 1994

2,6 x 10-2 1,13 x 10


-6

2,78 x 10-1 4,55 x 10


-1

2,28 x 10-1 1 x 10
-7

4,28 x 10-1 4,22 x 10


-13

8,0 x 10-3 1,77 x 10 0,16 0,21 0,18 5,9 x 10 1,04 1,65 x 10 1 x 10-3 3,38 x 10-5 1,25 x 10-6 1,29 1,37 6,45 x 10
-7 -3 -8 -6

5,7 x 10-2 1 1,0 x 10-2 2,1 x 10-2 2,2 x 10-2 3,15 2,31 1,69 x 10 1 x 10-2 2,65 x 10-1 3,04 x 10-1 3,03 x 10-1 4,7 x 10 5,8 x 10
-2 -3

1,99 x 10 1,5 1,6 1,5 1,09 x 10 1,71 2,19 x 10

-4

4,26 x 10 0,18 0,71 1,5

-3

1,25 x 10 0,17 1,5 1,1 1,50 x 10 1,26 2,9 x 10

-9

Ye et al., 1995 Zeng et al., 1996b Zeng et al., 1996b Zeng et al., 1996b

-9

2,36 3,04 x 10-6

-3

Woo et al., 1995b Ye et al., 1996a

1,36 x 10-3 4,40 x 10 1 x 10-3 1,85 x 10-5 1,12 x 10-6 1,93 x 10-1 7,19 x 10 1,41 x 10 2,09 1,0 3,77 x 10-1 2,18 x 10
-1 -2 -1

-3

1,06

-4

Woo et al., 1999 Ratnayake et al., 1994

3,59 x 10-4 2,66 x 10-4 9,30 x 10-1 3,77 x 10 1,50 x 10 2,78 0,11 2,24 1,00
-1

3,56 x 10-1 3,51 x 10-1 1,98 x 10-1 5,53 x 10 1,73 x 10 2,28 1,11 1,77 3,94
-2

1,40 x 10-3 6,22 x 10-4 3,12 x 10-3 7,48 x 10 1,0 x 10


-3

Ye et al., 1996c Ye et al., 1996c Son et al., 2003 Son et al., 2003 Alali et al., 1999 Woo et al., 1999 Colman-Saizarbitoria et al., 1998 Woo et al., 2000 Woo et al., 2000

-7

-1

-1

-1

-5

4,39 x 10-3 0,13 1,12 x 10-1 1,76 x 10


-1

2,11 x 10-3 1,0 1,85 1,10

3,99 x 10-5 0,21 x 10


-2

1,29 x 10-1 1,02 x 10-1

Ref, Referencias; DE50 Dosis efectivas capaces de inhibir el 50% de la proliferacin celular; a Carcinoma de pulmn; b carcinoma de mama; c adenocarcinoma de colon; d carcinoma de rin; e adenocarcinoma de prstata; f Carcinoma pancretico.

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Acetogeninas de Annonaceae: Efecto antiproliferativo

Tabla 1. Dosis efectivas medias (g/mL) de acetogeninas de anonceas en lneas celulares de tumores slidos humanos (continuacin...)
Bis-THF adyacentes Acetogenina Carbonos del espaciador Posicin de OH A-549a MCF-7 b HT-29 c A 498 d PC-3 e PaCa-2 f Ref.

Dosis efectivas medias (DE50)* Mucoxina Longimicina C Longimicina A Longimicina B Rollidecina C Rollidecina A Rollidecina B Parviflorina Molvizarina Longimicina D Rollidecina D 2,4-cistrilobacinona 10-OH trilobacina Trilobacina 10-OH asimicina 10-OH trilobacina Bullatacina Asitribina Asimitrina 4-OH trilobina 6 7 9 9 9 9 9 11 11 11 11 11 13 13 13 13 13 13 13 13 8,14,17 4,9,18 4,11,20 4,11,20 4,20 4,20,23,24 4,20,23,24 4,13,22 4,13,22 10,13,22 4,22 15,24 4,10,15,24 4,15,24 4,10,15,24 4,10,15,24 4,15,24 15,24,28 4,15,17,24 4,10,15,24 3,6 x 10
-2 -1 -1

3,7 x 10-3 8,8 x 10


-2 -1

6,1 x 10-1 1,0 5,25 x 10


-1

8,4 x 10-1 1,27 x 10 5,44 x 10


-1 -1

3,1 x 10-1 2,96 7,01 x 10 2,2 2,86 x 10


-1 -2

3,3 x 10-1 1,09 1,73 x 10


-2

Alali et al., 1999 Ye et al., 1996b Ye et al., 1996b Ye et al., 1996b Gu et al., 1997 Shi et al., 1996 Shi et al., 1996 Ratnayake et al., 1994 Ratnayake et al., 1994

4,55 x 10 2,59 x 10

8,89 x 10

1,43 x 10-1 1,32 1,04 x 10-2 3,73 x 10 1 x 10-12 1 x 10


-12 -5

154 x 10-2 1,07 1,78 1,32 1,72 2,77 x 10


-9

3,32 x 10-3 6,26 x 10 1,42 1,69 5,49 x 10-1 1,67 x 10


-6 -2

6,4 x 10-2 1,44 5,40 x 10-1 2,28 x 10


-5

7,92 x 10-2 1,08 x 10


-1

1,65 x 10-4 1,7 x 10


-5

1,41 x 10-6 3,44 x 10


-3

4,93 x 10-4 5,9 4,64 x 10


-6

2,15 x 10-1 5,0 1,25 x 10


-8

1,16x 10-2 5,4 1,57 1,4 2,28 7,58 x 10-3 1,39 1 x 10-12

3,53 x 10-2 4,0 4,91 x 10-1 1,0 x 10-2 5,97 x 10 1 1,0 x 10


-2 -2

2,42 x 10-4 1,9 2,75 3,8 x 10-1 9,8 x 10


-1

1,69 x 10-7 1,0 6,86 x 10-2 2,0 x 10-1 2,75 x 10-1 1 1,96 x 10-1

Ye et al., 1996b Gu et al., 1997 He et al., 1997 Alali et al., 1999 He et al., 1997 Alali et al., 1999 Alali et al., 1999 Ratnayake et al., 1994

1,0 x 10-8 5,8 x 10


-8

1,9 x 10-8 1,59 x 10


-7

6,73 x 10-1 1,0 x 10


-8

3,27 x 10-1 1,88 x 10 1 x 10-12


-8

5,26 x 10-1 3,78 x 10-1

1 x 10-12 2,25 x 10 1,19 1,54


-10

1,24 x 10 2,12 3,79

-4

7,04 x 10-5 1,19 x 10-4 1,54 x 10-6

1,69 7,5 x 10-1 3,62 x 10-2

1,3 1,7 x 10-6 2,01 x 10-4

1,25 x 10-4 2,11 x 10-4 2,01 x 10-4

Woo et al., 1995a Kim et al., 2005 Kim et al., 2005

Bis-THF no adyacentes Gigantecinona Goniotriocina Parvifloracina Trilobalicina Bullatacinona Cherimolina-2 (bullatanocina) Cherimolina-1 (bullatalicina) 5 7 7 7 7 11 11 14,17,22 4,14,18 4,14,17,22 4,14,17,22 16,19,24 4,16,19,24 4,16,19,24 2,1 x 10 3,3 x 10
-1 -2

1 3,3 x 10
-5

1 1,2 x 10 2,5 2,28 1,29 x 10


-2 -6 -3

2,1 x 10-1 1,1

1,1 x 10-3 2,6 x 10-1

1 1,4

Alali et al., 1999 Alali et al., 1999 Ratnayake et al., 1994

2,83 x 10-11 5,78 x 10 1,8 x 10


-8

10 x 10-12 1,59 x 10-7 2,16

5,97 x 10-3

9,8 x 10-1

2,75 x 10-1

He et al., 1997 Tormo et al., 1999 Tormo et al., 1999 Tormo et al., 1999

-3

1,0 x 10

-8

6,0 x 10 1

1 x 10 1

-8

1,8 x 10-11

Acetogeninas no clsicas Muconina THFTHP adyacente Piragonicina Mono THP Jimenezina THFTHP adyacente
d

10 11 13

4,12,22 4,10,13,17 4,15,23

5,5 x 10-3 2,0 1,6 x 10-2

2,4 x 10-4 1,6 10 x 10-1

3,9 x 10-1 2,8 4,3 x 10-3


a

1,8 x 10-1 1,3 4,9 x 10-2

5,8 x 10-1 1,2 x 10-1 2,8 x 10-4


b

5,4 x 10-4 5,8 x 10-2 1,7 x 10-4


c

Alali et al., 1999 Alali et al., 1998 Alali et al., 1999

Ref, Referencias; DE50 Dosis efectivas capaces de inhibir el 50% de la proliferacin celular; carcinoma de rin; e adenocarcinoma de prstata; f Carcinoma pancretico.

Carcinoma de pulmn; carcinoma de mama; adenocarcinoma de colon;

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Acetogeninas de Annonaceae: Efecto antiproliferativo

de colon aument hasta 1,23 g/mL (Ye et al., 1996a) y la bis-THF parviflorina mostr una DE50 de 2,83 x 10-11 y 1 x 10-12 g/mL en las clulas de pulmn y mama respectivamente, en tanto que en las de colon fue de 2.5 g/mL (Ratnayake et al., 1994). Algunas acetogeninas superan la actividad del frmaco control como las mono-THP piranicina y piragonicina que tuvieron una actividad 10 veces mayor que la adriamicina sobre las clulas de carcinoma pancretico (DE50= 1,3 x 10-3 g/mL), en tanto que la mono-THF goniotrionina (DE50= 5,3 x 10-6) fue 1 x 105 veces ms potente en las de mama (Alali et al., 1998); las bis-THF trilobacina y la trilobacinona fueron 1 x 106 veces ms potentes en las clulas de carcinoma de pulmn y de mama respectivamente (DE50 1 x 10-8 g/mL) (He et al., 1997); y la asimirina (DE50 1.72 x 10-6) y la 4hidroxitrilobina (DE50 1,54 x 10-6) entre 1 x 105 a 1 x 104 veces ms potentes que la droga antineoplsica mencionada (Kim et al., 2005). Debido a la diversidad y posicin de los grupos reactivos en la molcula de las acetogeninas, se ha buscado la relacin entre su estructura y la actividad mostrada en las lneas cancerosas (Nakanishi et al., 2003; Oberlies et al., 1997a, 1995; Landolt et al., 1995), sealndose como tendencia dentro de los estudios, que el grupo ms potente (considerando el valor DE50) son las bis-THF adyacentes, seguidas de las bis-THF no adyacentes; las acetogeninas monoTHF presentan una potencia menor, la que a su vez es mayor que la de las lineales (Zafra-Polo et al., 1998; Tormo et al., 1999). En las ACG listadas en el Tabla 1 y designando arbitrariamente como una actividad notable la DE50 9,99 x 10-5 g/mL de estos compuestos exhibida en una o varias lneas cancerosas, se observa que el mayor nmero de molculas con esta caracterstica se encuentra en el grupo de las bis-THF no adyacentes (85,7%) seguidas de las bis-THF adyacentes (65%) y las mono-THF (38,5%); dentro del grupo de las ACG lineales ninguna de ellas cumpli este requisito. Si tomamos en cuenta el nmero de lneas afectadas por la DE50 mencionada, la tendencia se mantiene (bisTHF no adyacentes, 30%; bis-THF adyacentes, 22,5%; mono-THF 14,7%) (Tabla 2). Utilizando nuevamente la DE50 descrita como notable, se encuentra que el nmero de carbonos entre el sistema THF y la lactona terminal en las ACG mono-THF con esta actividad es de 15, en las bis-THF es entre 11-13, y en las bis-THF no adyacentes de 11 unidades. Por otro lado la posicin
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de los grupos OH en la cadena aliftica no parece ser un factor crtico (Tabla 2). La variacin de las tendencias en relacin a lo sealado por otros autores y mencionadas anteriormente pudieran deberse a: 1) a la actividad (DE50) considerada como notable y 2) a la unin de varios estudios con el fin de incrementar el nmero de ACG y encontrar en conjunto las tendencias generales de actividad. stas debieran ser confirmadas incrementando el nmero de compuestos en cada grupo as como las lneas celulares analizadas. Uno de los mayores problemas clnicos en los pacientes con cncer, es la falta de respuesta de las clulas tumorales a uno o varios agentes antineoplsicos que pueden diferir en su estructura qumica, blancos farmacolgicos o inclusive rutas metablicas, denominado sistema de resistencia mltiple a los frmacos (MDR) (Bredel, 2001). En particular las lneas P-gp+ se caracterizan por tener protenas que atraviesan la membrana celular y cuya funcin es actuar como bombas que expulsan los frmacos al exterior, evitando su concentracin intracelular. Debido a que este mecanismo es dependiente de ATP, los requerimientos energticos celulares pudieran ser mayores (Lage, 2003). As, la expresin de Pgp+ en las clulas cancerosas expuestas a las acetogeninas pudiera ser desventajosa o bien volverlas ineficientes, con efectos inclusive mayores a los mostrados por las lneas neoplsicas originales. En la lnea cancerosa de mama humana (MCF-7) y su derivada con resistencia a la adriamicina, vincristina o vinblastina (MCF-7/Adr), se encontr que las clulas multiresistentes fueron inhibidas por la bullatacina de manera dosis-dependiente en el rango de 1,0 a 1 x 104 g/mL (DE50 de 1 x 102 g/mL) en tanto que las clulas parentales (MCF-7) mostraron estabilidad en su crecimiento a esas concentraciones. Cuando la bullatacina fue retirada a las 24 h de tratamiento, las clulas parentales recuperaron su actividad proliferativa en contraste con las adriamicina-resistentes que permanecieron inhibidas, indicando que la actividad de esta acetogenina pudiera ser citoesttica en las primeras y citotxica en las segundas (Oberlies et al., 1997b). Adems, en un estudio para determinar la relacin entre la estructura-actividad de 14 acetogeninas pertenecientes a los tipos estructurales bis THF adyacentes, bis-THF no adyacentes y mono-THF, se logr identificar que aunque el compuesto ms potente fue la mono-THF gigantetrocina A, las clulas MCF-7/Adr fueron particularmente sensibles

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Tabla 2. Nmero de acetogeninas de anonceas con DE50 9.99x10-5 y nmero de lneas afectadas.

No carbonos en la cadena del espaciador

No. de ACG analizadas

No. de ACG con DE50 notable

% de ACG con actividad notable

Total de lneas celulares analizadas

No. de lneas celulares afectadas

% de lneas celulares afectadas

Acetogeninas Mono-THF 7 9 11 13 15 17 Total 1 6 6 8 3 2 26 1 1 2 4 2 0 10 100.0 16.7 33.3 50.0 66.7 0.0 38.5 6 36 33 45 18 12 150 1 3 6 8 4 0 20 16.7 8.3 18.2 17.8 22.2 0.0 14.7

Acetogeninas Bis-THF adyacentes 6 7 9 11 13 Total 1 1 5 5 8 20 0 0 2 4 7 13 0.0 0.0 40.0 80.0 87.5 65.0 6 6 30 24 45 111 0 5 7 13 25 0.0 0.0 16.7 29.2 28.9 22.5

Acetogeninas Bis-THF no adyacentes 5 7 11 Total 1 4 2 7 0 4 2 6 0.0 100.0 100.0 85.7 6 18 6 30 0 6 3 9 0.0 33.3 50.0 30.0

a los compuestos con estructura bis-THF adyacente tipo bullatacina (estereoqumica treo-trans-treotrans-eritro) y una cadena espaciadora de 13 carbonos (Oberlies et al., 1997a). En las lneas celulares mencionadas pero tratadas con esquamocina, los resultados fueron similares. Adems, se encontr el ciclo celular bloqueado en la fase G1, un decremento en la concentracin de ATP y por el contrario una elevacin de lactato; (Reynaud et al., 1999). Esto ltimo pudiera reflejar un mecanismo
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de salvamento temporal de las clulas neoplsicas, al aumentar la gliclisis en bsqueda de energa Actividad antitumoral en modelos in vivo Si la actividad antitumoral se define como una accin en contra de las clulas carcinognicas sin que exista toxicidad en el hospedero, entonces los resultados publicados con este criterio son escasos. En modelos experimentales murinos, los resultados sealan que la efectividad de las acetogeninas en relacin a algunas drogas anti-

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neoplsicas, puede ser comparable o inclusive superior. As, en ratones atmicos implantados con clulas de carcinoma ovrico humano A2780, la bullatacina a 0.1 mg/kg/da inhibi el crecimiento de los tumores en 68%, porcentaje semejante al tratamiento con 5 mg/kg del frmaco antitumoral cisplatino (Ahammadsahib et al., 1993) y la annonacina a 10 mg/kg/da durante dos semanas en ratones BDF-1 redujo el crecimiento del carcinoma murino de pulmn (LLC) en 57,9% (tratados/controles) y de manera similar a 2 mg/kg/da de adriamicina (54,6% tratados/controles) (Wang et al., 2002). La va de administracin de estos compuestos puede ser un factor crucial para su efectividad, as como el posible uso de isoacetogeninas (ACG con cetolactonas) o acetogeninas de menor actividad a fin de evitar daos colaterales en los organismos. De esta manera, los ratones con la lnea murina de leucemia L1210 que recibieron intraperitonealmente bullatacina a razn de 50 g/kg/da, tuvieron una sobrevida del 38%, en contraste con el 44% del grupo tratado con 400 g/kg/da de bullatacinona (isorolliniastatina-2) (Ahammadsahib et al., 1993). Adems, en estudios toxicolgicos utilizando ratones atmicos, la isorolliniastatina-1 present una dosis letal media (DL50) de 200 mg/kg/da considerablemente menos agresiva que la rolliniastatina-1 (DE50 de 5 mg/kg/da) (Duret et al., 1999). Es prematuro establecer alguna influencia de los grupos qumicos en la molcula de las acetogeninas sobre su actividad antitumoral. En las acetogeninas bis-THF, la cetolactona parece tener un papel importante en su tolerancia; por otro lado, los resultados con annonacina (mono-THF con lactona insaturada) indican que adems de la lactona, el nmero y posicin de otros grupos funcionales estn involucrados. De manera importante, su transporte y metabolismo en los animales deben estar implicados. Debido al mecanismo inhibitorio de las acetogeninas sobre el complejo I mitocondrial, un aspecto crucial ser esclarecer si su actividad puede inducir la regresin de los tumores, y si ste es el caso, los efectos colaterales de su administracin en los organismos receptores. Induccin de la muerte celular programada o apoptosis En general, las clulas que mueren por necrosis presentan aumento de tamao, ruptura de la
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membrana plasmtica y liberacin del contenido celular al exterior, lo que desencadena un proceso inflamatorio que puede daar a las clulas vecinas. La cromatina se observa condensada de manera irregular y el ADN se degrada en sitios al azar. Por otro lado, la apoptosis es un proceso de muerte celular programada, que permite la homeostasis eliminando las clulas redundantes o potencialmente peligrosas. Este proceso se caracteriza por la prdida de asimetra de la membrana citoplasmtica; la fragmentacin del ADN en porciones ms o menos constantes y con condensacin nuclear. La desintegracin celular se realiza con formacin de cuerpos apoptticos que son fagocitados, evitando su liberacin al exterior y la respuesta inflamatoria. Estos eventos son generados por una transduccin de seales en cascada en donde la activacin de proteasas de la familia de las caspasas es un evento crucial (Kaufmann y Earnshaw 2000; Okada y Mak 2004). Debido a las implicaciones que pudieran suscitarse durante la administracin de las ACG, se han realizado diversos estudios para esclarecer si su efecto citotxico est asociado con una muerte celular necrtica u apopttica. La muerte por apoptosis se asoci al tratamiento con bullatacina en las clulas del hepatocarcinoma humano transfectadas con el virus de la hepatitis B (2.2.15). En ellas, la fosfatidil-serina de la membrana plasmtica se localiz en su lado externo (normalmente confinado al lado citoplsmico) y se observ la cromatina condensada y marginada en el ncleo. De manera adicional, se manifest una inhibicin de la proliferacin (CI50 7.8 ng) y un decremento de antgenos Hb liberados al medio (Chih et al., 2001). Antes de la translocacin de la fosfatidil-serina al exterior, las concentraciones de AMPc y GMPc se encontraron bajas y la adicin al medio de forskolina o de GSNO para incrementarlas fue inefectiva (Chiu et al., 2003). Tambin se ha observado el incremento de protenas relacionadas con la apoptosis como la caspasa 3 en las clulas de leucemia HL-60 expuestas a esquamocina, (Zhu et al., 2002), as como las protenas proapoptticas bad y bax y los inhibidores de la progresin del ciclo celular p21 y p27 en las clulas cancerosas de vejiga T24 (Yuan et al., 2003) y de leucemia mieloide K562 (Lu et al., 2006). Resultados semejantes fueron obtenidos en clulas T24 tratadas con annonacina (Yuan et al., 2006).

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DISCUSIN La actividad inhibitoria de las ACG sobre la proliferacin celular de las lneas cancerosas es heterognea, y esto no es sorprendente si se considera que cada lnea proviene de eventos de carcinognesis especficos, por lo que diversos genes se expresan y/o suprimen, an en las lneas que provienen de un mismo rgano. As, otros factores adems de las ACG deben estar involucrados. Para evitar la muerte, las clulas expuestas a las ACG pudieran activar mecanismos para superar aunque sea de manera transitoria, la reduccin energtica y la produccin de especies reactivas de oxgeno, productos de la inhibicin del complejo I mitocondrial. Entre estos mecanismos se encuentran el incremento de la gliclisis anaerobia, la expresin de factores antiapoptticos y una respuesta antioxidante con las enzimas superxido dismutasa, catalasa y glutatin peroxidasa. Se ha descrito que las ACG inducen la muerte celular programada, con el incremento de las protenas proapoptticas bad y bax y de inhibidores de la progresin del ciclo celular (Yuan et al., 2003; 2006; Lu et al., 2006), y aunque an no est claro su mecanismo de activacin, es posible que sea mediante la va mitocondrial con la prdida del potencial de membrana. An no es posible dar explicaciones claras a las diferencias en actividad que pueden observarse en ACG con estructuras semejantes; por un lado las molculas de las ACG presentan diversos centros quirales que pueden afectar su estructura espacial en los sitios de inhibicin y por otro, el sitio de unin de los inhibidores al complejo I est an caracterizndose. En su localizacin se han involucrado a las subunidades SSP y de 49 kDa, formando una oquedad amplia, en donde las zonas de unin pudieran sobreponerse (Zickermann et al., 2008), o bien presentar diferentes dominios cercanos y cuya ocupacin de uno de ellos, pudiera causar cambios conformacionales en los otros (Degli Esposti, 1998; Fendel et al., 2008). En cualquiera de los casos, variaciones en la estructura de la molcula de la ACG afectaran su afinidad con la enzima. Ms an, los inhibidores del complejo I son molculas lipoflicas, y esta propiedad les permite alcanzar el sitio donde la ubiquinona reacciona y que parece estar inmerso en la membrana mitocondrial interna o al menos su acceso (Miyoshi, 2001). Si bien se ha sealado como un problema la pobre solubilidad de las ACG en medios acuosos, los derivados aminoaciles de la esquamocina 1 con un
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incremento en su hidrosolubilidad, pierden drsticamente su funcin inhibitoria (Duval et al., 2005a), lo que pudiera ser atribuido a su exclusin de la membrana lipdica. As, en ausencia de un modelo estructural de la zona de unin, es difcil predecir la potencia de nuevos inhibidores, pero que deber ser determinada tanto por las interacciones especficas con la enzima como por factores no especficos que afectan su acceso al sitio de unin. La relacin entre la potencia inhibitoria de las acetogeninas sobre el complejo I y su efecto sobre las clulas neoplsicas en cultivo an no ha sido encontrada (Royo et al., 2003; Tormo et al., 2005; Tormo et al., 2003); un factor importante pudiera ser el que los trabajos sobre el complejo I se han realizado con partculas submitocondriales abiertas y en donde las ACG no tienen barreras fisiolgicas que impidan su acceso al sitio de unin en este complejo enzimtico. Otras tcnicas como la polarografa de oxgeno que permite medir los estados respiratorios en la mitocondria, en presencia de substratos especficos para el complejo I, pudieran ayudar a encontrarla. La actividad de las ACG relacionada con la reduccin de los niveles de ATP y la induccin de la apoptosis seran difciles de superar por las clulas malignas, aunado a que hasta el momento no se han descrito mecanismos de resistencia a ellas, las convierte en compuestos interesantes para el desarrollo de medicamentos oncolgicos, incluyendo aquellos casos en que se presente resistencia a los frmacos, o bien podran utilizarse como sensibilizadores durante la administracin de otros quimioteraputicos. Lo anterior ha incentivado el trabajo para la sntesis de estos compuestos, reportndose desde 1996 el desarrollo de la sntesis total de ACG de todos los tipos; recientemente se publicaron dos trabajos de revisin que cubren este importante aspecto (Li et al., 2008; Makabe et al., 2008). Tambin se ha descrito la sntesis de diferentes derivados de las ACG, entre los que destacan por su actividad inhibitoria sobre el complejo I mitocondrial, las molculas lineales de bullatacina (sin sistema THF) denominados AA005. Estas molculas que pueden ser marcadas con deuterio (Liu et al., 2005), son citotxicas en clulas de adenocarcinoma de intestino HCT-8 y HT-29 sin afectar a las normales, aunque en las clulas tumorales gstricas AGS, la muerte se relacion con la necrosis y slo parcialmente con la apoptosis independiente de

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p53 (Huang et al., 2003). Actualmente los investigadores continan buscando la conformacin ptima de la molcula (Liu et al., 2008). Otros derivados importantes de la bullatacina son los deltalac-acetogeninas que poseen dos tallos alifticos, con lo que se ha suprimido el anillo lactona terminal. En estos derivados la simetra de las cadenas laterales con longitud de 11 carbonos, la presencia de anillos dihidroxilados bis-THF adyacentes y estereoqumica semejante a la bullatacina, son factores necesarios para mantener su actividad sobre el complejo I (Hamada et al., 2004; Ichimaru, 2006). Por ltimo, la introduccin de un grupo amino terminal en la lactona insaturada de la esquamocina 1, convierte a esta molcula en un inhibidor dual de los complejo I y III (Duval, 2005b), de gran inters para el estudio de transporte de electrones en la cadena respiratoria mitocondrial. CONCLUSIONES Las perspectivas de los estudios con ACG son variadas e interesantes, desde su utilidad para comprender mejor los mecanismos de transferencia energtica en el complejo I mitocondrial, hasta el desarrollo de productos para el control de insectos vectores de enfermedades de importancia mdica y plagas de la agricultura, as como de frmacos oncolgicos. Para definir su utilidad en el tratamiento contra el cncer, es indispensable incrementar los trabajos con modelos experimentales, contestando preguntas como su seguridad, vehculos y vas de administracin, as como su actividad en la regresin de tumores, entre otras. REFERENCIAS
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Schlie-Guzmn et al.

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 258 - 265 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Diseo y desarrollo de una formulacin con Bixa orellana L. como revelador de placa dentobacteriana
[Design and development of a dental disclosing (plaque revealing) formulation with Bixa orellana L.]
Celia Magaly CASADO MARTN1*, Yamilet GUTIRREZ GAITEN1, Migdalia MIRANDA MARTNEZ1, Ofelia BILBAO REVOREDO1, Margarita DAZ SAN MIGUEL1, Irma MENA2
1

Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Ave 23 # 21425 e/ 214 y 222. La Coronela. La Lisa. Ciudad de La Habana. Cuba. 2 Laboratorio de Control de Calidad. Empresa de Medicamentos del Oeste. Ave. 32 e/ 3ra y 5ta Avenida. Playa. Ciudad de La Habana. Cuba.

Abstract
A homogeneous liquid formulation was developed, as dental disclosing (plaque revealing), from Bixa orellana. Crude drug pharmacognostic parameters were evaluated and qualitative chemical studies were carried out, as well as microbiological evaluation, showing satisfactory results for carotenes presence and microorganisms absence in the sample. An experimental design of the extractive process was developed, applying a 23 factorial design. For the extract and the designed formulation, quality parameters and qualitative chemical and microbiological studies were developed, during a year, being guaranteed in all cases, a stable behaviour under refrigerated conditions. Keywords: Gums plaque; Bixa orellana; Natural coloring.

Resumen
Se desarroll una formulacin lquida homognea, como reveladora de placa dentobacteriana, a partir de Bixa orellana. Fueron evaluados parmetros farmacognsticos de la droga y realizados estudios qumico cualitativos, as como la evaluacin microbiolgica, arrojando resultados satisfactorios en cuanto a la presencia de carotenos en la muestra y la ausencia de microorganismos. Se desarroll un diseo experimental del proceso extractivo, aplicando un diseo factorial 23. Para el extracto obtenido y la formulacin diseada fueron determinados parmetros de calidad y desarrollados estudio qumicos cualitativos y microbiolgicos, durante un ao, garantizndose en todos los casos, un comportamiento estable en condiciones de refrigeracin. Palabras Clave: Placa dentobacteriana; Bixa orellana; Colorantes naturales.

Recibido | Received September 26, 2008. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: February 4, 2009. Publicado en Lnea | Published Online July 22, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of Interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: None declared. This article must be cited as: Celia Magaly Casado Martn, Yamilet Gutirrez Gaiten, Migdalia Miranda Martnez, Ofelia Bilbao Revoredo, Margarita Daz San Miguel, Irma Mena. 2009. Diseo y desarrollo de una formulacin con Bixa orellana L. como revelador de placa dentobacteriana. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4):258 265.{EPub July 22, 2009}.

*Contactos | Contacts: celia@uh.cu, Tel: 53-7-7977883, 53-7-2716076, Fax: 53-7-273-6811

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Atribucin Comn Creativa-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Casado Martn et al.

Bixa orellana L. como revelador de placa dentobacteriana

INTRODUCCIN Las plantas medicinales y los medicamentos herbarios, que formaron la base de la atencin de salud en todo el mundo desde los primeros das de la humanidad, siguen utilizndose ampliamente y tienen una considerable importancia en el comercio internacional. Sigue en aumento el reconocimiento de su valor clnico, farmacutico y econmico, aunque esto vara ampliamente entre un pas y otro (Jayasuriya, 1990). En la dcada de los 70 se detect que muchos de los colorantes sintticos utilizados en la industria eran cancergenos. En Europa se desat una serie de escndalos en relacin con estos compuestos y en varios pases se lleg a prohibir su uso para el consumo humano. En 1990 la Food and Drug Administration de Estados Unidos prohibi el uso de algunos de stos definitivamente (PrezSandi y Becerra, 2003). Ante esta situacin cobran vital importancia los colorantes naturales, los que son considerados en general como inocuos y consecuentemente, las limitaciones especficas en su utilizacin son menores que las que afectan a los colorantes artificiales. La ardua lucha contra el uso de colorantes artificiales trasciende las barreras de la industria alimentaria, en el campo farmacutico tambin se buscan alternativas naturales, a ser usadas como excipientes en diferentes formas de dosificacin, tal es el caso de las formulaciones reveladoras de placa dentobacteriana. Teniendo en cuenta los elementos anteriores y la amplia distribucin en nuestra zona geogrfica de Bixa orellana L. (Bixaceae), planta oriunda de nuestro continente, es que puede considerarse factible la utilizacin de los pigmentos naturales extrados de sus semillas, como colorante, en el diseo de una formulacin tpica dental, que permita el revelado de la placa bacteriana acumulada en dientes y otras estructuras bucales. El componente fundamental de B. orellana, la bixina, es un excelente pigmento que presenta varias ventajas para ser utilizado en la industria. En primer trmino ya que es un colorante completamente inocuo y se reconoce su nula toxicidad tanto para el consumo humano como para su aplicacin en la piel. Es una sustancia con alta resistencia a los agentes qumicos, por lo que resulta muy apropiada para colorear alimentos y bebidas (PrezSandi y Becerra, 2003). Es til igualmente en cosmtica y en farmacia, para ungentos y pomadas, adems de sus diversas
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utilidades en la medicina tradicional, entre las que se destacan el tratamiento de problemas cardiovasculares y diabetes mellitus (Toledo de Oliveira et al., 2004). La bixina es el pigmento natural de la semilla de la bija y representa el 80% de todos los carotenoides presentes. A partir de la bixina es posible obtener otros pigmentos como la norbixina (liposoluble), la sal de norbixina (hidrosoluble) y diversos productos de la degradacin trmica que presentan liposolubilidad y el color amarillento estable e ideal para la coloracin (Toledo de Olveira et al., 2004). La capacidad de disolucin en alcohol etlico de los pigmentos mayoritarios de la especie vegetal objeto de estudio (bixina y norbixina), nos da la posibilidad de obtener con facilidad un extracto hidroalcohlico, que pueda ser incorporado a formulaciones farmacuticas. En este sentido, la formulacin de un sistema lquido homogneo (solucin) a partir del extracto crudo en base alcohlica, dado su origen natural, y con la garanta de su estabilidad y el beneficio econmico que implicara su generalizacin, constituira una alternativa viable para nuestros sistemas de salud, teniendo en cuenta adems, resultados de estudios preclnicos desarrollados por Gutirrez et al. (2005), que demuestran la eficacia de este producto natural como revelador, permitiendo la correcta identificacin de placa dentobacteriana en perros de raza Beagle, con efectos que no muestran diferencias significativas con el Placdent, revelador bucodentario disponible en los servicios de estomatologa. MATERIALES Y MTODOS Material vegetal. Evaluacin de sus parmetros de calidad Para el anlisis de la droga cruda, semillas de la especie vegetal Bixa orellana L. (Bixaceae) [Herbario INIFAT Nmero de Serie 1079], proveniente del Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical Alejandro de Humboldt en Santiago de las Vegas, Ciudad de La Habana, fueron evaluadas la materia orgnica e inorgnica extraa, humedad residual, sustancias solubles o extrables y cenizas totales, siguiendo en todos los casos la metodologa propuesta por Miranda y Cuellar (2000, 2001) y NRSP 309 (1992). Tambin fue evaluada la calidad microbiolgica a partir de las normativas de la USP30 NF25 (2006).

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Diseo experimental del proceso extraccin Se procedi a la realizacin de un mtodo de extraccin por reflujo, en manta elctrica, a una temperatura entre 50 y 60C, a partir de 1g de semilla de B. orellana, empleando como disolvente una solucin hidroalcohlica. Las variables analizadas en dicho proceso fueron: - Cantidad de disolvente: 10 mL, 20 mL (X1) - Concentracin de la solucin hidroalcohlica: 50% y 80% (X2) - Tiempo de extraccin: 20 min, 40 min (X3) Se utiliz un diseo factorial 23 y los resultados fueron evaluados a partir de la variable respuesta porcentaje de slidos totales (St), mediante la aplicacin del programa estadstico Design Expert, versin 6.0.1. Evaluacin de la calidad del extracto y la formulacin de B. orellana El extracto obtenido a partir de semillas enteras y previamente secadas a la sombra, fue analizado mediante la evaluacin de sus propiedades organolpticas, especficamente la determinacin visual de su color y apariencia, adems de su olor, pH, ndice de refraccin, densidad relativa, slidos totales, anlisis capilar, contenido alcohlico, siguiendo tambin la metodologa propuesta por Miranda y Cuellar (2000, 2001) y NRSP 312 (Ministerio de Salud Pblica, 1992a). El esquema empleado para su obtencin se muestra en la Fig. 1.
Figura 1. Mtodo de obtencin del extracto de B. orellana.

de frutas y agua destilada como excipientes, fue analizada a partir de la evaluacin de sus propiedades organolpticas, especficamente la determinacin visual de su color y apariencia, adems de su olor y sabor, pH, ndice de refraccin, densidad relativa, siguiendo la metodologa propuesta por Miranda y Cuellar (2000, 2001) y NRSP 312 (Ministerio de Salud Pblica, 1992b). Por otra parte se desarroll un estudio hednico para evaluar la aceptabilidad hacia la formulacin objeto de estudio. Se dise una prueba momentnea, con valoracin de atributos individuales y elementos de preferencia aceptabilidad. Se escogi la escala Hednica de 5 puntos: 1- me gusta mucho, 2- me gusta, 3- ni me gusta ni me disgusta, 4- me disgusta, 5me disgusta mucho; esta puntuacin demarca el grado de aceptacin. (Observatorio Alimentario, 2006). Participaron un total de 62 jueces no adiestrados. La metodologa empleada para el procesamiento de los resultados se bas en lo reportado por Espinosa (1986) y Newell y McFarlane (1987). En todas las etapas fueron desarrollados ensayos para la deteccin de hidrocarburos, utilizando 10 mL de muestra evaporados al aire y disueltos en Acetona mediante calentamiento suave sobre bao de agua, seguido de ensayos para la deteccin de carotenos, el cual emplea como muestra el residuo que se obtiene en el primer ensayo, filtrado y redisuelto en 2 mL de cloroformo, y el reactivo de Carr-Price (Miranda y Cuellar, 2000). Asimismo se desarrollan anlisis por cromatografa en capa delgada, punteando las muestras y empleando como fase mvil, cloroformo:metanol (9:1), con placas de gel de slice F254 nm sobre base de aluminio como soporte (Merck) y reactivo de CarrPrice, como revelador; tenindose en cuenta adems, los elementos referidos por RodrguezAmaya (2001) tambin fue evaluada la calidad microbiolgica a partir de las normativas de la USP30 NF25 (2006). Estabilidad fsico qumica y microbiolgica De manera general, la estabilidad de un producto farmacutico debe evaluarse bajo las condiciones de almacenamiento (con las tolerancias apropiadas), lo que permite evaluar su estabilidad trmica y, si fuera aplicable, su sensibilidad a la humedad o su potencial para la prdida del solvente (Niazi, 2004). En este sentido fue evaluada cualitativamente la estabilidad de la droga, el extracto y la formulacin durante un ao, tomando en consideracin la Regulacin No. 232000 del CECMED (Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos, 2000), que establece los

La formulacin diseada, compuesta fundamentalmente por el extracto de B. orellana (agente activo, revelador de la placa dentobacteriana), adems de glicerina, metil y propil parabenos, esencia
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requerimientos de los estudios de estabilidad para el registro de productos farmacuticos nuevos y conocidos, y propone evaluaciones a los 0, 3, 6, 9 y 12 meses, durante los cuales se midieron todos los parmetros previamente definidos para la determinacin de la calidad de las muestras estudiadas, incluyendo la evaluacin microbiolgica, que se desarroll a partir del conteo de bacterias y hongos, as como, ensayos para deteccin de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, especies de Salmonella y Escherichia coli. En el caso especfico del extracto y la formulacin fueron envasados en frascos de cristal mbar y en condiciones de refrigeracin (15 2 C). Estadstica ANOVA fue realizado mediante StatgraphicsPlus, versin 5.0. La matriz utilizada en el diseo factorial 23 fue realizada con el programa informtico Design Expert (Stat-Ease, Inc.), versin 6.0.1. RESULTADOS El anlisis de los parmetros evaluados durante el estudio de la droga cruda se muestra en las Tablas 1 y 2. Asimismo, la Fig. 2 muestra el comportamiento cromatogrfico de la misma al inicio y al final del perodo de evaluacin al que fue sometida.
Figura 2. Comportamiento cromatogrfico de la droga cruda (semillas de B. orellana) en su evaluacin inicial (I) y al concluir el estudio (II) a los 12 meses.

a la elucidacin de la ecuacin del diseo, que a continuacin se muestra:


Slidos Totales = 0,93 0,10 X1 0,29 X2 + 0,095 X3

Las Tablas 5 y 6, as como la Fig. 3, muestran los resultados de los diferentes estudios a los que fue sometido el extracto obtenido a partir de la especie vegetal objeto de estudio.
Figura 3. Comportamiento cromatogrfico del extracto hidroalcohlico de B. orellana, en su evaluacin inicial (I) y al concluir el estudio (II) a los 12 meses.

El diseo experimental del proceso de extraccin brind los resultados que se muestran en la Tabla 3, los cuales permitieron la obtencin de los parmetros estadsticos reflejados en la Tabla 4 y que condujeron
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El diseo de la formulacin consisti en una preparacin lquida (solucin), en la cual el extracto altamente pigmentado de B. orellana, constituy el componente fundamental, o activo de la formulacin. Tambin fueron empleados un grupo de excipientes caractersticos de esta forma de dosificacin, como lo son los esteres del cido para-hidroxibenzoico, y la glicerina, adems fueron empleadas esencias de frutas (frambuesa o naranja). Debe especificarse que se disearon inicialmente dos formulaciones en funcin de las esencias empleadas, las cuales fueron sometidas a un estudio hednico, cuyos principales resultados se muestran en la Tabla 7. Las Tablas 8 y 9, as como la Fig. 4, muestran los resultados de los diferentes estudios a los que fue sometida la formulacin que result mayormente aceptada, como consecuencia del estudio de preferencia o aceptacin llevado a cabo. En todas las etapas de trabajo fue detectada, desde el punto de vista cualitativo, la presencia en las muestras analizadas, de hidrocarburos, especficamente del tipo carotenos.

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Tabla 1. ndices numricos determinados a de las semillas de B. orellana. Tiempo (meses) 0 3 6 9 Humedad Residual (% DS) 6,03 0,92 6,09 0,35 6,20 0,84* 6,30 0,00* Sustancias solubles (% DS) Agua 23,93 0,75 23,03 1,53 23,78 0,74 23,39 0,86 Etanol 30% 20,65 1,53 21,85 0,00 19,96 0,76 21,24 0,76 Etanol 50% 27,48 0,30 26,82 1,38 27,10 2,22 26,38 0,76 Etanol 80% 31,13 0,30 30,42 2,28 31,58 0,22 31,48 2,35 30,90 1,96 Cenizas totales (% DS) 3,53 0,32 3,95 0,64 4,25 0,65 4,55 0,85 3,01 0,23

12 6,50 0,71* 24,91 1,17 21,39 0,55 27,30 2,35 * Denota diferencias estadsticamente significativas. DS Desviacin Estndar. ANOVA 1, p<0,05. StatgraphicsPlus, versin 5.0

Figura 4. Comportamiento cromatogrfico de la formulacin reveladora de placa dentobacteriana, en su evaluacin inicial (I) y al concluir el estudio (II) a los 12 meses.

Tabla 3. Matriz utilizada en el diseo factorial 23 con valores sustituidos. Experimento No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Factores X1 (mL) 10 20 10 20 10 20 10 20 X2 (%) 50 50 80 80 50 50 80 80 X3 (min) 20 20 20 20 40 40 40 40 Slidos totales (%) 1.15 1.07 0.68 0.49 1.52 1.22 0.85 0.51

Tabla 2. Resultados del anlisis microbiolgico de las semillas de B. orellana a 12 meses de estudio. Anlisis Conteo de bacterias Conteo de hongos Salmonellas Eschericia coli Staphylococcus aureus Pseudomona aerugenosa Lmites microbiolgicos permisibles (UFC/g) < 107 < 10
3

Resultados (UFC/g) 52 x 105 <1 Ausente Ausente Ausente Ausente

Tabla 4. Valores de los parmetros analizados en la observacin estadstica. Factores Modelo X1 X2 X3 Prdida de ajuste p < 0,0001 0,0075 < 0,0001 0,0085 0.0105

Ausencia Mx. 10
2

Ausencia Ausencia

Tablas 3 y 4 realizadas con Design Expert, versin 6.0.1.

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Tabla 5. Estabilidad del extracto de B. orellana. Tiempo pH DS (meses) 0 3 6 9 12 5,70 0,10 5,18 0,03 5,84 0,20 5,32 0,13 5,77 0,13 Slidos Totales Densidad Relativa DS (% DS) 1,56 0,141 1,47 0,361 1,53 0,103 1,50 0,017 1,48 0,050 0,943 0,003 0,939 0,042 0,941 0,003 0,938 0,014 0,941 0,013 ndice de Refraccin DS 1,3550 0,001 1,3560 0,006 1,3539 0,002 1,3539 0,003 1,3567 0,008 Altura Capilar (cm DS) 9,2 0,02 9,3 0,06 9,4 0,01* 9,5 0,02* 9,8 0.03*

Contenido Alcohlico (% DS) 55,48 2,86 53,71 1,27 51,94 2,16* 50,19 2,11* 48,45 2,23*

* Denota diferencias estadsticamente significativas. DS Desviacin Estndar. ANOVA 1, p<0,05. StatgraphicsPlus, versin 5.0 Tabla 6. Resultados del anlisis microbiolgico del extracto de B. orellana a 12 meses de estudio. Anlisis Conteo de bacterias Conteo de hongos Salmonellas Eschericia coli Staphylococcus aureus Pseudomona aerugenosa Lmites microbiolgicos permisibles (UFC/g) < 107 < 103 Ausencia Mx. 10
2

Resultados (UFC/g) Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente

Ausencia Ausencia

Tabla 7. Resultados de la prueba de preferencia o aceptacin realizada a 62 jueces no adiestrados. Nmero de individuos Opciones Muestra 1 1. Me gusta mucho 2. Me gusta 3. Ni me gusta ni me disgusta 4. Me disgusta 5. Me disgusta mucho Media (puntos) 21 32 8 1 0 4,18 Olor Muestra 2 8 32 17 5 0 3,69 Color Muestra 1 1 44 16 1 0 3,72 Muestra 2 2 33 24 3 0 3,55 Sabor Muestra 1 4 15 29 14 0 3,14 Muestra 2 1 14 35 10 2 3,03

Muestra 1: Formulacin con presencia de esencia de frambuesa. Muestra 2: Formulacin con presencia de esencia de naranja.

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Tabla 8. Estabilidad de la formulacin de B. orellana. Tiempo (meses) 0 3 6 9 12 pH DS 5,63 0,011 5,43 0,041 5,62 0,024 5,60 0,190 5,41 0,023 ndice de Refraccin DS 1,348 0,000 1,346 0,004 1,347 0,001 1,346 0,030 1,347 0,000 Densidad Relativa DS 1,029 0,001 1,027 0,110 1,030 0,000 1,024 0,017 1,027 0,001

DS Desviacin Estndar. ANOVA 1, p<0,05. StatgraphicsPlus, versin 5.0 Tabla 9. Resultados del anlisis microbiolgico a la formulacin de B. orellana a 12 meses de estudio. Lmites Resultados microbiolgicos Anlisis (UFC/g) permisibles (UFC/g) Ausente Conteo de bacterias < 107 Conteo de hongos Salmonellas Eschericia coli Staphylococcus aureus Pseudomona aerugenosa < 103 Ausencia Mx. 10
2

Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente

Ausencia Ausencia

DISCUSIN El anlisis estadstico de los resultados a los parmetros evaluados durante el estudio de estabilidad de las semillas de B. orellana (Tabla 1), mostr un comportamiento estable de la droga objeto de estudio en el perodo, al no ponerse de manifiesto diferencias estadsticamente significativas entre los valores encontrados para la mayora de las cuantificaciones realizadas. Solo en el caso de la humedad residual fueron encontradas diferencias significativas, que se considera debern estar relacionadas con la absorcin a partir de la humedad relativa medio ambiental, teniendo en cuenta adems, que el envase utilizado para su almacenamiento fue nylon. Es preciso destacar que el ligero aumento evidenciado no afecta la estabilidad microbiolgica de la droga (Tabla 2), pues no se constat proliferacin de microorganismos durante el ao de estudio, por encima de los lmites establecidos en este sentido. De igual forma pudo corroborarse, desde el punto de vista qumico cualitativo, la estabilidad de la misma, al ser encontrados resultados muy similares para las determinaciones realizadas en cuanta a la deteccin de
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hidrocarburos y carotenos. En la Fig. 2 puede observarse el comportamiento cromatogrfico del extracto etreo de la droga, en su evaluacin inicial (I) y al concluir el estudio (II), lo que confirma desde este punto de vista, el comportamiento estable de esta. Al analizar los resultados obtenidos en el diseo experimental del proceso de extraccin (Tabla 3), se pudo constatar que el mayor porcentaje de slidos totales se obtiene para el experimento 5, con 1,52%, seguido por el 6 y el 1 con valores de 1,22% y 1,15%, respectivamente, coincidiendo en todos los casos con la utilizacin de la solucin hidroalcohlica al 50%, independientemente del volumen de la solucin hidroalcohlica y el tiempo de extraccin. El anlisis de varianzas mostr como resultado que todas las variables ejercen un efecto significativo sobre el proceso de extraccin (Tabla 4), al ser en todos los casos los valores de p < 0.05. En este sentido se podra concluir que la concentracin de la solucin hidroalcohlica, es de las tres, la variable con un efecto ms marcado sobre el proceso extractivo, lo que se justifica plenamente con el menor de los valores de p encontrados, as como el mayor aporte a la ecuacin final en trminos de su coeficiente. Es importante resaltar adems, que el valor de R2 obtenido para este diseo, fue de 0,9547. En cuanto al estudio del extracto obtenido debe destacarse que el anlisis estadstico de los resultados de las cuantificaciones realizadas (Tabla 5), mostr un comportamiento estable del extracto en el perodo, al no encontrarse diferencias estadsticamente significativas en cuatro de los seis parmetros evaluados. Sin embargo, pudo detectarse un leve incremento de la altura capilar que puede ser relacionado, con la ligera disminucin del contenido alcohlico en el tiempo, lo que trae consigo una mayor relacin aguaetanol en el medio y por tanto una mayor afinidad del extracto por la celulosa del papel empleado en el anlisis capilar. Asimismo pudo corroborarse, desde el punto de vista organolptico, qumico cualitativo y micro-biolgico (Tabla 6), la estabilidad del extracto, al ser encontrados resultados muy similares para las determinaciones realizadas. Por otro lado, en la Fig. 3 puede observarse el comportamiento cromatogrfico del extracto hidroalcohlico de B. orellana, en su evaluacin inicial (I) y al concluir el estudio (II), la cual teniendo en cuenta la disposicin de las manchas y la respuesta de las mismas frente al mtodo de revelado desarrollado, sugiere un comportamiento relativamente estable, que podra ser corroborado con posteriores cuantificaciones.

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Tras el diseo de dos formulaciones reveladoras, en funcin de la esencia de frutas utilizada en el desarrollo de las mismas y la aplicacin del estudio hednico, pudo constatarse que ambas muestras alcanzan valores medios superiores a los 3 puntos para los parmetros psicofisiolgicos evaluados (Tabla 7), lo que evidencia claramente la aceptacin, desde el punto de vista organolptico, hacia las dos formulaciones, tenindose en cuenta que es este precisamente, el lmite de aceptabilidad en este tipo de estudios. Es importante sealar que a pesar de la similitud de los resultados, la tendencia de aceptabilidad y preferencia fue superior para la formulacin que contiene a la esencia de frambuesa, razn por la cual los estudios de estabilidad se encuentran referidos a dicha formulacin. El anlisis estadstico de los resultados a los parmetros evaluados durante el estudio de estabilidad de la formulacin reveladora de placa dentobacteriana (Tabla 8), mostr un comportamiento estable de la misma en el perodo, al no ponerse de manifiesto diferencias estadsticamente significativas entre los valores encontrados. Igualmente pudo corroborarse, desde el punto de vista organolptico, qumico cualitativo y microbiolgico (Tabla 9), su estabilidad, al ser encontrados resultados muy similares para las determinaciones realizadas. De forma similar al extracto hidroalcohlico de B. orellana, en la Fig. 4 puede observarse el comportamiento cromatogrfico de la formulacin reveladora de placa dentobacteriana, en su evaluacin inicial (I) y al concluir el estudio (II), indicando igualmente un comportamiento relativamente estable, tomando en consideracin la disposicin de las manchas y la respuesta de las mismas frente al mtodo de revelado desarrollado. CONCLUSIONES Las condiciones ensayadas para el almacenamiento de la droga cruda (semillas de B. orellana), as como el extracto obtenido y la formulacin diseada, permiten garantizar la estabilidad fsico-qumica y microbiolgica de las muestras durante un perodo de un ao, lo que unido a los resultados satisfactorios derivados de los estudios preclnicos llevados a cabo por otros miembros de nuestro equipo de trabajo, permite considerar a la formulacin reveladora de placa dentobacteriana desarrollada, una alternativa viable, ante el uso de colorantes artificiales, con las

consiguientes afectaciones que los mismos podran provocar a la salud humana. REFERENCIAS
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 266 - 274 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Longterm effects of Cinnamomum zeylanicum Blume oil on some physiological parameters in streptozotocin-diabetic and non-diabetic rats
[Efectos a largo plazo del aceite esencial de Cinnamomum zeylanicum Blume en algunos parametros fisiolgicos en ratas diabticas inducidas por estreptozotocina]
Talal A. ZARI1, Ayed Sh. AL-LOGMANI2
1

Department of Biological Sciences, Faculty of Science, King Abdulaziz University, P.O. Box 80203, Jeddah 21589, Saudi Arabia. 2 Department of Biology, Teachers College, Jeddah, Saudi Arabia

Abstract
The longterm effects of Cinnamomum zeylanicum Blume oil on some physiological parameters were investigated in streptozotocin (STZ)-induced diabetic and non-diabetic male Wistar rats. STZ-induced diabetic rats showed significant increases in the levels of blood glucose, triglycerides, cholesterol, low density lipoprotein LDL-cholesterol, urea, alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) while high density lipoprotein HDLcholesterol, total protein and uric acid levels were significantly decreased compared to normal rats. Administration of cinnamon oil to diabetic rats resulted in a significant decrease in blood glucose, triglycerides, cholesterol, LDLcholesterol and ALT while HDLcholesterol level was markedly increased after seven weeks compared to untreated diabetic rats. In comparison with control, administration of cinnamon oil significantly decreased the levels of triglycerides, urea and AST and significantly increased the levels of ALT and uric acid in non-diabetic rats after seven weeks. The results of this study indicate that the diet containing the oil of C. zeylanicum improves the examined physiological parameters in STZ-induced diabetic rats especially when it is used for a longer period. Keywords: Streptozotocin; Diabetes; Cinnamon oil; Blood;Rats.

Resumen
Los efectos a largo plazo del aceite de Cinnamomum zeylanicum Blume sobre algunos parmetros fisiolgicos fueron investigados en ratas machos Wistar no diabticas y diabticas inducidas por estreptozotocina (STZ). Las ratas diabticas inducidas por STZ mostraron incrementos significativos de las concentraciones de glucosa en sangre, triglicridos, colesterol, lipoprotenas de baja densidad LDL-colesterol, urea, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST); mientras que las concentraciones de lipoprotenas de alta densidad HDL-colesterol, protena total y cido rico decrecieron significativamente comparadas con ratas normales. La administracin de aceite de canela a ratas diabticas result en un decrecimiento significativo de glucosa en sangre, triglicridos, colesterol, LDLcolesterol y ALT, mientras que la concentracin de HDLcolesterol se increment marcadamente despus de siete semanas comparada con la obtenida para las ratas diabticas no tratadas. En relacin con el control, la administracin de aceite de canela decreci significativamente las concentraciones de triglicridos, urea y AST e increment significativamente las concentraciones de ALT y cido rico en ratas no diabticas despus de siete semanas. Los resultados de este estudio indican que la dieta con aceite de C. zeylanicum mejora los parmetros fisiolgicos examinados de ratas diabticas inducidas por STZ, especialmente cuando este es usado por un largo perodo. Palabras Clave: Estreptozotocina; Diabetes; Aceite de canela; Sangre; Ratas.

Recibido | Received: May 13, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: June 22, 2009. Publicado en Lnea | Published Online July 22, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was financed by authors. This article must be cited as: Talal A. Zari, Ayed Sh. Al-Logmani. 2009. Longterm effects of Cinnamomum zeylanicum Blume oil on some physiological parameters in streptozotocin-diabetic and non-diabetic rats. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4):266 274. {EPub July 22, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email talzari@yahoo.com; logmanher@yahoo.com; T +966506368204; F +96626208870.

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Comn Creativa-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Zari and Al-Logmani

Effects of Cinnamomum zeylanicum Blume oil on diabetic rats

INTRODUCTION Diabetes mellitus is probably the fastest growing metabolic disorder in the world and it is a major source of morbidity in developed countries. Medicinal plants play an important role in the management of diabetes mellitus especially in developing countries where resources are meager. Many studies have confirmed the benefits of medicinal plants with hypoglycaemic effects in the management of diabetes mellitus. The effects of these plants may delay the development of diabetic complications and correct the metabolic abnormalities (Al-Attar and Zari, 2007; AlLogmani and Zari, 2009). Moreover, during the past few years some of the new bioactive drugs isolated from hypoglycaemic plants showed antidiabetic activity with more efficacy than oral hypoglycaemic agents used in clinical therapy (Bnouham et al., 2006). Presently, there is an increased demand to use natural products with antidiabetic activity due to the side effects associated with the use of insulin and oral hypoglycemic agents (Holman and Turner, 1991; Kameswara et al., 1997; Kim et al., 2006). More than 400 plants with glucose lowering effect are known (Ernst, 1997). Also a number of plants have a hypolipidemic effect (Sharma et al., 2003). However, there is little information about plants with both hypoglycemic and hypolipidemic effects (Subash Babu et al., 2006). The pathogenesis of diabetes mellitus is managed by insulin and oral administration of hypoglycemic drugs such as sulfonylureas and biguanides (Larner, 1985). Unfortunately, apart from having a number of side effects, none of the oral synthetic hypoglycemic agents have been successful in maintaining euglycaemia and controlling long-term microvascular and macrovascular complications (Larner, 1985; Stenman et al., 1990). Insulin therapy is used for management of diabetes mellitus but there are several drawbacks, which include insulin allergy, insulin antibodies, lipodystrophy, autoimmunity and other delayed complications like morphological changes in kidney and severe vascular complications (Defronzo et al., 1982; Jarvinen and Koivisto, 1984; 1986). Thus, new, relatively non-toxic, therapeutic agents are needed to treat hyperglycemia, which also would correct dyslipidemia to reduce the risk of CV complications of diabetes (El-Hilaly et al., 2006). True cinnamon (C. zeylanicum) is among 300 species of Cinnamomum that belong to the Lauraceae
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family. The aromatic bark of the cinnamon tree is used worldwide for culinary purposes, but it is also used in Ayurvedic and traditional Chinese medicine for its hypoglycaemic, digestive, antispasmodic, and antiseptic properties (Battaglia 1995; Ody 1993). Animal studies have demonstrated that cinnamon, and its active constituent cinnamaldehyde, doses dependently improve glycaemic control and hyperlipidaemia in normal and streptozotocin-induced diabetic rats (Kannappan et al., 2006; Kim et al., 2006; Subash Babu et al., 2006). Recently, Kwon and coworkers described that cinnamon oil protects from the streptozotocin-induced -cell damage in vivo and in vitro and proposed inhibition of iNOS protein expression -mediated at the transcriptional level through the inhibition of NF-B activation and iNOS transcription- as a plausible mechanism underlying this effect (Kwon et al., 2006). Major compounds present in cinnamon stem-bark oil and cinnamon root-bark oil are cinnamaldehyde (75%) and camphor (56%), respectively (Senanayake et al., 1978) identified 53 constituents along with the major component eugenol (81-84.5%) in cinnamon leaf oil. Thirty-four compounds have been previously identified in cinnamon fruit oil with (E)-cinnamyl acetate (42-54%) and caryophyllene (9-14%) as the major components (Jayaprakasha et al., 1997). Twenty-six compounds constitutes 97% of the volatile oil from cinnamon flowers were characterized with (E)-cinnamyl acetate (42%), trans--bergamotene (8%) and caryophyllene oxide (7%) as the major compounds (Jayaprakasha et al., 2000). Induction of diabetes in laboratory animals is a convenient and useful strategy in the understanding and treatment of the disease. An appropriate dose of streptozotocin was used to induce experimental diabetes. Streptozotocin selectively destroyed pancreatic -cells, resulting in hypoinsulinemia (Szkudelski, 2001). Streptozocin-treated rats are often used as diabetic animals with insulin-deficiency resulting from damage of beta-cells caused by the drug. These rats are hyperglycemic and have reduced uptake of glucose in skeletal muscles (WallbergHarrison and Holoszy, 1985; Goodyear et al., 1988; Markun et al., 1999). It is generally considered that hyperglycemia is the major factor in the pathogenesis of diabetic complications (Odetti et al., 1996). In diabetes there is inability to store fat and protein along with breakdown of existing fat and protein stores. Streptozotocin induced diabetic rats showed significant increases in the levels of cholesterol,

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Zari and Al-Logmani

Effects of Cinnamomum zeylanicum Blume oil on diabetic rats

phospholipids, triglycerides, and free fatty acids (Ravi et al., 2005). These changes remain important in terms of explaining the accelerated atherosclerosis. In addition, there is a loss of body weight (Bolkent et al., 2005; Zari and Al-Attar, 2007). Impairment of kidney function is a prominent feature of diabetes. Elevated levels of urea and decreased concentrations of uric acid and creatinine were shown in diabetes (Gawronska-Szklarz et al., 2003; Yassin et al., 2004). Over time diabetic nephropathy will develop, characterized by proteinuria, a loss of renal function, and a rapid progression to end stage renal failure (Tesch and Nikolic-Paterson, 2006). Little information exists concerning the effects of C. zeylanicum oil on physiological parameters in STZinduced diabetic and non-diabetic rats. Therefore, the aim of this study is to find if the administration of the oil of C. zeylanicum could have beneficial effects on some physiological parameters in STZ-induced diabetic and non-diabetic rats after seven weeks. The physiological parameters including blood glucose, triglycerides, cholesterol, high density lipoprotein HDL-cholesterol, low density lipoprotein LDLcholesterol, total protein, creatinine, urea, uric acid, alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST). MATERIALS AND METHODS Materials Streptozotocin (STZ) was purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). All other chemicals were purchased from Al-Saggaf Est. (Jeddah, Saudi Arabia). The oil of C. zeylanicum was obtained from Dreams Essential Oils Est. (Jeddah, Saudi Arabia). C. zeylanicum oil was extracted by hydro-distillation. The major compounds of this oil were cinnamaldehyde (62.7%), -caryophyllene (6.5%), eugenol (5.25%), -terpineol (2.8%) and cinnamyl alcohol (0.18%). Experimental animals Male Wistar rats weighing (180230 g) were obtained from the Animal Experimental Unit of King Fahd Medical Research Center, King Abdul Aziz University, Jeddah, Saudi Arabia. The rats were housed in well-aerated individual cages in an animal room and maintained in a temperature-controlled room (24 1 C) with a 12 h light/12 h dark cycle, 5510%
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humidity. They were fed with normal commercial chow and water ad libitum. Throughout the experiments, animals were processed according to the suggested international ethical guidelines for the care of laboratory animals and all experimental procedures were approved by the Animal Care and Use Committee of King Abdul Aziz University. Induction of diabetes The experimental animals were fasted for 12 h and then diabetes was induced by a single intraperitonial injection of streptozotocin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), dissolved in a freshly prepared physiological saline solution (0.9% NaCl) at a dose of 65 mg/kg body weight. While normal rats received only the saline solution (0.9% NaCl) in the same volume and through the same route. After injection, all animals were returned to their cages and given free access to food and water. After 3 days, the fasting blood glucose levels were measured from tail blood samples by using an OneTouch Ultra glucometer (Lifescan; Johnson & Johnson, Milpitas, CA, USA). Animals with blood glucose levels more than 277 mg/dL were considered diabetic and used for the experiment. Experimental design A total of 40 rats were used in the experiment. The rats were divided into 4 groups of 10 animals each as follows: Group 1: Normal control (Non-diabetic normal rats) received normal commercial chow and water ad libitum. Group 2: STZ-Control (diabetic control rats) received the same diet given in group 1. Group 3: STZ + C. zeylanicum oil received diet containing 5% C. zeylanicum oil. Group 4: Normal control + C. zeylanicum oil received diet containing 5% C. zeylanicum oil. All of the experimental groups received the treatments for a period of 7 weeks. Rats were weighed at the start of the experimental period and weekly for 7 weeks using a digital balance. These weights were determined at the same time during the morning. Blood sampling After 7 weeks, the rats were fasted for 8 h before blood sampling, water was not restricted. Blood samples were collected from the orbital venous plexus of the rat under mild ether anaesthesia by heparinized capillary tube and into non-heparinized tubes, Plate et

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al. (1985) indicated that brief exposure and little amount of anesthetic used do not influence the activity of hepatic cytochrome P450 2E1 and P450 reductases in the rat. Clear serum samples were separated by centrifugation at 3000 rpm for 20 min and then collected and stored at -20 C for different biochemical analyses, prior immediate determination of glucose, triglycerides, cholesterol, high density lipoprotein HDL-cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein LDL-cholesterol (LDL-C), total protein, creatinine, urea, uric acid, alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST). All of these parameters were measured using an automatic analyzer (Architect c8000 Clinical Chemistry System, USA). Statistical analysis Statistical analyses were performed using SPSS package for Windows version 13.0. Data are expressed as mean SE. One-way ANOVA and t-tests were used to analyze differences among groups. Differences between groups were considered statistically significant at p<0.05. RESULTS The mean values of blood glucose of both control and experimental groups are presented in Table 1. STZ-induced diabetic rats showed a highly significant (p<0.001) increase in the levels of blood glucose, registering increases of 246.2% after 7 weeks compared to the controls. Administration of C. zeylanicum oil to diabetic rats resulted in a significant (p<0.001) decrease in blood glucose levels of 66.7% after 7 weeks, compared to untreated diabetic rats. In comparison with control, administration of cinnamon oil in non-diabetic rats showed no significant differences in the level of blood glucose after 7 weeks. The changes in the levels of serum lipids in control and experimental groups are illustrated in Table 1. There was a significant (p<0.001) decrease in the level of HDL- cholesterol (24.1%) and significant (p<0.001) increases in the levels of cholesterol, LDL- cholesterol and triglycerides in STZ-induced diabetic rats, with percentages of 64.7%, 70.9% and 170.9% respectively, compared to the controls. In comparison with control, administration of cinnamon oil in non-diabetic rats showed a significant (p<0.01) decrease in the level of triglycerides (38.8%) while there were no significant differences in the levels of cholesterol, HDLcholesterol and LDL-cholesterol after 7 weeks.
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The mean values of blood total protein, urea, uric acid and creatinine concentrations of both control and experimental groups are presented in Table 2. STZinduced diabetic rats showed a significant (p<0.05) decrease in blood total protein and uric acid with percentage of 7% and 19.8% respectively, compared to control. In contrast, STZ-induced diabetic rats showed a significant (p<0.001) increase in blood urea by 155.4% compared to the control. In comparison with control, administration of cinnamon oil significantly decreased the levels of urea and significantly increased the level of uric acid in non-diabetic rats while no significant differences in the levels of total protein and creatinine were observed after 7 weeks. Table 2 shows the mean values of AST and ALT activities of both control and experimental groups after 7 weeks. In STZ-induced diabetic rats the activities of blood AST and ALT were signicantly (p<0.001) increased by 31.2% and 136%, respectively, compared to their normal levels. On the other hand, treatment of the STZ-induced diabetic rats with C. zeylanicum oil caused reduction in the activity of these enzymes in blood by 36% for AST and by 49.5% for ALT, compared to the mean values of untreated diabetic group. In comparison with control, administration of cinnamon oil significantly decreased the level of AST and significantly increased the level of ALT in nondiabetic rats after 7 weeks.

DISCUSSION Results of the present study showed that diabetic rats exhibited a significant increase in blood glucose level. This result is in consistent with other studies in rats (Augusti and Sheela, 1996; Campos et al., 2003; Al-Attar and Zari, 2007). Numerous studies demonstrated that a variety of plant extracts effectively lowered the glucose level in STZ-induced diabetic rats (Ravi et al., 2004; Rajasekaran et al., 2005; Sekar et al., 2005). In the present study, the oil of C. zeylanicum significantly reduces blood glucose levels in STZ-induced diabetic rats after 7 weeks of treatment, which also demonstrates that there is significantly higher rate of glucose disposal. In a previous study, the oil of C. zeylanicum significantly reduces blood glucose levels in STZ-induced diabetic rats after 3 weeks of treatment (Al-Logmani and Zari, 2009). Cinnamon extract significantly reduces blood glucose levels in db/db mice after 2 weeks of treatment (Kim et al., 2006).

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Table 1. Effects of C. zeylanicum oil supplementation on blood glucose, triglyceride,cholesterol, LDL-C and HDL-C in rats. Treatment Parameters (mg/dL) Glucose Triglyceride Cholesterol HDL-C LDL-C Control 126.72 2.17*** 55.55 5.27*** 62.39 3.11*** 20.37 0.46*** 31.63 0.55*** STZ 438.70 4.48 153.40 6.52 102.77 2.14 15.45 0.50 54.06 1.37 STZ+Cinnamon oil 145.92 1.46***### 79.30 1.28***### 67.56 2.66***### 18.37 0.19**## 33.18 2.29***### Cinnamon oil 125.91 0.92 33.98 5.18* 60.68 1.99 20.05 0.74 31.80 3.41

The number of animals was 5 for each treatment except for the control, in which it was 10. All values are expressed as means SE. Significantly different from control (* p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001). Significantly different from untreated STZ-induced diabetic rats (# p < 0.05, ## p < 0.01 and ### p < 0.001).

Table 2. Effects of C. zeylanicum oil supplementation on blood total protein, urea, uric acid, creatinine, AST and ALT in rats. Treatment

Parameters Total protein (g/L) Creatinine (mg/dL) Uric acid (mg/dL) Urea (mg/dL) AST (U/L) ALT (U/L)

Control 6.53 0.55** 0.37 0.02** 0.97 0.04* 16.87 0.50**** 102.10 4.96** 46.10 2.06***

STZ 6.07 0.09 0.48 0.03 1.16 0.08 43.08 4.28 134.00 8.20 108.80 9.92

STZ+Cinnamon oil 6.06 0.08 0.36 0.03*# 1.74 0.14**## 37.76 5.16 85.80 4.35**## 55.00 2.21**##

Cinnamon oil 6.40 0.11 0.38 0.01 1.26 0.08** 13.05 0.49*** 84.80 2.35* 55.40 2.20*

The number of animals was 5 for each treatment except for the control, in which it was 10. All values are expressed as means SE. Significantly different from control (* p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001).

Similarly, blood glucose level decreased after administration of cinnamon extract in people with type II diabetes (Kham et al., 2003). Hyperglycemia increases the generation of free radicals by glucose auto-oxidation and the increment of free radicals may lead to liver cell damage. The increase in oxygen free
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radicals in diabetes could be primarily due to the increase in blood glucose levels and secondarily due to the effects of the diabetogenic agent streptozotocin (Szkudelski, 2001). Previous studies demonstrated that the essential oils of cinnamon and their active constituents have proven free radical scavenging and

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antioxidant activities (Burits and Bucar, 2000; Tomaino et al., 2005; Jayaprakasha et al., 2007). Based on above mentioned reports, it is suggested that the possible mechanism of action by the oil of C. zeylanicum could be related to antioxidants that aid to recover from impaired metabolism of glucose (AlLogmani and Zari, 2009). In the present study, normal rats fed on C. zeylanicum oil showed no significant differences in the levels of blood glucose, cholesterol, HDL-cholesterol and LDL-cholesterol after seven weeks compared to control while the level of triglycerides was significantly decreased. The diabetes caused by streptozotocin administration increases fat mobilization in skeletal muscle (Stearns et al., 1979) inducing significant weight loss (Besse et al., 1993). Lipids play a vital role in the pathogenesis of diabetes mellitus. The most common lipid abnormalities in diabetes are hypertriglyceridemia and hypercholesterolemia (AlShamaony et al., 1994). In our study, we have noticed significantly increased levels of serum total cholesterol, triglycerides and LDL- cholesterol but markedly decreased level of serum HDL- cholesterol in STZ- induced diabetic rats. These results are in agreement with those obtained by (Bolkent et al., 2004; Ravi et al., 2005; Singh et al., 2005; Rajasekaran et al., 2006). The abnormal high concentrations of serum lipids in diabetic animals are due mainly to an increase in the mobilization of free fatty acids from the peripheral fat depots, since insulin inhibits the hormone-sensitive lipase (Pushparaj et al., 2000). Excess fatty acids in the serum of diabetic rats are converted into phospholipids and cholesterol in the liver. These two substances along with excess triglycerides formed at the same time in the liver may be discharged into the blood in the form of lipoproteins (Bopanna et al., 1997). The present study showed that C. zeylanicum oil had favourably modified serum lipid profile in rats with significant decreases in total cholesterol, LDLcholesterol, triglycerides and increased HDL. Moreover, the effects of C. zeylanicum oil on the tested physiological parameters in streptozotocindiabetic rats are more beneficial after 7 weeks than after 3 weeks (Al-Logmani and Zari, 2009). In this study, the STZ + C. zeylanicum oil group showed significant decreases in the levels of glucose (19.82%), triglyceride (38.12%) and cholesterol (11.01%) after 7 weeks when compared with those after 3 weeks (Al-Logmani and Zari, 2009).
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Administration of cinnamaldehyde which are the main constituent of cinnamon lowers serum lipids, and also increases the serum HDL-cholesterol (Subash Babu et al., 2006). The antilipidemic action of C. zeylanicum oil may reside in their ability to stimulate insulin secretion and action. The data revealed significant elevations in blood urea in STZ-induced diabetic rats. A similar effect was recorded previously (Gawronska-Szklarz et al., 2003). A decrease in body weight of diabetic rats is possible due to catabolism of fats and protein, even though the food intake is more in diabetic rats than control. Due to insulin deficiency protein content is decreased in muscular tissue by proteolysis (Vats et al., 2004). The highly significant increase in serum urea concentrations of diabetic rats may be due to depletion of serum protein, increase in the rate of circulating amino acids and deamination takes place that consequently leads to the formation of large amount of ammonia which is eventually converted to urea. The breakdown of amino acids during gluconeogenesis in the liver results in increased production of urea, fostering negative nitrogen balance (Ganong, 2003). In contrast, serum total protein, uric acid and creatinine were decreased in diabetic animals. The decrease in blood total protein observed in diabetic rats is coinciding with the findings of Peavy et al. (1985) and Wanke and Wong (1991). This decline may be due to the inhibited oxidative phosphorylation processes which lead to decrease of protein synthesis, increase in the catabolic processes and reduction of protein absorption (Tragl and Reaven, 1972; Jefferson et al., 1983). Possible defects in tubular reabsorption and probably increased excretion may explain such decreases in blood uric acid and creatinine. Creatinuria occurs in any condition associated with extensive muscle breakdown as in starvation and poorly controlled diabetes mellitus (Ganong, 2003). However, uric acid clearance has been associated with insulin resistance (Facchini et al., 1991). Previous changes in serum urea, uric acid and creatinine concentrations strongly suggested impairment of kidney function in diabetes. In the present study, normal rats fed on C. zeylanicum oil showed no significant differences in the levels of total protein and creatinine after seven weeks compared to control while significant differences were observed in the levels of uric acid, urea, ALT and AST. European health agencies have recently warned against consuming large amounts of

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cinnamon, due to the presence of a moderately toxic component called coumarin in cinnamon. Coumarin is known to cause liver and kidney damage in high concentrations. High doses of coumarin by the oral route are known to be associated with liver toxicity in rodents (Felter et al., 2006). Coumarin exhibits marked species differences in both metabolism and toxicity (Lake, 1999). In STZ-induced diabetic rats the activities of blood AST and ALT were signicantly increased compared to their normal levels. These results indicated that diabetes may be induced due to liver dysfunction. Ohaeri (2001) also found that liver was necrotized in STZ-induced diabetic rats. Therefore, increase in the activities of AST and ALT in blood may be mainly due to the leakage of these enzymes from the liver cytosol into the blood stream (Navarro et al., 1993), which gives an indication on the hepatotoxic effect of STZ. On the other hand, treatment of the diabetic rats with C. zeylanicum oil caused reduction in the activity of these enzymes in blood compared to the mean values of diabetic group and consequently may alleviate liver damage caused by STZ-induced diabetes. These results are in agreement with those obtained by Subash Babu et al. (2006) who reported that oral administration of cinnamaldehyde for 45 days significantly restores the enzyme levels to near normal in diabetic rats. A possible explanation for the differential effects of C. zeylanicum oil on the activities of AST and ALT in blood is that these treatments may inhibit the liver damage induced by streptozotocin (Al-Logmani and Zari, 2009). CONCLUSION The results of this study indicate that cinnamon oil possesses hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidant effects in STZ-induced diabetic rats and suggest that this oil may be an excellent adjuvant support in the therapy of diabetes and its complications especially when it is used for a longer period. REFERENCES
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 275 - 281 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Isolation, characterization and quantification of artemisinin by NMR from Argentinean Artemisia annua L.
[Aislamiento, caracterizacin e identificacin de artemininina por RMN de Artemisia annua L. argentina]
Rubn S. RIMADA*, Walter O. GATTI, Ren JEANDUPEUX, Lzaro F. R. CAFFERATA Laboratorio LADECOR (UNLP), Departamento de Qumica. Facultad de Ciencias Exactas (UNLP), Calles 47 y 115, (1900) La Plata. Repblica Argentina.

Abstract
Artemisinin is a polycyclic sesquiterpene lactone present in leaves and inflorescences of wild Artemisia annua L. That substance is highly effective against multidrug-resistant strains of Plasmodium falciparum, which is the etiological agent of the most severe form of malaria. The known procedures for the extraction and isolation of artemisinin were performed and optimized. The extractions were carried out with different solvents and/or their mixtures. Chromatographic methods (TLC, HPLC and GC) were employed for the characterization and quality control of artemisinin and other metabolites presents in the solvents extracts. qNMR method was also employed for determination the artemisinin content in the solvents extracts.The convenience of the above procedures was critically evaluated by comparison of the analytical results with those derived by applying the classic isolation methods by Soxhlet extraction. The values of artemisinin content in Argentinean plants extracts were in the 0.2-0.3 %. (p/p) range. Keywords: Artemisinin; Isolation; Artemisia annua; Characterization; Quantification; Nuclear Magnetic Resonance.

Resumen
Artemisinina es una lactona policclica sesquiterpnica presente junto a otros metabolitos en hojas e inflorescencias de Artemisia annua L. Esra sustancia es muy eficaz contra cepas resistentes de Plasmodium falciparum, agente etiolgico de la forma ms grave de malaria. En este trabajo se modificaron y optimizaron procedimientos ya conocidos para la extraccin y aislamiento de artemisinina. Se efectuaron extracciones a temperatura ambiente con diferentes solventes y/o mezclas de los mismos. Se describen tcnicas cromatogrficas (TLC, GC y HPLC) y espectroscpica (NMR) empleadas en la caracterizacin y su control de calidad en los diferentes extractos. La conveniencia de la realizacin de esos procedimientos se evalu crticamente por comparacin de sus resultados con los obtenidos aplicando los mtodos clsicos de aislamiento por extraccin Soxhlet a mayores temperaturas. El contenido de artemisinina en los extractos estuvo en el rango de 0,2-0,3 %.(p/p). Palabras Clave: Artemisinina; Aislamiento; Artemisia annua; Caracterizacin; Cuantificacion; Resonancia Magntica Nuclear. Abbreviations: TLC: thin layer chromatography; HPLC: high performance liquid chromatography; GC: gas chromatography; NMR: nuclear magnetic resonance; qNMR: quantitative nuclear magnetic resonance; i.s.: internal Standard; DMF: N,N-dimetilformamide; TMS: tetrametilsilane.
Recibido | Received: October 27, 2008. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: June 26, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: July 22, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was financed by CONICET, the National University of La Plata and the Scientific Research Center of Buenos Aires Province (CIC). This article must be cited as: Rubn S. Rimada, Walter O. Gatti, Ren Jeandupeux, Lzaro F. R. Cafferata. 2009. Isolation, characterization and quantification of artemisinin by NMR from Argentinean Artemisia annua L. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4):275 281. {EPub July 22, 2009}.

*Contactos | Contacts: Email rsrimada@quimica.unlp.edu.ar

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Rimada et al.

Isolation, characterization and quantification of Argentinean artemisinin from Artemisia annua L

INTRODUCTION Artemisia annua L. is a member of the Asteraceae and since ancient times described in China for the treatment of fevers and thus used in antimalarial therapy. Malaria or paludism is an endemic disease in several regions of the world, nowadays also including subtropical zones of Argentina. Chloroquine and its derivatives have been used widely therapeutically, but are no longer effective against Plasmodium falciparum which participates in the evolutive cycle of the illness (Li et al., 1982; Qinghaosu Antimalaria Coordinating Research Group, 1979; Cooperative Research Group on Qinghaosu and its Derivatives as Antimalarials, 1982). Also A. annua extracts were demonstrated to be effective against both chloroquine-resistant and other sensitive strains, as well as against cerebral malaria. In 1979, the antimalarial principle and other metabolites were isolated from the plant and their structures determined (Qinghaosu Antimalaria Coordinating Research Group, 1979). The major metabolites of the Chinese A. annua (Fig. 1) are artemisinin (1), artemisinic or arteanuic acid (2), arteannuin B (3) and dihydroarteannuin (4). Of these four substances, only artemisinin (1) is biologically active and has been converted into several other derivatives, which are more effective and are now in clinical use (Klayman, 1985; Zaman et al., 1991; Bhattacharya and Sharma, 1999; Lansbury and Nowak, 1992, 1998). Artemisinin is a sesquiterpene lactone molecule containing a peroxidic bridge, with a 1,2,4-trioxane structure and represents a new generation of antimalarials. Because of the worldwide resurgence of malaria and the parasite resistance to drugs (Li et al., 1982), it is a big challenge to obtain pure artemisinin in industrial scale. For instance, in Brazil (Garcia Rehder et al., 2000; Rodney et al., 2006) and in many other countries there is currently a great interest in the production of natural artemisinin, because its chemical synthesis (Kim and Sasaki, 2006; Acton, 1989; Roth and Acton, 1991; Haynes, 2006) is quite laborious and costly. Here are described procedures to obtain (1) from the aerial parts (leaves and inflorescence) of wild plants of A. annua, an herb abundant in areas of spontaneous growth and moderate temperature (humid Pampa and Southern coastal rivers of the Argentine Republic). The method used is based on its extraction at room temperature from which the compound was obtained in crystalline form Cafferata and Jeandupeux,
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(2007), which makes a significant difference compared with the procedures so far done at higher temperatures (Acton, et al., 1986; Roth and Acton, 1987; 1989), using chromatographic techniques to eliminate the other related co-occurring metabolites.
Figure 1. Structures of artemisinin (1), artemisinic or arteanuic acid (2), arteannuin B (3) and dihydroarteannuin (4).
14

H
6 5 4

CH3
7

5a
12a

O
3

8a

O O
12

CH3
15

O
10

CH3

13

H HOOC Me

1
14

2
H
9 8 7

H
2 3 15 4 5 1 6 10

O
12

11

13

Me O

HO

O O

Determination of artemisinin in the source plants of A. annua, is a challenging problem since the compound is present in very low concentrations and it is thermally unstable in solution. The solvent extracts and the purified artemisinin were analyzed qualitatively by TLC, GC, HPLC and quantitatively by NMR spectroscopy. In the literature both 1D and 2D 1 H-NMR and 13C-NMR experiments were proved to be highly suitable for the simultaneous selective recognition and quantitative determination of metabolites in complex biological mixtures. Unlike chromatography, it is possible to employ a universal reference standard as an internal standard for the majority of the chemical products assayed by quantitative NMR. Here we report on an extraction technique especially developed based on revisions of theoretical and practical factors and NMR studies previously published (Pauli, 2001; Holzgrabe et al., 1998; Wells et al., 2002; Pauli et al., 2005; Wells et al. 2004; Zhongshan et al., 1985; Burton, 2007; Blask et al. 1988; Maniara et al. 1998; Lampasona et al. 1990).

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MATERIALS AND METHODS Vegetal material collected Plants of A. annua L. (Asteraceae) cultivated during the summer and autumn 2005 in Gualeguaych (Province of Entre Ros, Argentina) and harvested before flowering were employed. This material was dried in the open air or an electric stove at temperatures not exceeding 30 oC. Reagents and standard compounds Standard artemisinin (98% p/p) (Sigma-Aldrich, USA) and N,N-dimethyformamide (Merck, USA), were used. All other chemicals used were of analytical reagent grade. Deuterated chloroform (Aldrich, USA) was 99.8% atom D, containing 0.03% (v/v) of tetramethylsilane (TMS) as a chemical shift reference set at the 0.00 ppm scale. Extraction, isolation and purification of Argentinean artemisinin The extractions were performed with different solvents (e.g. n-hexane, isopropyl alcohol, ethanol, and

toluene) or mixtures of some of them. The solvent extracts were obtained by maceration, percolation or decoction of fresh or previously dried and conveniently milled aerial parts of the plants, placed in closed glass containers. Those procedures were performed at appropriated low temperatures, in the most of the cases, with vigorous mechanical shaking (Fig. 2). The purification of crude artemisinin was conducted in chromatographic columns filled with Silica gel. The elution of the components of the sample incorporated to the column was performed with mixtures of ethyl acetate (10% v/v) in n-hexane. The collected successive fractions were qualitatively monitored by a TLC method and a further purification was performed by successive recrystallizations with selected solvent (Cafferata y Jeandupeux, 2007). Colourless crystals, with typical aspect of long needles were obtained. The analysis was confirmed through checks with TLC, RP-HPLC, GC and NMR methods.

Figure 2. Flow sheet of the extraction method employed in the extraction and isolation of artemisinin from A. annua.
2 5 oC 2 4 hs. +++++++++++++ (x 3 ) A A 1 5 0 g , c a rb o n 1 0 g E tO H 7 0 % w a te r 3 0 % 2 5 0 m L E tO H 7 0 % xxxxxxxxx (x 3 ) R e d u c e d p re s s u re R e s id u e A A w a te r 3 0 % 300 m L

A r te a n u i c a c i d

150 m L 25
oC

n -h e xa n e

+++++++++++++

C r y s t a lli z e d a r t e m i s i n i n
Na
2

S O4

R V c o n c e n tr a te

4 oC A r te a n u i c a c i d + a r te a n u i n

C . C o lu m n

A r te m i s i n i n A r te a n u i c a c i d O t h e r m e t a b o li t e s

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Thin Layer Chromatography (TLC) TLC analysis is considered advantageous in this case, because of its rapid, easy and cheaper performance without the need of costly instrumental equipment. Cromatopholios (Merck, USA) silica gel coated with fluorescent indicator (=254 nm) were employed, using solutions of standard artemisinin dissolved in n-hexane. The mobile phase was a mixture of toluene 93% - ethyl acetate. The aluminium plates were revealed with a solution of 1% vanillin in sulphuric acid and subsequent heated to 105 110 oC to detect of spots. Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) A Pharmacia LKB liquid chromatograph 2942 (Uppsala, Sweden) model with a Spherisorb Superpack RP-C18 (100 mm length, 4 mm i.d, 3 microns average particle size) operating at room temperature were employed. A refraction index detector 2142 model LKB was used. The mobile phase were mixtures of methanol (80-90 %)- water with a 0.5 mL/min flow rate. 100 L of the samples solutions were manually injected.

Capillary Gas Phase Chromatography (GC) The artemisinin dosage in the hydrocarbon extracts (e.g n-hexane) was conducted in a 8000 model Perkin Elmer gas chromatograph, equipped with a methyl-phenylsilicone bonded phase capillary column (25 m length and 0.25 mm i.d.) and a FID detector at 220 oC. Solutions of 2 L of standard artemisinin (98% p/p) in n-hexane and hydrocarbon extracts were injected. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) PC software was developed to locate and integrate the signals with parameters of values the chosen signals. A 1H NMR spectra of artemisinin present in the purified extract solvent of wild A. annua was obtained (Fig. 3). Artemisinin shows a relevant singlet (H-C12 at =5.85 ppm) (Fig. 4). N,Ndimethyl-formamide was chosen as the internal standard for quantitative analyses which present a singlet at = 8 ppm. The artemisinin signal and its area were compared with the integrated value of the N,N-dimethylformamide singlet area (Fig. 4). Experiments nearity, accuracy, precision) were performed to validate (linearity, accuracy and precision) the q-NMR method employed.

Figure 3. 1H NMR spectrum of a wild A. annua extract


7.275 5.865 3.405 2.445 2.025 1.814 1.739 1.447 1.231 1.018 0.004 7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

0 1.00 5.0 ppm (t1) 0.0

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Figure 4. 1H NMR spectrum of a wild A. annua extract (including the internal standard) in the corresponding enhanced region, showing peaks used for the quantitative analyses.
D

S A

Artemisinin characterization Artemisinin: 3R-(, 5a, 6, 8a , 9 ,12 , 12aR*)]-octahydro-3,6,9-trimethyl-3,12-epoxy-12Hpyrano-2[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10 (3H)-one. 1 H NMR (200.03 MHz, CDCl3) :5.87-5.9 (1H, CH), : 3.64-3.68 (1H, c, CH), : 3.42 (1H, c, CH), : 2.45 (1H, c, CH), : 2.5-2.08 (2H, c, CH2), : 1.971.99 (2H, c, CH2), : 1.88-1.90 (2H, t, CH2, J= 5.35 Hz), : 1.75-1.78 (2H, c, CH2, J1= 5.25, J2=7.22), :1.63-1.66 (3H, s, CH3), :1.42-1.45 (1H, s, CH), :1.21-1.24 (3H, d, CH3, J=7.32), :1.02-1.05 (3H, d, CH3, J= 5.37), 13C NMR (50.305 MHz, CDCl3), : 172.6 (q), 105.9 (q), 94.1 (CH), 79.9 (q), 50.21 (CH), 45.25 (CH), 37.76 (CH2), 36.14 (CH2), 33.84 (CH2), 33.12 (CH2), 25.22 (CH3), 23.62 (CH), 20.05 (CH3), 12.78 (CH3). For over-multiplets and a few quadruplets not every coupling constant could be identified.
5.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.2

7.0

6.8

6.6

6.4

6.2

6.0

5.8

5.6

5.4

For quantitative analysis two spectra covering spectral windows were acquired in separate experiments. In the first experiment the resonance of the i.s. was off-set by 500 Hz from the carrier frequency and the FID was acquired. In the second experiment, resonance of the analyte is offset by +500 Hz from the carrier frequency and a second FID is acquired. 32-64 transients were collected using 8K data points, a flip angle of 45o, relax delay 1.00 sec and an acquisition time of 4.09 s. Areas of the peaks were determined by electronic integration of expanded regions around diagnostic resonances. Inverse-gated decoupling was employed using a lowpower composite pulse sequence to obtain 1Hdecoupled NMR spectra of artemisinin-nuclei without signal enhancement by nuclear Overhauser effects (NOE). Samples of each residue extract (10-20 mg) were dissolved in CDCl3, containing 1% (v/v) DMF and TMS a chemical shift reference. 0.6 mL with a concentration of 15 mg/mL was filtered and inserted in the NMR tube. Furthermore, artemisinin standard (10 mg) was dissolved in 0.6 mL of CDCl3 and inserted in the tube. The spectra were recorded on a Varian (Mercury Plus model) instrument at 200.037 MHz for 1H and 50.3 MHz for 13C operating at 25 o C temperature.

RESULTS AND DISCUSSION Isolation of artemisinin The extraction of 150 g of A. annua conveniently milled (particle size ca. 2 mm), to which were added suitably 20 g of activated charcoal granules to achieve partial removal of coloured substances of high molecular weight (chlorophylls, flavonoids, etc..), using 600 mL of a mixture of ethanol (70% v/v)-water, was performed. The hydroalcoholic suspension was vigorously agitated in a glass container fitted with a hermetic closure of rectangular section and ca. 1000 mL capacity, at room temperature (ca. 25 C). Samples aliquots (at 30, 60, 90 and 150 min) were collected. The suspension, initially yellow-green, turns light brown during the process of extraction, with pH values between 3 and 5 and was followed by extraction with n-hexane (100 mL) at ca. 25 C using a manually separating funnel. The qualitative analysis (TLC) of A in the two phases (hexane and hydroalcoholic) (Table 1) was proceeded and compared with those obtained in other solvents (Table 2). In this way it was found (TLC), removal of most of the terpenes and lipids (waxes), present in the plant material to start.

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Table 1. Artemisinin yield (w / w) obtained from extraction of A. annua L. time-dependent using methanol and ethanol as solvents and mixtures of water-methanol and ethanol-water, ca. 25 C Tiempo (min) 120 240 360 Metanol 100% 0.44 0.50 0.50 Etanol 100% 0.50 0.58 0.59 Metanol 20% 0.20 0.005 0.005 Etanol 20% 0.33 0.41 0.45

Table 2 Performance on the partition to 25 oC artemisinin (Art) from n-hexane and aqueous ethanol solutions Mixer of solvents in the L/L partition (1:1 v/v) n-hexane + (20% water-ethanol) n-hexane + (40% water-ethanol) n-hexane + (60% water-ethanol) n-hexane + (80% water-ethanol) Art in nC6 (%) 0 10 70 100 Art in ethanolwater (%) 100 90 30 0

Chromatographic methods The values of the retention parameters obtained in typical extracts of artemisinin in hydrocarbon solvents by chromatographic methods are indicated (Table 3). Standard methods statistical treatments were employed.
Table 3. Anaytical parameters of components analyzed in petroleum ether solution (fraction 60-80 oC). Compound HPLC (Rt, min) Arteannuin Artemisinin Artemisitone Artenuic acid
a b

TLC (Rf) /coloura 0.07 / brown 0.1 / pink 0.2 / brown

GC (Rt, min) 30.6d / 32.2 e 24.6 / 34.4 -

1.7 2c 5.3

2.1 / 11.9

0 / pink

qNMR method A 1H NMR spectra of artemisinin present in the purified extract solvent of wild A. annua was obtained (Fig. 4). A singlet of dimethylformamide was chosen as the internal standard for quantitative NMR analyses because it is readily available and non volatile and your proton signal does not interfere with any signals in the extracts of A. annua. Experimental accuracy, specificity and linearity were established. Accuracy: Experimental accuracy was expressed as relative standard deviation, RSD. The total number of 10 individual measurements were generated and analyzed statistically. Duplicate analysis of single spice extracts gave relative deviations of 11.5 % for artemisinin level. Linearity: The linearity of the method was tested in two experiments by determining the relation between NMR detector response and sample concentration. In the first experiment, the sample solution was prepared and the signal intensity was measured vs. range of receiver gain (signal amplification factor) settings and, in the second experiment, by measuring the response from serial dilutions of original sample stock solution. Five-point curves (from 2 to 12 mg/mL) gave a good linear responses (r2=0.9968) for the artemisinin molecule with sufficient sensitivity for the analyses of the extracts and acceptable repeatability. Specifity: The specificity of the method was established for each test substance by demonstrating the lack of interference from the internal standard and the solvent. The values obtained by q-NMR analyses were in the range ca. 0.3 11.5 % (w/w). This deviation is not statistically significant due to the relatively very low quantity observed in the wild A. annua sample here analyzed. CONCLUSION The best results in terms of yields and quality of artemisin were obtained with hydroalcoholics mixtures or n-hexane operating at room temperature. Quantitative NMR spectroscopy was found to be suitable and valid for the determination of artemisinin in the solvents extracts. The values obtained are significantly lower than the yield obtained from plant samples of European countries (ca. 2 %, w/w) (Gaudi and Simonnet, 2002; Delabays, 1997).

Vanillin-sulphuric acid as TLC developer; methanol/water 85:15, UV detector at 254 nm; mobile phase methanol/water 90:10, UV detector at 254 nm; Tinjector = 190 oC Toven =180 oC over X min; Tinjector = 190 oC Toven = 50 oC 250 oC over X min.

Crystalline artemisinin yields obtained from dried leaves of wild A. annua, from selected areas of the Argentine Republic, was of ca.0.2 % (w/w). The quantities of artemisinin evaluated by HPLC were 10.40 mg 0.86 (r2 =0.9850) and the evaluated for GC were 11.30 mg 0.56 (r2 =0.9899).
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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas Vol. 8 (4) 2009 | 281

2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 282 - 288 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Preparacin de un protector solar y evaluacin de la accin fotoprotectora del propleo verde del Vale do Ao, Minas Gerais, Brasil
[Preparation of a sunscreen and evaluation of the photoprotective action of the green propolis from Vale do Ao, Minas Gerais, Brazil]
Geisilaine SOARES DOS REIS1, Analina FURTADO VALADO2, Leonardo RAMOS PAES DE LIMA3, Mary LUCY MOREIRA4
Centro Universitrio do Leste de Minas GeraisUnileste MG (Farmcia)#725, CEP.:35160-215, IpatingaMG, Brasil.

Abstract
Propolis is a product gathered from plants and developed by melliferous bees. It possesses diverse biological activities as antiinflamatory action, antioxidant etc. and it contains more than 300 substances (for example: flavonoides). Due to the property of the propolis of absorbing light in the UV region, the photoprotective activity of the product was analyzed by analysis in vitro of the sun protection factor (SPF) of topical formulations with extract hidroalcoholic of green propolis, with espectrophotometer for readings in the region of the UVB. The propolis samples were gathered in apiaries in the Vale do Ao, a region in the East of the state of Minas Gerais, Brazil. The formulations were prepared with different bases: gels natrosol and carbopol and emulsion oil/water. The preparations of gel natrosol and emulsion oil/water with propolis extract remained stable during the study of stability. The formulations that contained 40% of propolis extract got values of SPF up of 10. The results obtained in this study overcame values of opposing SPF in natural formulations with plants and algae, for example, and they confirm the photoprotective action of the green propolis of the Vale do Ao. The developed products should be perfected so that they are adapted to the different skin types and acquire higher SPFs. Keywords: Propolis, Flavonoids, SPF, Brazil, Sunscreen, UV.

Resumen
Propleo es un producto recolectado en plantas y desarrollado por abejas melferas. Posee diversas actividades biolgicas como accin antiinflamatoria, antioxidante, antibacteriana, etc. y contiene ms de 300 substancias (ej.: flavonoides). Debido a la propiedad del propleo de absorber luz UV fue analizada la actividad fotoprotectora del producto por anlisis in vitro del factor de proteccin solar (FPS) de formulaciones tpicas con extracto hidroalcohlico de propleo verde con espectrofotmetro para lecturas en la regin del UVB. Las muestras de propleo fueron recolectadas en colmenares en el Vale do Ao, una regin al este del estado de Minas Gerais, Brasil. Las formulaciones fueron preparadas con diferentes bases: geles natrosol y carbopol y emulsin aceite/agua. Las preparaciones de gel natrosol y emulsin aceite/agua con extracto de propleo permanecieron estables durante el estudio de estabilidad. Para las formulaciones que contenan 40% de extracto de propleo fueron encontrados valores de FPS sobre 10. Los resultados obtenidos en este estudio superaron valores de FPS encontrados en formulaciones naturales con plantas y algas y confirman la accin fotoprotectora del propleo verde del Vale do Ao. Los productos desarrollados deben ser perfeccionados para que se adecuen a los diferentes tipos de piel y adquieran FPS ms altos. Palabras Clave: Propleo, Flavonoides, FPS, Brasil, Fotoprotector, UV.

Recibido | Received February 28, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: June 15, 2009. Publicado en Lnea | Published Online July 25, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of Interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: Este trabajo fue financiado por Centro Universitrio do Leste de Minas Gerais Unileste MG This article must be cited as: Geisilaine Soares Dos Reis, Analina Furtado Valado, Leonardo Ramos Paes De Lima, Mary Lucy Moreira. 2009. Preparacin de un protector solar y evaluacin de la accin fotoprotectora del propleo verde del Vale do Ao, Minas Gerais, Brasil. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4):282 288.{EPub July 25, 2009}.

*Contactos | Contacts: 55 31 9624 3581, rsgeise@yahoo.com.br; analinafurtado@yahoo.com.br; lrplima@hotmail.com; 4marylmoreira@yahoo.com.br

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INTRODUCCIN La palabra propolis es de origen griego y transmite la idea de la defensa (pro) de la ciudad (polis), lo que es aplicado en tal producto apcola, pues este protege la colmena de insectos y de los microorganismos invasores (Ramos y Miranda, 2007). Esta defensa es debida a la presencia de ms de 300 sustancias en el propleo y entre ellas, tres grupos qumicos merecen la prominencia debido a las actividades biolgicas que ejercen: los flavonoides, derivados de cido cinmico y terpenos. Los flavonoides han sido considerados los principales compuestos biolgicos activos del propleo (Bankova et al., 1995) y son polifenoles de origen botnico que han sido usados como los marcadores de la calidad del propleo (Grosso et al., 2007). Estos son producidos en las plantas y poseen la funcin de atraccin para los polinizadores, pues varan de colores como del amarillo al rojo de ptalos de flores. La concentracin de los flavonoides en las plantas vara de acuerdo con la estacin en que fue producido, as como con la vegetacin, clima y relieve en los cuales estn los colmenares y de qu partes de las plantas las abejas (Apis mellifera) recolectaron el propleo (Edreva y Kostoff, 2005). Segn GooboNeto y Lopes (2006), la sazonalidad es considerada el factor primordial para la variacin del propleo, pues la naturaleza y la cantidad de molculas activas, como los flavonoides, no son constantes durante todo el ao. Las condiciones locales de temperatura tambin afectan la maleabilidad del propleo: en las temperaturas sobre 15 C el propleo es normalmente ms maleable; inferior a 15 C el propleo tiene una consistencia ms dura. Las abejas melferas recolectan material resinoso y lo transportan hasta las colmenas dnde ellos mezclan el material recolectado a las secreciones glandulares, enzimas y cera. El produto final presenta propriedades anti-inflamatorias, imunoestimulantes, hepatoprotetoras, antimicrobianas, anti-virales, antifngicas (Grosso et al., 2007), vasodilatadores. Adems, los flavonoides presentes inhiben la peroxidacin lipdica, agregacin plaquetaria y fragilidad capilar (Havsteen, 2002). Varios estudios tambin demuestran que el propleo es una fuente natural de antioxidantes debido a su actividad contra los radicales libres. El propleo ha sido usado en la preparacin de medicamentos en varios pases del mundo (Garca et al., 2004; Chen et al., 2009). Entre los productos apcolas como miel, jalea real, polen, entre otros, el
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propleo es destacado por las actividades biolgicas comprobadas y tambin por la posibilidad de la aplicacin en las industrias farmacutica y alimenticia (Park et al., 1998). Actualmente es posible encontrar de dulces a jabones que contienen propleo. Otra clase de productos que se desarrollan a base del propleo son los protectores solares tpicos, pues las ltimas investigaciones han demostrando la accin fotoprotectora de los metabolitos secundarios de las plantas: los flavonoides. La clave para la proteccin es la concentracin de electrones deslocalizados en los anillos bencnicos de las estructuras qumicas de esas sustancias, lo que facilita el traslado de energa (Edreva & Kostoff, 2005). La radiacin ultra-violeta (UV) es un componente de la radiacin solar. Los niveles altos de radiacin UV causan dao y perjuicios a las molculas biolgicas de gran importancia, como los nucletidos, cidos nucleicos y protenas. Esas molculas absorben UVB, altamente energtica, propiciando la formacin de radicales libres. Los anillos aromticos reducen la absorcin de UVB (Edreva & Kostoff, 2005). La exposicin de la piel a la radiacin UVB puede provocar el cncer del epitelio en caso de no se utilizar los mtodos que evitan la absorcin de esa radiacin por el tejido epitelial. Este tipo del neoplasia es una de las de mayor incidencia en Brasil, con 122.400 nuevos casos en 2006, lo que corresponde al 26% del total de neoplasias malignas en el pas en ese ao (Sociedade Brasileira de Dermatologia, 2006). El uso de lociones fotoprotectoras es la forma ms aplicable para la prevencin contra el dao y perjuicios provocados por la exposicin del epitelio a UV. Las substancias fotoprotectoras son elaboradas en emulsiones del tipo aceite/agua o en geles que no provocan otros daos y perjuicios a la piel. La idea de producir una locin de proteccin solar a base de propleo acompaa la necesidad de nuevos productos para la proteccin contra la radiacin UV y sigue la tendencia mundial de producir cosmticos a partir de componentes naturales (Ferrari et al., 2007). En el presente estudio, el propleo verde del Vale do Ao, regin metropolitana del estado de Minas Gerais, Brasil, fue investigado con el objetivo de analizar sus caractersticas sensoriales y probar su accin fotoprotectora a travs de la produccin de lociones fotoprotectoras elaboradas con emulsin aceite/agua y en gel, con el propleo como sustancia activa y la evaluacin de los productos desarrollados mediante un mtodo in vitro para investigacin del factor de proteccin solar (FPS).

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MATERIALES Y MTODOS Para verificar y determinar la accin fotoprotectora del propleo verde del Vale do Ao, Minas Gerais, Brasil, se elaboraron las bases para las lociones en gel y emulsin aceite/agua. Fue utilizado el propleo producido en los colmenares de la regin durante el verano de 2007, porque segn la literatura especializada (Franco et al., 2000), es el propleo que ms contiene flavonoides entre los producidos durante las estaciones anuales. Coleccin de muestras El propleo fue recolectado de las colmenas utilizando el mtodo de raspaje. Despus de la separacin de las impurezas, las muestras fueron acondicionadas en bolsas atxicas plsticas, al resguardo de la luz y conservadas en el congelador a la temperatura de -17 C hasta el posterior anlisis. Anlisis sensorial Los anlisis sensoriales realizados, y exigidos por el Ministerio de la Agricultura de Brasil para la fijacin de identidad y calidad del propleo, fueron los siguientes: anlisis de color, sabor y consistencia a la temperatura ambiente. Debido al hecho de que los caracteres sensoriales se han estimado a travs de los rganos de los sentidos, asumen, por consiguiente, un aspecto subjetivo, propio del analista, por esta razn los resultados se expresaron dentro de las posibilidades descritas por el Ministerio de la Agricultura (para sabor: picante, suave, fuerte y amargo; para la consistencia: maleable y rgido; para el aroma: resinoso y balsmico). El anlisis sensorial del propleo fue realizado a la temperatura ambiente (25 C) a travs de la observacin de alcuotas de aproximadamente 80 g, que corresponde a un pedazo de los raspados de la colmena. As fue posible evaluar la consistencia, olor y color caractersticos del producto apcola en evidencia. Para las observaciones visuales futuras, tambin se fotografi la muestra y los archivos estn en el banco de datos generado por el presente estudio. El estudio de estabilidad Para el anlisis del comportamiento del propleo en los vehculos para los protectores solares, fueron preparadas tres formulaciones tpicas con 10% de extracto hidroalcohlico (etanol 70%) del propleo verde del Vale do Ao. Los vehculos utilizados en las
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preparaciones tpicas fueron gel natrosol (pH 5,5), gel Carbocol (pH 10) y emulsin aceite/agua (pH 6). Se analiz la estabilidad de las formulaciones por 9 meses a travs de la comprobacin mensual de pH, color, textura y homogeneidad de los productos. Preparacin de la locin fotoprotectora Despus del estudio de estabilidad, las formulaciones que fueron estables durante los anlisis se utilizaron en la preparacin de las lociones fotoprotectoras. Fueron preparadas cinco formulaciones con concentraciones diferentes del extracto hidroalcohlico del propleo verde para cada vehculo aprobado: 5%, 10%, 20%, 30% y 40% de extracto en la formulacin. El extracto de propleo verde del Vale do Ao fue preparado en etanol a 70% porque segn Valadao et al. (2007), es la mejor manera para la extraccin de flavonoides presente en el propleo y despus, concentrado en la ruta al vapor de 0,105 g de propleo por mL del extracto para 0,18 g/mL. El anlisis de FPS Se sometieron las formulaciones preparadas con el extracto de propleo verde a anlisis en el espectrofotmetro en la regin de la radiacin UVB (290-320 nm), principal responsable por los foto-daos cutneos. Lo anlisis en el espectrofotmetro son parte de la metodologa de comprobacin de FPS in vitro descrita por Sayre (1979) y utilizada por Mansur et al. (1986), por poseer buena correlacin con los resultados obtenidos en los anlisis in vivo para la misma finalidad, para los productos con filtros orgnicos, lo que se aplica a los flavonoides presentes en el propleo. Fueron preparadas diluciones sucesivas de las formulaciones en gel con el propleo en el etanol a 70% hasta la concentracin de 0,2 L de la formulacin por mL de la solucin. Estas diluciones se analizaron en lo espectrofotmetro y los resultados obtenidos fueron utilizados en la ecuacin siguiente, para el clculo de FPS.
FPS espectrofotomtrico = FC. EE ( ).I ( ). Abs( )
290 320

Donde: FC = factor de la correccin (igual a 10) determinado de acuerdo con dos lociones fotoprotectoras de FPS conocidos, de semejante manera de una locin que contiene 8% de homosalato de FPS igual a 4; EE () = efecto eritemognico de la radiacin de longitud de onda ; I() = la intensidad

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del sol en la longitud de onda y Abs ()= absorbancia de la solucin en la longitud de onda (Borghetti y Knorst, 2006). Los valores del efecto eritemognico (EE) versus la intensidad de la radiacin (I) pueden verificarse, en la Tabla I, para cada longitud de onda usada en lo anlisis y fueron obtenidos por Sayre en 1979.
Tabla 1: Relacin entre efecto eritemognico (EE) versus intensidad da radiacin (I) conforme la longitud de onda () (nm) 290 295 300 305 310 315 320 EE X I 0,0150 0,0817 0,2874 0,3278 0,1864 0,0839 0,0180

Tratamiento de datos Los resultados obtenidos en los anlisis de factor de proteccin solar de las formulaciones fueron calculados a travs de la ecuacin proporcionada por Sayre et. (1979) y demostrados por grficos hechos a travs de Microsoft Excel 2007, Microsoft Office Student 2007. RESULTADOS Durante el anlisis sensorial las muestras del propleo recolectado en el distrito municipal de Cocais das Estrelas, en la regin metropolitana del Vale do Ao presentaron aroma resinoso y balsmico, color verde, sabores amargo suave y fuerte, consistencia rgida a la temperatura ambiente y los pedazos de las muestras se presentaron heterogneos. El anlisis sensorial es importante pues el propleo verde est bien valorizado en el mercado internacional, sugiriendo que hay una relacin entre su color y su composicin qumica pues es rico en compuestos fenlicos. La consistencia a la temperatura ambiente tambin puede dar indicaciones de la relacin resina/cera presente en el propleo: la consistencia rgida puede indicar un alto nivel de resinas, lo que es deseable porque las actividades biolgicas que se verificaron para el propleo se han atribuido a sustancias contenidas en esta fraccin del propleo (Grosso et al., 2007). El aroma y el sabor del propleo indican el tiempo de produccin por las abejas. Las muestras analizadas presentaron las caractersticas sensoriales bien
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evidenciadas, lo que indica que el propleo fue producido recientemente. Todas las muestras analizadas presentaron las caractersticas sensoriales dentro de las normas establecidas por el Ministerio de la Agricultura a travs de la Instruccin Normativa N 3, del 19 de enero de 2001 que dispone sobre la fijacin de identidad y calidad del propleo. La formulacin preparada con gel carbopol para el estudio de estabilidad sufri alteraciones en el color y en la textura muy evidenciada: la formulacin se volvi gradualmente muy consistente y el color se torno ms intenso, tonndose cercano al color caramelo. El pH del medio, bsico (inicialmente igual a 10) demostr ser impropio para las formulaciones con el extracto hidroalcohlico concentrado de propleo verde. La forma farmacutica preparada con el gel natrosol mantuvo el pH inicial hasta el final del estudio de estabilidad (pH=5,5) y no present alteraciones en la consistencia del gel. Durante el estudio tampoco se observaron alteraciones en las fases: la formulacin qued homognea hasta el final del estudio. No se descubrieron otras alteraciones macroscpicas en la formulacin durante los anlisis. La formulacin en emulsin aceite/agua permaneci estable durante el estudio y tampoco present alteraciones macroscpicas como separacin de fases o cambios en la textura del producto. Las formulaciones tpicas en el gel son ventajosas para el uso en las pieles con alto tenor de oleosidad, a pesar de no poseer las caractersticas sensoriales y de extenderse satisfactoriamente sobre la piel como las emulsiones aceite/agua. Despus de seis meses de estudio de estabilidad fueron aprobadas la formulacin en gel natrosol en la formulacin en emulsin aceite/agua. La formulacin en gel carbopol, debido a las alteraciones muy pronunciadas durante el estudio, se reprob para la produccin de locin tpica fotoprotectora. Despus de la aprobacin de las bases para la locin del protector solar, fueron preparadas 8 formulaciones, 4 de cada una de las bases aceptadas: el gel natrosol y la emulsin aceite/agua. Para cada grupo de 4 formulaciones fueron preparadas 4 formulaciones diferentes: 5, 10, 20 y 40% del extracto hidroalcohlico concentrado de propleo verde del Vale do Ao. Cada producto fue condicionado en embalajes plsticos de 15 g, opacos, atxicos e identificados y hechos para la comercializacin de productos cosmticos de uso tpico.

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Tabla 2: Estudio de estabilidad de la formulacin en gel carbopol Fecha de los Alteracin del Separacin de pH anlisis color las fases 05/12/2007 10,0 14/02/2008 10,0 + 07/03/2008 10,0 + 18/04/2008 10,0 + 10/05/2008 10,0 + 26/06/2008 10,0 + - significa ausencia de alteraciones e + significa presencia de alteraciones

Alteraciones de olor + + + -

Alteraciones en la textura + + + + + +

Para el anlisis del factor de proteccin solar, se usaron las formulaciones de gel natrosol, debido a la comodidad del manejo comparado a los productos obtenidos en emulsin aceite/agua. Fueron preparadas diluciones con una concentracin de 0,2 L de formulacin de gel natrosol para un mL de la solucin final. Estas diluciones fueron sometidas al anlisis en el espectrofotmetro en las longitudes de onda UVB: 290, 295, 300, 305, 310, 315 y 320. Los valores obtenidos fueron utilizados en la ecuacin elaborada por Sayre (1979) y tambin utilizada por Mansur et al. (1986) y Borghetti & Knorst (2006) en los estudios de anlisis de FPS de formulaciones tpicas de lociones fotoprotectoras. Los valores de FPS encontrados estn presentados en La Fig. 1. A travs del estudio in vitro realizado en las formulaciones tpicas con el propleo verde del Vale do Ao, fue probada la capacidad fotoprotectora del producto apcola en asunto. Es posible verificar anteriormente en el grfico que al duplicar la concentracin del extracto de propleo verde en la formulacin, fue duplicado, tambin, el FPS del mismo.
Figura 1. FPS versus Concentracin de extracto de propleo (%).

DISCUSIN El aumento del ndice de los clorofluorcarbonos en la atmosfera ha causado efectos deletreos en la capa de ozono presente en la estratosfera y esos efectos deletreos han causado el aumento en los niveles de UVB que alcanzan la superficie de la Tierra (Xu et al., 2007). En todo el mundo se observa un aumento de incidencia de cncer de piel. En los Estados Unidos de Amrica, la incidencia y mortalidad por cncer de piel ha experimentado un crecimiento significativo en la poblacin blanca, principalmente debido a la exposicin al sol. En Chile tambin ha sido registrado el aumento en la mortalidad por el cncer de piel. Hay datos en este pas que anuncian que hay aumento en esos ndices alrededor de 62% entre 1987 y 1998 (Molgo et al., 2005). La evaluacin de la eficacia de lociones protectoras solares ha sido realizada por un periodo largo a travs de mtodos in vivo para la cuantificacin de FPS. El mtodo se basa en el eritema causado por la radiacin UVB en el tejido epitelial humano, analizado en voluntarios. Ese mtodo es eficaz para el descubrimiento de slo algunas unidades de FPS, pero con el incremento de productos con FPS 30 o ms, los valores encontrados en las pruebas para esos productos con FPS ms alto se tornaron inciertos. Por razones econmicas, prcticas y ticas, se ha estado adoptando para el anlisis de FPS de formulaciones fotoprotectoras, un mtodo in vitro seguro y que posee buena correlacin con los resultados obtenidos en los estudios in vivo (Pissavini & Ferrero, 1989). Entre las lociones fotoprotectoras estudiadas en la literatura, las que contienen productos ricos en flavonoides, como el caso del propleo, presentan valores de FPS ms altos. Por ejemplo, Racan et al. (2002) desarroll un protector solar con lquenes ricos en cido snico. Ellos encontraron un FPS 3,4 para la formulacin. Adems, hay lociones fotoprotectoras inorgnicas en el mercado con las formulaciones con FPS iguale a 5, stos normalmente se usan en reas

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dnde la piel est muy delgada, como en los labios. Racan et al. (2002) analiz la capacidad fotoprotectora del Peumus boldus y de los compuestos aromticos de lquenes chilenos que viven en las reas de incidencia alta de radiacin ultravioleta y encontr FPS mximo de 10 para las formulaciones producidas con los lquenes y FPS igual a 3,4 para la formulacin con Peumus boldus. Tabriz et al. (2003), analiz el FPS de lociones fotoprotectoras con el extracto de flor de Rosa damascena que presenta flavonoides, lo que fue confirmado en las pruebas de identificacin de los flavonoides en el estudio. Las emulsiones constituyen el mejor vehculo para las lociones fotoprotectoras pues est constituidas por componentes tanto apolares como polares y pueden vehicular as substancias fotoprotectoras de ambas polaridades. Las emulsiones aceite/agua constituyen los sistemas ms empleados y ellos garantizan proteccin apropiada con una sensacin tctil ms cmoda al usuario. Los geles son vehculos obtenidos a travs de un espesante hidroflico que pueden ser naturales (alginatos) o sintticos (copolmeros del acrilamida). Estos pueden vehicular, tambin, tanto substancias apolares como polares, pero apenas los polares proporcionan una formulacin translcida, los polares vuelven el gel opaco (Flor & Davolos, 2007). Las formulaciones con propleo, desarrolladas en el presente estudio, presentaron FPS mayores que algunas formulaciones disponibles en el mercado, como el Nivea Sun Spray, con FPS igual a 5. Las bases de las formulaciones preparadas (emulsin aceite/agua y gel natrosol) ya han sido utilizadas para fabricar frmacos tpicos, por consiguiente, su uso es comprobadamente seguro. Los productos preparados tambin demostraron ser estables por periodo largo (al menos seis meses). La bsqueda de nuevos productos naturales como protectores solares ha sido tema de varios estudios. Por ejemplo, Aquino et al. (2002) analizaron la actividad fotoprotectora del extracto de Culcitium reflexum en el que encontraron la presencia de flavonoides. Es posible producir formulaciones fotoprotectoras a un costo bajo con los productos naturales (Racan et al., 2002). CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en este estudio confirman la accin fotoprotectora del propleo verde del Vale do Ao, Minas Gerais. En este estudio tambin fue posible desarrollar formulaciones estables para la
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elaboracin de lociones fotoprotectoras a base del propleo verde. Los productos desarrollados durante la investigacin deben ser perfeccionados para que sean utilizados en los diferentes tipos de piel y para que sean alcanzados valores de FPS sobre 10. Son sugeridos estudios in vivo de las formulaciones preparadas para ser demostrada la efectividad de estas. REFERENCIAS
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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 289 - 294 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

An antibacterial sesquiterpene lactone from fresh-water alga Vaucheria sessilis


[Una lactona sesquiterpenica antibacteriana aislada del alga de agua dulce Vaucheria sessilis]
Rosa Martha PREZ GUTIRREZ Laboratorio de Investigacin de Productos Naturales. Escuela Superior de Ingeniera Qumica e Industrias Extractivas IPN. Punto fijo 16, Col. Torres Lindavista cp 07708. Mxico D.F.

Abstract
A sesquiterpene lactone 10-Hydroxy-11H-guai-12,6-olide has been isolated from hexane extract of fresh-water alga Vaucheria sessilis using bioassay-guided fractionation. Its structure was established by a combination of spectroscopic methods and chemical correlation. The sesquiterpene lactone was assayed against Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella typhi and Kiebsiella pneumoniae. Disk-diffusion and the macrodilution methods were used as assay. The isolated compound inhibits growth of B. subtilis, B. cereus, E. coli, S. aureus and S. epidermidis in vitro with at a minimun inhibitory concentration (MIC) ranging from 25 to 50 g/mL. It had no activity at 100 g/mL against other bacterial species. Keywords: Vaucheria sessilis; Sesquiterpene lactone; Antimicrobial activity.

Resumen
A partir del extracto hexnico del alga de agua dulce Vaucheria sessilis se aisl una lactona sesquiterpenica 10-Hidroxi-11H-guai-12,6-olido, por medio de un fraccionamiento bioensayo-guiado y su estructura fue establecida por una combinacin mtodos espectroscpicos y correlacin qumica. La lactona sesquiterpenica se ensayo por el mtodo de disco con Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella typhi y Kiebsiella pneumoniae. El compuesto aislado inhibe el crecimiento de B. subtilis, B. cereus, E. coli, S. aureus y S. epidermidis in vitro con una concentracin mnima inhibitoria (MIC) de 25 a 50 g/mL, pero no tuvo actividad frente a las dems especies de bacterias a 100 g/mL. Palabras Clave: Vaucheria sessilis; Sesquiterpen lactona; Actividad antimicrobial.

Recibido | Received: May, 5, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: July 1, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: July 22, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Financiacin | Funding: This work was financed by Instituto Politcnico Nacional, Mxico. This article must be cited as: Rosa Martha Prez Gutirrez. 2009. A antibacterial sesquiterpene lactone from fresh-water alga Vaucheria sessilis. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4):289 294. {EPub July 22, 2009 }.

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BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Creativa Comn-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Prez-Gutirrez

An antibacterial sesquiterpene lactone from Vaucheria sessilis

INTRODUCTION Fresh water algae comprise a vast group of photopsynthetic heterothophic organisms, which have a extraordinary potential of cultivation as energy crops (Amsler, 2007). They are able to produce a wide range of commercially interesting byproducts such as fats, oils, sugars and functionally bioactive compounds. Discovering new therapeutic molecules is becoming increasingly important as more bacteria become resistant to the commonly used antibiotics. Antibacterial effects have been noticed in all algal classes. However, a few studies have been initiated in fresh water algae (Das et al., 2005). There are approximately 87 species of genus Vaucheria of which only Vaucheriale vaucheria has phytochemical studies of carotenoids (Kleinig et al., 1967). A literature survey revealed that this alga has no reports on characterization of bioactive constituents. This paper reports identification of one antibacterial principle and their antimicrobial activity. MATERIALS AND METHODS Vaucheria sessilis (Vaucheriaceae) field samples were collected from Balsas basin in February and July 2006, from one spring, Los Manantiales, Xochimilco, Mexico state and were taxonomically authenticated in the Laboratorio de Investigacin de Ficologa de la Facultad de Ciencias UNAM and a voucher specimen of the plant is stored for reference. After collection, samples were kept in an ice chest. Upon return to the laboratory, samples were washed with distilled water and extraneous plant/animal was removed and subsequent use in the test. Preparation of extract V. sessilis samples were dried at room temperature and ground into a find powder heated to reflux temperature (Soxhlet) with 2.5 L of hexane, chloroform, methanol and water for 3 h consecutively. Solvents were removed under reduced pressure using a rotatory evaporator to constant weight. % yields obtained for hexane, chloroform, methanol and water extracts were of 5.74, 1.36, 4.1 and 1.49%, respectively.

General Experimental Procedure IR spectra were run in KBr on a Perkin Elmer 1710 Spectrophotometer. All NMR experiments were performed on a Varian 300 Hz Spectrometer. Microorganisms Staphylococcus epidermidis (ATCC 55654), Escherichia coli (ATCC 25922), Salmonella typhi (ATCC 13310) and Bacillus subtilis (NCTC 542) were obtained from our laboratories; Bacillus cereus (ATCC 17689) Vibrio cholerae (ATCC 17689) and Staphylococcus aureus (NCTC 8531) were provided by the Departamento del Hombre y su Ambiente de la Universidad Autnoma Metropolitana-Xochimilco; Kiebsiella pneumoniae (ATCC 14786) was provided by the Departamento de Microbiologa de la Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas, IPN. Evaluation of antimicrobial activity by paper disk-diffusion method Samples were dissolved in 1:10 diluted ethanol. Further dilutions were made with sterile distilled water. Paper disk-diffusion method was used for preliminary, qualitative evaluation of their antimicrobial effects (Mitscher et al., 1972). Overnight incubations of cultures of bacteria were adjusted to approx. 106 c.f.u mL according to Mc Farland turbidity standards (Orabi et al., 1991) and spread over the appropriate media (Mueller-Hinton agar for bacteria) in Petri dishes. Filter paper discs ( 5 mm) impregnated with the solutions (each disc containing 200 g of compound) was placed on the air dried surface of the media, and inoculated with respective microorganisms. Discs containing diluent were used as control; these did not show any antimicrobial activity. After overnight incubation at 37 C, zones of inhibitions around the discs were measured Evaluation of minimal inhibitory concentrations by macrodilution method Macrodilution method (Hufford et al., 1975) was used to determine minimal inhibitory concentration (MIC) values (g/mL). The same test was carried out with alcohol (1:10) control which had no effect on microorganisms. They were tested to determine the quantitative antimicrobial effects in respective broth media. Gentamicine (10 g/disc) and kanamicine (15 g/disc) were used as standard antibiotics. Results are shown in Table 2.

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An antibacterial sesquiterpene lactone from Vaucheria sessilis

Extraction and isolation Air-dried powdered algae (200 g) of V. sessilis was extracted in a Soxhlet with hexane and the solvent eliminated under reduced pressure, giving an extract (11.5 g) which was subjected to chromatography on silica gel (400 g; 50 x 7 cm column) with chloroform to produce 7 fractions (F1F-7). F3 was applied on a silica gel column and eluted by chloroform/ethyl acetate 8:2 where 5 fractions were obtained (F3-1 to F3-5). F3-4 followed by further purification on Sephadex LH-20 (80 g) with chloroform, collecting 9 fractions of 10 mL each. Fraction F34-2 was submitted to preparative silica gel thin layers chromatography (2 x 20 x 20 x 0.1 cm) with hexane/acetone/chloroform 1:6:8 v/v to give 6 fractions. F3424 to yield 60 mg of 1 (0.03% weight of the dry algae). 10-Hydroxy-11H-guai-12,6-olide (1) Oil, yellow; HRFABMS: m/z 252. 1792 [M + H]+ (calcd for C15H24O3 252. 1725; IR max (KBr) 3424 (OH), 1719 (C=O) cm-1.

H NMR (300 MHz, CDCl3): 2.20 (1H, ddd, J = 8.0, 7, 9 Hz, H-1), 1.8-2.1 (2H, m, H-2, 2), 1611.76 (2H, m, H-3 3), 2.42 (1H, m, H-4), 2.32 (1H, m, H-5), 2.89 (1H, m, H-5), 2. 4.12 (1H, dd, J = 9.5, 10.1Hz, H-6), 1.96 (1H, m, H-7), 1.46 (2H, m, H-8), 2.52 (2H, m, H-9), 2.75 (1H, dq, J = 10.9, 7.5Hz, H11), 1.07 (3H, d, J = 7.5Hz, H-13), 0.96 (3H, d, J = 7.5 Hz, H-14), 1.23 (3H, s, H-15). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): 51.3 (C-1), 27.9 (C-2), 35.6 (C-3), 36.4 (C-4), 43.6 (C-5), 78.5 (C-6), 42.6 (C-7), 25.1 (C-8), 35.7 (C-9), 74.6 (C-10), 42.4 (C-11), 179.0 (C-12), 16.5 (C-13), 15.5 (C-14), 27.2 (C-15). RESULTS AND DISCUSSION Antimicrobial activity of the crude extract, fractions, pure compound and two principal antibiotics were used in therapy. (Gentamicine and kanamicine) were detected by agar well diffusion method. Bioactivity data (zones inhibition in mm) of crude extract, fractions and antibiotics are shown in Table 1.
Zone of inhibition (mm) SEM

Table 1. Antibacterial activity of hexane extract and fractions from V. sessilis and positive controls.

Microorganisms Bacillus subtilis NCTC 542 Bacillus cereus ATCC 17689 Staphylococcus aureus NCTC 8531 Staphylococcus epidermidis ATCC 55654 Escherichia coli ATCC 25922 Vibrio cholerae ATCC 17689 Salmonella typhi ATCC 13310 Kiebsiella pneumoniae ATCC 14786

Crude extract (200 g/mL) 14 1.25

Fractions (200 g/mL) F3 F3-4 (18 0.24) ( 22 0.43) (19 1.21) (21 2.43) (10 0.19) (14 0.16) (9 1.31) (11 0.89) (10 1.26) (13 1.23)

Gentamicine (10 g/disc) 28 1.21

Kanamicine (15 g/disc) 15 0.62

F34-2 (27 1.61) 13 1.67 F3 F3-4 19 1.98 F3 F3-4 17 1.86 F3 F3-4 19 2.43 F3 F3-4 25 2.31 16 1.65

F34-2 (23 2.85) 22 0.96 24 4.23

F34-2 (17 0.14) 19 2.43 20 3.72

F34-2 (13 0.93) 23 1.32 18 2.61

F34-2 (15 0.98) 16 2.6 23 3.02 18 1.09 18 1.65 19 3.54 15 1.32

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Hexane extract of V. sessilis was subjected to column chromatography to produce antibacterial compound 1. Biological activity data (MIC) for 10Hydroxy-11H-guai-12,6-olide are given in Table 2.
Table 2. Antibacterial activity of 10-Hydroxy-11H-guai-12,6 -olide Microorganismos Bacillus subtilis Bacillus cereus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Escherichia coli Vibrio cholerae Salmonella typhi Kiebsiella pneumoniae DMSO MIC (g/mL) 50 50 25 25 50 -

Assignment of the given stereochemistry was accomplished by the NOE correlations of H-2 with H-14 and H-3 of 15 with H-3 and H-6, and H-7 with H-13 in the NOESY spectrum (Fig. 2). HMBC correlation is summarized in Fig. 3. One of methyl group was attached at C-10 from HMBC correlations observed between H-15 and C-10, C-1 could be assigned to a carbon further substituted by an oxygen function (Tan et al., 1998), indicated 10-hydroxy function (Neves et al., 1999). The second methyl group was connected to C-11 from correlation between H-13 and C-11, C-12 indicated presence of an -methyl--lactone moiety. Third methyl group was observed in the C-4 by correlation between H-3 and C-2, C-4 C-5. In conclusion, structure of compound 1 was established as 10-Hydroxy-11Hguai-12,6-olide (Fig 1).
Figure 1. Chemical structure of 10-Hydroxy-11H-guai-12,6olide (1)

Elucidation of compound 1 Structure of lactone 1 was determined by means of IR, 1H, 13C NMR spectra. Compound 1 was obtained as yellow oil. Presence of lactone was confirmed by IR bands at 1719 cm-1, tertiary-OH group was indicated by a band at 3424 cm-1 and by resistance to formation of an acetate. Its molecular formula was assigned as C15H24O3 after HRFABMS. DEPT spectra revealed that it possesses three methyl, four methylenes, and six methines. This 1HNMR spectrum shows singlet for one tertiary methyl group at H 1.23, two secondary methyl groups at 1.07 (3H, d, J = 7.5 Hz) and H 0.96 (3H, d, J = 7.5 Hz,), a double doublet (H 4.12, J = 9.5, 10.1, Hz) characteristic for a lactonic proton (H-6), indicated a guaia-12,6-olide structure with trans-anelated lactone ring (Meng et al., 2000). 13CNMR spectrum indicated presence of two oxygenated carbon atoms at C 74.6 C-OH) and C 179.0 (C=O). No olefinic carbon could be detected. Methyl doublet at a lower field according to the characteristic chemical shift and COSY correlation to H-11 at H 2.75 was readily assigned to H-13. Similarity of J11,13 to that in the related 11-methylguaianolides (Safayhi et al., 1994; Abad et al., 1994) and large coupling constant of H11 to H-7 (J = 10.9 Hz, together with a NOESY H13, H-7 correlation indicated 11-methyl configuration (Fuchino et al., 2000). Coupling patterns and magnitude of coupling constants of H-1, H-4 and H-5 to H-8 were in full agreement with the stereochemistry for H-1. The strong NOE between H15 and H-6 fully accorded with 4-Me geometry.
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H H H 3 4 2

15 H3C H 1 5 H H 6 O 10

OH H 9 8 7 H 11 H

H3C 14

12

H CH3 13

O
Figure 2. NOESY connectivities for 1

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An antibacterial sesquiterpene lactone from Vaucheria sessilis

Figure 3. 2J and 3J HMBC correlation for 1


H3 C OH

H3 C

CH3

family are peculiar in that they produced a series of xenicane lactones. Brown algae Dictyota dichotoma showed 4-acetoxydictyolactones, dictotyalide A, and B, and nordictyotalide (Midori et al., 1988). Gloeolactone, an epoxy lactone has been isolated from the blue-green alga, Gloeotrichia sp. (Stierle et al., 1998). In other study three acylhomoserine lactone have been isolated from the Korean red alga. Ahnfeltiopsis flabelliformis, these compounds were floridoside, betonicine and isethionic acid (Kim et al., 2007). A -lactone named oedogonolide was isolated from Oedogonium capillare (Perez et al., 2006). CONCLUSION

In an attempt to separate components with antibacterial properties, three fractions from hexane extract were obtained on the basis of biological activity. Under identical test conditions, extract and fraction demonstrated a greater degree of activity against Gram positive and Gram negative bacteria. The guaianolide isolated was to be active against B. subtilis, B. cereus and E. coli with same MIC value of 50 g/ml, while was active against S. aureus and S. epidermidis with a MIC of 25 g/mL showed no activity against K. pneumoniae, V. cholerae and S. typhi but had no activity at 100 g/mL against other bacterial tested. In research for antimicrobial activity of plant extracts some species have been shown to contain sesquiterpenes lactones, some of them being biologically active. Guaianolide, salograviolide A, its 9-O-acetyl and 3-O-deacetyl-9-O-acetyl derivatives from Centaurea Nicolai revealed antifungal activity (Vajs et al., 1999). Sesquiterpenoid lactones, (4H)-8-(2methylpropenoyloxy)-2-oxo-1 (5),10(14), 11 (13)guaiatrien-12,6-olide and (4H)-5-hydroxy-8-(2methylpropenoyloxy)-1 (10),11 (13)-guaiadiene12,6-olide were isolated from Peruvian Elephantopus mollis. They exhibited potent in vitro leishmanicidal activities against Leishmania major (Fuchino et al., 2001). In addition, a sesquiterpene lactone, belonging to a 12,6-olide group (guaianolide), was isolated from Achillea atrata 8hydroxy-1,4,5, 11H -guaia-l0(14) -en-12,6olide showed antibacterial and antifungal activities (Aljancic et al., 1999). Also several sesquiterpene lactones have been isolated from algae. Brown algae of the Dictyotaceae
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An activity-guided fractionation of the hexane extract of Vaucheria sessilis led to the isolation of an antibacterial sesquiterpene lactone, 10-Hydroxy11H-guai-12,6-olide, which exhibits inhibitory activity against Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis.. REFERENCES
Abad MJ, Bermejo P, Valverde S, Villar A. 1994. Antiinflammatory activity of hydroxyachillin a sesquiterpene lactone from Tanacetum microphyllum. Planta Med 60:228-231. Aljancic I, Vajs V, Menkovic N, Karadzic I, Juranic N, Milosavljevic S, Macura S. 1999. Flavones and sesquiterpene lactones from Achillea atrata subsp. multifida: antimicrobial activity. J Nat Prod 62:909911. Amsler CD. 2007. Algal chemical ecology. Springer Das BK, Pradham J, Pattnaik P, Samantoray BR, Samai SK. 2005. Production of antibacteriales from the fresh water alga Euglena viridis (Ehren). World J Microbiol Biotech 21:45-50. Das S, Chakrabarti J, Ghosh Z, Sahoo S, Mallick B. 2005 A new measure to study phylogenetic relations in the brown algal order Ectocarpales: the "codon impact parameter". J Biosci 30:699-709. Fuchino H, Koide T, Takahashr M, Sekita S, Satakel M. 2001. New sesquiterpene lactones from Elephantopus mollis and their leishmanicidal activities. Planta Med 67:647-653. Hufford CD, Funderbuck MJ, Morgan JM, Robertson LW. 1975. Two antimicrobial alkaloids from hertwood of L. tulifera. J Pharm Sci 4:789-792. Kim JS, Kim KH, Seo YW, Sunghoon S. 2007. Quorum sensing inhibitors from the red alga, Ahnfeltiopsis flabelliformis. Biotech Bioprocess Engin 12:308-311.

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An antibacterial sesquiterpene lactone from Vaucheria sessilis

Kleinig H, Egger K. 1967. Carotenoids of Vaucheriale vaucheria adBotrydium (Xanthophyceae). Z Naturforsch 22:868-872. Meng JC, Zhu QX, Tan RX. 2000. New antimicrobial Monoand sesquiterpenes from Soroseris hookeriana subsp. Erysimoides. Planta Med 66:541-544. Midori O I, Kusumi T, Kakisawa H. 1988. Antitumor xenicane and norxenicane lactones from the brown alga Dictyota dichotoma. J Org Chem 53:5010-5013. Mitcher LA, Leu RP, Bathala MS, Wu WN, Beal J. 1972. Antimicrobial agents from higher plants 1. Introduction, rationale and methodology. Lloydia 35:157-166. Neves M, Morais R, Gafner S, Stoeckli-Evans H, Hostettmann K. 1999. New sesquiterpene lactones from the Portuguese liverwort Targionia lorbeeriana. Phytochemistry 50:967-972. Orabi KY, Mossa JS, El-feraly FS. 1991. Isolation and characterization of two antimicrobial agents

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 295 - 300 BLACPMA ISSN 0717 7917 Artculo Original | Original Article

Composition and antibacterial activity of essential oil of Lippia graveolens H.B.K. (Verbenaceae)
[Composicin y actividad antibacteriana del aceite esencial de Lippia graveolens H.B.K. (Verbenaceae)]
Tzasna HERNNDEZ1, Margarita CANALES1, Jos Guillermo AVILA1, Ana Maria GARCA1, Samuel MERAZ1, Javier CABALLERO2, Rafael LIRA3 Laboratorio de Fitoqumica, 3Laboratorio de Recursos Naturales, UBIPRO, Facultad de Estudios Superiores-Iztacala, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Tlalnepantla 54090, Edo. de Mexico, Mxico. 2 Jardn Botnico Exterior, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, Coyoacn 04510, D. F., Mxico
1

Abstract
The essential oil of the aerial parts of Lippia graveolens H.B.K. (Verbenaceae) was examined by GC and GC-MS. Nine constituents were identified. Carvacrol, -terpinyl acetate, m-cymene, thymol and -pinene were found to be the major components. The oil exhibited antibacterial activity against Grampositive (Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Sarcina lutea) and Gram-negative bacteria (Shigella boydii, Vibrio cholerae No-01, Vibrio cholerae (clinical strain), Vibrio cholerae (isolated from water), Vibrio cholerae Tor, Escherichia coli, Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes; Yersinia enterocolitica, Salmonella typhi). Keywords: Antibacterial activity; Essential oil; Gastrointestinal diseases; Lippia graveolens.

Resumen
El aceite esencial de la parte area de Lippia graveolens H.B.K. (Verbenaceae) fue analizado por GC y GC-MS. Se determinaron 9 componentes de los cuales carvacrol, -terpinil acetato, m-cimeno, timol y -pineno fueron los compuestos mayoritarios. El aceite esencial exhibi actividad antibacteriana en bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Sarcina lutea) y Gram negativas (Shigella boydii, Vibrio cholerae No-01, Vibrio cholerae (aislado de un caso clnico), Vibrio cholerae (aislada de agua contaminada), Vibrio cholerae Tor, Escherichia coli, Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes; Yersinia enterocolitica, Salmonella typhi). Palabras Clave: Actividad antibacteriana; Aceite esencial; Enfermedades gastrointestinales; Lippia graveolens.

Recibido | Received: May 4, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: July 2, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: July 22, 2009 Declaracin de intereses | Declaration of interests: authors have no competing interests. Todos los autores contribuyeron de igual manera en el manuscrito. Financiacin | Funding: This work was financed by the Mexican Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, through grant CONACyT 400389G35-450 and UNAM PAPCA 20072008 This article must be cited as: Tzasna Hernndez, Margarita Canales, Jos Guillermo Avila, Ana Maria Garca, Samuel Meraz, Javier Caballero, Rafael Lira. 2009. Composition and antibacterial activity of essential oil of Lippia graveolens H.B.K. (Verbenaceae). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4):295 300. {EPub July 22, 2009}.

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BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los trminos de una licencia Atribucin Creativa Comn-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor. Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Hernndez et al.

Antibacterial activity of Lippia graveolens

INTRODUCTION Since ancient times traditional Mexican medicine has used a wide variety of plants to treat gastrointestinal and respiratory disorders which are particularly prevalent in rural areas of the country. The information obtained from oral and written means is a good option to preserve and improve human health in geographically and culturally isolated communities (Argueta & Cano, 1994; McGaw et al., 2000; Canales et al., 2005, 2006; Hernandez et al., 2005). Lippia graveolens is a shrub found in America (Rzedowski, 1978). Several species of the genus Lippia are used in folk medicine mainly in dermatological, gastrointestinal and respiratory affections (Argueta & Cano, 1994; Pascual et al., 2001). A previous ethnobotanical study in Zapotitln de las Salinas, Puebla, (Mxico) showed that the local people use infusions of the aerial part of 44 different plant species to treat gastrointestinal and respiratory illnesses (mainly produced by Gram negative and Gram positive bacteria respectively). L. graveolens was recognized as being the most important species used (Hernandez et al., 2003). There are some publications about the chemical composition of the essential oil of L. graveolens (Compadre et al., 1987; Dominguez et al., 1989; Vernin et al., 2001; Salgueiro et al., 2003; Hernandez et al., 2008). However, only few pharmacological studies have been made. The aim of this work was to investigate essential oil composition of L. graveolens and its antibacterial activity. MATERIALS AND METHODS Plant material Aerial parts of L. graveolens were collected in July 2001 in Zapotitln de las Salinas, Puebla. Voucher specimens were deposited in the National Herbarium of Mexico (MEXU) at the Universidad Nacional Autnoma de Mexico, and the herbarium IZTA at the Facultad de Estudios Superiores Iztacala (Voucher n 26474). Chemical analysis of essential oil The essential oil was obtained by steam distillation (1 kg of fresh plant) during 4 h in a Cleavenger-type apparatus. The essential oil was analyzed in a Hewlett Packard 5890-II gas
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chromatograph equipped with a DB WAX column (30 m x 0.32 mm). The temperature of the column was programmed from 80 C to 220 C at 8 C/min. The injector and detector temperatures were 225 C. The gas carrier was He, at a flow rate of 1 mL/min. Peak areas were measured by electronic integration. The relative amount of the individual components was based on the peak areas. GC-MS analysis was performed on a Jeol AX50HA using a 30 m x 0.32 mm capillary column. The temperature of the column and the injector were the same as those from GC. Mass spectra were recorded at 70 eV. The oil components were identified by comparison of their retention indices and mass spectra with the NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library. Antibacterial assay Fourteen strains of bacteria were used: Vibrio cholerae INDRE 206 (isolated from polluted water), Vibrio cholerae (clinical strain pertaining to 01 group, Inaba serotype, El Tor biotype, and enterotoxin producer), Vibrio cholerae CDC V 12, Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter agglomerans ATCC 27155, Salmonella typhi ATCC 19430, Shigella boydii ATCC 8700 and Staphylococcus aureus ATCC 12398. All the strains tested were maintained in Mueller Hinton Agar and were subcultured every month. Enterobacter aerogenes (cephalosporin and ampicillin resistant), Vibrio cholerae No-01 (ampicillin resistant), Staphylococcus epidermidis (ampicillin, cephotaxim and dicloxacillin resistant), Sarcina lutea (cephotaxim and dicloxacillin resistant) and Bacillus subtilis (cephalothin, penicillin, cephotaxim and dicloxacillin resistant) were donated by the Laboratory of Microbiology of FES-Cuautitln, Yersinia enterocolitica (ampicillin resistant) was donated by the Clinical Analysis Laboratory of the University Hospital UNAM Campus Iztacala. These strains were maintained in Mueller Hinton agar (Bioxon), submitted to sensitivity tests (multidiscs Bigaux) and were subcultured every month. The antibacterial activity was measured by the disc-diffusion method (Van der Berghe & Vlietinck, 1991). The microorganisms were grown overnight at 37 C in 10 ml of Mueller Hinton Broth (Bioxon). The cultures were adjusted with sterile saline solution to obtain turbidity comparable to that of McFarland no. 0.5 standard (Lennette et al., 1987). Petri dishes containing Mueller Hinton agar (Bioxon) were inoculated with these microbial suspensions. Discs of

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Antibacterial activity of Lippia graveolens

filter paper (Whatman no. 5) of 5 mm diameter were impregnated with 5 L of the essential oil and placed on the agar surface. Discs with 25 g (5 L) of chloramphenicol (5 mg/mL Sophia Labs, Mexico) were used as positive controls. The plates were incubated overnight at 37 C and the diameter of any resulting zones of inhibition (mm) of growth was measured. Each experiment was repeated three times. The estimation of the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bactericidal Concentration (MBC) were carried out by the broth dilution method (Van der Berghe & Vlietinck, 1991). Dilutions of essential oil from 2000-7 g/mL were used (essential oil was diluted directly into the broth). Test bacteria culture was used at the concentration of 105 CFU/mL. MIC values were taken as the lowest essential oil concentration that prevents visible bacterial growth after 24 h of incubation at 37 C, and MBC as the lowest concentration that completely inhibited bacterial growth. Chloramphenicol was used as reference and appropriate controls with no essential oil were used. Each experiment was repeated three times. The bactericidal kinetic assay was performed by using appropriate concentrations of essential oil (corresponding to MIC, MIC and MBC), in accordance with the method described by Avila et al., 1999 (Avila et al., 1999). RESULTS The physicochemical data of the essential oil were as follows: d25 = 0.93 g/mL, and 1.15% v/w of oil from fresh weight were obtained. As shown in Table 1, nine compounds of the essential oil of L. graveolens were identified by GC/MS analysis representing 94.58%. The main compounds with concentrations higher than 2% as percentage peak area were the monoterpenes: carvacrol (37.84%), -terpinyl acetate (22.35%), mcymene (20.42%), thymol (6.72%), -pinene (2.54%), and the sesquiterpene: isocaryophyllene (2.18%). All the strains tested were sensitive to the essential oil. Gram-negative bacteria exhibited the biggest inhibition zones. The results obtained in the evaluation of the antibacterial activity of the essential oil of L. graveolens are shown in Table 2.

Table 1. Composition of essential oil of L. graveolens. Compounds -Thujene -Pinene m-Cymene -Terpinyl acetate Linalool Carvacrol Thymol Isocaryophyllene Humulene RT 4.51 6.13 7.30 8.16 8.79 13.98 15.05 15.96 16.60 % 1.03 2.54 20.42 22.35 0.26 37.84 6.72 2.18 1.24

Total 94.58 Compounds are listed in order of their elution from a DB WAX column.

Figs. 1 and 2 show the effect of the essential oil (in the survival curve) on a Gram-positive bacterium (S. aureus) and a Gram-negative bacterium (V. cholerae isolated of a clinical strain). Minimum inhibitory concentrations (MIC) had a bacteriostatic effect on the bacterial population of S. aureus and V. cholerae, while the minimum bactericidal concentrations (MBC) had a lethal effect on bacteria within the first eight hours. DISCUSSION The essential oil of L. graveolens (Table 1) is constituted mainly by monoterpenes. The major components are: carvacrol (37.84%), -terpinyl acetate (22.35%), m-cymene (20.42%), thymol (6.72%), and -pinene (2.54%). Differences in the yield, components and concentrations compared to those previously reported in the literature for L. graveolens collected in other geographic areas could be attributed to some factors such as climate, time of collection, mode of extraction, etc. (Compadre et al., 1987; Dominguez et al., 1989; Vernin et al., 2001; Cimanga et al., 2002; Salgueiro et al., 2003). The essential oil of L. graveolens presented antibacterial activity against the tested strains (Table 2), showing the biggest inhibition zones in the four strains of V. cholerae, S. typhi and Y. enterocolitica (these strains commonly cause gastrointestinal disease).

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Antibacterial activity of Lippia graveolens

Table 2. Antibacterial activity of the essential oil of L. graveolens. Inhibition zone (mm) Microorganism Sa Se Sl Bs Sb St Ye Eag Vch Indre Vch No 01 Vch Tor Vch cc Eae Chloramphenicol 25g 18.67 0.58 19.67 2.08 22.67 0.58 25.00 1.00 25.00 1.00 27.00 1.00 15.67 0.58 25.33 0.58 24.33 0.58 24.33 0.58 22.67 1.53 19.33 0.58 24.00 1.00 Essential oil 23.00 0.05 24.67 0.58 23.67 0.58 28.67 3.00 25.00 0.50 30.00 0.55 30.00 0.50 25.00 0.50 30.00 0.50 30.00 0.50 30.00 0.50 30.00 0.50 21.00 2.65 Essential oil MIC (g/mL) 125 62 7 125 7 125 31 125 62 62 62 62 125 MBC (g/mL) 250 125 15 250 15 250 62 250 125 125 125 125 250

Ec 125 250 18.33 1.15 20.33 1.15 Sa, Staphylococcus aureus; Se, Staphylococcus epidermidis; Sl, Sarcina lutea; Bs, Bacillus subtilis; Sb, Shigella boydii; St, Salmonella typhi; Ye, Yersinia enterocolitica; Eag, Enterobacter agglomerans; Vch Indre, Vibrio cholerae (isolated from water); Vch No-01, Vibrio cholerae No-01; Vch Tor, Vibrio cholerae CDC V12; Vch cc, Vibrio cholerae (clinical strain); Eae, Enterobacter aerogenes; Ec, Escherichia coli. Chloramphenicol was a positive control Figure 1. Survival curve of S. aureus exposed to essential oil of L. graveolens. Figure 2. Survival curve of V. cholerae isolated of a clinical sample exposed to essential oil of L. graveolens.

12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35
Time of exposition (h)

12

Log surviving number (CFU/ml)

Log surviving numbe (CFU/ml)

Control 1/2 MIC MIC MBC

10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35

Control 1/2 MIC MIC MBC

Time of exposition (h)

The essential oil was added to each experimental culture in zero time. The concentrations used for S. aureus were: 62 g/ml ( MIC), 125 g/mL (MIC)) and 250 g/mL (MBC), the control tube did not contain essential oil.

The essential oil was added to each experimental culture in zero time. The concentrations used for V. cholerae isolated of a clinical sample were: 31 g/mL ( MIC), 62 g/mL (MIC)) and 125 g/mL (MBC), the control tube did not contain essential oil.

It was observed that S. lutea and S. boydii presented the lowest values of MIC and MBC. The strains which presented the biggest inhibition zones
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(diffusion method) are not always the most sensitive (values of MIC and MBC were lower) because the size of the inhibition zone does not reflect the

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Antibacterial activity of Lippia graveolens

antibacterial effectiveness of a compound, since it is affected by the solubility of the oil, the diffusion range in the agar, the evaporation (it can affect the dose), etc. (Kim et al., 1995; Cimanga et al., 2002). L. graveolens has been used traditionally to treat various gastrointestinal and respiratory ailments, which may be either Gram negative or Gram positive bacteria, the survivals curves were performed on a gastrointestinal (V. cholerae isolated of a clinical strain) and a respiratory (S. aureus) common pathogens. Comparison of the survivals curves for the organisms studied showed that the effect of the essential oil on the bacterial population of S. aureus and V. cholerae (Figs. 1 and 2) was bacteriostatic at MIC dose, but a bactericidal effect is observed at MBC dose within the first eight hours. This confirms the use of L. graveolens to treat Gram negative and Gram positive gastrointestinal and respiratory ailments respectively. The results suggest that the antibacterial activity showed by the essential oil can be attributed, to a considerable degree, to the existence mostly of carvacrol (37.84%), -terpinyl acetate (22.35%), thymol (6.72%), and -pinene (2.54%)), which appears to possess similar activities against all of the tested microorganisms. Essential oils rich in phenolic compounds such as carvacrol, thymol, etc. are reported to possess high levels of antimicrobial activity (Knobloch et al., 1985; Juven et al., 1994; Harborne et al., 1995; Kim et al., 1995; Cimanga et al., 2002). In general, the essential oils in bacteria produce membrane damage. In bacteria, the permeabilization of the membranes is associated with loss of ions and reduction of membrane potential, collapse of the proton pump and depletion of the ATP pool (Knobloch et al., 1985; Helander et al., 1998). The essential oils can coagulate the cytoplasm (Ultee et al., 2002). Damage on the cell wall and membrane can lead to the leakage of macromolecules and to lysis (Juven et al., 1994). CONCLUSION The present study tends to validate the use in the folk medicine of L. graveolens in gastrointestinal and respiratory diseases. ACKNOWLEDGEMENTS This research could not have been done without the cooperation of many people in Zapotitlan de las Salinas, Puebla. The authors are grateful to Roberto
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Garcilazo, Martin Paredes and Dr. Edith Lpez Villafranco for their technical assistance. To Javier Prez and Luis Velasco for their support on gas-mass measurement. REFERENCES
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Antibacterial activity of Lippia graveolens

Hernndez T, Canales M, Avila JG, Garca AM, Meraz S, Duran A. 2008. Antifungal activity of the essential oils of two Verbenaceae: Lantana achyranthifolia Desf. And Lippia graveolens H.B.K. of Zapotitln de las Salinas, Puebla (Mxico). Bol Latinoamer Caribe Plant Med Aromat 7(4):203-207. Juven BJ, Kanner J, Schved F, Weisslowicz H. 1994. Factors that interact with the antibacterial action of thyme essential oil and its active constituents. J Applied Bacteriol 76:626-631. Kim J, Marshall MR, Wei C. 1995. Antibacterial activity of some essential oil components against five foodborne pathogens. J Agric Food Chem 43:28392845. Knobloch L, Weigand H, Weis N, Schwarn HM, Vigenschow H. 1985. Action of terpenoids on energy metabolism. In: Progress in Essential Oil Research. USA, Eds.: Ernst-Joachim Brunke Editor, Walter de Gruyter. pp 429-448. Lennette HE, Balows A, Hausler JW, Shadomy HJ. Manual de microbiologa clnica. 4 edicin. Argentina. Mdica Panamericana, 1987. pp. 336-352, 358-382, 1192, 1200-1245. McGaw LJ, Jager AC, van Staden J. 2000. Antibacterial, anthelmintic and antiamoebic activity in South

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 301 - 304 BLACPMA ISSN 0717 7917 Comunicacin | Communication

Composicin qumica y actividad antibacteriana del aceite esencial de hojas de Piper lanceaefolium, planta usada tradicionalmente en Colombia*
[Chemical composition and antibacterial activity of the essential oil from the leaves of Piper lanceaefolium a plant traditionally used in Colombia]
Nayive PINO BENTEZ1, Erika MELENDEZ1, Elena E. STASHENKO2
2 1 Universidad Tecnolgica del Choc, Bloque 6, Laboratorio 316, Grupo Productos Naturales, Quibd- Choc Colombia. Centro Nacional de Investigaciones para la Agroindustrializacin de Especies Vegetales Aromticas y Medicinales Tropicales (CENIVAM), Universidad Industrial de Santander, Colombia.

Abstract
The essential oil from the leaves of Piper lanceaefolium Kunth, collected of the department of Choc, in the north-western Colombia, and identified by botanists from Herbarium National Colombian COL (voucher No. 519969), This plant is called frequently cordoncillo and desinchadora (for anti-inflammatory action). The essential oil obtained by microwave-assisted hydrodistillation (MWHD), was investigated by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). A total of 43 constituents, representing 97.4% of the oil were identified. The main compound was trans--cariofileno (11.6%), followed germacreno D (10.7%), -selineno (7.8%), -pineno (5.4%), -selineno (4.8%) y -cubebeno (4.3%). P. lanceaefolium was effective against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis.
Keywords: Essential oil; Piper lanceaefolium; Analysis chromatographic; trans-- caryophyllene; Antibacterial activity.

Resumen
El aceite esencial de hojas de Piper lanceaefolium Kunth, recolectada en el departamento del Choc, nor-occidente de Colombia e identificado por botnicos en el herbario nacional colombiano COL (testigo No. 519969). Esta planta se conoce con el nombre de cordoncillo y desinchadora (por su accin desinflamante). El aceite esencial fue obtenido por hidrodestilacin asistida por la radiacin de microondas (MWHD) y analizados por cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GC-MS). Se identificaron 43 constituyentes representados en 97.4%, el componente mayoritario fue trans--cariofileno (11,6%), seguido de germacreno D (10,7%), selineno (7,8%), -pineno (5,4%), -selineno (4,8%) y -cubebeno (4,3%). P. lanceaefolium fue efectiva contra Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis.
Palabras Clave: Aceite esencial; Piper lanceaefolium; Actividad antibacteriana; Anlisis cromatogrfico, trans--cariofileno.
Recibido | Received: March 1, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 7, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: July 10, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding: This work was financed by COLCIENCIAS (RC-432)-CENIVAM-UTCH This article must be cited as: Nayive Pino Bentez1, Erika Melendez1, Elena E. Stashenko. 2009. Composicin qumica y actividad antibacteriana del aceite esencial de hojas de Piper lanceaefolium, planta usada tradicionalmente en Colombia. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4) :301 304. {EPub July 22, 2009}.

*Contacto | Contact: e-mail: nayivepino@yahoo.com, Tel. 57- 3104559617, Fax. 57 -46712492

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Trabajo presentado en el 1er. Congreso Internacional de Farmacobotnica. Enero de 2009, Chilln, Chile.

Pino Bentez et al.

Composicin qumica y actividad antibacteriana del aceite esencial de hojas de Piper lanceaefolium

INTRODUCCIN Actualmente, los productos naturales gozan de amplia aceptacin y reemplazan, cada vez ms, los productos sintticos o materiales generados artificialmente. Como respuesta a esta tendencia, los aceites esenciales son uno de los principales productos naturales usados en un amplio rango de materiales comerciales y de consumo masivo. As, pueden ser citados en la industria de esencias, especias, frmacos y como aditivos en productos de limpieza e higiene, pinturas y pesticidas, entre otros (Haagen-Smith 1972 y Bandoni 2000). Los aceites esenciales o esencias, se definen como mezclas de muy variados compuestos provenientes, en su gran mayora, del metabolismo de organismos vegetales. Los terpenos suelen ser los compuestos representativos de los que constituyen un aceite esencial. Adems, pueden encontrase hidrocarburos no terpnicos, aldehdos, steres, alcoholes, fenoles y, con poca frecuencia, cidos carboxlicos, lactonas, compuestos nitrogenados y sulfurados (Haagen-Smith, 1972). Qumicamente los constituyentes ms comunes del gnero Piper son las amidas, lignanos, neolignanos y sus precursores (Sengupta & Ray 1987). MATERIALES Y MTODOS rea de estudio, recoleccin y procesamiento del material vegetal La especie fue recolectada en el departamento del Choc, nor-occidente de Colombia e identificado por botnicos en el herbario nacional colombiano COL (voucher No- 519969). Esta planta se conoce con el nombre de pegahueso y desinchadora (por su accin desinflamante). La extraccin del aceite esencial se realiz por hidrodestilacin asistida por la radiacin de microondas (MWHD) como lo describe Stashenko et al. (2004), empleando un equipo de destilacin tipo Clevenger con reservorio de destilacin Dean-Stark y adaptacin para calentamiento por radiacin de microondas, a travs de un horno de microonda convencional LG, modelo MS-1242 ZK, con una potencia de salida de 800 vatios y frecuencia de radiacin de 2,5 GHz. Se emple cromatografo Agilent Technologies 6890 plus Series GC System, columna capilar de slice fundida DB-5MS (J & W Scientific Folsom, CA, EE.UU.) de 60 m 0.25 mm, D.I. 0.25 m, df; con fase estacionaria de 5% fenilpoli(metilsiloxano). El gas de arrastre helio (AGAwww.blacpma.org

Fano, 99,999%) con presin de entrada en la cabeza de columna de 16,47 psi y velocidad de flujo de 1 mL/min. La temperatura de la lnea de transferencia permaneci a 280 C y la cmara de ionizacin del detector selectivo de masas Agilent 5973 Network permaneci a 230 C. El detector oper a (70 eV) y el analizador cuadrupolar registr las seales mediante el mtodo full scan, en el rango de masas 40-350 (m/z). La identificacin de los compuestos mediante el clculo de los ndices de Kovts (Ik) a partir de una serie homloga de hidrocarburos (C10-C25), y por comparacin de los espectros de masas con los de libreras del software MSD Chemstation de Agilent (NIST02, Adams, Wiley7n). Cepas de microorganismos La actividad antibacteriana fue determinada por el mtodo de Dilucin en agar descrito por Mitcher et al. (1971). Se usaron cepas de inters clnico humano Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Bacillus subtillis ATCC 6633, Klebsiella pneumoniae ATCC 70063, Pseudomona aeruginosa ATCC 13076, Salmonella tiphy CMDMUJ 045. Como control positivo se utiliz sulfato de estreptomicina 10 g/mL y como control negativo agar Mueller Hinton. Las pruebas se realizaron en tres tratamientos por triplicado cada uno para cada extracto probado, con lecturas a 24 horas. RESULTADOS Y DISCUSIN El aceite esencial de la especie P. lanceaefolium se caracteriza por presentar alto contenido de sesquiterpenos (71,7%), esta composicin fue representada por hidrocarburos sesquiterpenicos (58,5%) y sus derivados oxigenados (13,2%); los componentes mayoritarios fueron trans--cariofileno (11,6%) y germacreno D (10,7%), seguidos por selineno (7,8%), -pineno (5,4%), -selineno (4,8%) y -cubebeno (4,3%); la distribucin de las principales familias de compuestos en el aceite esencial de P. lanceaefolium se muestran en la Fig. 1. En la Tabla 1 se muestran los resultados antibacterianos, donde se observa actividad en 2 de las 6 cepas probadas (Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis). La composicin qumica del aceite esencial de la especie P. lanceaefolium presenta altos contenidos de hidrocarburos sesquiterpnicos (-cariofileno y el germacreno D) tanto el recolectado en Colombia (58,0%), como el recolectado en Costa Rica (42,8%), pero en el aceite esencial de este ltimo, existe una

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Pino Bentez et al.

Composicin qumica y actividad antibacteriana del aceite esencial de hojas de Piper lanceaefolium

marcada diferencia en cuanto a la presencia de contenidos considerables de fenilpropanoides (36,3%) elemicino (16,4 %), parsley y apiol (9,8 %), de acuerdo con lo descrito por Mundina et al. (2001), que no fueron encontrados en el aceite esencial recolectado en Colombia. Segn este mismo autor la especie P. lanceaefolium presenta polimorfismo qumico, lo que se corrobora con este estudio. Varios estudios han revelado principalmente la presencia de monoterpenos, sesquiterpenos y arilpropanoides que muestran

interesantes propiedades biolgicas (Martins et al., 1998; Moreira et al., 1998). Muchas Piperaceae son usadas en la medicina tradicional en el tratamiento de diversas enfermedades incluida las infecciosas (Keller y Klohs, 1963, Atal et al., 1975, Garca- Barriga, 1992, Prez, 1996, Otero et al., 2000, Pino-Bentez & Valois, 2004, Pino-Bentez et al., 2005). En este estudio el aceite esencial extrado de P. lanceaefolium que crece en Colombia presenta actividad frente a Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis.

Tabla 1. Actividad antibacteriana del aceite esencial de P. lanceaefolium P. lanceaefolium Conc. 20 mg/mL Estreptomicina sulfato Agar Meller Hinton +: -: S. aureus + + E. coli + K. pneumoniae + B. subtilis + P. aeruginosa + + Salmonella tiphy + -

Hay sensibilidad o sea que el crecimiento bacteriano es afectado en su totalidad Hay resistencia o sea que el crecimiento bacteriano no es afectado en su totalidad.

Control +: Streptomicina 10 ug/mL Control -: Agar Mueller Hinton.

Figura 1: Distribucin de principales familias de compuestos en aceite esencial de P. lanceaefolium.


58,5

60

50

Cantidad Relativa,%

40

30

20
13,2 10,8

13,9

10
1

0 Hidrocarburos Monoterpnicos Monoterpenos Oxigenados Hidrocarburos Sesquiterpnicos Sesquiterpenos Oxigenados Otros

Tipo de Compuestos

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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas Vol. 8 (4) 2009 | 303

Pino Bentez et al.

Composicin qumica y actividad antibacteriana del aceite esencial de hojas de Piper lanceaefolium

CONCLUSIN La composicin del aceite esencial est sujeta, principalmente, al tipo de planta, mtodo de extraccin y variables como condiciones geobotnicas, tipo de suelo, poca de recoleccin y edad de la planta, los cuales pueden afectar la concentracin de los compuestos que constituyen al aceite esencial tal como se ha venido considerando. REFERENCIAS
Atal CK, Dhar KL & Singh J. 1975. The chemistry of Indian Piper species. Lloydia 38:256-264. Bandoni A. (Ed.) 2000. Los recursos vegetales aromticos en Latinoamrica, su aprovechamiento industrial para la produccin de aromas y sabores Ed. I Editorial de la Universidad Nacional de la Plata, Buenos Aires pp. 410. Garca-Barriga H. 1992. Flora Medicinal de Colombia, Botnica Mdica. Tomo I Ed. II, Ediciones Tercer Mundo, Santaf de Bogot, pp. 221-222. Haagen-Smith A. J. 1972.The chemistry, origin and function of the essential oil in plant life, pp 17-28, In Guenther E. The essential oils Vol I, Krieger Publishing Company Malabar, Florida. Keller F. & Klohs M.W. 1963. A review of the chemistry and pharmacology of the constituents of Piper methysticum. Lloydia 26:1-15. Martins AP, Salgueiro L, Vila R, Tomi F, Caigueral S, Casanova J, Proenca A and Adzet T. 1998. Essential oils from four Piper species. Phytochemistry 49(7): 2019-2023.

Mitscher L A, Leu R. P, Bathala M.S., Wu WN, Beal J.L. 1971. Antibiotic agents from higer plants, I Introduction rationale and methodology. Lloydia 35 (2):157-166. Moreira D.I., Guimaraes E.F., Kaplan M.A. 1998. Essential oil analysis of two Piper species (Piperaceae). An Acad Bras Ci 70(4):751-754. Mundina M., Vila R., Tomi F., Toms X., Cicci J. F., Adzet T, Casanova J and Caigueral S. 2001. Composition and chemical polymorphism of the essential oils from Piper lanceaefolium. Bioch System Ecol 29:739-748. Otero P.R., Fonnegra R. & Jimnez S.L. 2000. Plantas utilizadas contra mordeduras de serpientes en Antioquia y Choc, Colombia. Ed. I, Grandacolor, Medelln, Colombia, pp. 78-299 Prez A. E. 1996. Plantas tiles de Colombia. Quinta edicin (Edicin del centenario) Ed. V, Ediciones Fondo FEN Colombia, DAMA Jardn Botnico Jos Celestino Mutis, Bogot , pp. 752. Pino Bentez N, Yurgaky T y Cuesta J. 2005. Aspectos botnicos y qumica preeliminar de de seis especies del gnero Piper usadas como medicinales en el Municipio de Quibd-Choc. Rev Inst UTCH 23:20-25. Pino-Bentez N and Valois H. 2004. Ethnobotany of four black communities of the municipality of Quibd, Choc - Colombia. Lyonia 7(2):59-68. Sengupta S & Ray AB. 1987. The chemistry of Piper species: A review. Fitoterapia 58:147-166. Stashenko EE, Jaramillo BE, and Martinez JR. 2004. Comparison of different extraction methods for the analysis of volatile secondary metabolites of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, grown in Colombia, and evaluation of its in vitro antioxidant activity. J Chromatogr 1025:93-103.

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Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas Vol. 8 (4) 2009 | 304

2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 305 - 307 BLACPMA ISSN 0717 7917 Comunicacin | Communication

Presencia de salvado de cereal en "organos" comercializados en la ciudad de Buenos Aires (Argentina)*


[Presence of cereal bran in organos commercialized in Buenos Aires city (Argentina)]
Beatriz G. VARELA, Mariela J. GANOPOL, Priscila BOSCO, Lorena AGOSTINELLI, Alberto A. GURNI Ctedra de Farmacobotnica, Facultad de Farmacia y Bioqumica (UBA), Junn 956 4 Piso, 1113, Buenos Aires, Argentina.

Abstract
The genus Origanum L. (Lamiaceae) comprises several species, subspecies and hybrids whose leaves and aerial flowery parts are used. A ten per cent of strange material is admitted by Argentinean Food Codex. The quality control of commercial oreganos showed the presence of colored cereal bran in the samples and in a great percentage. In this study, six Origanum samples commercialized in Buenos Aires city were analyzed. Representative and 10% equivalent portions of the samples were processed. The components were separated under a magnifying glass, were weight and the elements percentages were calculated. In four samples, cereal bran was found and was identified as wheat bran. The bran percentages found were high respect of those of the leaves, bracts and flowers. These data suggest an appreciable decrease in the used plant parts and the addition of an improper element to the drug, whence the commercialized product quality may be affected.
Keywords: Organo; Origanum spp; Bran; Quality control.

Resumen
El gnero Origanum L. (Lamiaceae) comprende varias especies, subespecies e hbridos cuyas partes usadas son las hojas y las sumidades floridas. El Cdigo Alimentario Argentino admite diez por ciento de material extrao. El control de calidad realizado en organos comerciales revel la presencia de salvado de cereal coloreado en varias muestras, en porcentajes considerables. En este trabajo se analizaron seis muestras de organo comercializadas en la ciudad de Buenos Aires. Se tomaron porciones equivalentes al 10% del contenido neto, se separaron los componentes bajo lupa, se pesaron y se calcularon los porcentajes de los elementos separados. Cuatro muestras presentaron salvado de cereal que se identific como salvado de trigo. Los porcentajes de salvado hallados fueron altos con respecto a los de hojas, brcteas y flores. Estos datos indican una marcada disminucin de las partes usadas y la introduccin de un elemento totalmente ajeno a la droga, lo cual afecta la calidad del producto comercializado.
Palabras Clave: Organo; Origanum spp; Salvado; Control de calidad.
Recibido | Received: January 15, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 11, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: July 22, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding: This study was financed by SECyT (UBA) B120 This article must be cited as: Beatriz G. Varela, Mariela J. Ganopol, Priscila Bosco, Lorena Agostinelli, Alberto A. Gurni. 2009. Presencia de salvado de cereal en "organos" comercializados en la ciudad de Buenos Aires (Argentina). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):305 307. {EPub July 22, 2009}.

*Contacto | Contact: e-mail: bgvarela@ffyb.uba.ar

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Trabajo presentado en el 1er. Congreso Internacional de Farmacobotnica. Enero de 2009, Chilln, Chile.

Varela et al.

Presencia de salvado de cereal en organos comercializados en la ciudad de Buenos Aires

INTRODUCCIN En la Repblica Argentina, se comercializan como organo varias especies, subespecies e hbridos del gnero Origanum L. (Lamiaceae). Estas hierbas con propiedades tnicas, digestivas, vulnerarias y tambin antioxidantes y antispticas, adquirieron gran popularidad principalmente como condimento y aromatizante (Rouquaud et al., 2000; Roig, 2001). Se trata de plantas subarbustivas, de 30-80 cm de altura, de tallos cuadrangulares. Las hojas son enteras, ovaladas, de hasta 4 cm y pubescentes en ambas caras. Las flores son pequeas, dispuestas en verticilastros, y protegidas por brcteas ovaladas, verdosas o purpreas. Los clices son tubiformes con dientes triangulares sub-iguales, o bien bilabiados con dientes desiguales; las corolas son bilabiadas, con tonos blancos, rojizos o purpreos. El fruto es un tetraquenio liso, seco y globoso (Xifreda, 1983). Las zonas ms apropiadas para su cultivo en la Argentina estn en Mendoza, Crdoba y San Juan, siendo en ese orden las principales provincias productoras (Lenardis et al., 2006). Si bien en el Cdigo Alimentario Argentino (CAA) se menciona a Origanum majorana L. bajo la denominacin organo, esta especie no se cultiva a escala comercial (Cdigo Alimentario Argentino, 1969). Trabajos recientes han propuesto a O. vulgare ssp viridulum y a O. x majoricum como las especies ms cultivadas y comercializadas en el pas (Xifreda, 1990, 2005). Las partes usadas estn constituidas por las hojas y las sumidades floridas (brcteas y flores) y se admite, segn el CAA, un 10% de sustancia extraa constituida por tallitos y materiales heterogneos inocuos (Cdigo Alimentario Argentino, 1969). En este trabajo se realiz una revisin de muestras comerciales de organo de la ciudad de Buenos Aires con el objeto de encarar un control de calidad de las mismas, comprobar la pureza en cuanto a partes usadas y la presencia de elementos extraos e identificacin de los mismos. MATERIALES Y MTODOS Se analizaron lotes distintos de seis marcas comerciales de organo. Los aspectos morfolgicos externos fueron corroborados con los datos de la

bibliografa. Se tomaron porciones representativas equivalentes al 10% del contenido neto de las muestras, se separaron los componentes bajo lupa estereoscpica Carl Zeiss, se pesaron y se calcularon los porcentajes de los elementos. Se realizaron disociados leves con hidrxido de sodio al 5%. Los preparados obtenidos de los disociados se fotografiaron con un fotomicroscopio Zeiss Axiolab MC 80 DX. Las observaciones bajo lupa se fotografiaron con una cmara digital Canon Powershot A560. RESULTADOS Y DISCUSIN Todas las muestras analizadas presentaron hojas, brcteas y flores (constituidas por clices y corolas) en proporciones variadas y adems, tallitos y otros materiales heterogneos. Se encontr en varias de las muestras un porcentaje bastante alto de trozos irregulares, de tamao variable, color amarillento plido con tonalidades verdes en los bordes. Luego de realizar disociados leves y por comparacin con bibliografa y materiales de referencia, los trozos irregulares se identificaron como salvado de trigo. Se procedi a calcular los porcentajes de todos los componentes separados en relacin con el peso de la muestra representativa (Tabla 1). Varias muestras comerciales presentaron un porcentaje de materia extraa muy superior al aceptado por el CAA. Se observ adems, salvado de cereal en cuatro de las muestras. El salvado separado se identific por comparacin con patrones de salvado de trigo y de avena y con bibliografa. Est constituido por clulas alargadas tangencialmente y con puntuaciones, clulas con contenido y tricomas eglandulares unicelulares largos. Por las caractersticas mencionadas, el material hallado se identifica como salvado de trigo donde las clulas alargadas y punteadas pertenecen al mesocarpio y se denominan clulas cruzadas, las clulas con contenido son clulas con aleurona y los tricomas unicelulares eglandulares corresponden al epicarpio. El organo posee clulas epidrmicas poligonales o irregulares con estomas, pelos eglandulares unicelulares cortos y pluricelulares largos y pelos glandulares peltados y capitados (Varela et al., 2007).

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Varela et al.

Presencia de salvado de cereal en organos comercializados en la ciudad de Buenos Aires

Tabla 1. Cuadro comparativo de las muestras de organo analizadas

Muestras de organo

Contenido neto (g)

Cantidad analizada (g)


2,8 2,5 2,5 2,5 2,5 2,0

Hojas g
0,5 0,3 0,3 0,7 1,7 0,8 % 18 12 12 28 68 40

Brcteas g
0,2 0,2 0,2 0,3 0,1 0,5 % 7 8 8 12 4 25

Flores g
0,3 0,15 0,2 0,1 0,1 0,6 % 11 6 8 4 4 30

Materia extraa
Salvado Otros

g
0,3 1,7 1,7 1,2 0 0

% 11 68 68 48 0 0

g
1,5 0,15 0,1 0,2 0,6 0,1

% 53 6 4 8 24 5

A B C D E F
g: gramos %: porcentaje

28 25 25 25 25 20

CONCLUSIN Los porcentajes de salvado hallados fueron altos con respecto a los de las hojas, brcteas y flores. Hay una marcada disminucin en la proporcin de las partes usadas de la droga por lo cual, la introduccin de salvado de cereal con un colorante no declarado afectara notablemente la calidad del producto comercializado. REFERENCIAS
Cdigo Alimentario Argentino (CAA). Ley 18.284. 1969. Captulo XVI, artculo 1226. Lenardis A, Gil A, Morvillo C. 2006. Organo. En Elba De La Fuente et. al.(Ed.) Cultivos Industriales, EFA, Buenos Aires:509-544

Roig FA. 2001. Flora medicinal mendocina. EDIUNC, Mendoza, pp. 214-215. Rouquaud E, Videla M. 2000. Organos de Mendoza (Argentina). Rev Fac Ciencias Agr UN Cuyo 32(1):2332 Varela BG, Ganopol MJ, Gurni AA. 2007. Estudio anatmico preliminar en hojas de organos comercializados en la ciudad de Buenos Aires (Argentina). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 6(6):388-389. Xifreda CC. 1983. Sobre organos cultivados en Argentina. Kurtziana 16:133-148 Xifreda CC. 1990. Los nombres cientficos correctos de dos organos hbridos (Lamiaceae). Taxon 39(3):523-525 Xifreda CC. 2005. Bol Soc Argent Bot 40(supl.):88.

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 308 - 311 BLACPMA ISSN 0717 7917 Comunicacin | Communication

Estudio de polifenoles de infusiones y cocimientos de hojas de Cedrn (Aloysia citrodora Palau) y Poleo (Lippia turbinata Griseb.) -Verbenaceae *
[Study of polyphenols of infusions and decoctions of "Cedrn" (Aloysia citrodora Palau) and "Poleo" (Lippia turbinata Griseb.) - Verbenaceae - leaves]
Mara F. WERNERT1, Marcelo L. WAGNER1, Alberto A. GURNI1, Marta A. CARBALLO2, Rafael A. RICCO1
1

Ctedra de Farmacobotnica. Facultad de Farmacia y Bioqumica. Universidad de Buenos Aires. Junin 954. 4to piso. (1113) Buenos Aires. Repblica Argentina. 2 CIGETOX-INFIBIOC. Facultad de Farmacia y Bioqumica. Universidad de Buenos Aires

Abstract
"Cedrn" (Aloysia citrodora Palau) and "Poleo" (Lippia turbinata Griseb.) - Verbenaceae are used in folk medicine as infusion or decoction of their leaves, mainly in the treatment of gastrointestinal disorders. The chromatographic profile of polyphenols of both species is characterized by the presence of two groups of compounds: hidroxycinnamic acids and flavonoids (flavons). Chromatograms from infusion and decoction of A. citrodora leaves present higher complexity and concentration of total phenols, total tannins and total flavonoids than those obtained from L. turbinata leaves. Condensed tannins (proanthocyanidins) were not detected neither in infusion nor in decoction from both species. These results constitute the starting point for later studies of biological activity and quality control of commercial samples, when the polyphenols are used as reference compounds.
Keywords: Aloysia citrodora; Cedrn; Lippia turbinata; Poleo; Polifenoles.

Resumen
Cedrn (Aloysia citrodora Palau) y Poleo (Lippia turbinata Griseb.) Verbenaceae- son empleadas en la medicina tradicional, bajo la forma de infusin y cocimiento (decoccin) de sus hojas, principalmente en el tratamiento de desrdenes gastrointestinales. El perfil cromatogrfico de polifenoles de ambas especies se caracteriza por la presencia de dos grupos de compuestos: los cidos hidroxicinmicos y los flavonoides (flavonas). Los cromatogramas provenientes de la infusin y el cocimiento de hojas de A. citrodora presentan una mayor complejidad de compuestos respecto de los provenientes de la infusin y el cocimiento de hojas de L. turbinata. Tanto la infusin como el cocimiento de las hojas de A. citrodora presentan una mayor concentracin de fenoles totales, taninos totales y flavonoides totales, cuando se compara con aquellos obtenidos para los extractos de L. turbinata. En ambas especies no se detecta la presencia de taninos condensados (proantocianidinas). Estos resultados constituyen el punto de partida para posteriores estudios de actividad biolgica y para el control de calidad de muestras del comercio, cuando se emplean los polifenoles como compuestos de referencia.
Palabras Clave: Aloysia citrodora; Cedrn; Lippia turbinata; Poleo; Polifenoles.
Recibido | Received: March 16, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: March 30, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: July 26, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding:This study was supported by ANPCYT-PICT No. 38238. This article must be cited as: Mara F. Wernert, Marcelo L. Wagner, Alberto . Gurni, Marta A. Carballo y Rafael A. Ricco. 2009. Estudio de polifenoles de infusiones y cocimientos de hojas de Cedrn (Aloysia citrodora Palau) y Poleo (Lippia turbinata Griseb.) Verbenaceae. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(2):309 311. {EPub July 26, 2009}.

*Contacto | Contact: e-mail: raricco@ffyb.uba.ar

This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Trabajo presentado en el 1er. Congreso Internacional de Farmacobotnica. Enero de 2009, Chilln, Chile.

Wernert et al.

Estudio de polifenoles de infusiones y cocimientos de hojas de Cedrn y Poleo

INTRODUCCIN Cedrn (Aloysia citrodora Palau) y Poleo (Lippia turbinata Griseb.), pertenecientes a la familia Verbenaceae (Troncoso, 1974, 1979; Zuloaga y Morrone, 1999) , son especies ampliamente utilizadas en la medicina tradicional. Se emplean principalmente sus hojas (Ratera y Ratera, 1980) bajo la forma de infusin y cocimiento, en el tratamiento de desrdenes gastrointestinales, como digestivo (estomacal) y carminativo, as tambin como tnico, sedante, antiespasmdico y en el tratamiento de enfermedades respiratorias. (Ratera y Ratera, 1980, Toursakissian, 1980, Soraru y Bandoni, 1978) En lo que respecta a sus composiciones qumicas, los aceites esenciales de ambas especies han sido los compuestos ms estudiados. (De Vincenzi et al., 1995; Terblanch y Cornelius, 1996) En menor medida, los estudios de la composicin qumica de estas especies tambin abarcan otros tipos de compuestos, como los polifenoles. Para A. citrodora se ha detectado principalmente la presencia de flavonas derivadas de luteolina y en menor medida apigenina, entre otros compuestos. Entre los derivados hidroxicinmicos el verbascsido es el compuesto mayoritario. (Carnat et al., 1999; Skaltsa y Shammas, 1988, Pascual et al., 2001). Para L. turbinata es escasa la bibliografa referida a la composicin de polifenoles. Se reporta la presencia de flavonas derivadas de apigenina y leucoantocianidinas. (Pascual et al., 2001; Coll Aroz y Abdala, 2005). El objetivo de ste trabajo es profundizar en el anlisis cuali-cuantitativo de los polifenoles foliares de ambas especies: obtener sus perfiles cromatogrficos, la cuantificacin de fenoles totales, taninos totales, taninos condensados (proantocianidinas) y flavonoides totales, que constituyen el punto de partida para posteriores estudios de citotoxicidad y actividad antioxidante mediada por flavonoides (Cook y Samman, 1996; Rice-Evans et al., 1996) y para el control de calidad fitoqumico de muestras del comercio, cuando se emplean los polifenoles como compuestos de referencia. MATERIALES Y MTODOS Material empleado: hojas de cedrn y poleo provenientes de un cultivo controlado. Lugar: Barreal. Calingasta. Provincia de San Juan. Fecha: 2007-2008.
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Extractos: se realizaron los extractos acuosos correspondientes a una infusin y cocimiento segn Farmacopea (FNA). Anlisis cualitativo: con el objeto de determinar el perfil cromatogrfico de polifenoles se realiz una cromatografa bidimensional planar en TLC de celulosa para cada extracto, segn metodologa estndar. (Mabry et al., 1970 ; Markham, 1982) Se revelaron en todos los casos mediante el empleo del reactivo de productos naturales (NP). Anlisis cuantitativo: se realiz la cuantificacin de fenoles totales (mtodo de Folin-Ciocalteau) (FAO/IEA, 2000), taninos totales (mediante el mtodo de precipitacin de seroalbmina bovina, BSA) (Waterman y Mole, 1994), taninos condensados (mediante la reaccin de la proantocianidina) (Waterman y Mole, 1994) y flavonides totales (mtodo de quelacin con AlCl3) (Maksimovic, 2005). RESULTADOS Los cromatogramas provenientes de las hojas de cedrn presentan una mayor concentracin y complejidad de compuestos respecto de los provenientes de hojas de poleo. Las infusiones y cocimientos de las hojas de ambas especies muestran un perfil de polifenoles caracterizados por la presencia de derivados del cido cafeico (cidos hidroxicinmicos), como as tambin flavonoides (flavonas). Mayoritariamente estos compuestos forman un complejo coloreado naranja con el reactivo NP, lo que sugiere la presencia de grupos ortodifenoles en el esqueleto flavonodico. El estudio de los espectros UV sugiere la presencia de derivados de luteolina. En menor medida se detectan compuestos que presentan un anillo B flavonodico monohidroxilado, de coloracin amarilla con NP, compatibles con la presencia de derivados de apigenina. Cuantificacin de fenoles totales Los resultados de la cuantificacin de fenoles totales se consignan a continuacin: Cedrn infusin: 51,85 3,17 mg cido tnico/g material seco Cedrn cocimiento: 51,53 3,49 mg cido tnico/g material seco. Poleo infusin: 10,62 0,62 mg cido tnico/g material seco.

Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas Vol. 8 (4) 2009 | 309

Wernert et al.

Estudio de polifenoles de infusiones y cocimientos de hojas de Cedrn y Poleo

Poleo cocimiento: 13,36 0,26 mg cido tnico/g material seco. Cuantificacin de taninos totales Los resultados de la cuantificacin de taninos totales se consignan a continuacin: Cedrn infusin: 5,95 0,65 mg cido tnico/g material seco. Cedrn cocimiento: 8,90 0.90 mg cido tnico/g material seco. Poleo infusin: 1,60 0,17 mg cido tnico/g material seco. Poleo cocimiento: 1,98 0,20 mg cido tnico/g material seco. Cuantificacin de taninos condensados (proantocianidinas) La cuantificacin se efectu mediante la reaccin de la proantocianidina, obtenindose resultados negativos para las infusiones y cocimientos de ambos materiales. Cuantificacin de flavonoides totales Los resultados de la cuantificacin de flavonoides totales se consignan a continuacin: Cedrn infusin: 20,82 1,80 mg rutina/g material seco. Cedrn cocimiento: 20,67 1,70 mg rutina/g material seco. Poleo infusin: 5,95 0,60 mg rutina/g material seco. Poleo cocimiento: 8,68 0,90 mg rutina/g material seco. DISCUSIN Los perfiles cromatogrficos de polifenoles obtenidos permiten diferenciar a ambas especies. Los cromatogramas obtenidos de los extractos de las hojas de cedrn presentan una mayor concentracin y complejidad de compuestos. El anlisis cuantitativo de fenoles totales, taninos totales y flavonoides totales, tanto de la infusin como del cocimiento de las hojas de cedrn, presenta altos valores comparados con aquellos obtenidos para las hojas de poleo. Estos resultados son concordantes con aquellos obtenidos para los mapeos cromatogrficos, donde puede observarse que los extractos de las hojas de cedrn presentan una mayor concentracin relativa de flavonoides.

El anlisis de taninos condensados no detecta la presencia de estos compuestos en los extractos analizados de ambas especies, por lo cual en la cuantificacin de taninos totales se obtienen bajos valores. Estudios preliminares de actividad antioxidante total (mtodo de ABTS), permiten determinar valores equivalentes de 17887,5 181,8 M cido ascrbico para la infusin de cedrn y de 3406,0 167,0 M cido ascrbico para la infusin de poleo. Los resultados obtenidos podran ser empleados como parmetros en el control de calidad fitoqumico para ambas especies. CONCLUSIN La alta concentracin de polifenoles y la mayor diversidad de compuestos presentes en la infusin y cocimiento de hojas de cedrn permitiran seleccionar a dicha especie para la realizacin de futuros estudios de actividad biolgica mediada por polifenoles. REFERENCIAS
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Wernert et al.

Estudio de polifenoles de infusiones y cocimientos de hojas de Cedrn y Poleo

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2009 The Authors 2009 Boletn Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromticas, 8 (4), 312 - 316 BLACPMA ISSN 0717 7917 Comunicacin | Communication

Anlisis microgrfico de rizomas de Canna coccinea Mill. (Cannaceae) *


[Micrographic essay of Canna coccinea Mill. (Cannaceae) rhizomes]
Ignacio AGUDELO1, Judith MONTENEGRO1, Alberto GURNI1, Jorge SCHIMPF2, Nilda D. VIGNALE2, Graciela BASSOLS1
1

Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad de Buenos Aires. Junn 956 4to Piso (1113), Buenos Aires (Argentina). 2 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Jujuy, Alberdi 47 (4600), S. S. de Jujuy, Argentina.

Abstract
Achira or achira roja (Canna coccinea Mill., Cannaceae) grows in coastal and marshy environments of the Delta and shore of the Rio de la Plata. Rhizomes of this species are used like diuretic, anti-asthmatic, anti-rheumatic and emollient. The following micrographical techniques were applied: disaggregation with 5% NaOH; reduction to dust; histo-chemical reactions; obtaining of microphotographs with polarized light of starch grains; measurement of the observed elements and obtaining of microphotographs. In rhizome, starch grains with bivalve form and elements of conduction are observed, whereas in the rhizomatous frond, elements of conduction and crystalliferous cells with clusters of calcium oxalate are observed. The application of these parameters would allow to distinguish species from the same genus, with nutritional and medicinal applications, as well as species of other genus that receive the same common name.
Keywords: Canna; Achira; Rhizomes; Micrography; Andean cultives; Starch.

Resumen
La achira o achira roja (Canna coccinea Mill., Cannaceae) crece en ambientes palustres y ribereos del Delta y ribera del Ro de la Plata. Los rizomas de esta especie se emplean como diurticos, antiasmticos, antirreumticos y emolientes. Se aplicaron las siguientes tcnicas microgrficas: a.- Disociado leve con NaOH acuoso al 5%; b.- Reduccin a polvo; c.- Reacciones histoqumicas; d.- Obtencin de fotomicrografias con luz polarizada de los granos de almidn; e.- Medicin de los elementos observados; f.- Obtencin de fotomicrografas. En el rizoma se observan grnulos de almidn caractersticos con forma de bivalvo y elementos de conduccin, en tanto que en la fronde rizomatosa se observan elementos de conduccin y clulas cristalferas con drusas de oxalato de calcio. La aplicacin de estos parmetros permitira diferenciar especies del mismo gnero as como tambin especies de otros gneros que reciben el mismo nombre vulgar.
Palabras Clave: Canna; Achira; Rizomas; Micrografa; Cultivos andinos; Almidn.
Recibido | Received: June 15, 2009. Aceptado en Versin Corregida | Accepted in Corrected Version: June 20, 2009. Publicado en Lnea | Published Online: July 25, 2009. Declaracin de Intereses | Declaration of interests: Authors have no competing interests Financiacin | Funding: This work was financed by CA-PICT 2005 E7 (Proyecto 9-30134) This article must be cited as: Ignacio Agudelo, Judith Montenegro, Alberto Gurni, Jorge Schimpf, Nilda D. Vignale, Graciela Bassols. 2009. Anlisis microgrfico de rizomas de Canna coccinea Mill. (Cannaceae). Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat 8(4) :312 316. {EPub July 25, 2009}.

*Contacto | Contact: e-mail: gbassols@ffyb.uba.ar; ndvignale@yahoo.com.ar

BLACPMA es una publicacin de la Cooperacin Latinoamericana y Caribea de Plantas Medicinales y Aromticas This is an open access article distributed under the terms of a Creative Commons Attribution-Non-Commercial-No Derivative Works 3.0 Unported Licence. (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ ) which permits to copy, distribute and transmit the work, provided the original work is properly cited. You may not use this work for commercial purposes. You may not alter, transform, or build upon this work. Any of these conditions can be waived if you get permission from the copyright holder. Nothing in this license impairs or restricts the author's moral rights. Este es un articulo de Acceso Libre bajo los terminos de una licencia Creative Commons Atribucion-No Comercial-No trabajos derivados 3.0 Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by-ncnd/3.0/deed.es) Usted es libre de copiar, distribuir y comunicar pblicamente la obra bajo las condiciones siguientes: Reconocimiento. Debe reconocer los crditos de la obra de la manera especificada por el autor o el licenciador (pero no de una manera que sugiera que tiene su apoyo o apoyan el uso que hace de su obra). No comercial. No puede utilizar esta obra para fines comerciales. Sin obras derivadas. No se puede alterar, transformar o generar una obra derivada a partir de esta obra. Al reutilizar o distribuir la obra, tiene que dejar bien claro los trminos de la licencia de esta obra. Alguna de estas condiciones puede no aplicarse si se obtiene el permiso del titular de los derechos de autor Nada en esta licencia menoscaba o restringe los derechos morales del autor.

Trabajo presentado en el 1er. Congreso Internacional de Farmacobotnica. Enero de 2009, Chilln, Chile.

Agudelo et al.

Rizoma de Canna coccinea (Cannaceae)

INTRODUCCIN La familia Cannaceae es monotpica, siendo Canna el nico gnero que la integra. El nmero de especies que presenta se ha visto reducido en funcin de las modificaciones que ha experimentado su taxonoma, siendo todas de origen sudamericano (Novara, 2001). Entre ellas se destaca Canna indica L. (=Canna edulis Ker-Gawler), por ser uno de los cultivos andinos que aporta energa a la dieta a travs del consumo de los rizomas para elaborar diferentes platos que proveen almidn de fcil digestibilidad, de modo que puede ser usado por nios, enfermos y ancianos (Crdenas, 1969; Hernndez Bermejo y Len, 1992; Tapia y Fries, 2007) y cuyas hojas se emplean para envolver platos tradicionales (Ulloa, 2006). Se puede consumir tanto cruda como cocida al vapor o al horno. Para la elaboracin de harina, los rizomas se pelan, se secan al sol y se muelen, resultando la harina de inters para elaborar panes, galletas y fideos (Montaldo, 1991; Tapia et al., 1996). La mayora de las especies poseen valor ornamental, otorgado por las flores vistosas rojas o amarillas. En ambientes palustres y ribereos del Delta y ribera del Ro de la Plata (Argentina), se encuentra Canna coccinea Mill, achira o achira roja (Foto 1), cultivada frecuentemente como ornamental junto con otras especies de su mismo gnero. Exomorfolgicamente, los rizomas de esta especie son simpodiales y presentan tuberibulbos (Foto 2) (Fabris, 1968). Las frondes rizomatosas son de color marrn. Los rizomas de esta especie se emplean como diurticos, antiasmticos, antirreumticos y emolientes (Toursarkissian, 1980). Por otro lado, el nombre vulgar de achira es compartido por otras especies pertenecientes a Familias diferentes a Cannaceae; entre ellas se encuentra, para Argentina Thalia geniculata L. y T. multiflora Horkel, de la familia Marantaceae, palustres, la primera rizomatosa, ornamental de la que existe alguna referencia como alimento (De la Pea, 2004 El presente trabajo tiene por objetivo establecer los parmetros de identificacin microgrficos de la parte subterrnea de esta especie, ya que los mismos sern necesarios para su identificacin en situaciones en que no se disponga del material herborizado, con hojas y particularmente con flores, en cuyo caso se trabaja con dichos parmetros exomorfolgicos. Las referencias microgrficas a definir adquieren particular importancia para diferenciar esta especie, de la que se
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conoce su valor medicinal, de aquella que integra el repertorio de cultivos andinos y de otras especies de Familias diferentes con las que comparten el mismo nombre vulgar.
Foto 1. Planta entera de Canna coccinea.

Foto 2. Rizoma de Canna coccinea.

MATERIALES Y MTODOS Materiales El material estudiado ha sido coleccionado por uno de los autores y se encuentra depositado en el Herbario J. A. Domnguez del Museo de Farmacobotnica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad de Buenos Aires, cuya sigla, segn Index Herbariorum es BAF. El mismo ha sido identificado por caractersticas exomorfolgicas, mediante el uso de claves dicotmicas.

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Agudelo et al.

Rizoma de Canna coccinea (Cannaceae)

Material estudiado Canna coccinea: ARGENTINA. Buenos Aires. Zrate. Agudelo s/n. 5/XI/2008 (BAF) Material consultado Canna edulis: PER. Cuzco. Cuzco. Maihua. Vargas, C. s/n, VI/1935 (CUZ) Mtodos Se aplicaron las siguientes tcnicas microgrficas: a.- Disociado leve con NaOH acuoso al 5%; b.- Reduccin a polvo; c.- Reacciones histoqumicas; d.- Medicin de los elementos observados; e.- Obtencin de fotomicrografas (Normas IRAM, 1993). RESULTADOS Y DISCUSIN Se presentan los resultados de las observaciones realizadas al microscopio ptico de rizomas y frondes rizomatosas de C. coccinea. La reduccin a polvo del rizoma mostr abundantes grnulos de almidn simples, con particular forma de bivalvo, cuyo hilo es excntrico y sus estras notorias (Foto 3), su tamao variable entre 10 y 140 micras, con un promedio de 60 micras, los que se confirman mediante la reaccin histoqumica con solucin yodo-iodurada de lugol, mostrando el clsico color azul violceo (foto 4); estn presentes los elementos de conduccin, destacndose los miembros de vasos espiralados (Foto 5) y restos de tejido epidrmico con estomas (Foto 6).
Foto 3. Rizomas - granos de almidn (100 x).

Foto 4. Rizomas - reaccin con lugol para poner en evidencia los granos de almidn (400 x).

Foto 5. Rizomas - restos de tejidos de conduccin (400 x).

Foto 6. Rizoma - restos de epidermis con estomas (400 x).

En tanto, en la fronde rizomatosa se observaron elementos de conduccin (Foto 7) y clulas


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Agudelo et al.

Rizoma de Canna coccinea (Cannaceae)

cristalferas con drusas de oxalato de calcio ubicadas cerca de las nervaduras (Foto 8).
Foto 7. Frondas - restos de tejidos de conduccin (100 x).

comprendido entre 10 y 140 micras y una medida promedio de 60 micras (Ciccarelli, 2007). El grano de almidn de C. coccinea tambin es simple, presenta la forma tpica bivalvo (triangular con base y ngulo superior convexo) con hilo y estras excntricas, su forma es bastante uniforme y su tamao vara de 15-60 (30) micras de alto y 12-70 (35) micras en la base. Por aparte, los datos aportados por las frondes constituyen referencias complementarias que pueden ser incorporados al control de calidad botnico cuando la parte que se comercializa o intercambia en mercados y ferias regionales las incluye. CONCLUSIN Las caractersticas referidas a la morfologa y tamao de los granos de almidn del rizoma de C. coccinea constituyen un punto de partida vlido para definir su presencia en muestras de materiales de diversas procedencias, ya sean rizomas enteros o partidos, al estado fresco y/o seco, que se pueden encontrar a lo largo del proceso de comercializacin informal de la especie. De igual manera, se constituyen en elementos de valor diagnstico para diferenciar esta especie de, por ejemplo, harina obtenida del rizoma de C. indica, especie que posee una larga trayectoria de uso en la alimentacin artesanal andina, la que se espera logre proyectarse al mbito comercial dentro del marco de la poltica de ampliacin del horizonte de uso de dichos cultivos, con la incorporacin del valor agregado cultural que la sociedad andina les ha impreso a travs de su larga historia. Por otra parte, estos parmetros se pueden aplicar para diferenciar los rizomas de las otras especies que integran el gnero en estudio, con aplicaciones alimenticias y medicinales y particularmente con especies de otras Familias que reciben el mismo nombre vulgar., por ej Thalia geniculata L. y Thalia multiflora Horkel (Marantaceae). REFERENCIAS

Foto 8. Frondas - cristales de oxalato de calcio con forma de drusas (400 x).

Tradicionalmente, C. indica es la especie que ms se emplea como medicinal y como alimenticia. Sus rizomas son monopodiales, ramosos y crecen en forma paralela a la superficie del piso. El grano de almidn de esta especie es simple y tiene forma variable entre discoide y ovalada con una superficie lisa y se observan variaciones de tamao con un rango
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