UNIDAD III.

FORMAS DE TRANSMISIN E IDENTIFICACIN DE LOS VIRUS DE PLANTAS

3.1. CONCEPTO DE TRANSMISIN DE VIRUS La propiedad de transmitirse de una planta enferma a una sana es una caracterstica fundamental de los virus al igual que otros agentes biolgicos que causan enfermedades. Los virus a diferencia de hongos y bacterias no tienen la capacidad de diseminarse por el viento o agua porque fuera de las clulas se inactivan con rapidez, adems, no pueden penetrar a la planta por sus propios medios y requieren que se les deposite directamente dentro de una clula.

Dada su condicin como parsitos obligados los virus no se pueden desarrollar en materia orgnica muerta; requieren del albergue en tejido vivo, ya sea en estado de reposo o de multiplicacin activa. El Virus Mosaico del Tabaco (VMT) constituye una de las pocas excepciones, ya que puede sobrevivir en restos de tejidos infectados que quedan en el campo despus de la cosecha, de tal manera que estos materiales sirven como fuente de inculo primario en el siguiente ciclo. Los virus requieren pasar constantemente de un hospedante infectado a otro sano, para poder sobrevivir en cualquier regin.

Los virus no penetran a las plantas de manera directa, ni salen de estas por sus propios dispersin no es activa; es pasiva y se da mediante los siguientes mecanismos: 3.2. TIPOS DE TRANSMISIN DE VIRUS

medios. La

Las formas en que los virus son transmitidos de plantas enfermas a plantas sanas son a) Propagacin vegetativa; b) mecnicamente; c) semilla; d) polen y e) biotransmisores.

3.2.1. TRANSMISIN POR PROPAGACIN VEGETATIVA Siempre que las plantas se propaguen vegetativamente mediante injerto, esquejes, tubrculos, bulbos o rizomas, cualquier tipo de virus que se encuentre en la planta madre, a partir de la cual dichos rganos de propagacin se obtienen casi siempre sern transmitidos a la progenie. Tomando en cuenta que casi todas las frutas y la mayora de los rboles de ornato, y los cultivos como papa se propagan mediante estos medios, este tipo de transmisin adquiere importancia significativa.

3.2.2. TRANSMISIN MECNICA Todos los virus pueden ser transmitidos a algunas plantas mediante inoculacin mecnica, pero no todas pueden infectar y establecer infeccin. En teora las partculas virales pueden ser introducidas a clulas vivas por este mtodo, pero para que el virus llegue a ser funcional depende de una gran variedad de condiciones como: el grado de susceptibilidad de la clula receptora, funcionamiento del genoma viral dentro de la clula, condiciones necesarias para la maduracin del virus, factores ambientales, etc. La TRANSMISIN MECNICA es definida como el proceso por el cual las partculas de virus son manualmente introducidas a una planta por heridas mecnicas, para facilitar la iniciacin de la infeccin en clulas potencialmente infectables.

La transmisin mecnica puede ocurrir de manera natural (campo) y de forma artificial (laboratorio); en campo, dicha transmisin puede efectuarse entre plantas bastantes prximas al rosarse con el viento, cuando las plantas son daadas por el hombre en las labores de cultivo, por medio de fumadores (como el caso del VMT), etc.

La transmisin mecnica artificial es de gran importancia a nivel experimental y se puede realizar de diferentes formas: frotis; injerto e inyecciones.

3.2.2.1. TCNICA DE FROTIS Es la tcnica ms usada artificialmente ya que presenta varias ventajas entre las que destacan de que es muy rpida y segura, facilita el estudio de los virus en ausencia de vectores, facilita el estudio de los virus "in vitro", se pueden separar virus mediante inoculaciones mecnicas por frotis y nos da pauta para realizar estudios sobre el nmero de lesiones locales que se obtienen con inoculaciones mecnicas (Holmes, 1929; demostr que el nmero de lesiones locales era proporcional a la concentracin del inculo en ciertas especies de tabaco inoculadas con VMT). La tcnica de transmisin por este medio es muy simple y la metodologa bsica es la siguiente:

a) Tomar aproximadamente dos centmetros cuadrados (preferentemente hojas), con los sntomas bien marcados. b) Macerar en un mortero el tejido de la planta enferma y agregar solucin buffer con un PH de 7.0 a 8.5. c) Adicionar carborundum de 400 o 600 mallas por pulgada cuadrada sobre las hojas que se van a inocular. d) Con un cotonete impregnado con savia infectiva se talla suavemente donde se aplic el carborundum y lavar con agua corriente para eliminar el exceso de este material. e) Colocar la planta inoculada en un lugar fresco y fuera del alcance de los insectos vectores para evitar traslape de resultados. Otros detalles de la transmisin mecnica.

1) Preferible inocular hojas cotiledonales 2) En plantas grandes inocular las hojas medias a jvenes 3) Gramneas deben inocularse por el envs de las hojas 4) Cucurbitceas inocularse preferentemente en hojas cotiledonales. 5) Macerar e inocular preferentemente a bajas temperaturas 6) Lavar la hoja inoculada inmediatamente despus de la inoculacin. 7) Las lesiones locales tienen menor concentracin que la superficie verde. 8) Inocular de preferencia por la maana o por la tarde. 3.2.2.1.1. FACTORES QUE INTERVIENEN EN UNA TRANSMISIN POR FROTIS

La eficiencia de la transmisin por frotis depende de varios factores como: FUENTE DE INOCULO, PREPARACIN DEL INOCULO, APLICACION DEL INOCULO, CONSTITUYENTES DEL INOCULO Y FACTORES AMBIENTALES. FUENTE DE INCULO.- El inculo puede ser obtenido de varias partes de la planta infectada, pero si las hojas muestran sntomas se deben de probar primero, ya que los tejidos leosos usualmente son ms pobres en partculas virales que las hojas. En hojas lo ms conveniente es usar la tiernas donde los sntomas estn ms acentuados, en hojas viejas, la concentracin de virus es menor. PREPARACIN DEL INCULO.- Los tejidos infectados pueden contener numerosas partculas de virus infecciosos, pero la infectividad depender de varias condiciones y tcnicas que pueden ser empleadas en la fase de la preparacin del inculo, que es por tanto, un factor muy importante que puede influenciar la efectividad del inculo. El inculo es preparado por extracto de virus de tejido enfermo, por unos momentos el virus est expuesto al medio ambiente el cual puede reducir su infectividad. Varias sustancias tales como metabolitos de la hospedera y escombros celulares son liberados simultneamente con el virus; algunos de estos componentes celulares producen substancias inhibitorias por lo que es necesario agregar un solvente apropiado como antiinhibidor. Generalmente, al momento de la preparacin del inculo se utiliza una solucin de fosfatos monobsicos y dibsico de potasio (solucin buffer) con PH 7.0-8.5 ya que esta solucin ayuda a mantener la configuracin del virus y aumenta la eficiencia de la infeccin ya que diluyen inhibidores.

APLICACIN DEL INCULO.- En este caso es muy recomendable que la planta que se va a inocular sea previamente herida con abrasivos, pudindose usarse carborundum de 400 600 mallas por pulgada cuadrada, celite, arena, carbn molido, caoln, etc., es importante evitar los excesos de abrasivo ya que causan daos muy fuertes a las plantas que pudieran confundirse a los causados por virus, tambin es necesario tallar muy suavemente la parte inoculada pudindose hacer con los dedos, cotonetes (mas usado), manta de cielo, esptulas de vidrio, etc., y posteriormente lavarse con agua corriente para eliminar los excesos de abrasivo. CONSTITUYENTES DEL INCULO.- Como se mencion anteriormente, varios componentes (INHIBIDORES) que resultan al momento de la maceracin, afectan la infectividad de los virus. Los inhibidores son de distinta naturaleza pudiendo encontrar a los taninos (los cuales actan sobre la protena y provocan precipitacin de virus) y polifenoles oxidativos (oxidasas). Para contrarrestar el efecto de estos componentes se usan los ANTIINHIBIDORES (sustancias que contrarrestan el efecto de los inhibidores), pudiendo usar nicotina y cafena (para taninos) y para los polifenoles usar cianamida, cido saliclico, hidroxilamina, cido tioglicolico y cido ascrbico. FACTORES AMBIENTALES.- Los factores ambientales juegan un papel muy importante en la transmisin mecnica por frotis en virologa; la luz, temperatura, nutricin y humedad son los factores ms importantes:

a) Luz.- Se ha observado que cuando la planta que es inoculada se le somete a perodos de oscuridad continua, tres das antes se favorece la infeccin; tambin cuando se inocula y despus se expone a altas luminosidades se aumenta la eficiencia de la transmisin. b) Temperatura.- Se ha determinado que cuando se inocula a altas temperaturas (>36 C), existe una marcada tendencia a no presentarse la infeccin; esto mismo sucede cuando las temperaturas son menores de 12 C. La ptima para inocular es de 18-25 C. c) Nutricin.- Se ha comprobado que es mejor inocular plantas con una nutricin ptima o en ocasiones con ligeros excesos de nitrgeno. d) Humedad.- La infeccin aumenta con los excesos de agua.

3.2.2.2. TCNICA DE INJERTO Este mtodo fue usado desde el siglo XVIII para la obtencin de plantas de tulipn que producan flores variegadas. Desde el siglo XX, el injerto se convirti en una tcnica muy til para el estudio de los virus y fue la base para determinar la naturaleza infecciosa de varias enfermedades.

El injerto es muy utilizado en virus que no se transmiten mecnicamente, pero hay que tener mucho cuidado ya que por esta tcnica tambin se transmiten otros agentes fitopatgenos. El injerto se puede realizar en plantas de diferentes especies y de diferentes gneros; cuando se usa esta tcnica en plantas diferentes existe menor posibilidad de que el injerto prenda pero, en este caso, lo nico que se persigue en virus es poner en contacto los tejidos vasculares de la planta enferma con los tejidos de la planta sana.

La metodologa usada es muy sencilla, se toma una planta que se utiliza como patrn, a la cual se le hace un corte en el tallo tratando de que llegue a los tejidos vasculares, se utiliza una hoja o una pequea rama de la planta enferma y con una navaja de rasurar se le quita la epidermis con el fin de dejar los haces vasculares descubiertos, posteriormente se introduce en el cuerpo del patrn, teniendo cuidado que los haces vasculares se pongan en contacto, para la transmisin del virus, luego se sella con Parafilm o polietileno y la planta se coloca en un lugar fresco, para esperar la aparicin de sntomas.

Las condiciones que se deben de tomar en cuenta para el xito del injerto son las siguientes:

1.- El corte debe de ser lo ms uniforme posible para que se establezca la unin entre el patrn y el injerto.

2.-Tratar de que la superficie de contacto entre patrn e injerto sea lo ms grande posible.

3.- Evitar la deshidratacin de los tejidos una vez que se haya realizado el injerto; esto se puede lograr colocando la planta en una cmara hmeda y si no se tiene, colocar una bolsa de polietileno hmeda.

3.2.2.3. TCNICA DE INYECCIN Esta tcnica fue una de las que se utilizaron por primera vez para la transmisin de virus en plantas; en la actualidad solo se utiliza para transmitir algunos virus que no se transmiten por frotis como por ejemplo, el Virus Curly Top de la Remolacha.

3.2.3. TRANSMISIN POR SEMILLA Cuando un virus infecta a una planta, invaden todos los tejidos y llegan hasta la semilla. La evidencia ms concluyente de que los virus se transmitan por medio de la semilla fue la presentada por Reddick y Stewart en 1919, cuando demostraron que las semillas de frjol infectadas con el Virus Mosaico Comn del Frjol producan plantas infectadas desde un 10-90 %. Doolittle y Gilbert (1919), tambin demostraron que el Virus Mosaico del Pepino se transmita por este medio en pepinillo. En la actualidad alrededor del 20 % de los virus de plantas conocidos se transmiten a travs de la semilla. La transmisin de virus por este medio ocurre cuando: el hospedante es infectado sistmicamente en la floracin, cuando el virus es capaz de invadir el polen y el vulo, cuando es capaz de sobrevivir en la gameta, cuando sobrevive a la deshidratacin de la semilla y al almacenamiento y cuando no es inactivado durante el desarrollo de la semilla. 3.2.3.1. IMPORTANCIA DE LA TRANSMISIN POR SEMILLA DE VIRUS EN PLANTAS La transmisin por semilla constituye uno de los factores ms importantes en el desarrollo epidmico de algunos virus. Las semillas infectadas dan origen a plntulas que representan una fuente de inculo inicial temprana, que adems se halla uniformemente distribuido. Las plntulas infectadas constituyen reservorios a partir de los cuales ocurre la dispersin secundaria del virus, lo cual sucede por transmisin mecnica o mediante vectores.

La gran mayora de los virus que se transmiten por semilla, persisten en el embrin; el porcentaje de transmisin depende de la raza del virus, el hospedante, las condiciones ambientales, entre otros factores, y su "longevidad" depende del hospedante, inculo, condiciones de almacenamiento y el perodo de almacenaje.

A continuacin se mencionan algunos virus de gran importancia que se transmiten por este medio, sus hospedantes y en algunos casos su perodo de viabilidad. VIRUS Virus Mosaico Comn del Frijol Virus Mosaico de la Alfalfa Virus Mosaico Sureo del Frijol Virus Mosaico del Pepino Pepino, Crtamo, Meln, Sandia, Calabaza, Tomate Virus Mosaico del Meln Meln, Calabaza, Sandia 3-5 aos 0.5-2.2 aos Alfalfa, Chile Frijol, Chcharo 3 aos 6 meses CULTIVOS Chcharo VIABILIDAD 3-3.8 aos

Virus Mosaico de la Soya Virus Mosaico de la

Soya Sandia

2 aos 3-5 aos

Calabaza Virus Mosaico del Tabaco Virus Mancha Anular del Tabaco Virus Mosaico Amarillo del Frijol Virus Mosaico del Maz Virus X de la Papa Virus Y de la Papa Virus Marchitez Manchada del Tomate Virus Mosaico de la Sandia Virus Mosaico del Trigo Calabaza Trigo, Maz X X Maz Papa Papa Tomate X X X X Chile Garbanzo, Meln, Soya, Tabaco Frijol, Haba X 3-9 aos 0.7-5.5 aos

3.2.3.2. MECANISMOS DE ENTRADA DE LOS VIRUS EN LA SEMILLA Los virus asociados con las semillas son acarreados de dos formas: como una infeccin o como una infestacin. La infeccin implica que el virus es llevado internamente, inmerso en los tejidos de la semilla y cuando el virus es llevado pasivamente se le conoce como infestacin o contaminacin. El Virus Mosaico Comn del Frjol, Virus Mosaico de la Soya, Mancha Anular del Tabaco, etc., son ejemplo de algunos virus que van internamente; el Virus Mosaico del Tabaco en tomate y la Marchitez Manchada del Tomate se encuentran en la cubierta de la semilla.

3.2.3.3. TCNICAS DE DETECCIN DE LOS VIRUS EN SEMILLAS La deteccin de virus en semillas es ms difcil que detectar hongos, bacterias y nematodos. Los virus son parsitos obligados y por tanto requieren de pruebas especiales para su deteccin; estas varan desde una observacin visual simple, hasta pruebas muy sofisticadas como el uso de serologa y microscopa electrnica. Las pruebas ms usadas se describen a continuacin:

A) Observacin de semillas secas.

Las observaciones visuales de la semilla revelan anormalidades tales como decoloracin, arrugamientos, reduccin en tamao, manchado, necrosis, etc. por ejemplo, el Virus Mosaico de la Soya provoca un moteado en la semilla de soya, el Mosaico del Tabaco causa necrosis y deformacin en semilla de tomate el Virus Mosaico de la Calabaza reduce el tamao en un alto porcentaje cuando infecta meln y calabaza.

B) Pruebas biolgicas.

Es uno de los mtodos ms usados por el agricultor ya que es econmico, fcil y muy seguro. Existen dos pruebas biolgicas:

1) Prueba de crecimiento.

La prueba de crecimiento es usada para determinar el porcentaje de transmisin por semilla. Se plantan 100 semillas en suelo, vermiculita u otro medio de crecimiento y una vez germinado son examinadas regularmente siguiendo muy de cerca los sntomas de los virus; en algunos casos como el V.M.C.F. la transmisin por semilla puede ser detectada una vez que las hojas primarias hayan aparecido. Sin embargo, los sntomas se observan ms claramente en el primero o segundo trifolio. 2) Deteccin usando plantas indicadoras.

Los virus pueden ser detectados en la semilla haciendo extracciones de diferentes partes de la semilla y posteriormente inoculando en plantas indicadoras. El Virus Mosaico Comn del Frjol es detectado al inocular la savia del embrin y cotiledones en plantas de frjol "Monroe" en donde reacciona con sntomas locales; Chenopodium amaranticolor es usado para detectar virus como por ejemplo, el Virus Mosaico del Pepino, Virus Mosaico de la Sanda, entre otros.

C) Pruebas bioqumicas.

Dentro de las pruebas bioqumicas el uso de a) Serologa, b) Tinciones de tejidos y c) Microscopio electrnico son las pruebas ms confiables para detectar virus en la semilla. a) Serologa.

Los mtodos serolgicos son usados para caracterizar y determinar las relaciones entre los virus. Estas pruebas estn basadas en la relacin entre un antisuero (virus purificado) y un antgeno (virus a identificar). Dentro de las pruebas serolgicas ms usadas para la deteccin de virus en la semilla se pueden mencionar las microprecipitacin serolgica, doble difusin en agar, aglutinacin serolgica, aglutinacin de cloroplastos y E.L.I.S.A., entre otros.

b) Tcnica de tincin.

Un gran nmero de colorantes tales como la acridina, giemsa, azul de triponina, entre otros, pueden detectar infecciones virales en los tejidos de las plantas. El uso de acridina (colorante fluorescente) sirve para diagnosticar la presencia del Virus del Chcharo de Vaca en semillas de chcharo; es muy simple y consiste en poner las

semillas de chcharo en agua durante dos das, agregarle el colorante y si existe la presencia del virus se observar un agregado de un color rojo fluorescente en las semillas infectadas.

c) Microscopa electrnica.

Consiste en hacer preparaciones de las posibles semillas infectadas y observarlas al microscopio electrnico. 3.2.4. TRANSMISIN POR POLEN Cuando una planta est infectada, el virus tiene la capacidad de llegar a infectar el polen y cuando este es acarreado por el viento o por insectos el virus se transmite de una planta enferma a una sana por este medio. La transmisin por medio del polen est muy relacionada con la transmisin de virus por semilla, por ejemplo, el Virus Mosaico Comn del Frijol tiene un mayor porcentaje de transmisin por semilla y por polen ya que la planta es autgama. La gran mayora de los virus que se transmiten por medio de la semilla tambin se transmiten por polen, por ejemplo, Virus Mosaico Comn del Frijol, Virus Mosaico de la Calabaza, Virus Mosaico de la Lechuga, etc. 3.2.5. TRANSMISIN DE VIRUS A TRAVS DE BIOTRANSMISORES Se aplica este trmino a cualquier agente vivo (excluyendo semilla y polen) capaz de portar o transmitir un virus fitopatgeno de una planta enferma a una planta sana. En sentido estricto la palabra vector no es sinnimo de biotransmisor, aunque en el lenguaje comn se usan de manera indistinta. Siendo ms comn el primer trmino. El ser vector implica que el virus es ingerido y se halla en contacto ntimo con el transmisor. Un ejemplo til de vector es el del mosco Anopheles, que transmite al protozoario causante del paludismo; el microorganismo ingerido se multiplica y sufre transformaciones en el interior del cuerpo del insecto, antes de poder ser transmitido. En muchos casos de biotransmisores de virus, el patgeno si se multiplica en el insecto pero hay abundantes excepciones en las que no sucede as.

Este tipo de transmisin incluye a los insectos, caros, nematodos, hongos, plantas parsitas y vertebrados, y constituye la forma ms importante de diseminacin de los virus en campo.

3.2.5.1. TRANSMISIN POR INSECTOS Constituye el grupo de biotransmisores ms importante de virus. La primera evidencia que se tiene de la transmisin por este medio fue la publicada por Takata en Japn (1895) y Takami (1901), donde se menciona a las chicharritas Inzuma dorsalis y Nephotettix cinctipes asociadas con el Virus Enanismo del Arroz. Ms tarde Doolittle (1916) demostr que el pulgn Aphis gossypii transmita al Virus Mosaico del Pepino; Botjes (1920) encontr que Myzus persicae poda transmitir al Virus del Enrollamiento de la Hoja de Papa. Actualmente se reconoce que ms de 400 especies de insectos transmite virus, y de todas estas especies Myzus persicae, es el ms importante ya que transmite alrededor de 85 virus diferentes. Las especies de insectos reportadas como transmisores de virus se encuentran principalmente en los rdenes Homptera (pulgones, moscas blancas,

chicharritas, escamas, psilidos, etc.); Thysanptera (trips); Coleptera (escarabajos); Orthptera (chapulines); Dermptera (tijeretas); Lepidptera (palomillas y mariposas); Dptera (mosquitos) y Hemptera (tingidos).

En general, durante la transmisin por insectos se pueden distinguir tres fases:

Perodo de adquisicin. Es el tiempo mnimo que requiere el insecto para adquirir el virus. Perodo de latencia. Tiempo transcurrido desde que el insecto adquiere el virus hasta que es capaz de transmitirlo.

Perodo de inoculacin. Tiempo mnimo requerido por el insecto para poder trasmitir el virus adquirido, una vez que empieza a alimentarse de una planta sana.

Hay otro trmino importante denominado perodo de retencin, que se refiere al tiempo durante el cual el insecto permanece infectivo.

3.2.5.1.1. CLASIFICACIN DE VIRUS DE ACUERDO A LA TRANSMISIN POR INSECTOS En base al fenmeno de transmisin de los virus por insectos estos se han clasificado en: virus no persistentes y virus persistentes. 3.2.5.1.1.1. VIRUS NO PERSISTENTES Llamados tambin virus de estilete o virus no circulativos, constituye el grupo ms grande y de mayor importancia en campo. Este grupo de virus se caracteriza por que el insecto que los transmite (generalmente pulgones), tiene un perodo de adquisicin (tiempo que tarda el insecto en adquirir a un virus) y un perodo de transmisin (tiempo que tarda el vector en transmitir a un virus) sumamente cortos (de 10-60 segundos). El insecto retiene al virus durante un perodo muy corto que puede ser de minutos u horas; esto depende del insecto ya que si este se alimenta ms rpido, ms pronto se deshace de los virus. El virus no penetra al tracto digestivo del insecto por lo que al darse el proceso de muda en este se elimina al virus; si el vector es sometido a un perodo de ayuno se aumenta la eficiencia de la transmisin. La mayora de estos virus presentan las siguientes caractersticas en comn: 1) Su punto de inactivacin trmica anda entre 50-65 C. 2) Generalmente son filamentosos (varilla rgida o flexible). 3) La longevidad "in vitro" es solamente de unos cuantos das. 4) Generalmente presentan sntomas de mosaico y manchas anulares. 5) La gran mayora se transmite por pulgones 6) Se transmiten muy fcilmente mecnicamente 7) Generalmente estn confinados a las clulas epidermales 3.2.5.1.1.2. VIRUS PERSISTENTES

Tambin llamados virus circulativos; y se caracterizan porque el insecto que los transmite (pulgones, mosca blanca, chicharritas, etc.) tienen perodos de adquisicin y transmisin largos (horas, das y hasta semanas) y adems poseen un perodo de incubacin (tiempo que tarda el virus en recorrer el tracto digestivo del insecto) que tambin es de horas, semanas y hasta das. En este caso el virus si penetra al tracto digestivo del insecto por lo que al darse el proceso de muda en este, no se pierde la infectividad.

Los virus persistentes presentan las siguientes caractersticas:

1) Generalmente poseen forma polidrica 2) Los sntomas ms comunes son: amarillamientos, enchinamientos, enrrollamientos, etc. 3) Su longevidad "in vitro" en algunos casos puede durar toda la vida del insecto. 4) Al mudar el insecto no se pierde la infectividad 5) Estn confinados a los tejidos vasculares de la planta. 6) Generalmente no se transmiten por medios mecnicos. 7) En la naturaleza sus principales vectores son mosca blanca, chicharritas, nematodos, etc.

Los virus persistentes se pueden clasificar en: circulativos, propagativos y transovricos. 3.2.5.1.1.2.1. PERSISTENTES CIRCULATIVOS Son aquellos virus que penetran al tracto digestivo del insecto vector, pero no se multiplican de este. Este tipo de virus generalmente son transmitidos por mosca blanca. 3.2.5.1.1.2.2. PERSISTENTES PROPAGATIVOS Son aquellos virus que penetran al tracto digestivo del insecto y se multiplican de este. Este tipo de virus se multiplican en la hemolinfa, tubos de Malpighi, cerebro, etc., y generalmente son transmitidos por chicharritas. 3.2.5.1.1.2.3. PERSISTENTES TRANSOVRICOS Son aquellos virus que penetran al tracto digestivo del insecto, se multiplican de este y adems la infectividad se pasa la progenie. Estos virus solo se transmiten por chicharritas y el virus aparentemente se multiplica en los rganos reproductores de la hembra; el Virus Enanismo del Arroz es un ejemplo tpico de estos virus. VIRUS TRANSMITIDOS POR FIDOS Los fidos, llamados comnmente pulgones, constituyen el grupo ms importante como vector de virus que transmiten alrededor del 60 % de todos los virus que se transmiten por insectos y porque adems transmiten virus principalmente del tipo no persistente pero tambin transmiten virus circulativos y propagativo. El ciclo de vida de los pulgones es muy variado y en lugares donde el invierno no es muy fro, se reproducen partenogenticamente y en las partes donde si hace fro existe reproduccin sexual, es decir, los machos fertilizan a las hembras, las cuales ponen huevecillos y de esta forma invernan. Los fidos generalmente tienen

un hospedante perenne que es el hospedante primario y un hospedante secundario que es una planta herbcea; las formas ms importantes como transmisores de virus son las aladas aunque las formas pteras son muy importantes en laboratorio; los pulgones empiezan el vuelo en las maanas muy temprano y dejan de volar unas cuantas horas antes de que acabe la luz, estos insectos son atrados por los colores brillantes, principalmente amarillo. Cuando un fido se coloca en una planta, primeramente realiza inserciones de su estilete de corta duracin cuya trayectoria es hacia el interior de las clulas epidrmicas: Si la planta es de su agrado, posteriormente, para alimentarse, realiza inserciones en la bsqueda de los haces vasculares a travs de los espacios intercelulares. El piquete de probado de corta duracin es el responsable de la adquisicin e inoculacin de virus no persistentes. El piquete de alimentacin se encarga de la transmisin de virus persistentes.

Los fidos transmiten virus que pueden ser transmitidos manualmente muy fcilmente y cuyos sntomas son generalmente los mosaicos, encontrndose dentro de estos a los Potyvirus, Cucumovirus, Carlavirus, Grupo del Virus Mosaico de la Alfalfa, etc., los cuales los transmite de manera no persistente y de manera persistente transmite a los de los grupo Luteovirus, Grupo del Virus Mosaico, Rhabdoviridae. VIRUS TRANSMITIDOS POR CHICHARRITAS De los hompteros del suborden Auchenorrhincha, las chicharritas (Cicadellidae) transmiten aproximadamente 40 virus distintos y la mayora de ellos son virus persistentes circulativos propagativos por lo que su perodo de adquisicin es sumamente grande (alrededor de 24 horas), el perodo de incubacin es de una a dos semanas y el perodo de persistencia es casi toda la vida. Tambin transmiten virus transovricos y los sntomas principales son amarillamientos, enrrollamientos y enchinamientos. Enanismo del Chcharo y a la familia

Para comprobar que el virus se multiplica dentro del insecto vector, con una microjeringa se extrajo hemolinfa de una chicharrita del genero Ogallia constricta y se inyect a otra y la infectividad se pas hasta en ocho generaciones; se comprob que el virus se multiplicaba en las clulas del epitelio, intestino, tubos de malpighi, ovarios, hemolinfa, etc. Los virus anteriormente mencionados que son transmitidos por chicharritas estn

incluidos dentro de las familias Rhabdoviridae y Reoviridae, y los grupos: Geminivirus, Grupo del Virus Rayado Fino del Maz y Enanismo Clortico del Maz, principalmente.

VIRUS TRANSMITIDOS POR MOSCA BLANCA Las moscas blancas son un grupo importante en la transmisin de virus ya que se les ha encontrado transmitiendo alrededor de 10 distintos Geminivirus; por lo menos cinco virus en forma de varilla distribuidos en los grupos Closterovirus, Carlavirus y Potyvirus, y otras enfermedades de tipo viral cuya partcula no ha sido observada. En todos los casos, la forma de transmisin es persistente circulativa. Para que la mosca blanca adquiera al virus requiere de un perodo de alimentacin de cuando menos 5 minutos, el cual va a depender del virus que se trate, su concentracin en el tejido vegetal, el biotipo, etc. El perodo de alimentacin mnimo para inocularlo en una planta sana es de 5 a 60 minutos y el perodo de incubacin es de 8-12 horas. El principal

vector es Bemisia tabaci y transmiten virus cuyos sntomas principales son: aclareamiento de nervaduras, amarillamientos, enchinamientos, entre otros. Algunos virus transmitidos son el Virus Mosaico Dorado del Frijol, Virus Enchinamiento del Tomate, Virus Mosaico Amarillo de Chile, etc. VIRUS TRANSMITIDOS POR ESCAMAS Las escamas tambin tienen la capacidad de transmitir virus; aun a pesar de que carecen de movimiento, pero las hormigas las trasladan de un lado a otro. El virus ms importante transmitido por estos insectos es el Virus de la Macroyemas del Cacao; al cual no se conoce con certeza su perodo de incubacin, su perodo de transmisin es de 36 das y tiene una incubacin de alrededor de 10 das. VIRUS TRANSMITIDOS POR COLEPTEROS Los colepteros transmiten virus circulativos y a diferencia de los hompteros, poseen un aparato bucal del tipo masticador y en lugar de glndulas salivales poseen glndulas gnetales las cuales secretan un jugo enzimtico en el tracto digestivo. Todos los virus transmitidos por estos insectos conservan su infectividad ante la accin de estas enzimas lo que no ocurre con otros virus. El perodo de adquisicin de estos insectos es mayor de 5 minutos y el perodo de persistencia o transmisin es de das a semanas. Cualquier virus adquirido por un coleptero es detectado en el excremento, la hemolinfa y en el regurgitado que genera el insecto en su alimentacin y que se piensa es la forma de transmisin. Las partculas de los virus trasmitidos por escarabajos son de forma polidrica y miden alrededor de 30 nm de dimetro, son relativamente estables en el laboratorio y usualmente causan mosaicos y moteados. Casi todas las especies vectoras pertenecen a la familia Crysomelidae (Alticinae y Galerucinae) pero tambin la familia Coccinelidae y Curculionidae (picudos) transmiten virus; la mayora de los virus transmisibles por colepteros se encuentran en los grupos Comovirus y Tymovirus, encontrndose principalmente al Virus Mosaico de la Calabaza ( Acalymma trivittata, Diabrotica undecimpunctata y Ceratoma trifurcata), Virus Mosaico Sureo del Frijol (Ceratoma spp., Diabrotica balteata y Epilachna varivestis), Virus Mosaico del Nabo, etc. VIRUS TRANSMITIDOS POR TRIPS Los trips presentan dos estadios larvarios pteros los cuales se alimentan de su planta hospedante. Los siguientes dos o tres estadios larvarios muestran pequeas protuberancias de alas, son inactivos y no se alimentan. El ltimo estadio preadulto es una pupa encerrada en un capullo del cual sale el adulto. El virus ms ampliamente estudiado, transmitido por estos insectos es el Marchitez Manchada del Tomate, el cual se encuentra ampliamente distribuido, tiene un amplio rango de hospedantes y es transmitido por Thrips tabaci, T. setosus, Frankiniella schultzei, Frankiniella fusca, F. occidentalis y Scritothrips dorsalis; los cuales lo adquieren en un perodo de 30 minutos, su latencia es de 5 a 12 das y su perodo de persistencia es alrededor de tres semanas. Solamente las partculas virales adquiridas por el insecto durante los primeros estadios larvales atraviesan el tracto digestivo y llegan a las glndulas salivales para ser transmitidos en la etapa adulta. A pesar de que el estado adulto no es virulfero (virulento), ste puede adquirir al virus pero no logra trasmitirlo, supuestamente debido a que conforme aumenta la edad del insecto, decrece la permeabilidad del intestino. Otros

virus reportados que pueden ser transmitidos por estos insectos son el Virus Mancha Anular del Tabaco y el Virus Mosaico del Chcharo.

VIRUS TRANSMITIDOS POR OTROS INSECTOS Varias especies de piojos harinosos (Homptera: Pseudococcidae), han sido reportadas como transmisores de algunas razas del Virus de la Macroyemas del Cacao, el virus puede ser adquirido en una hora e inoculado en 15 minutos y persiste por tres o cuatro das. El transmisor de este virus es Planococcoides njalensis y el virus se caracteriza por ser de forma baciliforme, se transmite muy fcilmente mecnicamente y posee un rango moderado de plantas. Dos especies de tingidos son reconocidos como transmisores de virus en remolacha, uno se encuentra reportado en Europa y otro en Norteamrica.

3.2.5.2. TRANSMISIN DE VIRUS POR HONGOS Desde hace mucho tiempo se empez a manejar la posibilidad de que los hongos transmitieran enfermedades virales, sin embargo, los trabajos se iniciaron en la dcada de los 70's y fue Olpidium brassicae, el primer hongo reportado transmitiendo al Virus de la Necrosis del Tabaco. Existen dos grupos de hongos, ambos de la clase Phycomycetes, que se han reportado como transmisores de enfermedades virales; en los Chytridiales, Olpidium brassicae, transmite al Virus Satlite de la Necrosis del Tabaco, Virus Necrosis del Pepino, Virus Macronervaduras de la Lechuga y Achaparramiento del Tabaco; en los Plasmodiophorales, Polymyxa graminis transmite al Virus Mosaico del Trigo, Mosaico de la Avena y Virus Mosaico Amarillo de la Cebada , y Spongospora subterranea, transmite al Virus Mop-top de la Papa. Tambin se reporta que una especie de Pythiaceae (Pythium ultimum) transmite al Virus X de la Papa. El hongo adquiere al virus y lo retiene indefinidamente en el esporangio (se ha comprobado que los esporangios de reposo de Olpidium brassicae pueden sobrevivir hasta ocho aos y mantener al virus) y despus es diseminado por las zoosporas.

3.2.5.3. TRANSMISIN DE VIRUS POR NEMATODOS La transmisin de virus por nematodos fue reportada desde 1958 por Hewitt, Rashi y Gehen, demostrando que el nematodo Xiphinema index transmita al Virus de la Hoja de Abanico de la Vid. Actualmente, dos grupos de virus son transmitidos por estos habitantes del suelo; los Nepovirus, los cuales tienen partculas isomtricas que miden alrededor de 30 nm de dimetro y los Tobravirus, los cuales la gran mayora son de partculas tubulares. Los nematodos vectores de estos dos grupos de virus corresponden al orden Dorylaimida, los cuales incluyen relativamente pocas especies conocidas como parsitos de plantas y los gneros ms comunes como transmisores de virus son Xiphinema y Longidorus (para Tobravirus) y Trichodorus (para Nepovirus). Tanto los Nepovirus como los Tobravirus pueden ser adquiridos de 15 minutos a una hora y puede ser inoculados en un perodo ms o menos similar, ambos grupos son retenidos por sus vectores por semanas y son transmitidos tanto por las larvas como por los adultos, no existe evidencia de transmisin transovarial, ni de multiplicacin del virus en el vector, se transmiten muy fcilmente mecnicamente, por semilla, y los sntomas generalmente son mosaicos y manchas anulares. Algunos virus que son transmitidos por estos vectores son: Virus de la Hoja de Abanico de la Vid (Xiphinema index y X. diversidaudatum), Mancha Anular del Tabaco (X. americanus), Virus

Anillo Negro del Tomate (Longidorus elongatus), Virus Cascabeleo del Tabaco (Trichodorus pachydermus) y el Virus Bronceado Temprano del Chcharo (T. teres).

3.2.5.4. TRANSMISIN DE VIRUS POR CAROS Los caros transmisores de virus se encuentran en las familias Eriophydae y Tetranychidae y se cree que transmitan virus del tipo circulativo ya que cuando estos artrpodos mudan no se pierde la infectividad. El cuerpo de los adultos (que son los transmisores de virus) es alargado y mide alrededor de 2 mm de longitud, se alimentan principalmente de hojas y otras partes de las plantas y con su estilete y dos pares de apndices que tienen en el rostro succionan, la savia de las clulas de las plantas. Cuatro de los virus transmitidos por Eriophydae tienen partculas filamentosas de alrededor de 700 nm de longitud, son transmisibles por savia y los sntomas que causan son principalmente mosaicos y moteados. El caso ms conocido es Virus Mosaico del Trigo que es transmitido por Aceria tulipae; el virus puede ser adquirido en 15 minutos, persiste alrededor de 9 das y puede ser transmitido despus de 15 minutos. Los adultos no adquieren al virus pero si lo transmiten. Otros virus transmitidos por caros son el Virus Mosaico del Higo (Aceria ficus), Virus Mosaico del Durazno (Eriophyes insidiosus), el Virus Y de la Papa (Tetranychus telarius) y el Virus Mancha Anular del Tabaco (Tetranychus spp). 3.2.5.5. TRANSMISIN DE VIRUS POR PLANTAS PARSITAS En principio, la transmisin por injerto y la transmisin por plantas parsitas es de manera similar, ya que ambos mtodos se pone en contacto el sistema vascular y las clulas. La transmisin se realiza por medio de unas estructuras que poseen estas plantas llamados haustorios. Alrededor de 20 especies de Cuscuta han sido usadas para transmitir virus, sin embargo, Cuscuta campestris y Cuscuta subinclusa, son las especies ms importantes al transmitir 24 y 12 virus, respectivamente. Los virus ms importantes transmitidos por plantas parsitas son el Virus Mosaico del Pepino, Mosaico del Tabaco y Virus Mosaico del Meln.

3.2.5.6. VIRUS TRANSMITIDOS POR VERTEBRADOS Dentro de los vertebrados transmisores de virus el hombre es considerado factor de diseminacin ms importante ya que transmite virus por semilla (transporte), partes vegetativas y labores culturales. Todos los animales vertebrados que se conocen pueden transmitir virus de manera mecnica.

3.3. IDENTIFICACIN DE VIRUS La identificacin de virus es considerado como el proceso mediante el cual se diagnostica con precisin la presencia real del de los virus presentes en una planta hospedante. Para diagnosticar una enfermedad, lo primero que hay que conocer es la naturaleza de la misma, ya que ser la base primaria de identificacin del patgeno causante y por tanto se implementarn las medidas de control pertinentes. Cuando se nos presenta un problema en campo, en donde se especula la presencia de patgenos; la primera muestra de que la planta est enferma ser basndose en la sintomatologa que sta manifiesta. An a pesar de que los sntomas no son un criterio bsico para determinar al agente causal de una enfermedad, si son de gran utilidad para algunos, ya que los sntomas difieren del resto de los dems.

Comprobar la naturaleza infecciosa de la enfermedad

Antes que nada debe de determinarse que la enfermedad se puede transmitir de una planta enferma a una sana, ya que solo las enfermedades de naturaleza bitica son infecciosas. Este aspecto se prueba haciendo injertos de brotes de plantas enfermas en plantas sanas cultivadas en invernadero. Es obvio que el invernadero deber estar protegido para evitar el acceso de vectores.

A continuacin se mencionan algunas caractersticas para la identificacin de los virus fitopatgenos. 3.3.1. PRUEBAS DE ELIMINACIN DE VIRUS El primer paso en la identificacin de un virus es saber si la enfermedad es causada por ste y no por otros fitopatgenos como hongos, bacterias, nematodos, micoplasmas, espiroplasmas, plantas parsitas, deficiencias de nutrientes, etc.

Para efectuar el diagnstico de enfermedades ocasionadas por plantas parsitas superiores, solo se requiere encontrarlas en crecimiento activo sobre las ramas o races de sus plantas hospederas. La presencia de nematodos fitoparsitos indica que probablemente sea esta la causa de la enfermedad; si en un rea afectada se localiza con la ayuda del microscopio biolgico se encuentra esporas de hongos y bacterias entonces se recomienda aislar para realizar las pruebas de patogenicidad con los microorganismos aislados. Si los sntomas de la enfermedad se reproducen en una planta sana injertada se descarta la posibilidad de factores abiticos; si la enfermedad se logra transmitir mecnicamente la enfermedad se considera de origen viral; si no existe transmisin por savia y los sntomas se logran suprimir con la aplicacin de tetraciclinas ser un micoplasma y si se hace con penicilina ser un espiroplasma. Si los sntomas no desaparecen con la aplicacin de antibiticos entonces ser un virus o viroide.

Una vez establecido que es un virus el causante de la enfermedad, se requiere de una serie de pruebas para determinar su infectividad dentro de las cuales tenemos las siguientes:

3.3.2. RANGO DE HOSPEDANTES Desde hace mucho tiempo y hasta nuestros das los que se encargan del estudio de los virus de plantas, utilizan hospedantes alternos en la identificacin de estos patgenos, especialmente cuando estos son transmisibles por savia. Estos hospedantes alternos responden con algn tipo de sntoma especfico (es mejor cuando reaccionan con lesiones locales) al ataque de un virus y reciben el nombre de plantas indicadoras o plantas diferenciales.

El uso de plantas indicadoras es muy importante en los estudios de identificacin de virus ya que mediante estas plantas se puede confirmar la presencia de un virus en una planta cuando los sntomas sean desconocidos, son un factor de gran importancia en la identificacin de enfermedades latentes causadas por virus y nos pueden

servir en la separacin de virus cuando exista un complejo viral atacando. Las plantas indicadoras ms usadas en la identificacin de los virus son las siguientes: Nicotiana glutinosa, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Phaseolus vulgaris, Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Physalis spp. etc., las cuales reaccionan a los diferentes virus de plantas.

3.3.3. PROPIEDADES DE INFECTIVIDAD DE LOS VIRUS Llamadas tambin propiedades fsicas de los virus y son usadas comnmente para conocer la concentracin y estabilidad de las partculas virales en la savia. Las ms importantes son el punto de inactivacin trmica (PIT), punto final de dilucin (PFD) y la longevidad "in vitro".

3.3.3.1. PUNTO DE INACTIVACIN TRMICA (PIT) Es la temperatura mxima que soporta un virus para seguir conservando su infectividad durante un perodo de exposicin de 10 minutos. La prueba es sencilla y consiste en extraer al virus de la planta hospedante y depositar 5 ml de savia para cada tratamiento. La savia se coloca en tubos de ensayo y se ajusta a distintas temperaturas con un perodo de exposicin de 10 minutos y se separa con un intervalo de 5 C; para mantener la temperatura constante se puede usar un bao mara y una vez transcurrido el tiempo de exposicin se detiene el tratamiento sumergiendo los tubos en agua helada. Posteriormente se inocula en plantas que de preferencia reacciones con lesiones locales y en caso de no existir se usa plantas que presenten sntomas sistmicos; es conveniente empezar a inocular del tratamiento con mayor temperatura con el fin de evitar contaminaciones. El punto de inactivacin trmica de de los virus tiene un rango de 45 C (como el Virus Marchitez Manchada del Tomate) hasta 95 C (algunas razas del Virus Mosaico del Tabaco), pero la gran mayora est entre 55 y 70 C ; en virus ms complejos, como los que poseen lpidos el PIT es bajo. Diferentes razas de un mismo virus pueden tener diferente PIT; por ejemplo, para la raza B del Virus de la Necrosis del Tabaco est entre 80 y 85 C, la raza A, entre 85 y 90 C y para la razas D y E, es de 90 a 95 C.

3.3.3.2. PUNTO FINAL DE DILUCIN (PFD) Es la dilucin mxima que soporta un virus para seguir conservando su infectividad. La metodologa consiste en extraer la savia de la planta enferma y se agrega un mililitro en un tubo de ensayo que contenga 9 ml de agua destilada o solucin buffer al 0.01 molar y un PH de 7.0 para tener la dilucin de 10-1; el tubo se agita hasta mezclarse bien la savia con el agua y de este se agrega a otro tubo con la misma cantidad de agua para obtener la 10-2 y as sucesivamente hasta llegar a 10-8. Una vez realizadas las diluciones, inocular en plantas que reaccionen con sntomas locales iniciando con la dilucin ms alta. Esta tcnica depende de la concentracin del virus, del diluyente, las condiciones y especies de las plantas donde se tom el inculo, las plantas inoculadas y el abrasivo usado para facilitar la infeccin. El PFD de la mayora de los virus se encuentra entre 10-1 a 10-7. 3.3.3.4. LONGEVIDAD IN VITRO

Es el tiempo que dura el virus fuera del tejido hospedante una vez extrada su savia y sometida a temperatura ambiental. La savia se guarda en un frasco y se va inoculando a intervalos de tiempo dependiendo del grupo de virus que crea uno que tenga hasta que se pierda la infectividad. La longevidad "in vitro" vara de una hora (Virus Mosaico de la Manzana) hasta ms de un ao (Virus Mosaico del Tabaco).

3.3.4. TIPO DE PARTCULA VIRAL Con el descubrimiento de la microscopa electrnica se logr un importante avance en la identificacin de los virus de plantas ya que basta en muchos de los casos, una observacin del tipo de partcula del virus en estudio para diagnosticar al virus que se encuentra presente 3.3.5. FORMAS DE TRANSMISIN Desde un principio debe intentarse la transmisin mecnica ya que este aspecto permite hacer diversos estudios y da una idea del posible grupo de virus al que pertenece el patgeno en estudio.

Independientemente de que se transmita o no de manera mecnica el agente infeccioso, se debe probar la transmisin por insectos y de ser necesario, la posible transmisin por hongos, nemtodos y otros agentes sospechosos de actuar como vector.

3.3.6. PRUEBAS SEROLGICAS Todas las tcnicas anteriores forman parte del protocolo formal para identificar virus desconocidos en una regin. Sin embargo, en los diagnsticos de rutina su uso es cada da menor, ya que otras tcnicas ms rpidas y eficaces, como la serologa presentan amplias ventajas (y algunas desventajas).

Los mtodos serolgicos han sido reconocidos desde hace miles de aos en animales que mostraban inmunidad a ciertas enfermedades. La mayora de las reacciones inmunolgicas tienen un comn bsico. El agente inmunolgico, llamado tambin antgeno (en la enfermedad el patgeno), estimula al animal a la formacin de protenas llamadas anticuerpos que aparecen en el suero; estas reaccionan especficamente con el antgeno que estimul su formacin. El suero que lleva a los anticuerpos se llama antisuero, y al que no lleva se le conoce como suero normal. Si el antisuero se mezcla con el antgeno que dio origen a los anticuerpos, se presenta una reaccin homloga o positiva y cuando la mezcla no fue con los que dieron origen la reaccin es heterloga o negativa. La serologa constituye una de las herramientas ms importantes en estudios tales como:

-Diagnsticos rpidos y precisos -Estudios epidemiolgicos -Relaciones entre virus y entre sus variantes

Bases de la serologa La tcnica se fundamenta en el conocimiento que se tiene sobre la reaccin (produccin de anticuerpos) que ocurre en los animales de sangre caliente cuando son invadidos por un agente extrao (antgeno; en este caso el virus).

Los antgenos son molculas o partculas constituidas por polisacridos y/o protenas de elevado peso molecular, ajenas al animal inoculado. De hecho un proceso similar ocurre diariamente en la naturaleza cuando los animales sealados se defienden del ataque de microorganismos potencialmente patgenos. En contraparte los anticuerpos son macromolculas producidas por el animal inoculado natural o artificial mente. Las reacciones antgeno anticuerpo se caracterizan por ser relativamente especficas. As un antgeno "A" dar origen a un anticuerpo "A" y un antgeno "B" inducir la sntesis de un anticuerpo "B"; pero ni "A" dar origen a "B" y viceversa; tampoco "A" ni "B" producirn anticuerpos C, D...ni N.

Los anticuerpos son protenas del tipo de las gamaglobulinas especficas. Los anticuerpos funcionan como un sistema de defensa especfica contra el antgeno que indujo su formacin. Partculas de nucleoprotenas, tales como los virus, funcionan como antgenos; en este caso, la cpside (cubierta de protena) determina el tipo de antgeno, (segn el arreglo de sus aminocidos) que ser producido.

Este fenmeno que ocurre de manera natural tambin puede ser inducido inoculando animales con virus conocidos, con el fin de aprovechar los anticuerpos producidos en estudios de identificacin y diagnstico de virus. La produccin controlada de antisueros (anticuerpos presentes en SL suero sanguneo) se lleva a cabo en algunos centros de investigacin y en los ltimos aos constituye un prspero negocio de algunos laboratorios que se encargan de producir los a nivel comercial. Ejemplos de estas compaas internacionales son Agdia y Sanofi. Produccin de antisueros Aunque en si la produccin de antisueros no es una tarea complicada, para lograr una alta calidad si se requiere de personal altamente capacitado. En trminos generales el proceso consiste en inocular plantas susceptibles con el virus especfico. Posteriormente el tejido infectado se macera y se somete a proceso de extraccin con solventes, agentes de precipitacin y otras substancias, auxilindose tambin con el uso de centrfugas y ultracentrfugas hasta obtener al virus con la mayor pureza posible. El virus purificado se inyecta mediante un programa calendarizado en algn animal de sangre caliente, tales como conejos de Nueva Zelanda, caballos, borregos u otros. El virus tiene que combinarse con substancias coadyuvantes antes de inyectarse, para que el virus sea liberado lentamente y no cause un shock en el animal.

Despus de cierto nmero de inyecciones y 5-10 das despus de la ltima, se puede hacer un sangrado previo para checar la concentracin de los anticuerpos en la sangre del animal. Una vez determinada la

concentracin ptima, el animal se puede sangrar parcialmente o se sacrifica (aplicando antes un anticoagulante), tratando de obtener la mayor cantidad de sangre posible.

Se deja la sangre en reposo y una vez que esta se coagula, se separa el suero que contendr los anticuerpos (antisuero), el cual se guarda congelado (15-25C) en pequeas ampolletas cerradas hermticamente, previa incorporacin de un microbicida. Este antisuero est listo para su uso, previa dilucin del mismo a las concentraciones adecuadas. Reacciones serolgicas Es posible aprovechar la capacidad de los anticuerpos para reconocer y acoplarse con el antgeno especfico que indujo su formacin con fines de identificacin de virus. Es decir si tenemos una muestra de una planta infectada con un virus "X" desconocido, podemos utilizar nuestro banco de antisueros para tratar de identificar al patgeno en estudio. Si al hacer reaccionar por separado cada antisuero disponible, y entre nuestros antisueros est un antgeno "X", habr un reconocimiento y una reaccin entre antgeno "X" y los antisueros conteniendo al anticuerpo "X", pero no con los antisueros "Y", o "Z"; estos ltimos daran reaccin positiva solo en el caso de que en la muestra hubiera los antgenos (virus) especficos correspondientes.

Existen diversidad de tcnicas disponibles, cada una con ventajas y desventajas, entre las ms usuales: Doble Difusin en Agar, Latex, Elisa, Dot Blot, etc. La tcnica ELlSA es la ms usada en la mayora de los laboratorios.

3.3.6.1. DOBLE DIFUSIN EN AGAR Para efectuar esta reaccin se emplea una caja de petri, con agar puro. Se hacen perforaciones equidistantes de un agujero central. Para evitar que el antisuero y el antgeno se difundan por el fondo del vidrio, se sellan las perforaciones con una gota de agar lquido. En la perforacin central se coloca el antisuero y en la periferia la savia del virus y se espera 24-72 horas para observar la reaccin la cual si es positiva se manifestar en forma de media luna o espuela (cuando los antgenos estn relacionados). 3.3.6.2. PRUEBA DE ELISA Las tcnicas serolgicas convencionales (aglutinacin, doble difusin en agar) tenan numerosos inconvenientes, tales como una baja sensibilidad, o el efecto de la forma la forma de la partcula, presencia de inhibidores de la reaccin presentes en la savia. Estas desventajas quedaron superadas con la tcnica ELlSA, la cual revolucion la serologa. Esta tcnica desarrollada inicialmente en patologa clnica e inmunologa, fue adaptada en 1976 para utilizarse en la deteccin de virus fitopatgenos. Desde entonces ha sido una de las tcnicas ms utilizadas, junto con las tcnicas moleculares como PCR, que fueron desarrolladas poster. El trmino ELlSA se deriva de "Enzyme-Lynked-Immuno-Sorbent-Assay" que puede traducirse como "Ensayo de inmunoabsorbencia con enzimas conjugadas".

La ELlSA es ampliamente usada en investigacin por su alta sensibilidad y especificidad, por su carcter prctico y verstil en su metodologa, lo que permite trabajar gran cantidad de muestras con pequeas cantidades de tejido vegetal. Es posible detectar virus an en plantas con sntomas muy tenues o asintomticas y permite cuantificar concentraciones del virus. Tambin permite detectar virus en semillas e incluso en insectos vectores. Tambin se pueden detectar hongos y bacterias con ELlSA.

El mtodo ELlSA consiste bsicamente de cuatro fases principales:

1. La adsorcin de un antisuero especfico a la pared de un pozo de plstico.

2. Se agrega un extracto de la planta infestada. Las partculas virales se adhieren a los anticuerpos portadas en el antisuero, que previamente se adhiri a las paredes del pozo.

3. De nuevo se agrega el antisuero usado inicialmente, pero conjugado previamente con una enzima (por ejemplo la fosfatasa alcalina). Este conjugado se adhiere al virus, de tal forma que este queda atrapado entre el conjugado y el anticuerpo agregado inicialmente (se forma un "sndwich" con el virus en medio).

4. Se agrega un substrato sobre la cual pueda actuar la enzima conjugada. Al combinarse la enzima con el substrato se registra un cambio de coloracin a simple vista, cuya intensidad ser proporcional a la concentracin.

Cabe sealar que entre cada paso el pozo se lava con una solucin especial que contiene detergente y se desecha el lavado, de tal manera que si la muestra de savia no tena al virus correspondiente al antisuero utilizado, en el primer lavado (despus del punto 1) los anticuerpos no atraparn ninguna partcula viral (dada su especificidad). Si esto ocurre el conjugado (enzima-anticuerpo) tampoco se pegar y ser eliminado por el segundo lavado. Despus al agregar el substrato, este no ser afectado porque la enzima ya fue eliminada. En consecuencia no habr cambio de coloracin.

Esta tcnica descrita es la que se usa con mayor frecuencia y se conoce como "ELlSA Sndwich doble anticuerpo". Existen variantes de ELlSA, que se usan en situaciones especiales.

Es claro que la tcnica es fcil de llevar al cabo, pero para que su utilizacin sea confiable se requiere de experiencia, ya que pequeos detalles a veces son la diferencia entre un diagnstico adecuado y uno errtico. La tcnica se facilita con el uso de equipo apropiado y en algunos laboratorios bien equipados el procedimiento es semiautomtico. Las placas con los pozos se pueden "leer" en un espectrofotmetro especial, para cuantificar la concentracin del virus. Un aspecto muy importante es la cantidad de antisueros

que se tengan disponibles y la calidad de los mismos. Algunas compaas como Agdia y Sanofi son proveedores de equipo, reactivos y antisueros de alta calidad.

Cabe mencionar que desde la dcada pasada inici el desarrollo de las tcnicas moleculares, las cuales hoy en da han alcanzado un alto desarrollo y su avance es vertiginoso. Tcnicas como la de Reaccin de la Polimerasa en Cadena (Polymerase Chain Reaction = PCR), tienen una sensibilidad mucho mayor que ELlSA, de tal manera que muestras registradas como sanas mediante ELlSA (porque el virus est poco concentrado) en realidad si estn infectadas. Estas nuevas tcnicas tienen una gran importancia en la deteccin de virus en frutales, semillas, etc. Su utilidad prctica es grande en diversos casos: por ejemplo en la certificacin de sanidad de semilla, material propagativo, etc.

Tcnicas moleculares En este caso se usan tcnicas ms sofisticadas, que requieren de equipo especial, que por su alto costo solo se tiene en aquellos laboratorios ms avanzados en la investigacin en virolgica. Las tcnicas moleculares incluyen diversos aspectos del anlisis bioqumico de los virus, entre ellas el anlisis del genoma vira!. Ejemplos de estas son la Reaccin de la Polimerasa en Cadena tambin llamada PCR, o la Hibridacin de cidos Nucleicos. Se caracterizan porque son muy sensibles y ms precisas que otras tcnicas. Regularmente estas pruebas se ejecutan, en casos especiales de diagnstico o con fines ms especficos. Sin embargo, en la medida que los reactivos y el equipo utilizado sea ms barato y cuando exista personas ms capacitado, estas tcnicas aparentemente se volvern tan rutinarias como ELISA.