Cultivos Celulares-BIOTECNOLOGA

Marta Llovera

TEMA 9- SISTEMAS DE MODIFICACIN CELULAR Esta clase corresponde al tema 9 de la asignatura de Cultivos Celulares de 3r curso de la licenciatura de Biotecnologa. En los temas previos, el alumno ha adquirido los conocimientos bsicos sobre el mantenimiento de las clulas animales en cultivo, tanto de las lneas celulares como de los cultivos primarios (temas 7 y 8 del programa). En el presente tema se introducen las tcnicas disponibles para la introduccin de macromolculas en las clulas en cultivo. Inicialmente se expondrn diversas aplicaciones de estas tcnicas, para proporcionar al alumno las motivaciones que conducen al desarrollo de estas estrategias. Tambin se dar a conocer al alumno los genes marcadores como herramienta muy importante para la medida de la tasa de transfeccin o transduccin. Despus, se explicarn los distintos mtodos de transfeccin de ADN, tanto qumicos como fsicos. Se compararn los distintos mtodos y se pondr nfasis en la importancia que tiene la puesta a punto del mtodo de transfeccin para cada tipo celular. Por ltimo se presentar el mtodo que se utiliza para la obtencin de clulas estables y se comparar con la transfeccin transitoria, para que los alumnos puedan valorar las ventajas e inconvenientes de cada mtodo. En la siguiente clase se tratar la introduccin de ADN exgeno mediante la infeccin con virus, y se vern las vectores virales ms utilizados en la actualidad: adenovirus, retrovirus y lentivirus. Diapositiva 1- Esquema de los contenidos del Tema 9 donde se remarcan los puntos que se van tratar en esta clase. Diapositiva 2-Manipulacin del cultivo celular para la modificacin de la expresin y/o funcin de los genes. Para modificar la expresin de los genes o la funcin de las protenas de una clula podemos introducir distintas molculas segn nuestro inters. cidos nucleicos los cuales pueden codificar por un gen de inters que queremos que se exprese (ADN o ARNm) o bin molculas que actuarn como reguladoras de la expresin de los genes de la clula (RNAi o antisense) Protenas: con el fin de evaluar su funcin en el entorno celular o protenas que sean capaces de bloquear la funcin de una protena endgena (dominantes negativos). Normalmente son la misma protena con una mutacin que la inactiva. Anticuerpos: la introduccin de anticuerpos normalmente se hace con el fin de bloquear la funcin de la protena a la cual se unen especficamente. Diapositiva 3- Con qu finalidad queremos introducir ADN en una clula? Pueden existir motivos muy diversos, pero a modo de ejemplo aqu se proponen varias razones: Conferir a la clula ventajas selectivas, es decir que pueda sobrevivir en unas condiciones que las otras clulas no superarn, por ejemplo crecer en presencia de una sustancia txica. Tambin puede interesar caracterizar la funcin que tiene la protena para la que codifica el ADN que hemos introducido. Podra ser interesante introducir una protena marcada con una seal que nosotros podremos detectar, para poder conocer dnde se encuentra dentro de la clula (citoplasma, ncleo, mitocondrias, membrana)

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Podramos querer estudiar la regin promotora de un gen, para saber como se regula su expresin O tambin podemos querer utilizar las clulas como fbricas para la produccin de un protena con inters farmacolgico. Diapositiva 4- Condiciones ideales. Nosotros querramos obtener una eficiencia de transfeccin del 100%, por lo tanto que todas las clulas expresen el transgen, y que adems todas sobrevivan a la modificacin, por lo tanto toxicidad nula. Estos resultados son muy difciles de obtener, y normalmente nos conformamos con elegir la condicin permita obtener una eficiencia suficiente sin causar mucha muerte celular. De hecho se tiene que establecer el mtodo y las condiciones ptimos para cada tipo celular empricamente. Diapositiva 5- En el caso de introduccin de ADN en las clulas se utilizan dos tipos de estrategias: La transfeccin consiste en la introduccin del ADN por mtodos qumicos o fsicos. En este caso el vector utilizado es un plsmido de expresin de clulas de mamfero. La transduccin o infeccin consiste en la utilizacin de virus para la introduccin del ADN exgeno, aprovechando que son organismos especializados en la introduccin de su material gentico dentro de clulas eucariotas, puesto que su replicacin depende de esto. En este caso el vector que se utiliza es el material gentico propio del virus. Diapositiva 6- Transfeccin: Vector Hemos dicho que en la transfeccin el vector que se utiliza es el plsmido de expresin de clulas de mamfero. Los alumnos han visto en detalle los componentes de un plsmido de expresin en la asignatura de Ingeniera Gentica molecular, pero se presenta aqu a modo de recordatorio. Un plsmido es una doble cadena de ADN extracromosmico normalmente circular que tienen las bacterias y eucariotas inferiores, como las levaduras. Mediante tcnicas de ingeniera gentica los plsmidos se han modificado para su utilizacin como vectores de expresin. Los plsmidos se amplifican y purifican a partir de bacterias, para ello contienen un origen de replicacin basteriano (ColE1) y tambin un gen de resistencia a un antibitico (como la ampicilina) que sirve para la seleccin de las bacterias que tienen el plsmido. Para el facilitar la insercin del ADN y la expresin del transgen en clulas de mamfero el plsmido ha de contener tambin: Un promotor fuerte que confiere una expresin elevada y constitutiva de la protena. Un sitio de clonaje con varias dianas de restriccin que permita introducir la secuencia codificante del gen de inters con facilidad. A continuacin contiene una seal de poliadenilacin para la cola de adeninas del ARN mensajero. Y puede contener tambin un gen de resistencia a un antibitico para la seleccin de las clulas que han integrado el plsmido en su genoma. Diapositiva 7- Vector de expresin para clulas de mamfero.

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Aqu est dibujado el mapa de un vector de expresin de clulas de mamfero como ejemplo con todas las cassettes que hemos visto en la diapositiva anterior. Diapositiva 8- Cmo vamos a saber si el ADN ha entrado en la clula y qu eficiencia de transfeccin tenemos con un mtodo determinado? Para la evaluacin de la eficiencia de transfeccin y como sistema de normalizacin entre distintos experimentos se utilizan los genes marcadores o reporter. Son genes que codifican para enzimas o protenas que nosotros mediante tcnicas estandarizadas podemos medir o detectar. Diapositiva 9- Los genes marcadores que ms comnmente utilizados son: La cloranfenicol acetiltransferasa que es un enzima que inactiva el cloranfenicol mediante la transferencia de grupos acetilo. El ensayo de actividad de esta enzima normalmente es laborioso, con cloranfenicol radiactivo y resulta caro por lo que en la actualidad no se utiliza mucho. Se ha utilizado bastante para la carcaterizacin de secuencias reguladoras de la expresin de genes. La luciferasa es una enzima aislada a partir de una lucirnaga. Este enzima cataliza la oxidacin de las luciferinas, reaccin que emite luz. La luz producida se puede medir y cuantificar en un aparato que se llama luminmetro. Es un ensayo fcil y rpido. La beta-galactosidasa es un enzima ms verstil que los anteriores porque adems de poder hacer la cuantificacin a partir de lisados celulares con un simple espectrofotmetro, tambin permite la visualizacin de las clulas transfectadas por mtodos histoqumicos, pudiendo tener una medida de la eficiencia de transfeccin. Diapositiva 10- El gen marcador que ha resultado ms til para la deteccin de clulas transfectadas vivas es el gen de la protena verde fluorescente (GFP). Este gen se clon de la medusa Aequorea victoria. La GFP cuando se expone a luz ultravioleta emite luz de color verde brillante que se puede ver mediante un microscopio de fluorescencia. Por lo tanto se puede monitorizar la expresin de la GFP tras la transfeccin sin necesidad de obtener extractos celulares. En la actualidad existe una amplia gama de protenas fluorescentes obtenidas a partir de distintos organismos, y que se han modificado para mejorar sus caractersticas. Diapositiva 11- Los mtodos de transfeccin se clasifican en dos grupos dependiendo del tipo de estrategia que se utiliza: Mtodos qumicos- se mezcla el ADN cargado negativamente con molculas de carga positiva, se forman complejos y estos pueden entrar en la clula por endocitosis Mtodos fsicos- se introduce el ADN de forma directa dentro de la clula o se fuerza su entrada. Diapositiva 12- Mtodos de transfeccin En cuanto a los mtodos qumicos existe una gran variedad de posibilidades: La coprecipitacin del ADN con fosofato clcico El DEAE-dextrano Los lpidos catinicos

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La polietilenemine (PEI) Los mtodos fsicos ms utilizados son: La electroporacin La microinyeccin del ADN dentro de la clula Mtodo biolstico Magnetofeccin Diapositiva 13- Barreras que tiene que superar el ADN. De hecho no es suficiente hacer entrar el ADN dentro de la clula, a parte de superar la barrera de la membrana plasmtica, el ADN dentro de la clula tiene que liberarse de las vesculas del endosoma, evitar la degradacin y entrar en el ncleo donde est toda la maquinaria transcripcional. Existen sistemas de transfeccin que son ms eficientes que otros en superar todas estas barreras. Diapositiva 14- Mtodos qumicos: coprecipitacin con fosfato clcico La coprecipitacin con fosfato clcico consiste en mezclar el ADN con cloruro clcico, y despus aadir tampn fosfato para que se formen los precipitados de fosfato clcico englobando el ADN. Los precipitados se depositan sobre las clulas y son endocitados. Este mtodo se ha utilizado mucho porque es muy econmico y para determinados tipos celulares funciona muy bin. Diapositiva 15- Mtodos qumicos: DEAE-dextrano El mtodo del DEAE-dextrano consiste en la formacin de complejos del polmero cargado positivamente con el ADN, y para promover la entrada de los complejos se hace un shock osmtico con DMSO o con glicerol. Este mtodo solo se utiliza en transfecciones transitorias como veremos ms adelante. Diapositiva 16- Mtodos qumicos: lposomas catinicos Uno de los mtodos que es muy utilizado en la actualidad es el de los liposomas catinicos. Se mezcla el ADN con liposomas cargados positivamente y estos hacen de carriers del ADN, facilitando su entrada al fusionarse con la membrana plasmtica. Este mtodo tambin recibe el nombre de lipofeccin, y existen muchas casas comerciales que venden sistemas de transfeccin basados en esta estrategia, y adaptados a tipos celulares especiales. Diapositiva 17- Protocolo de lipofeccin. Como ejemplo, aqu se presenta el protocolo que se sigue en una lipofeccin: El primer da se siembran las clulas para que al da siguiente estn bin adheridas y dividindose. El segundo da se diluye el DNA y se mezcla con los liposomas Se incuba la mezcla durante 10-15 min para dejar que se formen los complejos. Se retira el medio de las clulas y se aade la mezcla de transfeccin. Se incuban las clulas a 37C durante unas horas (1h a 6h) Se aade medio de crecimiento y se incuban durante 1-2 das hasta que se analiza la expresin del transgen. Diapositiva 18- La lipofeccin da una eficiencia de transfeccin alta y baja toxicidad, aunque resulta un mtodo ms caro que los otros mtodos qumicos. Aqu hay ejemplos

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del ensayo de beta-galactosidasa en distintas lneas celulares transfectadas por lipofeccin. Diapositiva 19- Mtodos qumicos: PEI Un mtodo que funciona muy bn para determinados tipos celulares es el mtodo del PEI (polietilenimine). Es un polmero catinico sinttico que se acompleja con el ADN, interacciona con los proteoglicanos aninicos d ela membrana plasmtica y entra por endocitosis. Es un mtodo econmico y fcil, aunque no funciona para todos los tipos celulares. Diapositiva 20- Comparacin entre distintos mtodos de transfeccin. Para que los alumnos vean que no todos los mtodos dan una eficiencia de transfeccin similar, aqu se presentan imgenes de inmunofluorescencia de un mismo tipo celular transfectado con dos mtodos distintos con la GFP. En este caso el PEI da una eficiencia mucho mejor que la lipofeccin, pero esto podra ser al revs para otro tipo celular. De ah la importancia de probar distintos mtodos y varias condiciones antes de elegir cmo transfectar un tipo celular determinado. Diapositiva 21- Comparacin eficiencia en distintas lneas celulares. Un mismo mtodo de transfeccin da distinta eficiencia en sistemas celulares distintos. Se presentan imgenes de expresin de la GFP en distintas lneas celulares transfectadas for lipofeccin. SE puede observar que la eficiencia varia segn la lnea celular. Diapositiva 22- Factores que pueden influir la eficiencia de transfeccin. Se ha visto que hay factores que pueden influir negativamente en la eficiencia de transfeccin: Los antibiticos pueden interferir en la formacin de los complejos La presencia de suero puede dificultar la formacin de los complejos, aunque por otro lado en ausencia de suero los liposomas pueden ser ms txicos. Normalmente la formacin de los complejos ADN-carrier se hace en medio sin suero y sin antibitico para evitar interferencias en la formacin de los complejos. Diapositiva 23- Mtodos Fsicos En cuanto a los mtodos fsicos de transfeccin nos encontramos con: Microinyeccin: inyeccin directa del ADN al citoplasma o ncleo de la clula Biolstico: bombardeo con micropartculas de tungsteno u oro recubiertas con ADN. Se utiliza una pistola especial que proyecta las partculas mediante gas a presin (helio) Electroporacin: En este caso se somete a las clulas a un shock elctrico corto que produce poros en la membrana plasmtica, por donde puede entrar el ADN. Con este mtodo se puede obtener elevada eficiencia, pero tambin produce elevada muerte celular. Diapositiva 24- Mtodos fsicos: microinyeccin La microinyeccin se debe realizar con un aparato especial controlando todo el proceso bajo el microscopio. Por microinyeccin se puede introducir cualquier tipo de macromolcula. Diapositiva 25- Mtodos fsicos: microinyeccin La microinyeccin presenta ciertas limitaciones en su aplicacin: Es una tcnica difcil y adems requiere del instrumental adecuado

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El nmero de clulas que se pueden microinyectar por sesin es limitado, porque es un procedimiento muy laborioso. Despus de la microinyeccin se tiene que hacer el seguimiento de cada clula individualizada. A pesar de sus limitaciones, se ha utilizado mucho para ciertas aplicaciones. Por ejemplo la generacin de animales transgnicos y knock-out/knock-in, tambin en el clonaje de animales, en la fecundacin in vitro, etc Diapositiva 26- Mtodos fsicos: biolstico El mtodo biolstico es una buena estrategia para introduccin de ADN en clulas resistentes a los mtodos qumicos de transfeccin. Consiste en el bombardeo de las clulas con micropratculas de tungsteno u oro, que han sido previamente recubiertas con el ADN que se quiere introducir. En la foto se muestra una pistola de helio de la casa comercial Bio-rad que recibe el nombre de gene gun. El video muestra de forma esquemtica el procedimiento que se seguira en la transfeccin de clulas vegetales por gene gun. Diapositiva 27-Mtodos fsicos: electroporacin La tcnica de la electroporacin aprovecha el hecho que la exposicin de las clulas a un campo elctrico de elevada intensidad provoca la despolarizacin de la membrana plasmtica y la formacin de poros, que al cesar el pulso elctrico se vuelven a cerrar. La apertura de poros, hace la clula permeable al ADN, el cual puede entrar al citoplasma y quedar atrapado dentro al cerrarse. Es una tcnica simple, reproducible y de gran eficacia. De hecho tambin se utiliza para la transformacin de bacterias. Presenta ciertas desventajas, normalmente la electroporacin se realiza en cubetas con los electrodos, y por lo tanto las clulas tienen que estar en suspensin. Esta tcnica provoca una elevada mortalidad celular, muchas clulas son daadas por el pulso elctrico, por lo que las condiciones que dan mejor eficiencia normalmente provocan la muerte del 40 al 60% de las clulas. Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular y hacer pruebas de optimizacin. Diapositiva 28- Mtodos fsicos: electroporacin Para la electroporacin se tiene que ajustar dos parmetros: - La amplitud del pulso (o voltaje) - Y la longitud del pulso (tiempo) o bin la capacitancia (son parmetros dependientes) Las condiciones que dan mayor eficiencia de transfeccin provocan una muerte celular de entre el 40 y el 60% En la actualidad tambin encontramos sistemas de electroporacin para clulas adheridas al sustrato y para electroporar in vivo. Diapositiva 29- Magnetofeccin La magnetofeccin es una combinacin de los dos tipos de mtodos, qumico y fsico. Consiste en la utilizacin de nanopartculas magnticas (de xido de hierro) las cuales se recubren del ADN que se quiere introducir, y con la ayuda de un imn se pueden

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concentrar en la superfcie celular y entrar por endocitosis o pinocitosis. Es un mtodo muy rpido, eficiente y no es txico para las clulas. El vdeo ilustra el procedimiento que se sigue en una magnetofeccin. Diapositiva 30- Tipos de transfeccin Dependiendo del tiempo que se mantiene la expresin del transgen hablamos de transfeccin transitoria o de transfeccin estable. En la transfeccin transitoria el ADN exgeno se mantiene en la clula en forma extracromosmica por lo que la expresin del transgen es transitoria (entre 1 y 4-5 das). Despus de este tiempo la expresin disminuye y se pierde porque el ADN termina degradndose. En la transfeccin estable se pretende obtener clulas que hayan incorporado el transgen en su genoma, y que por lo tanto mantengan la expresin de forma estable. Esta integracin del ADN transfectado ocurre al azar con una frecuencia de 1 de cada 10000 clulas. Para ello se tiene que hacer una seleccin de las clulas estables con una antibitico de seleccin, normalmente G418, higromicina o puromicina) Diapositiva 31- Transient vs. Stable transfection Estas dos modalidades de transfeccin conllevan unas ventajas y unos inconvenientes por lo que en cada caso se tendr qu valorar qu procedimiento seguir segn los objetivos finales del estudio. La transfeccin transitoria produce elevados niveles de expresin, aunque el porcentaje de clulas que expresan el transgen es variable. Es fcil de poder expresar a la vez varios genes (cotransfeccin). No se puede llegar a obtener grandes cantidades de protena porque la expresin es transitoria. Se necesita mucha cantidad de plsmido porque de hecho no se transmite de clula a clula. El mtodo de transfeccin transitoria es rpido y fcil. En cuanto a la transfeccin estable, el ADN exgeno se integra en una regin de un cromosoma, al azar y se integran pocas copias, por lo que los niveles de expresin son ms bajos que en la expresin transitoria. Es ms difcil de co-expresar varias protenas a la vez. Requiere de la seleccin clonal con un antibitico y esta seleccin representa el trabajo de ms de un mes. La poblacin celular es ms homognea porque proviene de una nica clula. Potencialmente puede ser una fuente inacabable de protena recombinante. Diapositiva 32- Clones estables: procedimiento Una vez las clulas han sido transfectadas por cualquiera de los mtodos descritos anteriormente (excepto del DEAE-dextrano). Se aade el antibitico de seleccin al cultivo, y al cabo de 7-10 dias se observa una muerte masiva del cultivo, todas las clulas que no han integrado el transgen, mueren y se desenganchan de la placa y slo quedan algunas clulas (1 de cada 10000 clulas que han sido transfectadas aprox). Estas despus de una semanas habrn formado colonias como la de la imagen, y se podran aislar con cilindros de clonaje, cultivar aisladamente y amplificar. Una vez se han amplificado se analizan para detectar el nivel de expresin del transgen y se eligen los clones que tengan mejor expresin. Diapositiva 33- Clones estables: seleccin con antibitico Se ensean imgenes de las clulas en los distintos pasos del proceso de seleccin. En los plsmidos de expresin podemos encontrar distintas cassettes de resistencia. Las ms habituales son la NEO, el antibitico de seleccin es la geneticina o G418, la HYG

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que confiere resistencia a la higromicina-B y PAC que confiere resistencia a la puromicina. Estos tres antibiticos actuan inhibiendo la sntesis proteica. Diapositiva 34- Esquema contenidos del Tema 9 Resumen de lo que hemos hablado en la clase y presentacin de la siguiente clase.