SOUTHERN BLOT (ALKPHOS DIRECT) Tablas de soluciones SSC 20x (Buffer de transferencia para cidos nucleicos, 1 L) Citrato Na3

(FW 258.1) 0.34 M 88.2 g NaCl (FW 58.44) 3.0 M 175.3 g Ajustar a pH 7-8 con NaOH 10 M y aforar a 1 L. Solucin desnaturalizante (1 L) NaOH (FW 40) 0.5 M NaCl (FW 58.44) 1.5 M Solucin de despurinizacin (1 L) HCl (concentrado, 11.6 0.125 M M) H20 (destilada) Solucin de neutralizacin NaCl (FW 58.44) 1.5 M Tris (FW 121.1) 0.5 M Preparacin de Southern blots 1. Separar las muestras de DNA en un gel de agarosa neutral adecuado mediante electroforesis. Agregar 0.1 ug/ml de bromuro de etidio para visualizacin. 2. Siguiendo la electroforesis, visualizar las muestras de DNA en un Transiluminador y fotografiar. 3. Despurinizar las muestras cubriendo el gel en solucin despurinizadora y agitar por 10 minutos, luego enjuagar con agua destilada. 4. Desnaturalizar las muestras cubriendo el gel en buffer de desnaturalizacin y agitar por 30 minutos, luego enjuagar con agua destilada. 5. Neutralizar las muestras cubriendo el gel en buffer de neutralizacin y agitar por 30 minutos, luego enjuagar con agua destilada. 6. Transferir las muestras a la membrana de nylon usando un protocolo de transferencia capilar estndar o un sistema de transferencia de vaco. Preparacin de la sonda marcada usando AlkPhos Direct

20.0 g 87.7 g

11 ml 989 ml

87.7 g 60.5 g

1. Diluir 20 l de solucin crosslinker con 80 l de agua para preparar la concentracin de trabajo. 2. Diluir la sonda a una concentracin de 10 ng/l en agua destilada. 3. Desnaturalizar 10 l de solucin de sonda calentando por 5 minutos en un bao mara hirviendo. 4. Inmediatamente enfriar el DNA colocndolo en hielo por 5 minutos. Centrifugar brevemente en una microcentrfuga para precipitar los contenidos al fondo del tubo. 5. Agregar 10 l de buffer de reaccin, 2 l de reactivo marcador y 10 l de crosslinker a concentracin de trabajo. Mezclar entre cada adicin, luego centrifugar los contenidos brevemente en una microcentrfuga. 6. Incubar a 37 C por 30 minutos. Mantener la sonda marcada en hielo hasta su uso. Hibridacin y lavados de estringencia 1. Preparar la cantidad requerida de buffer de hibridacin aadiendo NaCl 0.5 M y reactivo blocking 4% (p/v) y precalentar a la temperatura de hibridacin requerida. 2. Colocar los blots en el buffer de hibridacin y prehibridar por al menos 15 minutos. 3. Agregar la sonda marcada a la concentracin requerida e hibridar toda la noche. No desnaturalizar la sonda antes de aadirla al buffer de hibridacin. 4. Precalentar el buffer de lavado primario a la temperatura requerida. 5. Transferir con cuidado los blots a la solucin de lavado y lavar por 10 minutos a la temperatura requerida. 6. Llevar a cabo un lavado ms en buffer de lavado primaro a la temperatura requerida. 7. Colocar los blots en un contenedor limpio y lavar por 5 minutos a temperatura ambiente en buffer de lavado secundario. Repetir una vez. Deteccin fluorescente con reactivo ECF 1. Combinar los contenidos de los recipientes del buffer de deteccin y del reactivo de deteccin ECF y mezclar bien. 2. Drenar el exceso de buffer de lavado de los blots y colocarlos, el lado de la muestra hacia arriba, en una superficie limpia y no absorbente. No permitir que los blots se sequen. 3. Cubrir los blots con reactivo ECF y dejar por un minuto. 4. Drenar el exceso del reactivo de deteccin de los blots, colocarlos en una bolsa de deteccin y sellar la bolsa para prevenir que la muestra se seque.

5. Incubar a temperatura ambiente en la obscuridad por la cantidad de tiempo requerida. EL tiempo ptimo puede ser determinado al reescanear a varios tiempos. 6. Coloque la bolsa que contiene los blots en el instrumento de escaneado de fluorescencia. 7. Escanear el blot usando un filtro de emisin apropiado como est disponible y de acuerdo a las indicaciones para el uso del equipo de escaneado.

Bibliografa GE Healthcare. AlkPhos Direct, a quick and convenient high-sensitivity alternative to alternative probe labels. Recuperado el 20/05/13 en: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/13 14716762536/litdoc80644993AB_20110830172532.pdf