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Pg. 1: Reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real

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Boletn del Servicio Bibliogrfico de Wiener Laboratorios S.A.I.C. http//:www.wiener-lab.com.ar

Ao XLII - Junio 2008

Director: Gustavo A. Capriotti - Redactor: Cristina M. Crepaldo - Editor Responsable: Wiener Laboratorios S.A.I.C. - 2000 - Rosario - Argentina

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA EN TIEMPO REAL

La Real Time PCR (del ingls: Reaccin en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real) es un mtodo revolucionario basado en la PCR tradicional desarrollada por Kary Mullis en los aos 80. Esta tcnica original permite amplificar secuencias especficas de cido desoxirribonucleico (ADN) ms de un billn de veces. Muchas tcnicas alternativas se han desarrollado en los ltimos aos a partir de la PCR, facilitando la manipulacin del ADN y permitiendo avances importantes a nivel cientfico.
Capriotti, G. A.; Gariglio, R.C. Centro de Investigacin y Biotecnologa, Wiener lab., Rosario, Argentina. rgariglio@wiener-lab.com.ar
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iguchi y colaboradores consiguieron en el ao 1992 la primera demostracin de la Real Time PCR, la cual representa otro salto tecnolgico importante ya que ha abierto la posibilidad de nuevas y poderosas aplicaciones para la investigacin a nivel mundial. Esta reaccin es un proceso de amplificacin por PCR y deteccin simultnea del ADN amplificado en tiempo real, pudiendo realizarse dicha deteccin por medio de diferentes qumicas. En los ltimos aos, el nmero de compaas que ofrecen instrumentos y reactivos para Real Time PCR, sumado a la inmensa cantidad de trabajos cientficos publicados, ponen en evidencia la importancia y competitividad de mercado que produjo esta tecnologa. La Real Time PCR generalmente envuelve sondas fluorognicas que iluminan

o fluorescen mostrando la cantidad de ADN presente en cada ciclo de amplificacin. Otros trminos con que se conoce la tecnologa son: PCR cintica refirindose al proceso antes mencionado o PCR cuantitativa, ya que la metodologa permite cuantificar una secuencia especfica de ADN presente en la muestra biolgica en estudio. Por otra parte, el ADN complementario (ADNc) generado bajo condiciones adecuadas a partir de la retrotranscripcin de un templado de cido ribonucleico (ARN), puede ser utilizado tambin como ADN blanco en la Real Time PCR, reaccin que se conoce como RTReal Time PCR, ampliamente utilizada en el trabajo con retrovirus, en la investigacin de la expresin de genes, etc. Durante la amplificacin, la rapidez con que la seal fluorescente alcanza el nivel umbral (Threshold level), se correla-

ciona con la cantidad inicial de ADN blanco, permitiendo de esta manera poder cuantificarlo. El nmero de ciclos necesarios para que la seal fluorescente alcance el nivel umbral, se conoce como Threshold cycle (CT) y es el parmetro en el cual se fundamenta la cuantificacin segn veremos ms adelante. A mayor CT, menor ser la cantidad de ADN blanco o templado inicial. La Figura 1 muestra curvas tpicas de amplificacin, donde se grafica en el eje de las ordenadas el aumento de fluorescencia producido durante el transcurso de la reaccin (1a: graficado en escala lineal y 1b: en escala logartmica) y en el eje de las abscisas, cada ciclo de la PCR. La lnea horizontal de color rojo est indicando dicho valor umbral de fluorescencia a partir del cual se definen los CT, siendo este umbral fijado en la fase exponencial de la reaccin.

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Figura 1a Figura 1: Curva de amplificacin Una de las ventajas fundamentales de la Real Time PCR en relacin a la PCR tradicional de punto final, es que en la primera las mediciones se realizan en la etapa exponencial de la reaccin donde en teora, por cada ciclo de amplificacin se acumula el doble de producto respecto al ciclo anterior, asumiendo una eficiencia del 100%. Por el contrario, en la PCR de punto final la deteccin del producto de amplificacin se realiza en la fase plateau de la reaccin, donde la misma ya se detuvo y hay degradacin de producto. Por lo tanto, medidas realizadas en esta fase, no ofrecen resultados muy confiables en cuanto a la cantidad inicial de templado de la muestra (Figura 2). Otras ventajas de la Real Time PCR son: - Sistema homogneo que evita la manipulacin de amplificado, evitando el grave problema de contaminaciones con el mismo. - Rapidez en la obtencin de resultados. - Amplio rango dinmico de cuantificacin. - Permite monitorear la eficiencia de la reaccin. - Mnima variabilidad en los resultados, dando una cuantificacin confiable y precisa. La habilidad que posee la Real Time PCR para monitorear el progreso de la amplificacin del ADN blanco en tiempo real, se logra mediante diferentes qumicas e instrumentacin especficas. Generalmente, las qumicas consisten en diferentes compuestos fluorescentes o fluorforos que pueden proporcionar una deteccin de tipo no especfica (como son los colorantes fluorescentes) o especfica (como el caso de los cebadores y sondas fluorescentes). Dentro de los colorantes fluorescentes, el ms utilizado es el SYBR Green I que tiene la propiedad de unirse al ADN doble hebra de manera inespecfica, emitiendo hasta 1000 veces ms fluorescencia cuando se encuentra unido al ADN que cuando est libre en solucin (absorbe luz de 480 nm de longitud de onda y emite a 520 nm) (Figura 3). Por lo tanto, el incremento de la seal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN doble hebra presente en el tubo de reaccin y la misma se mide al final de la fase de extensin de la PCR. Su principal desventaja es la inespecifi-

Figura 1b cidad, ya que se une independientemente de la secuencia del ADN, pudiendo generar resultados falsos positivos al detectar ADN espurios como son por ejemplo los dmeros de cebadores de la reaccin. Una forma de asegurar en estos casos la especificidad de la deteccin, es analizando las curvas de disociacin o de melting (Figura 4). Se puede lograr una mejor caracterizacin del producto de amplificacin, sometiendo el mismo a un aumento de temperaturas para determinar la temperatura de disociacin o melting point, caracterstica para cada producto, ya que depende de la longitud y composicin nucleotdica del mismo. La presencia de dos o ms picos, sugiere que se ha obtenido ms de un am-

Figura 2: Etapas de la reaccin de amplificacin

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Figura 3: Fundamento del colorante fluorescente SYBR Green I plificado y que el proceso de amplificacin no fue especfico para el ADN blanco. Por otra parte, estn los sistemas de sealizacin basados en cebadores fluorescentes. Estos varan considerablemente desde el ms simple llamado LUXTM primers (Light Upon Extension) a los ms complejos como ScorpionTM primers. Si bien no se detallarn aqu sus respectivos fundamentos, ambos tipos de cebadores poseen en solucin, una secuencia corta auto-complementaria que hace que los mismos estn apagados (quenched) y no emitan fluorescencia. Cuando se produce la hibridizacin del cebador al ADN blanco y su estructura se despliega, se observa un incremento importante en la fluorescencia, el cual es medido justamente durante esta etapa. La tercera categora de sistemas de sealizacin para Real Time PCR, es aquella que envuelve un tercer oligonucletido fluorescente localizado entre los cebadores, denominado comnmente sonda. A diferencia de los sistemas anteriores, ste agrega especificidad a la reaccin, al intervenir un tercero y a veces hasta un cuarto oligonucletido o sonda. Hay varios sistemas basados en sondas fluorescentes, los ms conocidos son: TaqMan probes, Molecular Beacons, Hybridization probes, Locked Nucleic Acid (LNA) probes, LightUp probes, etc. En cada caso, mltiples colorantes fluorescentes (ej. Fluorescein, 6-FAM, JOE, VIC, Cal Fluor, etc.), pueden ser utilizados con una variedad de quenchers (ej. TAMRA, DABCYL, BHQ, etc) que produzcan eficientemente el necesario efecto FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Dicho efecto se basa en que la excitacin electrnica de uno de los colorantes fluorescentes, es transferida al colorante aceptor cuando ambos se encuentran en posiciones cercanas, impidiendo la emisin de fluorescencia del primero. Cuando ambas molculas se alejan, por diferentes mecanismos segn el caso, los colorantes fluorescentes emiten fluorescencia libremente. Es importante cuando se disea el sistema de amplificacin a utilizar, tener en cuenta las ventajas y desventajas que presentan las diferentes opciones descritas. Utilizando sistemas basados en sondas fluorescentes, se suma la posibilidad de llevar a cabo reacciones multiplex, que tanta relevancia tienen a nivel diagnstico por su practicidad.

Adems es imprescindible que el instrumento est acoplado a una computadora que posea un software apropiado para la recoleccin y anlisis de los datos generados. Las curvas de amplificacin graficadas por dicho software determinan el nmero de ciclo en el cual la fluorescencia alcanza el valor umbral (CT). Este valor de CT es inversamente proporcional a la cantidad inicial de la secuencia especfica del cido nucleico a cuantificar, en la muestra original. A partir del mismo, el software realiza los clculos de cuantificacin. Un tipo de cuantificacin es la absoluta, que se utiliza para cuantificar muestras desconocidas por interpolacin a partir de una curva estndar, generada a partir de diluciones en serie de una muestra de concentracin conocida del ADN blanco. Un caso en donde se utiliza este tipo de cuantificacin, es la determinacin del nmero de copias de un virus. En la Figura 5 se muestra un ejemplo de cuantificacin absoluta, donde se grafican los respectivos CT correspondientes a cada muestra de la curva estndar, versus el logaritmo de las concentraciones conocidas de las mismas.

Figura 4: Curva de disociacin Hay una amplia variedad de instrumentos para Real Time PCR, que consisten en una parte ptica y otra de termociclador para realizar la reaccin. La qumica elegida y el instrumento estn ntimamente relacionados. Hay tres formas bsicas en que los instrumentos pueden aportar la energa de excitacin para los fluorforos: mediante lmparas, diodos o lser, combinados con distintos tipos de fotodetectores para medir la fluorescencia emitida. El nmero de copias de la muestra de ADN desconocida, puede calcularse a partir de la regresin lineal de la curva estndar de la siguiente manera: Log10 N de copias = CT - y-intercept / slope Siendo: y-intercept: la ordenada al origen que da la sensibilidad y slope: la pendiente de la curva que da una medida de la eficiencia de la amplificacin. La cuantificacin relativa es utilizada para analizar cambios en la expresin de

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Agenda de Congresos
Argentina
XVII Jornadas Bioqumicas del NOA
Jujuy, 7 al 9 de Agosto de 2008 Organiza / Informes Colegio de Bioqumicos de Jujuy infocbj@cobiju.com.ar V Congreso Argentino de la Calidad en el Laboratorio Clnico CALILAB 2008 Buenos Aires, 10 al 12 de Setiembre de 2008 Organiza / Informes Fundacin Bioqumica Argentina www.fba.org.ar/calilab calilabV@fba.org.ar

Figura 5: Cuantificacin Absoluta un gen en una dada muestra en relacin a otra muestra de referencia, por ejemplo en respuesta a un tratamiento. Esas muestras de referencia contienen genes invariables, llamados Housekeeping genes, los cuales normalmente no sufren cambios bajo las condiciones experimentales, sirviendo por lo tanto como estndares internos. Por lo tanto, las aplicaciones ms importantes de esta tecnologa, adems de incluir las de la PCR convencional, son entre otras: - Cuantificacin absoluta y relativa de la expresin gnica (mediante RT- Real Time PCR). - Deteccin y cuantificacin de microorganismos (bacterias, virus, hongos, etc). - Identificacin de mutaciones o polimorfismos de base simple (SNP) y genotipificacin (mediante el anlisis de curvas de melting). - Inestabilidad genmica: identificacin de deleciones/inserciones que resultan en trisomas, monosomas, etc. - Validacin de datos de expresin gnica generados por anlisis de microarrays. - Medicin del nmero de copias de ADN en general. - Inmuno-qPCR. - Anlisis cuantitativo de metilacin de ADN. reas como la Microbiologa, Gentica y Farmacogentica, Oncologa y Transplante se han visto beneficiadas por la implementacin de la Real Time PCR. Otros campos de aplicacin de esta tecnologa de gran potencial, son: Agricultura, Veterinaria, Alimentos y Medicina Forense. Cualquier necesidad de medicin rpida y precisa de pequeas cantidades de cidos nucleicos, representa un futuro potencial para innovaciones basadas en Real Time PCR. La evolucin de los instrumentos, el desarrollo de nuevas qumicas de deteccin, la estandarizacin en la puesta a punto de sistemas basados en esta tecnologa, dispararn seguramente nuevas aplicaciones y el surgimiento de procesos relacionados, tiles en el campo de las Ciencias Biolgicas.

Chile
XIV Congreso Chileno de Tecnologa Mdica Calidad sin Fronteras 27 al 30 de Agosto de 2008 Organiza / Informes Colegio de Tecnlogos Mdicos Regional Arica www.congresotmarica.cl

Brasil
42 Congreso Brasileiro de Patologia Clnica y Medicina Laboratorial San Pablo, 2 al 5 de Julio de 2008 Organiza / Informes Sociedade Brasileira de Patologia Clinica (SBPC) www.sbpc.org.br

Bibliografa
- Valasek MA, et al. The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ 2005, 29:151-9. - Dorak MT. Real-time PCR 2006, Edit. Taylor & Francis Group. - Kubista M, et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine 2006, 27:95-125. - Bustin SA, et al. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science 2005, 109:365-79.

Estados Unidos
2008 AACC Anual Meeting and Clinical Lab Expo 29 al 31 de Julio de 2008 Convention Center, Washington DC, USA