11 Nmero de publicacin: 19

OFICINA ESPAOLA DE PATENTES Y MARCAS

2 258 816

51 Int. Cl.:

ESPAA

C12N 15/53 (2006.01) C12N 15/81 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) C12N 1/19 (2006.01) C12P 7/64 (2006.01) C11B 1/00 (2006.01) A61K 31/20 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA T3

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86 Nmero de solicitud europea: 98915430 .7 86 Fecha de presentacin : 10.04.1998 87 Nmero de publicacin de la solicitud: 0975766 87 Fecha de publicacin de la solicitud: 02.02.2000

54 Ttulo: Procedimiento y composicin para la sntesis de cidos grasos polisaturados de cadena larga.

30 Prioridad: 11.04.1997 US 834655

73 Titular/es: Calgene L.L.C.

1920 Fifth Street Davis, California 95616, US ABBOTT LABORATORIES

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:

72 Inventor/es: Knutzon, Deborah;

01.09.2006

Mukerji, Pradip; Huang, Yung-Sheng; Thurmond, Jennifer; Chaudhary, Sunita y Leonard, Amanda, Eun-Yeong
74 Agente: Ponti Sales, Adelaida

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

01.09.2006

ES 2 258 816 T3

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. P de la Castellana, 75 28071 Madrid

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DESCRIPCIN Procedimiento y composicin para la sntesis de cidos grasos polisaturados de cadena larga.
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Solicitud relacionada Esta solicitud es una continuacin en parte de la Solicitud de Patente de Estados Unidos con Nmero de Serie 08/834.655 presentada el 11 de abril de 1997.

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Introduccin Campo de la invencin

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Esta invencin se reere a la modulacin de niveles de enzimas y/o componentes de enzimas relacionados con la produccin de cidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA) en un microorganismo o animal. Antecedentes

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Los cidos grasos 3, ejemplicados por el cido eicosapentaenoico (EPA), y los cidos grasos 6, ejemplicados por el cido araquidnico (ARA) son dos familias principales de los cidos grasos poliinsaturados (PUFA). Los PUFA son componentes importantes de la membrana plasmtica de las clulas, en donde pueden hallarse en formas tales como los fosfolpidos. Los PUFA son necesarios para un correcto desarrollo, particularmente en el cerebro en desarrollo de los nios, y para la formacin y reparacin de tejidos. Los PUFA tambin sirven como precursores de otras molculas importantes en los seres humanos y animales, incluyendo las prostaciclinas, los eicosanoides, los leucotrienos, y las prostaglandinas. Los cuatro PUFA de cadena larga principales incluyen el cido docosahexaenoico (DHA) y el EPA, los cuales se hallan primordialmente en diferentes tipos de aceites de pescado, el cido gammalinolnico (GLA), el cual se halla en las semillas de un cierto nmero de plantas, incluyendo la onagra (Oenothera biennis), la borraja (Borago ofcinalis) y el grosellero negro (Ribes nigrum), y el cido estearidnico (SDA), el cual se encuentra en aceites marinos y semillas de plantas. Tanto el GLA como otro importante PUFA de cadena larga, el cido araquidnico (ARA), se hallan en los hongos lamentosos. El ARA puede puricarse a partir de tejidos animales, incluyendo el hgado y la glndula adrenal. El GLA, el ARA, el EPA y el SDA son ellos mismos cidos grasos de cadena larga importantes, o son precursores en la dieta de cidos grasos de cadena larga importantes, implicados en la sntesis de prostaglandinas, en el tratamiento de enfermedades cardacas, y en el desarrollo del tejido cerebral. Para el DHA, existen un cierto nmero de fuentes para su produccin comercial, incluyendo una variedad de organismos marinos, aceites obtenidos a partir de peces marinos de aguas fras, y fracciones de la yema del huevo. Para el ARA, pueden usarse microorganismos, incluyendo el gnero Mortierella, Entomophthora, Phytium y Porphyridium, para su produccin comercial. Las fuentes comerciales de SDA incluyen los gneros Trichodesma y Echium. Las fuentes comerciales de GLA incluyen la onagra, el grosellero negro, y la borraja. Sin embargo, hay varias desventajas asociadas con la produccin comercial de PUFA a partir de fuentes naturales. Las fuentes naturales de PUFA, tales como los animales y plantas, tienden a tener composiciones de aceites altamente heterogneas. Los aceites obtenidos a partir de estas fuentes pueden por tanto requerir una puricacin extensa para separar uno o ms PUFA deseados, o para producir un aceite que est enriquecido en uno o ms PUFA. Las fuentes naturales estn sometidas tambin a uctuaciones incontrolables en su disponibilidad. Las reservas de peces pueden experimentar variaciones naturales o pueden agotarse por sobrepesca. Los aceites de peces tienen gustos y olores desagradables, los cuales pueden ser imposibles de separar econmicamente del producto deseado, y pueden hacer tales productos inaceptables como suplementos nutricionales. Los aceites animales, y particularmente los aceites de peces, pueden acumular contaminantes medioambientales. El tiempo y las enfermedades pueden causar uctuaciones en los rendimientos de ambas fuentes, peces y plantas. La tierra cultivable disponible para la produccin de cultivos alternativos productores de aceite est sometida a la competicin procedente de la continua expansin de las poblaciones humanas y de la creciente necesidad asociada a la produccin de alimentos en las tierras arables restantes. Los cultivos que s producen PUFA, tales como la borraja, no han sido adaptados al crecimiento comercial y pueden no comportarse bien en monocultivo. El crecimiento de tales cultivos es por tanto econmicamente no competitivo cuando pueden cultivarse cultivos ms provechosos y mejor establecidos. La fermentacin a gran escala de organismos tales como Mortierella tambin es cara. Los tejidos animales naturales contienen cantidades bajas de ARA y son difciles de procesar. Los microorganismos tales como Porphyridium y Mortierella son difciles de cultivar a escala comercial. Los suplementos dietarios y las formulaciones farmacuticas que contienen PUFA pueden retener las desventajas de la fuente de PUFA. Los suplementos tales como las cpsulas de aceite de pescado pueden contener niveles bajos del componente concreto deseado y, por tanto, requerir dosis elevadas. Las dosis elevadas pueden dar lugar a la ingestin de niveles elevados de componentes no deseados, incluyendo contaminantes. Los sabores y olores desagradables de los suplementos pueden hacer indeseables tales regmenes, y pueden inhibir su cumplimiento por parte del paciente. Debe tenerse cuidado al proporcionar suplementos de cidos grasos, puesto que la sobreadicin puede dar lugar a la supresin de las vas biosintticas endgenas y conducir a una competicin con otros cidos grasos necesarios en varias fracciones de lpidos in vivo, conduciendo a resultados no deseables. Por ejemplo, los esquimales que tienen una dieta elevada en cidos grasos 3 tienen una tendencia incrementada a sangrar (Patente estadounidense n 4.874.603). Un cierto nmero de enzimas estn implicados en la biosntesis de los PUFA. El cido linoleico (LA; 18:2 9, 12)
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se produce a partir del cido oleico (18:1 9) mediante una 12-desaturasa. El GLA (18:3 6, 9, 12) se produce a partir del cido linoleico (LA, 18:2 9, 12) mediante una 6-desaturasa. La produccin del ARA (20:4 5, 8, 11, 14) a partir del cido dihomo-gamma-linolnico (DGLA; 20:3 8, 11, 14) est catalizada por una 5-desaturasa. Sin embargo, ciertos animales no pueden desaturar ms all de la posicin 9 y por tanto no pueden convertir el cido oleico (18:1 9) en cido linoleico (18:2 9, 12). De igual forma, el cido -linolnico (ALA, 18:3 9, 12, 15) no puede ser sintetizado por los mamferos. Otros eucariotas, incluyendo los hongos y las plantas, tienen enzimas que desaturan en las posiciones 12 y 15. Por tanto, los principales cidos grasos poliinsaturados de los animales se derivan de la dieta y/o de la desaturacin y elongacin del cido linoleico (18:2 9, 12) o del cido -linolnico (18:3 9, 12, 15). Por tanto, tiene inters obtener material gentico implicado en la biosntesis de los PUFA a partir de especies que producen naturalmente estos cidos grasos, y expresar el material aislado en un sistema microbiano o animal que pueda manipularse para proporcionar la produccin de cantidades comerciales de uno o ms PUFA. Por tanto, hay una necesidad de desaturasas de cidos grasos, de genes que las codican, y de procedimientos recombinantes para producirlas. Existe una necesidad adicional de aceites que contengan proporciones relativas mayores de, y/o enriquecidos en, PUFA especcos. Tambin existe una necesidad de procedimientos econmicos ables para producir PUFA especcos. Literatura relevante
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La produccin de cido gamma-linolnico mediante una 6-desaturasa se describe en la USPN 5.552.306. La produccin de cido 8,11-eicosadienoico usando Mortierella alpina se describe en la USPN 5.376.541. La produccin de cido docosahexaenoico por parte de dinoagelados se describe en la USPN 5.407.957. La clonacin de una 6-desaturasa de protena portadora de palmitoilacilo se describe en la publicacin del PCT WO-96/13.591 y en la USPN 5.614.400. La clonacin de una 6-desaturasa procedente de borraja se describe en la publicacin del PCT WO-96/21.022. La clonacin de 9-desaturasas se describe en las solicitudes de patentes publicadas del PCT WO91/13.972, EP-0.550.162-A1, EP-0.561.569-A2, EP-0.644.263.A2, y EP-0.736.598-A1, y en la USPN 5.057.419. La clonacin de 12-desaturasas procedentes de varios organismos se describe en la publicacin del PCT WO-94/11.516 y en la USPN 5.443.974. La clonacin de 15-desaturasas procedentes de varios organismos se describe en la publicacin del PCT WO-93/11.245. Todas las publicaciones y patentes o solicitudes estadounidenses mencionadas en la presente se incorporan en su totalidad por referencia en la presente. Descripcin resumida de la invencin Se proporcionan nuevos polipptidos, cidos nucleicos, construcciones de cidos nucleicos, clulas huspedes y procedimientos para la preparacin de cidos grasos de cadena larga poliinsaturados. stos incluyen cidos nucleicos que codican una 6- y 12-desaturasa y polipptidos que tienen actividad 6- y/o 12-desaturasa. Los procedimientos implican el cultivo de un microorganismo o animal husped que expresan un gen o genes introducidos que codican al menos una desaturasa, particularmente una 6- o 12-desaturasa. La regulacin de la expresin del polipptido o polipptidos de desaturasa proporciona un incremento relativo en los PUFA desaturados deseados como resultado de unas concentraciones alteradas de los enzimas y sustratos implicados en la biosntesis de los PUFA. Esta invencin tiene utilidad, por ejemplo, en la produccin a gran escala de GLA y SDA. Por tanto, en una aspecto, la presente invencin proporciona un polipptido puricado o aislado que es capaz de desaturar una molcula de cido graso en los carbonos 6 12 a partir del extremo carboxilo de dicho cido graso, teniendo dicho polipptido una secuencia de aminocidos que tiene al menos un 60% de homologa con la secuencia de 457 aminocidos de la SEC. N ID.: 2 o los 399 aminocidos de la SEC. N ID.: 4. Preferiblemente, el polipptido tiene una secuencia de aminocidos que tiene al menos un 80% de homologa con la secuencia de 457 aminocidos de SEC. N ID.: 2 o la secuencia de 399 aminocidos de SEC. N ID.: 4. Ms preferiblemente, el polipptido tiene una secuencia de aminocidos que tiene al menos un 90% de homologa con la secuencia de 457 aminocidos de SEC. N ID.: 2 o la secuencia de 399 aminocidos de SEC. N ID.: 4. Preferiblemente, dicho polipptido que tiene al menos un 60%, al menos un 80%, o al menos un 90% de homologa con la secuencia de 457 aminocidos de SEC. N ID.: 2, incluye un motivo de aminocidos seleccionado de entre el grupo consistente en los residuos 50-53, 39-43, 172-176, 204-213, y 390-402 de la SEC. N ID.: 2. Ms preferiblemente, dicho polipptido comprende los residuos 50-53, 39-43, 172-176, 204-213, y 390-402 de la SEC. N ID.: 2. Incluso ms preferiblemente, dicho polipptido comprende la SEC. N ID.: 2. En otro aspecto la invencin proporciona un cido nucleico aislado que codica un polipptido de la invencin. En una realizacin preferida, el cido nucleico aislado se deriva de un hongo, tal como un hongo del gnero Mortierella. Ms preferido es un hongo de la especie Mortierella alpina. Preferiblemente, el polipptido de la invencin es un polipptido eucariota o se deriva de un polipptido eucariota, en donde un polipptido eucaritico preferido se deriva de un hongo. Preferiblemente, el cido nucleico aislado de la invencin se hbrida con la Figura 3A-E (SEC. N ID.: 1) o Figura 5A-D (SEC. N ID.: 3). Preferiblemente, el cido nucleico aislado tiene una secuencia nucleotdica con al menos aproximadamente el 50% de homologa con la Figuras 3A-E (SEC. N ID.: 1) o Figura 5A-D (SEC. N ID.: 3). Ms preferiblemente, el cido nucleico aislado comprende la SEC. N ID.: 1 SEC. N ID.: 3.
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Tambin se proporciona mediante la presente invencin una construccin de cido nucleico que comprende un cido nucleico de la invencin unido operativamente a un promotor. En otra realizacin, la invencin proporciona una clula husped transformada con la construccin de la invencin. La clula husped es eucaritica o procaritica. Las clulas huspedes eucariotas preferidas son aqullas seleccionadas de entre el grupo consistente en una clula de mamfero, una clula de insecto, una clula de hongo, y una clula de alga. Las clulas de mamfero preferidas incluyen una clula de ave, una clula de hongo preferida incluye una clula de levadura, y una clula de alga preferida es una clula de alga marina. Las clulas procariotas preferidas incluyen aqullas seleccionadas de entre el grupo consistente en una bacteria, una cianobacteria, clulas que contienen un bacterifago, y/o un virus. El promotor es preferiblemente inducible. En una realizacin ms preferida, la clula microbiana es una clula de hongo del gnero Mortierella, siendo un hongo ms preferido de la especie Mortierella alpina. Otra clula husped recombinante preferida es una clula tal como una clula de levadura, tal como una clula de Saccharomyces.
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Preferiblemente, la clula husped de la invencin es una clula microbiana recombinante que comprende al menos una copia de un cido nucleico que codica una desaturasa de cido graso funcionalmente activo de Morteriella alpina que tiene una secuencia de aminocidos tal como se ilustra en la Figura 3A-E (SEC. N ID.: 2), en donde la clula o una clula parental se transformaron con un vector que comprenda dicha secuencia de ADN, y en donde la secuencia de ADN est operativamente unida a una secuencia de control de la expresin. En una realizacin preferida, la clula es una clula microbiana que est enriquecida en cidos grasos 18:2, particularmente cuando la clula microbiana procede de un gnero seleccionado de entre el grupo consistente en una clula procariota y una clula eucariota. En otra realizacin preferida, la clula microbiana segn la invencin incluye una secuencia de control de la expresin que es endgena para la clula microbiana. La presente invencin tambin proporciona un procedimiento para la produccin de GLA en una clula husped, en donde el procedimiento comprende: hacer crecer un cultivo de clulas huspedes de la invencin que producen una 6-desaturasa en presencia de cido linoleico, en condiciones en las que dicho cido se convierte en cido gamma linoleico mediante la expresin del polipptido de dicha desaturasa; y recuperar el cido graso cido gamma linoleico del cultivo. Preferiblemente, el cido o cidos nucleicos que codican la 6-desaturasa se derivan de Morteriella alpina; el sustrato para el polipptido se aporta exgenamente; las clulas huspedes son clulas microbianas; las clulas microbianas son clulas de levadura, tales como clulas de Saccharomyces; y las condiciones de crecimiento son inducibles. En otro aspecto, la presente invencin proporciona un procedimiento para la produccin del cido graso cido linoleico, procedimiento que comprende: hacer crecer un cultivo de clulas huspedes de la invencin que producen una 12-desaturasa en presencia de cido olico, en condiciones en las que dicho cido se convierte en cido linoleico mediante la expresin del polipptido de dicha desaturasa; y recuperar el cido graso cido linoleico del cultivo. En otro aspecto, la invencin proporciona el uso de una clula husped microbiana de la invencin para la produccin de un cido graso. Preferiblemente, los procedimientos de la invencin comprenden adems formular el cido graso en un producto seleccionado de entre: composicin farmacutica que comprende el aceite en un portador farmacuticamente aceptable; una composicin nutricional comprende el aceite; y una frmula para bebs. Las composiciones nutricionales preferiblemente se administran a un husped mamfero parenteral o internamente. En una realizacin preferida, las composiciones nutricionales estn en una forma lquida o en una forma slida, y pueden formularse en o como un suplemento diettico, y el aceite se proporciona en forma encapsulada. El aceite puede estar libre de componentes particulares de otros aceites, y puede derivarse a partir de una clula microbiana, tal como una clula de levadura. Por tanto, el procedimiento de la invencin preferiblemente comprende adems formular el cido graso en frmulas nutricionales o frmulas para bebs, suplementos dietticos o suplementos dietticos en forma de un lquido o slido que contiene los cidos grasos de cadena larga descritos en la presente. Estas formulas y suplementos pueden administrarse a un humano o a un animal. Las frmulas y suplementos de la invencin pueden comprender adems al menos un macronutriente seleccionado del grupo consistente en aceite de coco, aceite de soja, aceite de colza, mono- y diglicridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche desnatada electrodializada, suero de leche, protena de soja, y otros hidrolizados de protena. Las frmulas de la presente invencin pueden comprender adems al menos una vitamina seleccionada del grupo consistente en las Vitaminas A, C, D, E y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo consistente en calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fsforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro. Un paciente que tiene una condicin causada por una ingesta o produccin insuciente de cidos grasos poliinsaturados puede tratarse mediante la administracin al paciente de un sustituto dietario, obtenido de acuerdo con los procedimientos de la invencin, en una cantidad suciente para efectuar el tratamiento del paciente. Los procedimientos de la presente invencin pueden comprender adems formular el cido graso en cosmticos y composiciones farmacuticas.
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Por tanto, los aceites transgnicos en portadores farmacuticamente aceptables, los suplementos nutricionales, los agentes cosmticos, y las frmulas infantiles que contienen aceites transgnicos pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invencin.
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Las composiciones farmacuticas que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invencin pueden comprender al menos un nutriente seleccionado de entre el grupo consistente en una vitamina, un mineral, una carbohidrato, un azcar, un aminocido, un cido graso libre, un fosfolpido, un antioxidante, y un compuesto fenlico. Breve descripcin de las guras

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La Figura 1 muestra las posibles vas para la sntesis del cido araquidnico (20:4 5, 8, 11, 14) y el cido estearidnico (18:4 6, 9, 12, 15) a partir de cido palmtico (C16 ) en una variedad de organismos, incluyendo las algas, Mortierella y humanos. Estos PUFA pueden servir como precursores de otras molculas importantes para los humanos y otros animales, incluyendo las prostaciclinas, los leucotrienos, y las prostaglandinas, algunas de las cuales se muestran. La Figura 2 muestra las posibles vas para la produccin de PUFA adems del ARA, incluyendo el EPA y el DHA, compiladas, una vez ms, a partir de una variedad de organismos.

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La Figura 3A-E muestra la secuencia de ADN de la 6-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminocidos deducida: Figura 3A-E (SEC. N ID. 1, ADNc de la 6-desaturasa)

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Figura 3A-E (SEC. N ID. 2, aminocidos de la 6-desaturasa) La Figura 4 muestra un alineamiento de una porcin de la secuencia de aminocidos de la 6-desaturasa de Morteriella alpina con otras secuencias relacionadas.

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La Figura 5A-D muestra la secuencia de ADN de la 12-desaturasa de Mortierella alpina y la secuencia de aminocidos deducida: Figura 5A-D (SEC. N ID. 3, ADNc de la 12-desaturasa)

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Figura 5A-D (SEC. N ID. 4, aminocidos de la 12-desaturasa) Las Figuras 6A y 6B muestran el efecto de diferentes construcciones de expresin sobre la expresin de GLA en levadura.

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Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto de la cepa del husped sobre la produccin de GLA. Las Figuras 8A y 8B muestran el efecto de la temperatura sobre la produccin de GLA en la cepa SC334 de Saccharomyces cerevisiae.
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La Figura 9 muestra los alineamientos de la secuencia de protena de Ma 29 y contig 253538a. La Figura 10 muestra los alineamientos de la secuencia de protena de Ma 524 y contig 253538a.
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Breve descripcin de los listados de secuencias La SEC. N ID. 1 muestra una secuencia de ADN de la 6-desaturasa de Mortierella alpina. La SEC. N ID. 2 muestra una secuencia de aminocidos de la 6-desaturasa de Mortierella alpina.

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La SEC. N ID. 3 muestra una secuencia de ADN de la 12-desaturasa de Mortierella alpina. La SEC. N ID. 4 muestra una secuencia de aminocidos de la 12-desaturasa de Mortierella alpina.

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Las SEC. N ID. 5-11 muestran varias secuencias de desaturasas. Las SEC. N ID. 13-18 muestran varias secuencias de cebadores de la PCR.

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Las SEC. N ID. 19 y SEC. N ID. 20 muestran las secuencias de nucletidos y de aminocidos de una desaturasa de Dictyostelium discoideum. Las SEC. N ID. 21 y SEC. N ID. 22 muestran las secuencias de nucletidos y de aminocidos de una desaturasa de Phaeodactylum tricornutum.
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Las SEC. N ID. 23-26 muestran las secuencias de nucletidos y de aminocidos deducida de un clon de ADNc de Schizochytrium. Las SEC. N ID. 27-33 muestran las secuencias de nucletidos de desaturasas humanas.
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Las SEC. N ID. 34-SEC. N ID. 40 muestran las secuencias peptdicas de desaturasas humanas. Descripcin de las realizaciones preferidas
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Con objeto de asegurar una completa comprensin de la invencin, se proporcionan las siguientes deniciones: 5-Desaturasa: la 5-desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 5 y 6 a partir del extremo carboxilo de una molcula de cido graso.

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6-Desaturasa: la 6-desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 6 y 7 a partir del extremo carboxilo de una molcula de cido graso. 9-Desaturasa: la 9-desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 a partir del extremo carboxilo de una molcula de cido graso.

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12-Desaturasa: la 12-desaturasa es un enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 12 y 13 a partir del extremo carboxilo de una molcula de cido graso. cido graso: los cidos grasos son una clase de compuestos que contienen una cadena hidrocarbonada larga y un grupo carboxilato terminal. Los cidos grasos incluyen los siguientes: cidos grasos

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12:0 16:0 16:1

cido lurico cido palmtico cido palmitoleico cido esterico cido oleico cido taxoleico cido 6,9-octadecadienoico cido linoleico cido gamma-linolnico cido pinolnico cido alfa-linolnico cido estearidnico cido araquidnico cido eicosenoico cido behnico cido ercico cido docosadienoico cido araquidnico 6-eicosatrienoico (dihomo-gamma-linolnico) 5,8,11,14-20:4 (ARA) 8,11,14-20:3 (DGLA) 9-18:1 5, 9-18:2 6, 9-18:2 9,12-18:2 (LA) 6,9,12-18:3 (GLA) 5,9,12-18:3 6,9,12-18:3 (ALA) 6,9,12,15-18:4 (SDA)

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22:1 22:2 20:4 6

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20:3 6

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(Continuacin) cidos grasos
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20:5 3 20:3 3

eicosapentanoico (cido timnodnico) 3-eicosatrienoico 3-eicosatetraenoico docosapentaenoico docosahexaenoico (cido cervnico) cido lignocrico

5,8,11,14,17-20:5 (EPA) 11,16,17-20:3 8,11,14,17-20:4 7,10,13,16,19-22:5 (3DPA) 4,7,10,13,16,19-22:6 (DHA)

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20:4 3 22:5 3 22:6 3

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Tomando en consideracin estas deniciones, la presente invencin se dirige a nuevas secuencias de ADN, construcciones de ADN, y procedimientos. Pueden obtenerse composiciones de acuerdo con los procedimientos de la invencin. Las secuencias de ADN, los procedimientos de construccin, y las composiciones permiten la modicacin del contenido en cido graso de cadena larga poliinsaturado de, por ejemplo, clulas microbianas o animales. Las clulas huspedes se manipulan para expresar un transcrito con sentido o antisentido de un ADN que codica un polipptido o polipptidos, los cuales catalizan la desaturacin de un cido graso. El sustrato o sustratos para el enzima expresado pueden ser producidos por la clula husped o pueden suministrarse exgenamente. Para conseguir la expresin, el ADN transformado est operativamente asociado con regiones de iniciacin de la transcripcin o de la traduccin y de terminacin que son funcionales en la clula husped. Las construcciones que comprenden el gen a ser expresado pueden proporcionar los medios para su integracin en el genoma de la clula husped, o pueden replicarse autnomamente en la clula husped. Para la produccin de cido linoleico (LA), los casetes de expresin generalmente usados incluyen un casete que proporciona actividad 12-desaturasa, particularmente en una clula husped que produce o puede captar cido oleico (patente estadounidente n 5.443.974). La produccin de LA puede incrementarse proporcionando un casete de expresin para una 9-desaturasa cuando la actividad enzimtica es limitante. Para la produccin de ALA, los casetes de expresin usados generalmente incluyen un casete que proporciona una actividad 15- u 3-desaturasa, particularmente en una clula husped que produce o puede captar LA. Para la produccin de GLA o SDA, el casete de expresin usado generalmente incluye un casete que proporciona la actividad 6-desaturasa, particularmente en una clula husped que produce o puede captar respectivamente LA o ALA. La produccin de cidos grasos insaturados del tipo 6, tales como el LA o GLA, est favorecida en un microorganismo husped o animal que es incapaz de producir ALA. La produccin de ALA del husped puede suprimirse, reducirse y/o inhibirse mediante la inhibicin de la actividad de una desaturasa del tipo 15- u 3-desaturasa (ver Figura 2). Esto puede conseguirse mediante seleccin estndar, proporcionando un casete de expresin para un transcrito antisentido de 15- u 3, o alterando un gen diana de 15- u 3-desaturasa a travs de la insercin, supresin, sustitucin de la totalidad o parte del gen diana, o aadiendo un inhibidor de la 15- u 3-desaturasa. De forma similar, la produccin de LA o ALA est favorecida en un microorganismo o animal que tenga actividad 6-desaturasa proporcionando un casete de expresin para un transcrito antisentido de , o alterando un gen de la 6-desaturasa, o mediante el uso de un inhibidor de la 6-desaturasa. Produccin microbiana de cidos grasos

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La produccin microbiana de cidos grasos tiene varias ventajas respecto a la puricacin a partir de fuentes naturales tales como los peces o plantas. Se conocen muchos microbios con composiciones de aceites enormemente simplicadas en comparacin con aqullas de organismos superiores, haciendo ms fcil la puricacin de los componentes deseados. La produccin microbiana no est sujeta a uctuaciones causadas por variables externas tales como el tiempo y el aporte de nutrientes. El aceite producido microbianamente est sustancialmente libre de contaminacin por parte de contaminantes medioambientales. Adicionalmente, los microbios pueden proporcionar PUFA en formas particulares que pueden tener usos especcos. Por ejemplo, Spirullina puede proporcionar PUFA predominantemente en las posiciones primera y tercera de los triglicridos; la digestin mediante lipasas pancreticas preferentemente libera cidos grasos en estas posiciones. A continuacin de la ingestin humana o animal de triglicridos derivados de Spirullina, estos PUFA son liberados por las lipasas pancreticas como cidos grasos libres y, por tanto, estn directamente disponibles para, por ejemplo, el desarrollo cerebral de los nios. Adicionalmente, la produccin de aceites microbiana puede manipularse mediante el control de las condiciones de cultivo, notablemente mediante el suministro de sustratos particulares para enzimas expresados microbianamente, o mediante la adicin de compuestos que suprimen vas bioqumicas no deseadas. Adems de estas ventajas, la produccin de cidos grasos a partir de microbios recombinantes proporciona la capacidad de alterar el perl de cidos grasos que ocurre de forma natural mediante la aportacin de nuevas vas sintticas en el husped, o mediante la supresin de vas no deseadas, incrementando de ese modo los niveles de PUFA deseados, o formas conjugadas de los mismos, y disminuyendo los niveles de PUFA no deseados.

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Produccin de cidos grasos en animales La produccin de cidos grasos en animales tambin presenta varias ventajas. La expresin de genes de desaturasas en animales puede producir niveles enormemente incrementados de PUFA deseados en tejidos animales, haciendo la recuperacin a partir de estos tejidos ms econmica. Por ejemplo, cuando los PUFA deseados se expresan en la leche materna de animales, los procedimientos para aislar PUFA a partir de la leche del animal estn bien establecidos. Adems de proporcionar una fuente para la puricacin de los PUFA deseados, la leche materna de animales puede manipularse a travs de la expresin de genes de desaturasas, bien slos o en combinacin con otros genes humanos, para proporcionar leches de animales con una composicin de PUFA sustancialmente similar a la leche materna humana durante las diferentes etapas de desarrollo infantil. Las leches de animales humanizadas pueden servir como frmulas para bebs cuando la lactancia humana es imposible o no deseada, o en los casos de malnutricin o enfermedad. Dependiendo de la clula husped, la disponibilidad de sustrato, y del producto o productos nales deseados, son de inters varios polipptidos, particularmente desaturasas. Por desaturasa se pretende indicar un polipptido que puede desaturar uno o ms cidos grasos para producir un cido graso mono- o poliinsaturado de inters, o un precursor del mismo. Son particularmente interesantes los polipptidos que pueden catalizar la conversin de cido esterico a cido oleico, de cido oleico a LA, de LA a ALA, de LA a GLA, o de ALA a SDA, lo cual incluye enzimas que desaturan en las posiciones 9, 12, (6), 15, (3) o 6. Por polipptido se quiere indicar cualquier cadena de aminocidos, con independencia de la longitud o modicacin posterior a la traduccin, por ejemplo, glicosilacin o fosforilacin. Las consideraciones para escoger un polipptido especco que tenga actividad desaturasa incluyen el pH ptimo del polipptido, si el polipptido o un componente del mismo es un enzima limitante de la velocidad, si la desaturasa usada es esencial para la sntesis de un cido graso poliinsaturado deseado, y/o los cofactores requeridos por el polipptido. El polipptido expresado preferiblemente tiene parmetros compatibles con el entorno bioqumico de su lugar en la clula husped. Por ejemplo, el polipptido puede tener que competir por el sustrato con otros enzimas en la clula husped. Los anlisis de la Km y de la actividad especca del polipptido en cuestin se consideran, por tanto, a la hora de determinar la conveniencia de un determinado polipptido para modicar la produccin de PUFA en una clula husped determinada. El polipptido usado en una situacin particular es uno que puede funcionar en las condiciones presentes en la clula husped deseada, pero, por otra parte, puede ser cualquier polipptido que tenga actividad desaturasa que tenga las caractersticas deseadas de ser capaz de modicar la produccin relativa de un PUFA deseado. Para la produccin de cido linoleico a partir de cido oleico, la secuencia de ADN usada codica un polipptido que tiene actividad 12-desaturasa. Para la produccin de GLA a partir de cido linoleico, la secuencia de ADN usada codica un polipptido que tiene actividad 6-desaturasa. En casos concretos, la expresin de la 6-desaturasa puede acoplarse con la expresin de la actividad 12-desaturasa, y la clula husped puede vaciarse opcionalmente de cualquier actividad 15-desaturasa presente, por ejemplo, proporcionando un casete de transcripcin para la produccin de secuencias antisentido contra el producto de la transcripcin de la 15-desaturasa, mediante la alteracin del gen de la 15-desaturasa, o usando un clula husped que tiene de forma natural, o ha sido mutada para tener, una actividad 15-desaturasa baja. La inhibicin de las vas de desaturasas no deseadas puede conseguirse tambin a travs del uso de inhibidores de desaturasas especcos, tales como aqullos descritos en la patente estadounidense n 4.778.630. Tambin, una clula husped para la expresin de la 6-desaturasa puede tener, o haberse mutado para tener, una elevada actividad 12-desaturasa. La eleccin de la combinacin de casetes usados depende en parte del perl de PUFA y/o del perl de desaturasa de la clula husped. Cuando la clula husped expresa la actividad 12-desaturasa y carece o est vaca de actividad 15-desaturasa, la sobreexpresin de la 6-desaturasa sola es generalmente suciente para proporcionar o potenciar la produccin de GLA. Cuando la clula husped expresa la actividad 9-desaturasa, la expresin de una 12- y una 6-desaturasa puede proporcionar una produccin potenciada de GLA. Cuando la actividad 9-desaturasa est ausente o limitada, puede usarse un casete de expresin de para una 9-desaturasa puede proporcionar una produccin potenciada de GLA. En la Figura 2 se muestra un esquema para la sntesis de cido araquidnico (20:4 5,8,11,14 ) a partir de cido esterico (18:0). Un enzima clave en esta va es una 6-desaturasa que convierte el cido linoleico en cido -linolnico. Tambin se muestra la conversin de cido -linolnico (ALA) en cido estearidnico por parte de una 6-desaturasa. Fuentes de polipptidos que tienen actividad desaturasa
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Los organismos tienen actividad desaturasa y oligonucletidos que codican tales polipptidos son organismos que producen un cido graso poli-insaturado deseado. Como un ejemplo, los microorganismos que tienen la capacidad de producir GLA o ARA pueden usarse como una fuente de actividad 6- o 12-desaturasa. Tales microorganismos incluyen, por ejemplo, aqullos que pertenecen al gnero Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophathora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, y Entomophthora. Dentro del gnero Porphyridium, es de especial inters Porphyridium cruentum. Dentro del gnero Mortierella, es de especial inters Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella ramanniana, var. angulispora, y Mortierella alpina. Dentro del gnero Mucor, es de especial inters Mucor circinelloides y Mucor javanicus. Los ADN que codican las desaturasas deseadas pueden identicarse de diversas formas. Como ejemplo, una fuente de la desaturasa deseada, por ejemplo, las bibliotecas genmicas o de ADNc de Mortierella, se examinan con sondas sintetizadas enzimtica o qumicamente, las cuales pueden construirse a partir de ADN, ARN, o de nucletidos que no ocurren de forma natural, o mezclas de los mismos. Las sondas pueden sintetizarse enzimticamente a partir
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de ADN de desaturasas conocidas para procedimientos de hibridacin con rigurosidad normal o reducida. Las sondas de oligonucletidos pueden usarse tambin para examinar fuentes, y pueden basarse en secuencias de desaturasas conocidas, incluyendo secuencias conservadas entre las desaturasas conocidas, o en secuencias de pptidos obtenidas a partir de la protena deseada puricada. Las sondas de oligonucletidos basadas en secuencias de aminocidos pueden hacerse degenerar para abarcar la degeneracin del cdigo gentico, o pueden predisponerse en favor de los codones preferidos del organismo fuente. Los oligonucletidos pueden usarse tambin como cebadores para PCR a partir de ARNm transcrito a la inversa procedente de una fuente conocida o sospechosa; el producto de la PCR puede ser el ADNc de longitud completa o puede usarse para generar una sonda para obtener el ADNc de longitud completa deseado. Alternativamente, puede secuenciarse completamente una protena deseada y realizarse la sntesis total de un ADN que codica ese polipptido. Una vez se ha aislado el ADN genmico o ADNc deseado, ste puede secuenciarse mediante procedimientos conocidos. Se sabe en la tcnica que tales procedimientos estn sujetos a errores, de tal forma que la mltiple secuenciacin de la misma regin es prctica rutinaria y todava se espera que conduzca a frecuencias de errores medibles en la secuencia deducida resultante, particularmente en regiones que tienen dominios repetidos, extensa estructura secundaria, o composiciones de bases inusuales, tales como regiones con un contenido elevado en bases GC. Cuando surgen discrepancias, puede realizarse el secuenciado de nuevo y pueden emplearse procedimientos especiales. Tales procedimientos especiales pueden incluir alterar las condiciones de secuenciacin mediante el uso de: temperaturas diferentes; enzimas diferentes; protenas que alteran la capacidad de los oligonucletidos para formar estructuras de orden superior; nucletidos alterados tales como ITP o dGTP metilado; composiciones de gel diferentes, por ejemplo, aadiendo formamida; cebadores diferentes o cebadores ubicados a diferentes distancias de la regin problema; o plantillas diferentes tales como ADN de hebra nica. Tambin puede emplearse la secuenciacin del ARNm. En la mayor parte de los casos, parte o toda la secuencia codicante del polipptido que tiene actividad desaturasa procede de una fuente natural. No obstante, en algunas situaciones, es deseable modicar toda o una porcin de los codones, por ejemplo, para potenciar la expresin, mediante el empleo de codones preferidos del husped. Los codones preferidos del husped pueden determinarse a partir de los codones con la frecuencia ms elevada en las protenas expresadas en la cantidad ms elevada en una especie de husped concreta de inters. De ese modo, la secuencia codicante para un polipptido que tiene actividad desaturasa puede sintetizarse completamente o en parte. Pueden sintetizarse tambin la totalidad o porciones del ADN para suprimir cualesquiera secuencias o regiones de estructura secundaria desestabilizantes que estaran presentes en el ARNm transcrito. Pueden sintetizarse tambin la totalidad o porciones del ADN para alterar la composicin de bases a una ms preferible en la clula husped deseada. Los procedimientos para sintetizar secuencias y agrupar las secuencias juntas estn bien establecidos en la literatura. Pueden emplearse la mutagnesis in vitro y la seleccin, la mutagnesis dirigida a un sitio, u otros medios, para obtener mutaciones de genes de desaturasas que ocurren de forma natural, para producir un polipptido que tenga actividad desaturasa in vivo con parmetros cinticos y fsicos ms deseables para su funcin en la clula husped, tales como una vida media ms larga o una velocidad de produccin ms elevada de un cido graso poliinsaturado deseado. Desaturasa de Mortierella alpina Es de particular inters la 6-desaturasa de Mortierella alpina, la cual tiene 457 aminocidos y un peso molecular predicho de 51,8 kD; la secuencia de aminocidos se muestra en la Figura 3. El gen que codica la 6-desaturasa de Mortierella alpina puede expresarse en microorganismos transgnicos o animales para efectuar una sntesis mayor de GLA a partir de ALA. Tambin pueden usarse otros ADN que son sustancialmente idnticos al ADN de la 6desaturasa de Mortierella alpina, o que codican polipptidos que son sustancialmente idnticos al polipptido de la 6-desaturasa de Mortierella alpina. Por sustancialmente idntico se quiere indicar una secuencia de aminocidos o secuencia de cido nucleico que presentan, en orden de preferencia creciente, al menos un 60%, 80%, 90% 95% de homologa con la secuencia de aminocidos o secuencia de cido nucleico que codica la secuencia de aminocidos de la 6-desaturasa de Mortierella alpina. Para los polipptidos, la longitud de las secuencias de comparacin es de al menos 16 aminocidos, preferiblemente al menos 20 aminocidos, o ms preferiblemente 35 aminocidos. Para los cidos nucleicos, la longitud de las secuencias de comparacin es generalmente de al menos 50 nucletidos, preferiblemente al menos 60 nucletidos, y ms preferiblemente al menos 75 nucletidos, y los ms preferiblemente, 110 nucletidos. La homologa se mide tpicamente usando un programa de anlisis de secuencias, por ejemplo, el paquete de programas de Anlisis de Secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), y MacVector (Oxford Molecular Group, 2105 S. Bascom Avenue, Suite 200, Campbell, California 95008). Tales programas emparejan secuencias similares mediante la asignacin de grados de homologa a varias sustituciones, supresiones y otras modicaciones. Las sustituciones conservadores tpicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; cido asprtico, cido glutmico, asparagina, y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las sustituciones pueden hacerse tambin en base a la hidrofobicidad o hidrolicidad conservada (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)), o en base a la capacidad de asumir una estructura secundaria de polipptido parecida (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47:45-148 (1978)). Es tambin de particular inters la 12-desaturasa de Mortierella alpina, cuyas secuencias de nucletidos y de aminocidos se muestran en la Figura 5. El gen que codica la 12-desaturasa de Mortierella alpina puede expresarse en microorganismos transgnicos o animales para efectuar una sntesis mayor de LA a partir de cido oleico. Tambin
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pueden usarse otros ADN que son sustancialmente idnticos al ADN de la 12-desaturasa de Mortierella alpina, o que codican polipptidos que son sustancialmente idnticos al polipptido de la 12-desaturasa de Mortierella alpina. Otras desaturasas
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Abarcadas por la presente invencin, estn las desaturasas relacionadas procedentes del mismo u otros organismos, tal como se dene en las reivindicaciones. Tales desaturasas relacionadas incluyen variantes de la 6- o 12-desaturasa descritas, que ocurren de forma natural en la misma o diferentes especies de Mortierella, as como los homlogos de la 6- o 12-desaturasa descrita procedentes de otras especies. Tambin se incluyen desaturasas que, aunque no son sustancialmente idnticas a la 6- o 12-desaturasa de Mortierella alpina, desaturan una molcula de cido graso respectivamente en el carbono 6 12, respecto el extremo carboxilo de una molcula de cido graso, o en el carbono 12 6, respecto el carbn metlico terminal en una molcula de cido graso de 18 carbonos. Las desaturasas relacionadas pueden identicarse por su capacidad para funcionar sustancialmente del mismo modo que las desaturasas descritas; es decir, que son capaces todava de convertir efectivamente el LA en GLA, el ALA en SDA, o el cido oleico en LA. Las desaturasas relacionadas pueden identicarse tambin mediante la bsqueda de secuencias homlogas a la desaturasa descrita en bases de datos de secuencias, mediante la hibridacin de una sonda basada en la desaturasa descrita con una biblioteca construida a partir del organismo fuente, o mediante la RT-PCR usando ARNm procedente del organismo fuente y cebadores basados en la desaturasa descrita. Tales desaturasas incluyen aqullas procedentes de humanos, Dictyostelium discoideum y Phaeodactylum tricornutum. Las regiones de un polipptido de desaturasa importantes para la actividad desaturasa pueden determinarse a travs de la mutagnesis de rutina, la expresin de los polipptidos mutantes resultantes, y la determinacin de sus actividades. Los mutantes pueden incluir supresiones, inserciones, y mutaciones en un punto, o combinaciones de las mismas. Un anlisis de funcin tpico empieza con la mutagnesis de supresin para determinar los lmites N- y C-terminales de la protena necesaria para la funcin, y a continuacin se hacen supresiones, inserciones o mutaciones en un punto para determinar adems otras regiones necesarias para la funcin. Tambin pueden usarse otras tcnicas tales como la mutagnesis en casete o la sntesis total. La mutagnesis de supresin se consigue, por ejemplo, usando exonucleasas para suprimir secuencialmente las regiones codicantes 5 y 3. Hay equipos disponibles para tales tcnicas. Despus de la supresin, la regin codicante se completa mediante la ligacin de oligonucletidos, que contienen respectivamente codones de inicio o detencin, a la regin codicante suprimida despus de la supresin 5 3. Alternativamente, los oligonucletidos que contienen codones de inicio o detencin se insertan en la regin codicante mediante una variedad de procedimientos que incluyen la mutagnesis dirigida a un sitio, la PCR mutagnica, o mediante ligacin en ADN digerido en sitios de restriccin existentes. Las supresiones internas pueden hacerse de forma similar a travs de un variedad de procedimientos, incluyendo el uso de sitios de restriccin existentes en el ADN, mediante el uso de cebadores mutagnicos a travs de la mutagnesis dirigida o la PCR mutagnica. Las inserciones se hacen a travs de procedimientos tales como la mutagnesis de barrido con engarce, la mutagnesis dirigida a un sitio, o la PCR mutagnica. Las mutaciones en un punto se hacen a travs de tcnicas tales como la mutagnesis dirigida a un sitio o la PCR mutagnica. Tambin puede usarse la mutagnesis qumica para identicar regiones de un polipptido desaturasa que son importantes para su actividad. Se expresa una construccin mutada, y se analiza la capacidad de la protena alterada resultante para funcionar como una desaturasa. Tal anlisis estructura-funcin puede determinar qu regiones pueden suprimirse, qu regiones toleran inserciones, y que mutaciones en punto permiten que la protena mutante funcione sustancialmente de la misma forma que la desaturasa nativa. La totalidad de tales protenas mutantes y secuencias de nucletidos que las codican se hallan dentro del mbito de la presente invencin. Expresin de genes de desaturasas

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Una vez se ha obtenido el ADN que codica un polipptido desaturasa, es coloca en un vector capaz de replicacin en una clula husped, o se propaga in vitro por medio de tcnicas tales como la PCR o la PCR larga. Los vectores de replicacin pueden incluir plsmidos, fagos, virus, csmidos, y similares. Los vectores deseables incluyen aqullos tiles para la mutagnesis del gen de inters o para la expresin del gen de inters en las clulas huspedes. La tcnica de la PCR larga ha hecho posible la propagacin de construcciones grandes, de forma que las modicaciones del gen de inters, tales como la mutagnesis o la adicin de seales de expresin, y la propagacin de las construcciones resultantes puedan efectuarse in vitro sin el uso de un vector de replicacin o una clula husped. Para la expresin de una polipptido desaturasa, se unen regiones funcionales de iniciacin y terminacin de la transcripcin y traduccin al ADN que codica el polipptido desaturasa. La expresin de la regin que codica el polipptido puede tener lugar in vitro o en una clula husped. Las regiones de iniciacin o terminacin de la transcripcin o traduccin se derivan de una variedad de especies no exclusivas. incluyendo el ADN a expresar, genes conocidos o sospechosos de ser capaces de expresarse en el sistema deseado, vectores de expresin, sntesis qumica, o a de un locus endgeno en una clula husped. Expresin in vitro

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La expresin in vitro puede conseguirse, por ejemplo, colocando la regin codicante del polipptido desaturasa en un vector de expresin diseado para su uso in vitro, y aadiendo lisado de reticulocito de conejo y cofactores; si se desea pueden incorporarse aminocidos aislados. Tales vectores de expresin in vitro pueden proporcionar algunas
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o todas las seales de expresin necesarias en el sistema usado. Estos procedimientos son bien conocidos en la tcnica y los componentes del sistema estn disponibles comercialmente. La mezcla de reaccin puede ensayarse entonces directamente en busca del polipptido, por ejemplo, determinando su actividad, o el polipptido sintetizado puede puricarse y ensayarse a continuacin.
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Expresin en una clula husped La expresin en una clula husped puede conseguirse de forma transitoria o estable. La expresin transitoria puede ocurrir a partir de construcciones introducidas que contienen seales de expresin funcionales en la clula husped, construcciones que sin embargo no se replican y raramente se integran en la clula husped, o en donde la clula husped no se est proliferando. La expresin transitoria puede conseguirse tambin induciendo la actividad de un promotor regulable unido operativamente al gen de inters, aunque tales sistemas inducible frecuentemente exhiben un nivel de expresin basal bajo. La expresin estable puede conseguirse mediante la introduccin de una construccin que puede integrarse en el genoma del husped o que se replica autnomamente en la clula husped. La expresin estable del gen de inters puede seleccionarse a travs del uso de un marcador seleccionable ubicado en o transfectado con la construccin de expresin, seguida por la seleccin de clulas que expresan el marcador. Cuando la expresin estable es el resultado de la integracin, la integracin de las construcciones puede ocurrir aleatoriamente dentro del genoma husped, o puede dirigirse a travs del uso de construcciones que contienen regiones con homologa suciente con el genoma husped como para apuntar la recombinacin al locus del husped. Cuando las construcciones se apuntan hacia un locus endgeno, todas o algunas de las regiones reguladoras de la transcripcin y traduccin pueden se proporcionas por el locus endgeno. Cuando se desea la expresin incrementada del polipptido desaturasa en el organismo fuente, pueden emplearse varios procedimientos. Pueden introducirse en el organismo husped genes adicionales que codiquen el polipptido desaturasa. La expresin a partir del locus de la desaturasa nativo puede incrementarse tambin a travs de la recombinacin homloga, por ejemplo, insertando un promotor ms fuerte en el genoma husped para causar una expresin incrementada, suprimiendo secuencias desestabilizadoras bien del ARNm o de la protena codicada mediante la supresin de esa informacin del genoma del husped, o aadiendo secuencias estabilizadoras al ARNm (USPN 4.910.141). Cuando es deseable expresar ms de un gen diferente, las regiones reguladoras apropiadas y los procedimientos de expresin introducidos en genes pueden propagarse en la clula husped a travs del uso de vectores de replicacin o mediante integracin en el genoma husped. Cuando dos o ms genes se expresan a partir de vectores de replicacin separados, es deseable que cada vector tenga un medio de replicacin diferente. Cada construccin introducida, est integrada o no, debera tener medios de seleccin diferentes y debera carecer de homologa con las otras construcciones para mantener la expresin estable e impedir la reordenacin de elementos entre construcciones. Las elecciones juiciosas de regiones reguladoras, medios de seleccin, y procedimientos de propagacin de la construccin introducida pueden determinarse experimentalmente, de forma que todos los genes introducidos se expresen con los niveles necesarios para proporcionar la sntesis de los productos deseados. Como un ejemplo, cuando la clula husped es una levadura, se proporcionan regiones de transcripcin y traduccin que son funcionales en clulas de levadura, particularmente procedentes de las especies husped. Las regiones reguladoras del inicio de la transcripcin pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de genes en la va glicoltica, tales como el de la deshidrogenasa de alcohol, la deshidrogenasa del gliceraldehdo-3-fosfato (GDP), la fosfoglucoisomerasa, la quinasa de fosfoglicerato, etc, o de genes regulables tales como el de la fosfatasa cida, el de la lactasa, el de la metalotionena, el de la glucoamilasa, etc. En una situacin concreta, puede usarse una cualquiera de un cierto nmero de secuencias reguladoras, dependiendo de si se desea la transcripcin constitutiva o inducida, de la eciencia concreta del promotor conjuntamente con la pauta de lectura abierta de inters, la capacidad para unir un promotor fuerte con una regin de control procedente de un promotor diferente que permite la transcripcin inducible, la facilidad de construccin, y similares. Son de particular inters los promotores que se activan en presencia de galactosa. Los promotores inducible con galactosa (GAL1, GAL7, y GAL10) se han usado ampliamente para la expresin con elevados niveles y regulada en levaduras (Lue et al., Mol. Cell Biol. 7:3446 (1987); Johnson, Microbiol. Rev. 51:458 (1987), La transcripcin a partir de los promotores GAL es activada por la protena GAL4, la cual se une a la regin promotora y activa la transcripcin cuando la galactosa est presente. En ausencia de galactosa, el antagonista GAL80 se une al GAL4 e impide que el GAL4 active la transcripcin. La adicin de galactosa impide que el GAL80 inhiba la activacin de la GAL4. Se ha hallado que las secuencias de nucletidos que roden el codon ATG de iniciacin de la transcripcin afectan la expresin en clulas de levadura. Si el polipptido deseado se expresa pobremente en levadura, las secuencias de nucletidos de genes exgenos pueden modicarse para incluir una secuencia de iniciacin de la traduccin en levadura eciente para obtener una expresin ptima del gen. Para la expresin en Saccharomyces, esto puede hacerse mediante la mutagnesis dirigida a un sitio de un gen expresado inecientemente, fusionndolo en pauta con un gen endgeno de Saccharomyces, preferiblemente un gen muy expresado, tal como el gen de la lactasa. La regin de terminacin puede derivarse de la regin 3 del gen a partir del cual se obtuvo la regin de iniciacin o a partir de un gen diferente. Se conocen un gran nmero de regiones de terminacin y se ha hallado que son satisfactorias en una variedad de huspedes del mismo y diferentes gneros y especies. La regin de terminacin usualmente se selecciona ms por una cuestin de conveniencia que a causa de una propiedad concreta. Preferiblemente, la regin
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de terminacin se deriva de un gen de levadura, particularmente de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida o Kluyveromyces. Se sabe tambin que las regiones 3 de dos genes de mamferos, del -interfern y 2-interfern, funcionan en levaduras.
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Introduccin de construcciones en clulas huspedes Las construcciones que comprenden el gen de inters pueden introducirse en una clula husped mediante tcnicas estndares. Estas tcnicas incluyen la transformacin, la fusin con protoplastos, la lipofeccin, la transfeccin, la transduccin, la conjugacin, la infeccin, el impacto con bolas (bolistic impact), la electroporacin, la microinyeccin, el raspado, o cualquier otro procedimiento que introduzca el gen de inters dentro de la clula husped. Los procedimientos de transformacin que se usan incluyen la transformacin con acetato de litio (Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)). Por conveniencia, una clula husped que ha sido manipulada mediante cualquier procedimiento para captar una secuencia o construccin de ADN se denominar en sta como transformada o recombinante. El husped sujeto tendr al menos una copia de la construccin de expresin y puede tener dos o ms, dependiendo de si el gen est integrado en el genoma, amplicado, o si est presente en un elemento extracromosmico que tiene mltiples nmeros de copias. Cuando el husped sujeto es una levadura, pueden usarse cuatro tipos principales de vectores plasmdicos para lavaduras: los plsmidos de integracin en levadura (YIp), los plsmidos de replicacin en levadura (YRp), los plsmidos del centrmero de levadura (YCp), y los plsmidos episomales de levadura (YEp). Los YIp carecen de un origen de replicacin de levadura y deben propagarse como elementos integrados en el genoma de levadura. Los YRp tienen una secuencia de replicacin autnoma derivada del cromosoma y se propagan como plsmidos que se segregan de forma inestable, replicndose autnomamente, con un nmero de copias medio (20 a 40). Los YCp tienen tanto una regin de origen de la replicacin como una secuencia de centrmero, y se propagan como plsmidos que se segregan establemente, se replican autnomamente, con un nmero de copias bajo (10 a 20). Los YEp tienen un origen de replicacin procedente del plsmido de 2 m y se propagan como plsmidos que se segregan irregularmente, replicndose autnomamente, con un nmero de copias elevado. La presencia de los plsmidos en las levaduras puede asegurarse manteniendo la seleccin para un marcador en el plsmido. Son de particular inters los vectores de levadura pYES2 (un plsmido YEp disponible de Invitrogen, conere prototrofa para el uracilo y un promotor inducible con galactosa, GAL1, para la expresin), pRS425-pG1 (un plsmido YEp obtenido del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Gentica Molecular, Ohio State University, que contiene un promotor GDP constitutivo y conere prototrofa para la leucina), y el pYX424 (un plsmido YEp que tiene un promotor TP1 constitutivo y conere prototrofa para la leucina; Alber, T. y Kawasaki, G., J. Mol. & Appl. Genetics 1:419 (1982)). La clulas husped transformada puede identicarse mediante la seleccin para un marcador contenido en la construccin introducida. Alternativamente, puede introducirse una construccin marcadora separada con la construccin deseada, puesto que muchas tcnicas de transformacin introducen muchas molculas de ADN en las clulas husped. Tpicamente, las clulas transformadas se seleccionan por su capacidad para crecer en un medio selectivo. Los medios selectivos pueden incorporar un antibitico o carecer de un factor necesario para el crecimiento de los huspedes no transformados, tal como un nutriente o un factor de crecimiento. Por consiguiente, un gen marcador introducido puede conferir resistencia al antibitico, o codica un factor de crecimiento o enzima esencial, y permitir el crecimiento en medio selectivo cuando se expresa en el husped transformado. La seleccin de un husped transformado puede ocurrir tambin cuando la protena marcadora expresada puede detectarse, bien directa o indirectamente. La protena marcadora puede expresarse sola o como una fusin con otra protena. La protena marcadora puede detectarse mediante su actividad enzimtica; por ejemplo, la -galactosidasa puede convertir el sustrato X-gal en un producto coloreado, y la luciferasa puede convertir la luciferina en un producto emisor de luz. La protena marcadora puede detectarse por sus caractersticas productoras de luz o modicantes; por ejemplo, la protena uorescente verde de Aequorea victoria uoresce cuando se ilumina con luz azul. Pueden usarse anticuerpos para detectar la protena marcadora o una marca molecular sobre, por ejemplo, una protena de inters. Las clulas que expresan la protena marcadora o la etiqueta pueden seleccionarse, por ejemplo, visualmente, o mediante tcnicas tales como el FACS o el cribado usando anticuerpos. Para la seleccin de transformantes de levadura, puede usarse cualquier marcador que funcione en levaduras. Deseablemente, son de inters la resistencia a la kanamicina y al aminoglicsido G418, as como la capacidad de crecer en medio que carece de uracilo, leucina, lisina o triptfano. Es de particular inters la produccin de PUFA mediada por 6- o 12-desaturasa en clulas husped procariotas y eucariotas. Las clulas procariotas de inters incluyen Escherichia, Bacillus, Lactobacillus, cianbocaterias, y similares. Las clulas eucariotas incluyen las clulas de mamferos, tales como aqullas procedentes de animales lactantes, de clulas de aves como los pollos, y otras clulas susceptibles de manipulacin gentica, incluyendo las clulas de insectos, hongos y algas. Las clulas pueden cultivarse o formarse como una parte o totalidad de un organismo husped, incluyendo un animal. Los virus y los bacterifagos pueden usarse tambin con las clulas en la produccin de PUFA, particularmente para la transferencia de genes, marcaje celular, y seleccin. En una realizacin preferida, el husped es cualquier microorganismo o animal que produce y/o puede asimilar sustrato o sustratos suministrados exgenamente para la 6- y/o 12-desaturasa, y preferiblemente produce grandes cantidades de uno o ms de los sustratos. Los ejemplos de tales animales huspedes incluyen los ratones, las ratas, los conejos, los pollos, la codorniz, los pavos, los bovinos, las ovejas, los cerdos, las cabras, los yak, etc., los cuales son susceptibles de manipulacin gentica y clonacin para la expansin rpida de la poblacin que expresa el transgn. Para los animales, el(los) transgn(es) de desaturasa puede adaptarse para su expresin en orgnulos, tejidos, y uidos corporales deseados, a travs de la modicacin de las regiones reguladoras del gen. Es de especial inters la produccin de PUFA en la leche de lactancia del animal husped.
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Expresin en levadura Los ejemplos de microorganismos huspedes incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, u otros tipos de levaduras tales como Candida, Kluyveromyces, u otros hongos, por ejemplo, hongos lamentosos tales como Aspergillus, Neurospora, Penicillium, etc. Las caractersticas deseables de un microorganismo husped son, por ejemplo, que est bien caracterizado genticamente, que pueda usarse para niveles elevados de expresin del producto usando fermentacin a densidad ultra-alta, y que est en la lista GRAS (generalmente reconocido como seguro) puesto que el producto nal propuesto est destinado a ingestin por parte de humanos. Es de particular inters el uso de una levadura, ms particularmente de la levadura de panadera (S. cerevisiae), como una clula husped en la presente invencin. Las cepas de particular inters son SC334 (Mat pep4-3 prbl-1122 ura3-52 leu2-3, 112 regl-501 gall; Hovland et al., Gene 83:57-64 (1989)), YTC34 (-ade2-101 his3200 lys2-801 ura3-52; obtenida del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Gentica Molecular, Ohio State University), YTC41 (/a ura3-52/ura3-52 lys2-801/lys2801 ade2-101/ade2-101 trp1-1/trp1-1 his3200/his3200 leu21/leu21; obtenida del Dr. T.H. Chang, profesor agregado de Gentica Molecular, Ohio State University), BJ1995 (obtenida del Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, CA 94720), INVSC1 (Mat hiw31 leu2 trp1-289 ura3-52; obtenida de Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA 92008) e INVSC2 (Mat his3200 ura3-167; obtenida de Invitrogen). Expresin en especies de aves
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Para producir PUFA en especies y clulas de aves, tales como pollos, pavos, codornices y patos, la transferencia del gen puede realizarse introduciendo una secuencia de cido nucleico que codica una 6- y/o 12-desaturasa en las clulas siguiendo procedimientos conocidos en la tcnica. Si se desea un animal transgnico, pueden proporcionarse clulas madres pluripotentes de embriones con un vector portador de un transgn que codica la 5-desaturasa, y desarrollarlas hasta un animal adulto (USPN 5.162.215; Ono et al. Comparative Biochemistry and Physiology A 113(3):287-292 (1996); WO-96/12.793; WO-96/06.160). En la mayora de los casos, el transgn se modicar para expresar niveles elevados de la desaturasa con objeto de incrementar la produccin de PUFA. El transgn puede modicarse, por ejemplo, proporcionando regiones reguladoras de la transcripcin y/o traduccin que funcionan en clulas de aves, tales como promotores que dirigen la expresin en tejidos concretos y partes del huevo tales como la yema. Las regiones reguladoras del gen pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, incluyendo los virus de la anemia de los pollos o de la leucosis aviar, o genes de aves tales como el gen de la ovoalbmina del pollo. Expresin en clulas de insectos

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La produccin de PUFA en clulas de insectos puede realizarse usando vectores de expresin de baculovirus que alberguen uno o ms transgenes de desaturasa. Los vectores de expresin de baculovirus estn disponibles a partir de varias fuentes comerciales tales como Clonetech. Tambin se proporcionan procedimientos para producir cepas transgnicas e hbridas de algas, tales como las algas marinas, que contienen y expresan un transgn de desaturasa. Por ejemplo, pueden prepararse algas marinas transgnicas tal como se describe en la USPN 5.426.040. Al igual que con los otros sistemas de expresin descritos ms arriba, el momento, la extensin de la expresin, y la actividad del transgn de desaturasa pueden regularse ajustando la secuencia codicante del polipptido con las regiones reguladoras de la transcripcin y traduccin apropiadas seleccionadas para un uso particular. Son de especial inters las regiones promotoras que pueden inducirse bajo condiciones de crecimiento preseleccionadas. Por ejemplo, puede usarse para este propsito la introduccin de mutaciones sensibles a la temperatura y/o que responden a metabolitos en las secuencias codicantes del transgn de desaturasa, sus regiones reguladoras, y/o el genoma de las clulas en las que se introduce el transgn. La clula husped transformada se cultiva en condiciones apropiadas adaptadas para un resultado nal deseado. Para clulas huspedes hechas crecer en cultivo, las condiciones estn tpicamente optimizadas para producir el rendimiento mayor o ms econmico de PUFA, el cual se relaciona con la actividad desaturasa seleccionada. Las condiciones de medio que pueden optimizarse incluyen: la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno, la adicin de sustrato, la concentracin nal de sustrato aadido, la forma del sustrato aadido, el crecimiento aerbico o anaerbico, la temperatura de crecimiento, el agente inductor, la temperatura de induccin, la fase de crecimiento en el momento de la induccin, la fase de crecimiento en el momento de la recoleccin, el pH, la densidad, y el mantenimiento de la seleccin. Por ejemplo, los microorganismos tales como las levaduras preferiblemente se cultivan usando el medio seleccionado de inters, el cual incluye caldo de peptona de levadura (YPB) y medio mnimo (contiene aminocidos, bases nitrogenadas de levadura, y sulfato amnico, y carece de un componente para la seleccin, por ejemplo, uracilo). Deseablemente, los sustratos a aadir se disuelven primero en etanol. Cuando fuera necesario, puede inducirse la expresin del polipptido de inters, por ejemplo, incluyendo o aadiendo galactosa para inducir la expresin a partir de un promotor GAL. Expresin en plantas La produccin de PUFA en plantas puede realizarse usando varios sistemas de transformacin en plantas tales como el uso de Agrobacterium tumefaciens, de virus de plantas, de la transformacin de clulas con partculas, y similares, los cuales se descubren en las solicitudes del solicitante relacionadas Solicitudes Estadounidenses con Nmeros de Serie 08/834.033 y 08/956.985, y las solicitudes de continuacin en parte registradas simultneamente con esta solicitud, la totalidad de las cuales se incorporan en esta por referencia.
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Expresin en un animal La expresin en clulas de un husped animal puede conseguirse igualmente de manera estable o transitoria. La expresin transitoria puede conseguirse mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, la infeccin o lipofeccin, y puede repetirse con objeto de mantener los niveles de expresin deseados de la construccin introducida (ver, Ebert, publicacin del PCT WO-94/05.782). La expresin estable puede conseguirse a travs de la integracin de una construccin en el genoma del husped, que resulta en un animal transgnico. La construccin puede introducirse, por ejemplo, mediante microinyeccin de la construccin en el proncleo de un huevo fertilizado, o mediante transfeccin, infeccin retroviral, u otras tcnicas mediante las cuales se introduce la construccin en una lnea celular que puede formar o incorporarse en un animal adulto (patente estadounidense n 4.873.191; patente estadounidense n 5.530.177; patente estadounidense n 5.565.362; patente estadounidense n 5.366.894; Wilmut et al., Nature 385:810 (1997)). Los huevos o embriones recombinantes se transeren a una madre sustituta (patente estadounidense n 4.873.191; patente estadounidense n 5.530.177; patente estadounidense n 5.565.362; patente estadounidense n 5.366.894; Wilmut et al. (ver ms arriba)). Despus del nacimiento, se identican los animales transgnicos, por ejemplo, mediante la presencia de un gen marcador introducido, tal como para el color de la cubierta, o mediante PCR o transferencia Southern a partir de una muestra de sangre, leche o tejido, para detectar la construccin introducida, o mediante un ensayo inmunolgico o enzimolgico para detectar la protena expresada o los productos producidos a partir de la misma (patente estadounidense n 4.873.191; patente estadounidense n 5.530.177; patente estadounidense n 5.565.362; patente estadounidense n 5.366.894; Wilmut et al. (ver ms arriba)). Los animales transgnicos resultantes pueden ser completamente transgnico o pueden ser mosaicos, teniendo los transgenes slo en un subconjunto de sus clulas. El advenimiento de la clonacin de mamferos, conseguida fusionando una clula nucleada con un huevo enucleado, segunda por la transferencia a una madre sustituta, presenta la posibilidad de produccin rpida y a gran escala a partir de la obtencin de un animal o clula fundador que comprenda la construccin introducida; antes de esto, era necesario que el transgn estuviera presente en al lnea germinal del animal para su propagacin (Wilmut et al. (ver ms arriba)). La expresin en un animal husped presenta ciertas eciencias, particularmente cuando el husped es un animal domstico. Para la produccin de PUFA en un uido fcilmente obtenible a partir del animal husped, tal como la leche, el transgn de la desaturasa puede expresarse en clulas de mamfero procedentes de un husped hembra, y alterarse el contenido de las clulas huspedes. El transgn de la desaturasa puede adaptarse para su expresin de forma que sta est retenida en las clulas de mamfero, o sea secretada hacia la leche, para localizar en la leche los productos de reaccin PUFA (publicacin del PCT WO-95/24.488). La expresin puede dirigirse para su expresin en tejido mamario usando secuencias reguladoras especcas, tales como las de la -lactoalbmina bovina, -casena, casena, -casena, -casena, -lactoglobulina, o protena cida del suero, y puede incluir opcionalmente uno o ms intrones y/o secuencias de seales secretoras (patente estadounidense n 5.530.177; Rosen, patente estadounidense n 5.565.362; Clark et al., patente estadounidense n 5.366.894; Garner et al., publicacin del PCT WO-95/23.868). La expresin de transgenes de desaturasa, o transcritos de desaturasa antisentido, adaptada de esta manera, puede usarse para alterar los niveles de PUFA especcos, o derivados de los mismos, hallados en la leche de los animales. Adicionalmente, los transgenes de desaturasa pueden expresarse bien por s mismo o con otros transgenes, con objeto de producir una leche de animal que contenga proporciones ms elevadas de los PUFA deseados, o proporciones de PUFA y concentraciones que se parezcan a la leche mamaria humana (Prieto et al., publicacin del PCT WO95/24.494). Puricacin de los cidos grasos Los cidos grasos desaturados pueden hallarse en el microorganismo o animal husped como cidos grasos libres o en formas conjugadas tales como acilgliceroles, fosfolpidos, sulfolpidos o glicolpidos, y pueden extraerse a partir de la clula husped a travs de una variedad de medios bien conocidos en la tcnica. Tales medios pueden incluir la extraccin con solventes orgnicos, la sonicacin, la extraccin con uidos supercrtica usando por ejemplo dixido de carbono, y medios fsicos tales como las prensas, o las combinaciones de los mismos. Es de particular inters la extraccin con metanol y cloroformo. Cuando sea deseable, la capa acuosa puede acidicarse para protonar los grupos cargados negativamente e incrementar de ese modo el reparto de los productos deseados en la capa orgnica. Despus de la extraccin, los solventes orgnicos pueden suprimirse mediante evaporacin bajo una corriente de nitrgeno. Cuando se aislan en formas conjugadas, los productos pueden descomponerse enzimtica o qumicamente para liberar el cido graso libre o un conjugado menos complejo de inters, y pueden someterse a continuacin a manipulaciones adicionales para producir un producto nal deseado. Deseablemente, las formas conjugadas de los cidos grasos se descomponen con hidrxido potsico. Si es necesaria la puricacin adicional, pueden emplearse procedimientos estndares. Tales procedimientos pueden incluir la extraccin, el tratamiento con urea, la cristalizacin fraccionaria, la HPLC, la destilacin fraccionaria, la cromatografa sobre gel de slice, la centrifugacin a alta velocidad, o la destilacin, o combinaciones de estas tcnicas. La proteccin de los grupos reactivos, tales como los grupos cidos o alquenilos, puede hacerse en cualquier paso a travs de tcnicas conocidas, por ejemplo, alquilacin o yodacin. Los procedimientos usados incluyen la metilacin de los cidos grasos para producir metilsteres. Similarmente, los grupos protectores pueden retirarse en cualquier paso. Deseablemente, la puricacin de fracciones que contienen ARA, DHA y EPA puede conseguirse mediante tratamiento con urea y/o destilacin fraccionaria.
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Usos de los cidos grasos Los cidos grasos objeto de la invencin hallan muchas aplicaciones. Las sondas basadas en los ADN de la invencin pueden hallar uso en procedimientos para aislar molculas relacionadas o en procedimientos para detectar organismos que expresan desaturasas. Cuando se usan como sondas, los ADN u oligonucletidos deben ser detectables. Esto se consigue usualmente uniendo una marca bien en un sitio interno, por ejemplo a travs de la incorporacin de un residuo modicado, o en los extremos 5 3. Tales marcas deben ser directamente detectables, pueden unirse a una molcula secundaria que est marcada detectablemente, o pueden unirse a una molcula secundaria no marcada y a una molcula terciaria marcada detectablemente; este proceso puede extenderse tan lejos como sea prctico para conseguir una seal detectable satisfactoriamente sin niveles inaceptables de seal de fondo. Los sistemas secundarios, terciario, o de puente pueden incluir el uso de anticuerpos dirigidos contra cualquier otra molcula, incluyendo marcas u otros anticuerpos, o pueden implicar cualesquiera molculas que se unan entre ellas, por ejemplo, un sistema biotina-estreptoavidina/avidina. Las marcas detectables tpicamente incluyen los istopos radiactivos, las molculas que qumica o enzimticamente producen o alteran la luz, los enzimas que producen productos de reaccin detectables, las molculas magnticas, las molculas uorescentes o molculas cuya uorescencia o caractersticas de emisin de luz cambian a partir de la unin. Pueden hallarse ejemplos de procedimientos de marcado en la USPN 5.011.770. Alternativamente, la unin de molculas diana puede detectarse directamente midiendo el cambio en el calor de solucin, a partir de la unin de la sonda a la diana, a travs de la calorimetra de valoracin isotrmica, o recubriendo una supercie con la sonda o diana y detectando el cambio en la dispersin de la luz a partir de la supercie producido por la unin de la diana o sonda, respectivamente, tal como puede hacerse con el sistema BIAcore. Los PUFA producidos mediante medios recombinantes hallan aplicaciones en una amplia variedad de reas. El suplemento de humanos o animales con PUFA en varias formas puede resultar en niveles incrementados, no slo de los PUFA aadidos, sino tambin de su progenie metablica.
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Composiciones nutricionales La composiciones nutricionales que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invencin para los propsitos de la presente invencin incluyen cualquier alimento o preparacin para consumo humano, incluyendo para consumo entrico o parenteral, el cual, cuando se toma en el cuerpo (a) sirve para nutrir o construir tejidos o aportar energa, y/o (b) mantener, restablecer, o apoyar el estado nutricional o funcin metablica adecuados. La composicin nutricional que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invencin comprende al menos un aceite o cido producido de acuerdo con la presente invencin, y puede estar en una forma slida o lquida. Adicionalmente, la composicin puede incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en cantidades deseadas para un uso particular. La cantidad de tales ingredientes variar dependiendo de si la composicin se destina a un uso con criaturas sana, normales, o nios o adultos que tengan necesidades especializadas tales como aqullas que acompaan ciertas condiciones metablicas (por ejemplo, alteraciones metablicas). Los ejemplos de macronutrientes que pueden aadirse a la composicin incluyen, pero no se limitan a, las grasas comestibles, los carbohidratos y las protenas. Los ejemplos de tales grasas comestibles incluyen, pero no se limitan a, el aceite de coco, el aceite de soja, y los mono- y diglicridos. Los ejemplos de tales carbohidratos incluyen, pero no se limitan a, la glucosa, la lactosa comestible, y el almidn hidrolizado. Adicionalmente, los ejemplos de protenas que pueden utilizarse en la composicin nutricional incluyen, pero no se limitan a, las protenas de la soja, el suero electrodializado, la leche desnatada eletrodializada, el suero de leche, o los hidrolizados de estas protenas. Con respecto a las vitaminas y minerales, pueden aadirse los siguientes a las composiciones nutricionales: calcio, fsforo, potasio, sodio, cloro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, yodo, y las Vitaminas A, E, D, C, y el complejo de B. Tambin pueden aadirse otras vitaminas y minerales parecidos.
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Los componentes utilizados en las composiciones nutricionales ser de origen semi-puricado o puricado. Por semi-puricado o puricado se entiende un material que ha sido preparado mediante puricacin de un material natural o por sntesis.
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Los ejemplos de composiciones nutricionales que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invencin incluyen, pero no se limitan a, las frmulas para bebs, los suplementos dietticos, y las composiciones para rehidratacin. Las composiciones nutricionales de particular inters incluyen, pero no se limitan a, aqullas utilizadas para el suplemento entrico o parenteral para bebs, las frmulas para bebs para especialista, los suplementos para los ancianos, y los suplementos para aqullos con dicultades gastrointestinales y/o malabsorcin. Composiciones nutricionales Una composicin nutricional tpica que puede obtenerse segn los procedimientos de la invencin contendr macronutrientes comestibles, vitaminas y minerales en las cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de tales ingredientes variarn dependiendo de si la formulacin est destinada a un uso con individuos sanos, normales, temporalmente expuestos a estrs, o a sujetos que tienen necesidades especiales debido a a ciertos estados morbosos crnicos o agudos (por ejemplo, alteraciones metablicas). Las personas formadas en la tcnica entendern que los componentes utilizados en una formulacin nutricional que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la
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presente invencin son de origen semi-puricado o puricado. Por semi-puricado o puricado se quiere indicar un material que se ha preparado mediante la puricacin de un material natural o mediante sntesis. Estas tcnicas son bien conocidas en tcnica (Ver, por ejemplo, Code of Federal Regulations for Food Ingredients and Food Processing; Recommended Dietary Allowances, 10 edicin, National Academy Press, Washington, D.C., 1989).
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Preferiblemente, la formulacin nutricional que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invencin es un producto nutricional enteral; ms preferiblemente un producto de nutricional enteral de adultos o nios. En consecuencia, la formulacin nutricional es apropiada para alimentar adultos o nios que estn experimentando estrs. La frmula comprende, adems de los PUFA de la invencin; macronutrientes, vitaminas y minerales en cantidades diseadas para proporcionar los requisitos nutricionales diarios de los adultos. Los componentes macronutricionales incluyen las grasas comestibles, los carbohidratos y las protenas. Son ejemplos de grasas comestibles el aceite de coco, el aceite de soja, y los mono- y diglicridos, y los aceites de PUFA producidos por esta invencin. Son ejemplos de carbohidratos la glucosa, la lactosa comestible, y el almidn hidrolizado de maz. Unas fuentes tpicas de protena son: la protena de soja, el suero electrodializado o la leche desnatada electrodializada o el suero de leche, o los hidrolizados de estas protenas, aunque tambin hay disponibles otras fuentes de protenas y pueden usarse. Estos macronutrientes se aadirn en forma de compuestos nutricionales comnmente aceptados en cantidad equivalente a las presentes en la leche humana o en base a la energa, es decir, en base a las caloras. Los procedimientos para formular frmulas nutricionales lquidas y enterales son bien conocidos en la tcnica, y se describen en detalle en los ejemplos.

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La frmula enteral puede esterizilarse y usarse subsiguientemente de forma lista-para-alimentar (RTF) o almacenarse en un lquido concentrado o en un polvo. El polvo puede prepararse mediante secado por atomizacin de la frmula enteral preparada tal como se ha indicado ms arriba, y reconstituirse la frmula mediante rehidratacin del concentrado. Las frmulas nutricionales para adultos y bebs son bien conocidas en la tcnica y estn disponibles comercialmente (por ejemplo, Similac, Ensure, Jevity y Alimentum procedentes de la Ross Products Divisin, Abbot Laboratories). Un aceite o cido que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invencin puede aadirse a cualquiera de estas frmulas en las cantidades descritas ms arriba. La densidad de energa de las composiciones nutricionales cuando estn en forma lquida, puede oscilar tpicamente desde aproximadamente 0,6 kcal hasta 3,0 kcal por ml. Cuando est en forma slida o pulverizada, el suplemento nutricional puede contener desde aproximadamente 1,2 hasta ms de 9 kcal por g, preferiblemente de 3 a 7 kcal por g. En general, la osmolalidad de un producto lquido debera ser inferior a 700 mOsm y ms preferiblemente inferior a 660 mOsm. La frmula nutricional tpicamente incluir vitaminas y minerales, adems de los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invencin, con objeto de ayudar a la ingestin individual de los requerimientos diarios de estas sustancias. Adems de los PUFA listados ms arriba, puede ser deseable suplir la composicin nutricional con zinc, cobre, y cido flico adems de antioxidantes. Se cree que estas sustancias tambin proporcionarn un impulso al sistema inmune estresado, y de est modo proporcionarn benecios adicionales al individuo. La presencia de zinc, cobre, o cido flico es opcional y no se requiere con objeto de ganar los efectos beneciosos sobre la supresin inmune. De igual forma, una composicin farmacutica se puede suplir tambin con estas mismas sustancias. La frmula nutricional puede contener, adems del sistema antioxidante y del componente PUFA, una fuente de carbohidratos, en donde al menos el 5% de dicho carbohidrato es un oligosacrido no digerible. Preferiblemente, la composicin nutricional contiene adicionalmente protena, taurina y carnitina.

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Los PUFA, o derivados de los mismos, preparados mediante el procedimiento descubierto pueden usarse como sustitutos o suplementos dietticos, particularmente en las frmulas para nios, para pacientes que experimentan alimentacin intravenosa o para prevenir o tratar la malnutricin. Tpicamente, la leche para lactancia humana tiene un perl de cidos grasos que comprende desde aproximadamente el 0,15% hasta aproximadamente el 0,36% como DHA, desde aproximadamente el 0,03% hasta aproximadamente el 0,13% como EPA, desde aproximadamente el 0,30% hasta aproximadamente el 0,88% como ARA, desde aproximadamente el 0,22% hasta aproximadamente el 0,67% como DGLA, y desde aproximadamente el 0,27% hasta aproximadamente el 1,04% como GLA. Adicionalmente, se ha descrito que el triglicrido predominante en la leche humana es el 1,3-di-oleoil-2-palmitoil, informndose que los 2-palmitoil glicridos son mejor absorbidos que los 2-oleoil o 2-lineoil glicridos (USPN 4.876.107). Por tanto, los cidos grasos tales como el ARA, DGLA, GLA y/o EPA producidos por la invencin pueden usarse para alterar la composicin de la frmula para bebs para replicar mejor la composicin en PUFA de la leche para lactancia humana. En particular, una composicin de aceite para uso en un suplemento farmacolgico o alimentario, particularmente un sustituto o suplemento de la leche para lactancia, preferiblemente comprender uno o ms de ARA, DGLA o GLA. Ms preferiblemente, el aceite comprender desde aproximadamente un 0,3 hasta un 30% de ARA, desde aproximadamente un 0,2 hasta un 30% de DGLA, y desde aproximadamente un 0,2 hasta aproximadamente un 30% de GLA. Adems de la concentracin, las proporciones de ARA, DGLA y GLA pueden adaptarse para un determinado
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uso nal. Cuando se formula como un suplemento o sustituto de leche para lactancia, una composicin de aceite que contenga dos o ms de ARA, DGLA y GLA se proporcionar respectivamente en una proporcin de desde 1:19:30 hasta aproximadamente 6:1:0,2. Por ejemplo, la leche para lactancia de animales puede variar en proporciones de ARA:DGLA:DGL que oscilan desde 1:19:30 hasta 6:1:0,2, las cuales incluyen proporciones intermedias que preferiblemente son 1:1:1, 1:2:1, 1:1:4. Cuando se producen juntos en una clula husped, el ajuste de la proporcin y porcentaje de conversin de un sustrato precursor, tal como GLA y DGLA a ARA, puede usarse para controlar con precisin las proporciones de PUFA. Por ejemplo, un 5% a 10% de velocidad de conversin de DLGA a ARA puede usarse para producir una proporcin de ARA respecto DGLA de aproximadamente 1:19, mientras que una velocidad de conversin de aproximadamente el 75% a 80% puede usarse para producir una proporcin de ARA respecto DGLA de aproximadamente 6:1. Por tanto, sea en un sistema de cultivo de clulas o en un animal husped, la regulacin del momento, extensin y especicidad de la expresin de la desaturasa tal como se describe, puede usarse para modular los niveles y proporciones de PUFA. Dependiendo del sistema de expresin usado, por ejemplo, un cultivo de clulas o un animal que expresa aceite o aceites en su leche, los aceite tambin pueden aislarse y combinarse de nuevo en las concentraciones y proporciones deseadas. La cantidades de aceites que proporcionan estas proporciones de PUFA pueden determinarse siguiendo protocolos estndares. Los PUFA, o las clulas huspedes que los contienen, pueden usarse tambin como suplementos alimentarios para animal para alterar la composicin en cidos grasos de un tejido o la leche del animal hacia una ms deseable para consumo humano o animal. Para el suplemento diettico, los PUFA puricados, o los derivados de los mismos, pueden incorporarse en los aceites, grasas o margarinas de coccin, formulados de tal forma que el receptor recibira la cantidad deseada con un uso normal. Los PUFA tambin pueden incorporarse en frmulas para nios, suplementos nutricionales u otros productos alimentarios, y puede hallar un uso como agentes antiinamatorios o reductores del colesterol. Composiciones farmacuticas
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Las composiciones farmacuticas que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invencin comprenden uno o ms de los cidos y/o aceites resultantes de acuerdo con los procedimientos descritos en sta. Ms especcamente, una composicin farmacutica puede comprender uno o ms de los cidos y/o aceites, as como un portador estndar, bien conocido, no txico, y farmacuticamente aceptable, un adyuvante o vehculo, tal como, por ejemplo, la solucin salina tamponada con fosfato, el agua, el etanol, los polioles, los aceites vegetales, un agente humectativo, o una emulsin tal como una emulsin agua/aceite. La composicin puede estar en una forma lquida o slida. Por ejemplo, la composicin puede estar en forma de una tableta, cpsula, lquido o polvo ingerible, inyectable, pomada tpica o crema. Las posibles rutas de administracin incluyen, por ejemplo, la oral, la rectal y la parenteral. La ruta de administracin depender, por supuesto, del efecto deseado. Por ejemplo, si la composicin se est utilizando para tratar una piel rugosa, seca o envejecida, para tratar piel lesionada o quemada, o para tratar piel o cabello afectados por una enfermedad o condicin, tal vez se aplicara tpicamente. La dosicacin de la composicin a administrar al paciente puede ser determinada por alguien con formacin ordinaria en la tcnica, y depende de varios factores, tales como el peso del paciente, la edad del paciente, el estado inmune del paciente, etc. En relacin a la forma, la composicin puede ser, por ejemplo, una solucin, una dispersin, una suspensin, una emulsin, o un polvo estril que se reconstituye a continuacin. Adicionalmente, la composicin que puede obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invencin puede utilizarse con propsitos cosmticos. Puede aadirse a composiciones cosmticas pre-existentes, de modo que se forme una mezcla, o puede usarse como una composicin sola.

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Las composiciones farmacuticas pueden utilizarse para administrar el componente PUFA a un individuo. Las composiciones farmacuticas pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas siolgicamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, y polvos estriles para su reconstitucin en soluciones o dispersiones estriles para su ingestin. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehculos acuosos y no acuosos apropiados incluyen el agua, el etanol, los polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales (tales como el aceite de oliva) y steres orgnicos inyectables tales como el etiloleato. La uidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamao de partcula requerido, en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. Tambin puede ser deseable incluir agentes isotnicos, por ejemplo, azcares, cloruro sdico y similares. Aparate de tales diluyentes inertes, la composicin puede incluir tambin adyuvantes, tales como agentes humectativos, agentes emulsionantes y de suspensin, agentes edulcorantes, de condimento y fragancias. Las suspensiones, adems de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensin, como por ejemplo, los alcoholes isostearilos etoxilados, el los steres de sorbitol y sorbitn con polioxietileno, la celulosa microcristalina, el metahidrxido de aluminio, la bentonita, el agar-agar, y el tragacanto, o mezclas de estas sustancias, y similares. Las formas de dosicacin slidas, tales como las tabletas y cpsulas, pueden prepararse usando tcnicas bien conocidas en la tcnica. Por ejemplo, los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invencin
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pueden formularse en tabletas con bases de tabletas convencionales, tales como la lactosa, la sacarosa, y el almidn de maz, en combinacin con unidores tales como acacia, almidn de maz, o gelatina, agentes desintegradores tales como el almidn de patata o el cido algnico, y un lubricante tal como el cido esterico o el estearato magnsico. Las cpsulas pueden prepararse incorporando estos excipientes en una cpsula de gelatina junto con los antioxidantes y el componente PUFA. La cantidad de los antioxidantes y del componente PUFA que debera incorporarse en la formulacin farmacutica debera hallarse dentro de las directrices discutidas ms arriba. Tal como se usa en esta solicitud, el trmino tratar se reere, bien a prevenir, o a reducir la incidencia del acontecimiento no deseado. Por ejemplo, tratar la supresin inmune se reere a prevenir la ocurrencia de esta supresin o a reducir la cantidad de tal supresin. Los trminos paciente e individuo se usan de forma intercambiable, y ambos de reeren a un animal. El trmino animal, tal como se usa en esta solicitud, se reere a cualquier mamfero de sangre caliente, incluyendo, pero no limitndose a, los perros, humanos, monos y simios. Tal como se usa en la solicitud, el trmino aproximadamente se reere a una cantidad que vara respecto el rango o nmero indicado en una cantidad razonable dependiendo del contexto de uso. Cualquier nmero o rango numrico especicado en la especicacin debera considerarse que est modicado por el trmino aproximadamente. Dosis y servicio se usan de forma intercambiable, y se reeren a la cantidad de composicin nutricional o farmacutica ingerida por el paciente en una composicin nica y diseada para proporcionar cantidades efectivas de los antioxidantes y el triglicrido estructurado. Como ser fcilmente evidente a los especialistas en la tcnica, una nica dosis o servicio del polvo nutricional lquido debera proporcionar la cantidad de antioxidantes y PUFA discutida ms arriba. La cantidad de la dosis o servicio debera tener un volumen tal que un adulto tpico lo pueda consumir de una vez. Esta cantidad puede variar ampliamente dependiendo de la edad, peso, sexo o condicin mdica del paciente. No obstante, como pauta general, un servicio o dosis nica de un producto nutricional lquido debera considerarse que abarca desde 100 hasta 600 ml, ms preferiblemente desde 125 hasta 500 ml, y lo ms preferiblemente desde 125 hasta 300 ml. Los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invencin tambin pueden aadirse a los alimentos, incluso cuando no se requieren suplementos de la dieta. Por ejemplo, la composicin puede aadirse a alimentos de cualquier tipo, incluyendo, pero no limitndose a, margarinas, mantequillas modicadas, quesos, leche, yogures, chocolate, golosinas, tentempis, aceites para ensaladas, aceites de coccin, grasas de coccin, pescados y bebidas. Aplicaciones farmacuticas
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Para un uso farmacutico (humano o veterinario), las composiciones se administran generalmente de forma oral, pero pueden administrarse por cualquier ruta por la que puede ser exitosamente absorbida, por ejemplo, parenteralmente (es decir, subcutnea, intramuscular o intravenosamente), rectalmente o vaginalmente o tpicamente, por ejemplo, como una pomada o locin para la piel. Los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la presente invencin pueden administrarse solos o en combinacin con otro portador o excipiente farmacuticamente aceptable. Cuando estn disponibles, las cpsulas de gelatina son la forma de administracin oral preferida. El suplemento diettico, tal como se ha establecido ms arriba, puede proporcionar tambin una ruta oral de administracin. Los cidos insaturados pueden administrarse en formas conjugadas, o como sales, steres, amidas o prodrogas de los cidos grasos. Cualquier sal farmacuticamente aceptable est contemplada, son especialmente preferidas las sales de sodio, potasio o litio. Tambin se contemplan las sales de N-alquilpolihidroxamina, tales como la N-metilglucamina, halladas en la publicacin del PCT WO-96/33.155. Los steres preferidos son los etilsteres. Como sales slidas, los PUFA pueden administrarse tambin en forma de tableta. Para la administracin intravenosa, los PUFA o derivados de los mismos pueden incorporarse en formulaciones comerciales tales como Intralipids. El perl tpico de cidos grasos en adultos normales comprende del 6,64 al 9,46% de ARA, del 1,45 al 3,11% de DGLA, y del 0,02 al 0,08% de GLA. Estos PUFA o sus precursores metablicos pueden administrarse, bien slos o en mezclas con otros PUFA, para conseguir un perl de cidos grasos normal en un paciente. Cuando se desee, los componentes individuales de las formulaciones pueden proporcionarse individualmente en forma de equipo, para uso nico o mltiple. Una dosicacin tpica para un cido graso particular va desde 0,1 mg hasta 20 g, o incluso 100 g, diarios, y preferiblemente es de 10 mg hasta 1, 2, 5 10 g diarios segn se requiera, o cantidades molares equivalentes de formas derivadas del mismo. Se contemplan las composiciones de nutricin parenteral que comprenden desde aproximadamente el 2 hasta aproximadamente el 30 por ciento en peso de cidos grasos, calculados como triglicridos; la preferida es una composicin que tiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente el 25 por ciento de la composicin de PUFA total como GLA (USPN 5.196.198). Opcionalmente pueden aadirse otras vitaminas, y particularmente vitaminas solubles en grasas, tales como las vitaminas A, D, E y la L-carnitina. Cuando se desee, puede aadirse un conservante tal como el -tocoferol, tpicamente a aproximadamente el 0,1% en peso. Las composiciones farmacuticas apropiadas pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas, dispersiones, suspensiones o emulsiones estriles y siolgicamente aceptables, o polvos estriles para su reconstitucin en soluciones o dispersiones inyectables estriles. Los ejemplos de portadores, diluyentes, solventes o vehculos acuosos y no acuosos incluyen el agua, el etanol, los polioles (propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, y similares), mezclas apropiadas de los mismos, aceites vegetales (tales como el aceite de oliva), y steres orgnicos inyectables tales como el etiloleato. La uidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamao de partcula, en el caso de las dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos. Tambin puede ser deseable la inclusin de agentes isotnicos, por ejemplo, azcares, cloruro sdico, y similares. Aparte de tales diluyentes inertes, la composicin
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puede incluir tambin adyuvantes, tales como agentes humectativos, agentes emulsionantes y de suspensin, agentes edulcorantes, de condimento y fragancias.
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Las suspensiones, adems de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensin, como por ejemplo, los alcoholes de isostearilo etoxilados, el polioxietilen sorbitol y los steres de sorbitn, la celulosa microcristalina, el metahidrxido de aluminio, la bentonita, el agar-agar, y el tragacanto, o mezclas de estas sustancias y las similares. Una composicin farmacutica especialmente preferida contiene steres del cido diacetiltartrico con mono- y diglicridos disueltos en un medio acuoso o solvente. Los steres del cido diacetiltartrico con mono- y diglicridos tienen un valor de HLB de aproximadamente 9-12, y son signicativamente ms hidroflicos que los lpidos antimicrobianos existentes, que tienen valores de HLB de 2-4. Esos lpidos hidroflicos existentes no pueden formularse en soluciones acuosas. Tal como se descubre en sta, esos lpidos pueden solubilizarse ahora en medio acuoso en combinacin con steres del cido diacetiltartrico con mono- y diglicridos. De acuerdo con esto, los steres del cido diacetiltartrico con mono- y diglicridos (por ejemplo, DATEM-C12:0) se funden con otros lpidos antimicrobianos activos (por ejemplo, monoglicridos de 18:2 y 12:0) y se mezclan para obtener una mezcla homognea. La homogeneidad permite una actividad antimicrobiana incrementada. La mezcla puede dispersarse completamente en agua. Esto no es posible sin la adicin de steres del cido diacetiltartrico con mono- y diglicridos, y mezclando previamente con otros monoglicridos antes de su introduccin en agua. Las composicin acuosa puede mezclarse a continuacin en condiciones estriles con diluyentes, conservantes, tampones o propulsores, tal como puede requerirse para formar un aerosol o inhalante, siolgicamente aceptables. Numerosos trastornos pueden tratarse con los cidos grasos que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de la invencin. El suplemento con los PUFA que pueden obtenerse usando los procedimientos de la presente invencin puede usarse para tratar la reestenosis posterior a la angioplastia. Los sntomas de inamacin, de la artritis reumatoide, y del asma y psoriasis pueden tratarse con los PUFA. La evidencia indica que los PUFA pueden estar implicados en el metabolismo del calcio, sugiriendo que los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invencin pueden usarse en el tratamiento o prevencin de la osteoporosis y de los clculos renales o urinarios. Los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invencin pueden usarse en el tratamiento del cncer. Se ha observado que las clulas malignas tienen una composicin de cidos grasos alterada; se ha observado que la adicin de cidos grasos retrasa su crecimiento y causa la muerte celular, y para incrementar su susceptibilidad a los agentes quimioteraputicos. Se ha mostrado que el GLA causa la expresin de nuevo en clulas cancerosas de las molculas de adhesin celular E-cadherinas, la prdida de las cuales est asociada con las metstasis agresivas. El ensayo clnico de la administracin intravenosa de sales de litio de GLA solubles en agua a pacientes con cncer de pncreas produjo incrementos estadsticamente signicativos en su supervivencia. El suplemento con PUFA puede ser til tambin para tratar la caquexia asociada con el cncer. Los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invencin se han usado tambin para tratar la diabetes (USPN 4.826.877; Horrobin et al., Am. J. Clin. Nutr. 57 (supl): 732S-737S). Se ha demostrado el metabolismo y composicin alterados de cidos grasos en animales diabticos. Se ha sugerido que estas alteraciones estn implicadas en alguna de las complicaciones a largo plazo resultantes de la diabetes, incluyendo la retinopata, la neuropata, la nefropata, y el dao del sistema reproductor. Se ha mostrado que el aceite de onagra, el cual contiene GLA, previene e invierte la lesin diabtica del nervio. Los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invencin se han usado para tratar eczemas, reducir la presin sangunea, y mejorar las notas en matemticas. Se ha sugerido que la deciencia en cidos grasos esenciales est implicada en el eczema, y hay estudios que han mostrado efectos beneciosos sobre el eczema a partir del tratamiento con GLA. Se ha observado tambin que el GLA reduce los incrementos en la presin sangunea asociados con el estrs, y que mejora los resultados en los exmenes de aritmtica. Se ha mostrado que GLA y DGLA inhiben la agregacin de las plaquetas, causan vasodilatacin, disminuyen los niveles de colesterol, e inhiben la proliferacin del tejido broso y muscular liso de las paredes de los vasos (Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. 83:85-101 (1976)). La administracin de GLA o DGLA, solos o en combinacin con EPA, se ha mostrado que reduce o previene el sangrado gastrointestinal y otros efectos secundarios causados por frmacos antiinamatorios no esteroideos (USPN 4.666.701). Tambin se ha mostrado que el GLA y DGLA previenen o tratan la endometriosis y el sndrome pre-menstrual (USPN 4.758.592), y que tratan la encefalomielitis milgica y la fatiga crnica despus de las infecciones virales (USPN 5.116.871). Los usos adicionales de los PUFA que pueden obtenerse con los procedimientos de esta invencin incluyen su uso en el tratamiento del SIDA, de la esclerosis mltiple, del sndrome respiratorio agudo, de la hipertensin, y de los desarreglos de la piel. Los PUFA pueden usarse tambin en frmulas para la salud en general as como para tratamientos geritricos. Aplicaciones veterinarias Debera destacarse que las composiciones farmacuticas y nutricionales antes descritas pueden utilizarse en relacin con animales, as como con humanos, puesto que los animales experimentan las mismas necesidades y condi19

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ciones que los humanos. Por ejemplo, el aceite o cidos que pueden obtenerse con los procedimientos de la presente invencin pueden utilizarse como suplementos de alimentacin animal. Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustracin y no de limitacin.
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Ejemplos Ejemplo 1
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Construccin de una biblioteca de ADNc a partir de Mortierella alpina. Aislamiento de una secuencia nucleotdica de 6-desaturasa a partir de Mortierella alpina Identicacin de homlogos de la 6-desaturasa Mortierella alpina Aislamiento de una secuencia nucleotdica de 12-desaturasa a partir de Mortierella alpina Expresin de los clones de desaturasa de M. alpina en levadura de panadera Optimizacin inicial de las condiciones de cultivo Distribucin de los PUFA en las fracciones lipdicas de levadura Optimizacin adicional del cultivo y coexpresin de las desaturasas 6 y 12 Identicacin de homlogos con las desaturasas 5 y 6 de M. alpina Identicacin de homlogos de 5 y 6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA Identicacin de homlogos de 5 y 6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA Secuencias de genes de desaturasas humanas Composiciones nutricionales

Ejemplo 2 Ejemplo 3

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Ejemplo 9 Ejemplo 10 Ejemplo 11

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Ejemplo 1 Construccin de una biblioteca de ADNc a partir de Morterilla alpina

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El ARN total se aisl a partir de un cultivo de 3 das de edad de Morteriella alpina que produca PUFA usando el protocolo de Hoge et al., Experimental Mycology, 6:225-232 (1982). El ARN se us para preparar un ADNc de doble hebra usando el sistema de BLR lambda-ZipLox siguiendo las instrucciones del fabricante. Se empaquetaron por separado fracciones de varios tamaos de ADNc de M. alpina para obtener bibliotecas con diferentes insertos de tamao promediado. Una biblioteca de longitud completa contiene aproximadamente 3 x 106 clones con una tamao promedio de inserto de 1,77 kb. La biblioteca del tipo secuenciacin contiene aproximadamente 6 x 105 clones con un tamao promedio del inserto de 1,1 kb. Ejemplo 2

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Aislamiento de una secuencia de nucletidos de 6-desaturasa a partir de Mortierella alpina Se obtuvo una secuencia de cido nucleico a partir de un clon parcial de ADNc, Ma524, que codicaba una 6desaturasa de cidos grasos de Mortierella alpina mediante la secuenciacin aleatoria de clones procedentes de la biblioteca del tipo secuenciacin de ADNc de M. alpina descrita en el Ejemplo 1. Los plsmidos que contenan el ADNc se cortaron como sigue. Se combinaron 5 l de fagos con 100 l de E. coli DH10B(ZIP) crecida en ECBL ms 10 mg/ml de kanamicina, 0,2% de maltosa, y Mg2 SO4 10 mM, y se incubaron a 37\degC durante 15 minutos. Se aadieron 0,9 ml de SOC e inmediatamente se sembraron 100 l de bacteria en cada una de las 10 placas de ECLB + 50 g Pen. No se necesit ningn tiempo de 45 minutos de recuperacin. Las colonias se recogieron en medio ECBL + 50 g Pen para cultivos de una noche a ser usados para preparar reservas en glicerol y ADN de miniprep. Una alcuota del cultivo para el miniprep se almacen como reserva en glicerol. El sembrado de ECLB + 50 g Pen/ml result en ms colonias y en una mayor proporcin de colonias conteniendo insertos que el sembrado sobre 100 mug/ml Pen. Se tomaron colonias aleatoriamente y el ADN plasmdico se puric usando equipos miniprep de Qiagen. La secuencia de ADN se obtuvo partir del extremo 5 del inserto de ADNc y se compar con la base de datos no redundante del National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando el algoritmo BLASTX. El Ma524 se
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identic como una desaturasa putativa basndose en homologa de secuencia de ADN con desaturasas previamente identicadas.
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Se aisl un clon de ADNc de longitud completa a partir de la biblioteca de tamao completo de M. alpina y se denomin pCGN5532. El ADNc est contenido como un inserto de 1617 p.b. en el vector pZL1 (BRL) y, empezando con el primer ATG, contiene una pauta de lectura abierta que codica 457 aminocidos. Las tres cajas de histidina que se sabe estn conservadas entre desaturasas unidas a membrana (Okuley et al., The Plan Cell 6:147-158 (1994)) se hall que estaban presentes en las posiciones de aminocidos 172-176, 209-213, y 395-399 (ver Figura 3). Al igual que con otras 6-desaturasa unidas a membrana, se hall que el motivo nal HXXHH de la caja de histidina era QXXHH. Se hall que la secuencia de Ma524 presentaba una homologa signicativa con una porcin de un csmido de Caenorhabditis elegans, WO6D2.4, una protena de fusin citocromo 5/desaturasa del girasol, y las 6-desaturasas de Synechocystis y Spirulina. Adems, se observ que Ma524 tena homologa con la secuencia de aminocidos de la 6-desaturasa de borraja (Publicacin del PCT WO 96/21022). Por tanto, Ma524 parece codicar una 6-desaturasa que est relacionada con las 6-desaturasa de borraja y de algas. Las secuencias peptdicas se muestran como SEC. N ID.: 5 - SEC. N ID.: 11. Se hall que el extremo amino-terminal de la protena codicada mostraba una homologa signicativa con las protenas del citocromo b5. El clon de ADNc de Mortierella parece representar una protena de fusin entre un citocromo b5 y una desaturasa de cido graso. Puesto que se cree que el citocromo b5 funciona como un donante de electrones para enzimas desaturasa unidos a membrana, es posible que el dominio N-terminal citocromo b5 de esta protena desaturasa est implicado en su funcin. Esto puede ser una ventaja cuando se expresa la desaturasa en sistemas heterlogos para la produccin de PUFA. Sin embargo, debera destacarse que, aunque se hall que las secuencias de aminocidos de la Ma524 y de la 6 de borraja contenan regiones con homologa, se vio que las composiciones en bases de los ADNc eran signicativamente diferentes. Por ejemplo, se observ que el ADNc de borraja tena una composicin global de 60% A/T, con algunas regiones excediendo del 70%, mientras que se observ que el Ma524 tiene un promedio del 44% de A/T de composicin de base, sin regiones que excedieron del 60%. Esto puede tener implicaciones para expresar el ADNc en microorganismos o animales que favorecen diferentes composiciones de bases. Se sabe que puede ocurrir la pobre expresin de los genes recombinantes cuando el husped preere una composicin de bases diferente de la del gen introducido. Los mecanismos para tal pobre expresin incluyen una estabilidad disminuida, sitios de ayuste crpticos, y/o la traducibilidad del ARNm y similares. Ejemplo 3 Identicacin de 6-desaturasas homlogas de la 6-desaturasa de Mortierella alpina

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Se identicaron las secuencias de cido nucleico que codican -6-desaturasa putativas a travs de una bsqueda BLASTX de las bases de datos de Margas de Secuencia Expresadas (EST) a travs del NCBI usando la secuencia de aminocidos del Ma524. Diversas secuencias mostraron homologa signicativa. En particular, la secuencia de aminocidos deducida de dos secuencias de Arabidopsis thaliana, (nmeros de acceso F13728 y T42806) mostr homologa con dos regiones diferentes de la secuencia de aminocidos deducida del Ma524. Se disearon los siguientes cebadores de la PCR: ATTS4723-FOR (complementario de F13728) 5 CUACU ACUAC UAGGA GTCCT CTACG GTGTT TTG (SEC. N ID.: 13) y T42806-REV (complementario de T42806) 5 CAUCA UCAUC AUATG ATGCT CAAGC TGAAA CTG (SEC. N ID.:14). Se transcribieron a la inversa cinco g de ARN total, aislado a partir de silicuas en desarrollo de Arabidopsis thaliana, usando el superscript RTase del BRL y el cebador TSyn (5-CCAAG CTTCT GCAGG AGCTC TTTTT TTTTT TTTTT-3) y se muestra como SEC. N ID.:12. La PCR se llev a cabo en un volumen de 50 l que contena: plantilla derivada del 25 ng de ARN total, 2 pM de cada cebador, 200 M de cada desoxiribonucletido trifosfato, Tris-HCl 60 mM, pH 8,5, (NH4 )2 SO4 15 mM, MgCl2 2 mM, 0,2 U de polimerasa Taq. Las condiciones de los termociclos fueron como sigue: 94 grados durante 30 segundos, 50 grados durante 30 segundos, 72 grados durante 30 segundos. La PCR se continu durante 35 ciclos seguidos por una extensin adicional a 72 grados durante 7 minutos. La PCR result en un fragmento de aproximadamente 750 pares de bases, el cual se subclon, denomin 12-5, y se secuenci. Cada extremo de este fragmento se form para corresponder a la EST de Arabidopsis a partir de la cual se haban diseado los cebadores. La secuencia de aminocidos putativa de 12-5 se compar con la de Ma524, y EST de humano (W28140), ratn (W53753), y C. elegans (R05219) (ver Figura 4). Los patrones de homologa con la 6-desaturasa de Morteriella indican que estas secuencias representan polipptidos de desaturasa putativos. En base a esta estrategia experimental, es probable que puedan clonarse genes de longitud completa usando sondas basadas en las secuencias EST. A continuacin de la clonacin, los genes pueden colocarse en vectores de expresin, expresarse en clulas huspedes, y su actividad especca 6-, u otras actividad desaturasa, puede determinarse como se describe ms abajo. Ejemplo 4 Aislamiento de una secuencia de nucletidos de 12-desaturasa a partir de Mortierella alpina

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En base a los cidos grasos que acumula, pareca probable que Mortierella alpina tuviera un tipo de desaturasas 6. La 6-desaturasa es responsable de la produccin del cido linoleico (18:2) a partir del cido oleico (18:1). El cido linoleico (18:2) es sustrato para una 6-desaturasa. Este experimento se dise para determinar si Mortierella alpina tiene un polipptido 12-desaturasa, y, si lo tiene, para identicar la secuencia nucleotdica correspondiente.
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Se secuenci una colonia aleatoria procedente de la biblioteca del tipo secuenciacin de M. alpina, Ma648, y se identic como una desaturasa putativa en base a la homologa de la secuencia de ADN con desaturasas previamente identicadas, tal como se describi para Ma524 (ver Ejemplo 2). La secuencia de nucletidos se muestra en SEC. N ID.: 13. La secuencia peptdica se muestra en SEC. N ID.: 4. La secuencia de aminocidos deducida desde el extremo 5 del ADNc de Ma648 muestra una homologa signicativa con la 6-desaturasa (12) microsomal (cdigo de acceso #L43921) as como con la oleato-12-hidroxilasa del ricino (cdigo de acceso #U22378). Adems, se observ homologa cuando se comparaba con una variedad de otras secuencias de desaturasas 6 (12) y 3 (15) de cidos grasos. Ejemplo 5 Expresin de los clones de 5-desaturasa de M. alpina en levadura de panadera Transformacin de la levadura
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La transformacin de las levaduras con acetato de litio se realiz de acuerdo con protocolos estndares (Methods in Enzymology 194:186-187 (1991)). En resumen, se cultivaron las levaduras en YPD a 30C. Se recolectaron las clulas mediante centrifugacin, se resuspendieron en TE, se recolectaron de nuevo mediante centrifugacin, y se resuspendieron en TE que contena acetato de litio 100 mM, se recolectaron de nuevo mediante centrifugacin, y se resuspendieron en TE/acetato de litio. Las levaduras resuspendidas se incubaron a 30C durante 60 minutos con agitacin. Se aadi el ADN portador, y se alicuotaron las levaduras en tubos. Se aadi el ADN transformante, y se incubaron los tubos durante 30 minutos a 30C. Se aadi una solucin de PEG, PEG 400 (35% p/p), acetato de litio 100 mM, TE pH 7,5) seguida por una incubacin de 50 minutos a 30C. Se realiz un choque trmico de 5 minutos a 42C, se precipitaron las clulas, se lavaron con TE, se precipitaron de nuevo, y se resuspendieron en TE. A continuacin, las clulas resuspendidas se sembraron sobre medio selectivo. Expresin de la desaturasa en levaduras transformadas

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40

Los clones de ADNc de Mortierella alpina se examinaron en busca de actividad desaturasa en levadura de panadera. Como control positivo se us una 15-desaturasa de colza (obtenida mediante PCR usando la primera hebra del ADNc procedente de semillas Cultivar 212/86 de Brassica napus usando cebadores basados en la secuencia publicada (Arondel et al., Science 258:1353-1355)). El gen de la 15-desaturasa y el gen procedente del clon mA29 de ADNc se insertaron en el vector de expresin pYES2 (Invitrogen), resultando respectivamente en los plsmidos pCGR-2 y pCGR-4. Estos plsmidos se transfectaron en la cepa 334 de la levadura S. cerevisiae y se expresaron despus de la induccin con galactosa y en presencia de sustratos que permitan la deteccin de la actividad desaturasa especca. La cepa control fue la cepa 334 de S. cerevisiae que contena el vector pYES2 inalterado. Los sustratos usados, los productos producidos, y las actividad desaturasa indicada fueron: el DGLA (la conversin a ARA indicara actividad 5-desaturasa), el cido linolnico (la conversin a GLA indicara actividad 6-desaturasa; la conversin a ALA indicara actividad 15-desaturasa), el cido oleico (un sustrato endgeno sintetizado por S. cerevisiae, la conversin a cido linolnico indicara actividad 12-desaturasa; de la cual carece S. cerevisiae), o el ARA (la conversin a EPA indicara actividad 17-desaturasa). Los resultados se proporcionan ms abajo en la Tabla 1. Las fracciones lipdicas se extrajeron como sigue. Los cultivos se dejaron crecer durante 48-52 horas a 15C. Las clulas se precipitaron mediante centrifugacin, se lavaron una vez con ddH2 O estril, y se precipitaron de nuevo. Los precipitados se agitaron con metanol; se aadi cloroformo junto con tritridecanona (como estndar interno). Las mezclas se incubaron durante al menos una hora a temperatura ambiente o a 4C durante la noche. Se extrajo la capa de cloroformo y se ltr a travs de un ltro Whatman con un gramo de sulfato sdico anhidro para suprimir las partculas y el agua residual. Los solventes orgnicos se evaporaron a 40C bajo una corriente de nitrgeno. Los lpidos extrados se derivatizaron a continuacin a metilsteres de cidos grasos (FAME) para su anlisis mediante cromatografa de gases (GC) mediante la adicin de 2 ml de hidrxido potsico 0,5 N en metanol en un tubo cerrado. Las muestras se calentaron hasta los 95C a 100C durante 30 minutos y se enfriaron hasta temperatura ambiente. Se aadieron aproximadamente 2 ml de triuoruro de boro al 14% en metanol y se repiti el calentamiento. Despus de enfriada la mezcla de lpidos extrada, se aadieron 2 ml de agua y 1 ml de hexano a los FAME extrados para su anlisis mediante GC. El porcentaje de conversin se calcul dividiendo el producto producido por la suma de (el producto producido y el sustrato aadido) y se multiplic a continuacin por 100. Para calcular el porcentaje de conversin del cido oleico, puesto que no se aadi ningn sustrato, el cido linolnico producido se dividi por la suma de (cido oleico y cido linolnico producidos), y se multiplic a continuacin por 100. En la Tabla 1 siguiente se proporcionan los resultados de la actividad desaturasa.

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TABLA 1 Expresin de la desaturasa de M. alpina en levadura de panadera
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Clon pCGR-2 (15 desaturasa de colza)

Tipo de actividad enzimtica 6 15 5

% De conversin de sustrato 0 (18:2 a 18:36) 16,3 (18:2 a 18:33) 2,0 (20:3 a 20:46) 2,0 (20:3 a 20:46) 2,0 (20:3 a 20:46)

10

15

7 12
20

pCGR-5 (Ma524 de M. alpina)

25

6 15 5

6,0 0 2,1 0 3,3

30

7 12

35

pCGR-7 (Ma648 de M. alpina)

6 15

0 3,8 2,2 0 63,4

40

5 7

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12

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El clon control de la 15-desaturasa exhibi un 16,3% de conversin del sustrato. El clon pCGR-5 que expresaba el ADNc del Ma524 mostr un 6& de conversin del sustrato a GLA, indicando que el gen codica una 6-desaturasa. El clon pCGR-7, que expresaba el ADNc del Ma648, convirti el 63,4% de la conversin del sustrato a LA, indicando que el gen codica una 12-desaturasa. El valor de fondo (conversin no especca de sustrato) estuvo entre 0-3% en estos casos. Tambin hallamos inhibicin de la actividad por sustrato usando diferentes concentraciones del sustrato. Cuando el sustrato se aada a 100 M, el porcentaje de conversin a producto disminua en comparacin a cuando el sustrato se aada a 25 M (ver ms abajo). Adicionalmente, variando las concentraciones de sustrato entre 5 M y 200 M, se hall que las velocidades de conversin oscilaban entre aproximadamente el 5% hasta aproximadamente ms del 75%. Estos datos muestran que pueden expresarse desaturasas con diferentes especicidades de sustrato en un sistema heterlogo, y usarse para producir cidos grasos de cadena larga poliinsaturados. La Tabla 2 representa los cidos grasos de inters como porcentaje del lpido total extrado de la levadura husped S. cerevisiae S334 con el plsmido indicado. No haba glucosa presente en el medio de cultivo. Se us la cromatografa de gas de anidad para separar los respectivos lpidos. Se emple GC/MS para vericar la identidad del producto o de los productos. El producto esperado para la 15-desaturasa de B. napus, el cido -linolnico, se detect cuando su sustrato, el cido linolnico, se aada exgenamente al cultivo de levaduras inducido. Este hallazgo demuestra que la expresin en levadura de un gen de desaturasa puede producir un enzima funcional y cantidades detectables del producto en las condiciones de cultivo actuales. Ambos sustratos aadidos exgenamente fueron captados por la levadura, aunque se incorpor algo menos del PUFA de cadena ms larga, cido dihomo--linolnico (20:3), que del cido linolnico (18:2) cuando cualquiera de ellos se aada en forma libre a los cultivos de levaduras inducidos.
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El cido -linolnico se detect cuando el cido linoleico estaba presente durante la induccin y expresin de S. cerevisiae 334 (pCGR-5). La presencia de este PUFA demuestra la actividad 6-desaturasa de pCGR-5 (MAS524). El cido linoleico identicado en los lpidos extrados de la expresin de S. cerevisiae 334 (pCGR-7) clasica el ADNc de Ma648 procedente de M. alpina. como la 12-desaturasa.
5

TABLA 2 cidos grasos como porcentaje de los lpidos totales extrados de levadura
10

Plsmido en las levaduras pYES2 (control) pCGR-2 (15)

18:2 incorporado 66,9 60,1 62,4 65,6

-18:3 producido 0 5,7 0 0

-18:3 producido 0 0 4,0 0

20:3 producido 58,4 50,4 49,9 45,7

20:4 producido 0 0 0 0

18:1* producido 4 0,7 2,4 7,1

18:2 producido 0 0 0 12,2

15

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pCGR-5 (6) pCGR-7 (12)

25

Aadido sustrato 100 M *18:1 es un cido graso endgeno en levaduras

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Claves para las Tablas 18:1 18:2 -18:3 -18:3 18:4 20:3 20:4 Ejemplo 6 = cido oleico = cido linolnico = cido -linolnico = cido -linolnico = cido estearidnico = cido dihomo--linolnico = cido araquidnico

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Optimizacin de las condiciones de cultivo La Tabla 3A muestra el efecto de la concentracin de sustrato de cido graso sobre la captacin y conversin en levadura a producto de cido graso como un porcentaje del lpido total de levadura extrado. En todos los casos, las cantidades pequeas de sustrato exgeno (1-10 M) resultaron en una baja captacin de cido graso sustrato y formacin de producto. Una concentracin de cido graso libre en el medio de cultivo e induccin entre 25 y 50 M rindi el porcentaje ms elevado de producto de cido graso formado, mientras que una concentracin de 100 M y una captacin subsiguiente ms elevada en levadura pareca disminuir o inhibir la actividad desaturasa. La cantidad de cido graso sustrato para levaduras que expresaban la 12-desaturasa fue similar bajo las mismas condiciones de cultivo, puesto que el sustrato, cido oleico, es un cido graso endgeno de levadura. El uso de cido -linolnico como un sustrato adicional para el pCGR-5 (6) produjo el resultado esperado, cido estearidnico (Tabla 3A). La retroinhibicin por la concentracin elevada de cido graso sustrato se ilustr claramente cuando se compararon en la Tabla 3B las velocidades de porcentaje de conversin de los respectivos cidos graso sustrato en sus respectivos productos. En todos los casos, la concentracin de sustrato 100 M en el medio de cultivo disminuy el porcentaje de conversin en producto. La captacin de -linolnico fue comparable a la de otros PUFA aadidos en forma libre, mientras que el porcentaje de conversin de 6-desaturasa, 3,8-17,5%, al cido estearidnico producto fue el ms bajo para todos los sustratos examinados (Tabla 3B). El efecto del medio, tal como el YPD (medio rico) en comparacin con el medio mnimo con glucosa sobre la velocidad de conversin de la 12-desaturasa fue dramtico. No slo call la velocidad de conversin del cido oleico en cido linoleico (Tabla 3B), sino que el porcentaje de cido linoleico formado tambin disminuy en un 11% cuando se us medio rico para el crecimiento e induccin de la expresin de la 12-desaturasa de levadura (Tabla 3A). El efecto de la composicin del medio fue tambin evidente cuando la glucosa estaba presente en el medio de cultivo para la 6-desaturasa, puesto que el porcentaje de captacin de sustrato disminuy a 25 M (Tabla 3A). Sin embargo, la velocidad de conversin permaneci la misma y el porcentaje de producto formado disminuy para la 6-desaturasa en presencia de glucosa.
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TABLA 3A Efecto del sustrato aadido sobre el porcentaje de sustrato incorporado y producto formado en los extracto de levaduras Plsmido en las levaduras
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pCGR-2 (15) 18:2/-18:3 N.D. N.D. N.D. 36,6/7,2 53,1/6,5 60,1/5,7

pCGR-5 (6) 18:2/-18:3 0,9/0,7 4,2/2,4 11/3,7 25,1/10,3 N.D. 62,4/4

pCGR-5 (6) -18:3/18:4 N.D. 10,4/2,2 18,2/2,7 N.D. N.D. 47,7/1,9

pCGR-7 (12) 18:1*/18:2 N.D. N.D. N.D. 6,6/15,80 10,8/13* 10/24,8

sustrato/producto 1 M sub. 10 M sub.

15

25 M sub. 25 M sub.
20

50 M sub. 100 M sub.

25

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TABLA 3B Efecto de la concentracin de sustrato en el medio sobre el porcentaje de conversin del sustrato de cido graso a producto en los extracto de levaduras

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Plsmido en las levaduras sustrato/producto

pCGR-2 (15) 18:2/-18:3 N.D. N.D. N.D. 16,40 10,90 8,70

pCGR-5 (6) 18:2/-18:3 43,8 36,4 25,2 29,10 N.D. 60

pCGR-5 (6) -18:3/18:4 N.D. 17,5 12,9 N.D. N.D. 3,8

pCGR-7 (12) 18:1*/18:2 N.D. N.D. N.D. 70,50 54,6* 71,3

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1 M sub. 10 M sub.

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25 M sub. 25 M sub. 50 M sub.

50

100 M sub. + *18:1 sub. N.R.

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sin glucosa en el medio caldo de peptona de levadura (YPD) es un lpido de levadura endgeno es la concentracin de sustrato no se ha realizado

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65

La Tabla 4 muestra la cantidad de cido graso producido por una desaturasa recombinante a partir de cultivos de levaduras inducidos cuando se usaron diferentes cantidades sustrato de cido graso libre. Se determin el peso de cido graso puesto que la cantidad total de lpido vari dramticamente cuando se cambiaron las condiciones de cultivo, tales como la presencia de glucosa en el medio de cultivo e induccin de levaduras. Para determinar mejor las condiciones en las que la desaturasa recombinante producira el mximo de producto PUFA, se examin la cantidad de cidos grasos individuales. La ausencia de glucosa redujo a la mitad la cantidad de cido linoleico producido por la 12-desaturasa. Para la 12-desaturasa, la cantidad de lpidos de levadura totales disminuy en casi la mitad en ausencia de glucosa.
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De igual opuesta, la presencia de glucosa en el medio de cultivo de levadura para la 12-desaturasa disminuye el cido -linolnico producido en casi la mitad, mientras que la cantidad total de lpido de levadura producido no fue alterada por la presencia/ausencia de glucosa. Esto apunta a un posible rol para la glucosa como modulador de la actividad 6desaturasa.
5

TABLA 4 cido graso producido en g a partir de los extracto de levaduras

10

Plsmido en las levaduras (enzima) producto

pCGR-4 (5) -18:3 1,9 5,3 10,3 29,6

pCGR-5 (6) 18:4 N.R. 4,4 8,7 N.R.

pCGR-7 (12) 18:2* N.R. N.R. 115,7 39,0

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1 M sub. 10 M sub. 25 M sub.

20

25 M sub. sub. *18:1, N.R.

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sin glucosa en el medio es la concentracin de sustrato el sustrato, es un lpido de levadura endgeno no se ha realizado

30

Ejemplo 7 Distribucin de los PUFA en las fracciones lipdicas de levaduras

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La Tabla 5 ilustra la captacin de cidos grasos libres y sus nuevos productos formados en los lpidos de levaduras tal como estn distribuidos en las principales fracciones lipdicas. Se prepar un extracto lipdico total como se describi ms arriba. El extracto lipdico se separ sobre placas de TLC, y las fracciones se identicaron mediante comparacin con estndares. Las bandas se recogieron rascando, y se aadieron estndares internos. A continuacin, se saponicaron las fracciones y se metilaron como ms arriba, y se sometieron a cromatografa en gas. La cromatografa en gas calcul la cantidad de cido graso por comparacin con un estndar. La fraccin lipdica contena la cantidad ms elevada de PUFAs sustrato y producto para la actividad 6-desaturasa. Parecera que los sustratos son accesibles en la forma de fosfolpido a las desaturasas. TABLA 5 Distribucin de cidos grasos en varias fracciones lipdicas de levadura en g

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Fraccin del cido graso SC (pCGR-4) sustrato 20:3 SC (pCGR-4) producto 20:4

Fosfolpido 166,2

Diglicrido 6,2

cido graso libre 15

Triglicrido 18,2

ster de colesterol 15,6

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61,7

1,6

4,2

5,9

1,2

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SC = (plsmido) S. cerevisiae
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Ejemplo 8 Optimizacin adicional del cultivo y coexpresin de las desaturasas 6 y 12
5

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Este experimento se dise para evaluar las condiciones de crecimiento e induccin para las actividades ptimas de las desaturasas en Saccharomyces cerevisiae. Se desarroll una cepa de Saccharomyces cerevisiae (SC334) capaz de producir cido -linolnico (GLA), para vericar la posibilidad de produccin de PUFA en levadura. Los genes para la 6 y 12-desaturasas de M. alpina se coexpresaron en SC334. La expresin de la D12-desaturasa convirti cido oleico (presente en levaduras) a cido linoleico. El cido linoleico fue usado como sustrato por la 12-desaturasa para producir GLA. La cantidad de GLA producido oscil entre 5-8% del total de cidos grasos producidos en cultivos de SC334, y la velocidad de conversin del cido linoleico a cido -linolnico oscil entre del 30% al 50%. Se optimiz la temperatura de induccin, y tambin se determin el efecto de cambiar la cepa del husped sobre la expresin de los genes de la 6 y 12-desaturasas (respectivamente, MA524 y MA648). Construccin del plsmido La clonacin del pCGR5 as como del pCGR7 se ha discutido ms arriba. Para construir pCGR9a y pCGR9b, se amplicaron los genes de la 6 y 12-desaturasa usando el siguiente conjunto de cebadores. Los pRDS1 y 3 tenan un sitio Xhol y los cebadores pRDS2 y 4 tenan un sitio Xbal (indicado en negritas).

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I. Cebadores para la amplicacin de la 6-desaturasa a. pRDS1 TAC CAA CTC GAG AAA ATG GCT GCT GCT CCC AGT GTG AGG

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b. pRDS2 AAC TGA TCT AGA TTA CTG CGC CTT ACC CAT CTT GGA GGC II. Cebadores para la amplicacin de la 12-desaturasa a. pRDS3 TAC CAA CTC GAG AAA ATG GCA CCT CCC AAC ACT ATC GAT

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b. pRDS4 AAC TGA TCT AGA TTA CTT CTT GAA AAA GAC CAC GTC TCC Las construcciones pCGR5 y pCGR7 se usaron como ADN de plantilla para la amplicacin respectivamente de los genes de las 6 y 12-desaturasas. Los productos amplicados se digirieron Xbal y Xho para crear extremos pegajosos- La 6-desaturasa amplicado por PCR con extremos Xhol-Xbal se clon en el pCGR7, que tambin se haba cortado con Xho-l-Xbal. Este procedimiento coloc la 6-desaturasa detrs de la 12-desaturasa, bajo el control de un promotor GAL1. Esta construccin se denomin pCGR9a. De forma similar, para construir el pCGR9b, la 12desaturasa con extremos XhoI-XbaI se clon en los sitios XhoI-XbaI del pCGR5. En el pCGR9b la 12-desaturasa estaba detrs del gen de la 6-desaturasa, lejos del promotor GAL. Para construir el pCGR10, el vector pRS425, que contiene el promotor constitutivo de la deshidrogenasa del gliceraldehdo-3-fosfato (GAL), se digiri con BamHl, y pCGR5 se digiri con BamHl-Xhol para liberar el gen de la 6-desaturasa. Este fragmento de 6-desaturasa y el pRS425 cortado con BamHl se llenaron usando la polimerasa Klenow para crear extremos romos, y se ligaron, resultando en pCGR10a y pCGR10b que contenan el gen de la 6desaturase respectivamente en la orientacin con sentido y antisentido. Para construir el pCGR11 y el pCGR12, los genes de las 6 y 12-desaturasas se aislaron respectivamente del pCGR5 y pCGR7, usando una doble digestin con EcoRl-XhoI. Los fragmentos EcoRl-Xhol de las 6 y 12-desaturasas se clonaron en el vector pYX242 digerido con EcoRl-Xhol. El vector pYX242 tiene el promotor TPl (un gen housekeeping de levadura), que permite la expresin constitutiva. Transformacin y expresin de levadura Se introdujeron diferentes combinaciones de pCGR5, pCGR7, pCGR9a, pCGR9b, pCGR10a, pCGR11 y pCGR12 en varias cepas huspedes Saccharomyces cerevisiae. La transformacin se hizo usando el PEG/LiAc (Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)). Los transformantes se seleccionaron sembrando sobre medio sinttico que careca del aminocido apropiado. El pCGR5, pCGR7, pCGR9a y pCGR9b se pueden seleccionar sobre medio que carezca de uracilo. Las construcciones pCGR10, pCGR11 y pCGR12 pueden seleccionarse sobre medio que carece de leucina. El crecimiento de los cultivos y el anlisis de los cidos grasos se realizaron como en el Ejemplo 3 anterior. Produccin de GLA La produccin de GLA requiere la expresin de dos enzimas (las 6 y 12-desaturasas), las cuales estn ausentes en levadura. Para expresar estos enzimas en niveles ptimos, se introjeron en varias cepas huspedes las siguientes construcciones o combinaciones de construcciones:
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1) pCGR9a/SC334 2) pCGR9b/SC334
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3) pCGR10a y pCGR7/SC334 4) pCGR11 y pCGR7/SC334
5

5) pCGR12 y pCGR5/SC334 6) pCGR10a y pCGR7/DBY746 7) pCGR10a y pCGR7/DBY746

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La construccin pCGR9a tiene ambos genes de las 6 y 12-desaturasas bajo el control de un promotor GAL inducible. Las clulas huspedes SC334 transformadas con esta construccin no muestran ninguna acumulacin de GLA en los cidos grasos totales (Figuras 6A y B, carril 1). Sin embargo, cuando los genes de las 6 y 12-desaturasas eran controlados individualmente por el promotor GAL, las construcciones de control eran capaces de expresar las 6 y 12-desaturasas, tal como se evidenci mediante la conversin de sus respectivos sustratos en productos. El gen de la 12-desaturasa en pCRG9a se expres, tal como se evidencia por la conversin de 18:1n-9 en 18:2n-6 en pCGR9a/SC334, mientras que el gen de la 6-desaturasa no se expresaba/era activo, porque el 18:2n-6 no estaba siendo convertido en 18:3n-6 (Figuras 6A y B, carril 1). La construccin pCGR9b tambin tiene ambos genes de las 6 y 12-desaturasas bajo el control de un promotor GAL, pero en un orden inverso en comparacin con el pCGR9a. En este caso, se observ muy poco GLA (<1%) en los cultivos de pCGR9b/SC33. La expresin de 12 fue tambin muy baja, tal como se evidenci por el bajo porcentaje de 18:2 en los cidos grasos totales (Figuras 6A y B, carril 1). Para ensayar si la expresin de ambos enzimas bajo el control de promotores independientes incrementara la produccin de GLA, se clon el gen de la 6-desaturasa en el vector pRS425. La construccin del pCGR10a tiene la 6-desaturasa en la orientacin correcta, bajo el control del promotor GPD constitutivo. El pCGR10b tiene el gen de la 6-desaturasa en la orientacin inversa, y sirve como control negativo. Las clulas pCGR10a/SC334 produjeron niveles de GLA signicativamente ms elevados (5% del total de cidos grasos, Figura 6, carril 3), en comparacin con pCGR9a. Ambos genes de las 6 y 12-desaturasas se expresaron a un nivel elevado porque la conversin de 18:118:2 fue del 65%, mientras que la conversin 18:218:3 (6-desaturasa) fue del 30% (Figura 6, carril 3). Tal como se esperaba, el control negativo pCGR10b/SC334 no mostr ningn GLA. Para optimizar adicionalmente la produccin de GLA, se introdujeron los genes de las 6 y 12 en el vector PYX242, crendose respectivamente el pCGR11 y pCGR12. El vector PYX242 permite la expresin constitutiva por parte del promotor TP1 (Alber, T. y Kawasaki, G., J. Mol. & Appl. Genetics, 1:419 (1982)). La introduccin de pCGR11 y pCGR7 en SC334 result en aproximadamente un 8% de GLA en los cidos grasos totales de SC334. La tasa de conversin de 18:118:2 y 18:2.18:3 fue respectivamente de aproximadamente el 50% y 44% (Figuras 6A y B, carril 4). La presencia del pCGR12 y pCGR5 en SC334 result en un 6,6% de GLA en los cidos grasos totales, con una tasa de conversin de aproximadamente el 50% para ambos, el 18:1 a 18:2 y el 18:2 a 18:3, respectivamente (Figuras 6A y B, carril 5). Por tanto, aunque la cantidad de GLA en los cidos grasos totales fue mayor en la combinacin de construcciones pCGR11/pCGR7, las tasas de conversin de sustrato a producto fueron mejores para la combinacin pCGR12/pCGR5. Para determinar si el cambio de la cepa husped incrementara la produccin de GLA, se introdujeron pCGR10a y pCGR7 en la cepas huspedes BJ1995 y DBY746 (obtenidas del Yeast Genetic Stock Centre, 1021 Donner Laboratory, Berkeley, California, 94720. El genotipo de la cepa DBY746 es Mat, his3-D1, leu2-3, leu2-112, ura3-32, trp1-289, gal). Los resultados se muestran en la Figura 7. Cambiar la cepa husped a BJ1995 no mejor la produccin de GLA, puesto que la cantidad de GLA fue slo del 1,31% del total de cidos grasos, y la tasa de conversin de 18:118:2 fue aproximadamente del 17% en BJ1995. No se observ GLA en DBY746 y la conversin 18:118:2 fue muy baja (<1% en control) sugiriendo que un cofactor requerido para la expresin de la 12-desaturas puede estar ausente en DB746 (Figura 7, carril 2). Para determinar el efecto de la temperatura sobre la produccin de GLA, los cultivos de SC334 que contenan el pCGR10a y pCGR7/SC334 se hicieron crecer a 15\degC y 30\degC. Se hallaron niveles ms elevados de GLA en los cultivos hechos crecer e inducidos a 15\degC que en los cultivos hechos crecer e inducidos a 30\degC (4,23% vs. 1,68%). Esto se debi a una tasa de conversin inferior del 18:218:3 en cultivos a 30\degC (11,6% vs. 29% en 15\degC), a pesar de una mayor conversin de 18:118:2 (65% vs. 60% a 30\degC (Figura 8). Estos resultados sugieren que la 12 y la 6 pueden tener temperaturas de expresin ptimas diferentes. De los diversos parmetros examinados en este estudio, la temperatura de crecimiento, la cepa husped de levadura, y los componentes del medio tuvieron el impacto ms signicativo sobre la expresin de la desaturasa, mientras que el momento de la adicin del sustrato y la concentracin de inductor no afectaron signicativamente la expresin de la desaturasa.

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Estos datos muestran que pueden aislarse, a partir Mortierella alpina, dos ADN que codican desaturasas que pueden convertir LA en GLA o cido oleico en LA, y que pueden expresarse, bien individualmente o en combinacin,
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en un sistema heterlogo y usarse para producir cidos grasos de cadena larga poliinsaturados. Se ilustra la produccin de GLA a partir de cido oleico mediante la expresin de las 12- y 6-desaturasas en levadura. Ejemplo 9
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Identicacin de homlogos con las desaturasas 5 y 6 de M. alpina Se identic una secuencia de cido nucleico que codica una 5-desaturasa putativa a travs de una bsqueda con TBLASTN de las bases de datos EST a travs del NCBI usando los aminocidos 100-446 de Ma29 como pregunta. Se us la porcin truncada de la secuencia Ma29 para evitar seleccionar homologas basadas en la porcin del citocromo b5 en el extremo N-terminal de la desaturasa. La secuencia de aminocidos deducida de una EST procedente de Dictyostelium discoideum (cdigo de acceso #C25549) muestra una homologa muy signicativa con la Ma29 y una menor homologa, pero an signicativa, con Ma524. La secuencia de ADN se presenta como SEC. N ID. 19. La secuencia de aminocidos se presenta como SEC. N ID. 20. Ejemplo 10 Identicacin de homlogos de 5 y 6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA

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Para buscar desaturasas implicada en la produccin de PUFA, se construy una biblioteca de ADNc a partir del ARN total aislado de Phaeodactylum tricornutum. Se construy un plsmido basado en la biblioteca de ADNc en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando un equipo disponible comercialmente (GIBCO-BRL). Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios y se identicaron secuencias de cidos nucleicos que codican desaturasas 5 y 6 putativas a travs de la bsqueda BLAST de las bases de datos y de la comparacin con las secuencias de Ma29 y Ma524. Se identic un clon procedente de la biblioteca de Phaeodactylum tricornutum con homologa por Ma29 y Ma524; se denomin 144-011-B12. La secuencia de ADN se presenta como SEC. N ID. 21. La secuencia de aminocidos se presenta como SEC. N ID. 22.

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Ejemplo 11 Identicacin de homlogos de 5 y 6 de M. alpina en otros organismos productores de PUFA

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Para buscar desaturasas implicada en la produccin de PUFA, se construy una biblioteca de ADNc a partir del ARN total aislado de especies de Schizochytrium. Se construy un plsmido basado en la biblioteca de ADNc en pSPORT1 (GIBCO-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando un equipo disponible comercialmente (GIBCO-BRL). Se secuenciaron clones de ADNc aleatorios y se identicaron secuencias de cidos nucleicos que codican desaturasas 5 y 6 putativas a travs de la bsqueda BLAST de las bases de datos y de la comparacin con las secuencias de Ma29 y Ma524. Se identic un clon procedente de la biblioteca de Schizochytrium con homologa por Ma29 y Ma524; se denomin 81-23-C7. Este clon contiene un inserto de 1 kb. Se obtuvo la secuencia parcial a partir de cada extremo del clon usando los cebadores de secuenciacin hacia adelante y hacia atrs universales. La secuencia de ADN procedente del primer cebador hacia adelante se presenta como SEC. N ID. 23. La secuencia peptdica se presenta como SEC. N ID. 24. La secuencia de ADN procedente del primer cebador hacia atrs se presenta como SEC. N ID. 25. La secuencia de aminocidos procedente del cebador hacia atrs se presenta como SEC. N ID. 26. Ejemplo 12

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Secuencias de desaturasas humanas Las secuencias de genes de desaturasas humanas potencialmente implicadas en la biosntesis de cidos grasos poliinsaturados de cadena larga se aislaron en base a la homologa entre las secuencias de ADNc humanas y la secuencias del gen de la desaturasa de Mortierella alpina. Se hallaron tres cajas de histidina conservadas que se sabe que estn conservadas entre las desaturasas unidas a membrana. Al igual que con algunas otras desaturasas unidas a membrana, se hall que el motivo de caja de histidina HXXHH nal era QQXHH. La secuencia de aminocidos de las desaturasas humanas putativas exhibi homologa con las desaturasas 5, 6, 9 y 12 de M. alpina. Las secuencias de ADNc de la 5-desaturasa y 6-desaturasa de M. alpina se usaron para buscar la base de datos LifeSeq de Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, California, 94304. La secuencia de la 5-desaturasa se dividi en fragmentos; 1) aminocidos n 1-150, 2) aminocidos 151-300, y 3) aminocidos 301-446. La secuencia de 6desaturasa se dividi en tres fragmentos; 1) aminocidos n 1-150, 2) aminocidos 151-300, y 3) aminocidos 301457. Estos fragmentos polipeptdicos se buscaron en la base de datos usando el algoritmo tblastn. Este algoritmo compara una secuencia pregunta de protena contra una base de datos de secuencias de nucletidos dinmicamente traducida en la totalidad de las seis pautas de lectura (ambas hebras).

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Los fragmentos polipeptdicos 2 y 3 de la 5 y 6 de M. alpina tienen homologas con las secuencias con CloneID tal como se esboza en la Tabla 6. El CloneID representa una secuencia individual procedente de la base de datos LifeSeq de Incyte. Una vez se hubieron revisados los resultados del tblastn, se busc la Informacin del Clone con los ajustes por defecto de Rigurosidad >= 50 (Stringency), y Puntuacin del Producto <= 100 (Productscore) para diferentes nmeros de CloneID. Los Resultados de Informacin del Clon mostraron la informacin, incluyendo el ClusterID, CloneID, Biblioteca, HitID, Descripcin del Acierto (Hit Description). Cuando se selecciona, el nmero del ClusterID muestra la informacin de clon para todos los clones que pertenecen a ese ClusterID. La instruccin Asemble agrupa la totalidad de los CloneID que comprende el ClusterID. Se usaron los siguientes ajustes por defecto para el Assembly del GCG (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Bioctechnology Center, Madison, Wisconsin 53705): Tamao de palabra Solapamiento mnimo Rigurosidad Identidad mnima Hueco mximo Peso del hueco Peso de la longitud 7 14 0,8 14 10 8 2

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Los resultados del Assembly del GCG mostraron los contig generados en base a la informacin de secuencia dentro del CloneID. Un contig es un alineamiento de secuencias de ADN basado en reas de homologa entre estas secuencias. Se gener una nueva secuencia (secuencia consenso) en base a las secuencias de ADN alineadas dentro del contig. Se identic el contig que contiene el CloneID, y los sitios ambiguos de la secuencia consenso se editaron en base al alineamiento del CloneID (ver SEC. N ID. 21 - SEC. N ID. 25) para generar la mejor secuencia posible. El procedimiento se repiti para la totalidad de los seis CloneID listados en la Tabla 6. Esto produjo cinco contig nicos. Las secuencias consensos editadas de los cinco contig se importaron en el programa informtico Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Harbor, Michigan 48105). Estas secuencias consenso se ensamblaron. El contig 2511785 se solapa con el contig 3506132, y este nuevo contig se denomin 2535 (SEC. N ID. 27). Los contig del programa Sequencher se copiaron en el paquete informtico Sequence Analysis del GCG. Cada contig se tradujo en la totalidad de las seis pautas de lectura en secuencias proteicas. Se compararon las secuencias 5 (MA29) y 6 (MA524) se M. alpina con cada uno de los contig traducidos usando la bsqueda FastA (una bsqueda segn Pearson y Lipman de similitudes entre una secuencia pregunta y un grupo de secuencias del mismo tipo (cido nucleico o protena)). La homologa entre estas secuencias sugiere las pautas de lectura abierta de cada contig. La homologa entre la 5 y 6 de M. alpina con los contig 2535 y 3854933 se utiliz para crear el contig nal denominado 253538a. La Figura 13 es el emparejamiento FastA del contig nal 253538a y el MA29, y la Figura 14 es el emparejamiento del contig nal 253538a y el MA524. Las secuencias de ADN de los varios contig se presentan en las SEC. N ID. 27 - SEC. N ID. 33. Las varias secuencias peptdicas se muestran en las SEC. N ID. 34 - SEC. N ID. 40. Aunque la pauta de lectura abierta se gener mezclando los dos contig, el contig 2535 muestra que hay una nica secuencia al inicio de este contig que no se empareja con el contig 3854933. Por tanto, es posible que estos contig se generaran a partir de genes humanos independientes parecidos a desaturasas. El contig 253538a contiene una pauta de lectura abierta que codica 432 aminocidos. Empieza con Gln (CAG) y termina con el codn de paro (TGA). El contig 253538a se alinea con ambas secuencias, 5 y 6, de M. alpina, sugiriendo que puede ser cualquiera de ambas desaturasas, as como con otras desaturasas conocidas que comparten homologa entre ellas. Los contig individuales listados en la Tabla 6, as como el contig 2535 intermedio y el contig 253538 nal, pueden utilizarse para aislar los genes completos para las desaturasas humanas. Usos de las desaturasas humanas Estas secuencias humanas pueden expresarse en levaduras y plantas utilizando los procedimientos descritos en los ejemplos precedentes. Para la expresin en clulas de mamferos y en animales transgnicos, estos genes pueden proporcionar un sesgo del codn superior.

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Adems, estas secuencias humanas pueden usarse tambin para identicar secuencias de desaturasas relacionadas.

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TABLA 6 Secciones de las desaturasas 151-300 5 301-446 5
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ID del clon en la base de datos LifeSeq 3808675 354535 3448789 1362863 2394760 3350263

Palabra clave Desaturasa de cido graso 6 6 6 6 6

151-300 6 151-300 6

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151-300 6 301-457 6

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Ejemplo 13 Formulaciones para bebs A. Frmula de Soja Isomil con hierro

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Uso: como bebida para bebs, nios y adultos con alergia o sensibilidad a la leche de vaca. Un alimento para pacientes con desrdenes para los que debera evitarse la lactosa: deciencia de lactasa, intolerancia a la lactosa y galactosemia.
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Caractersticas Aislado de protena de soja para evitar los sntomas de la alergia o sensibilidad a las protena de la leche de vaca. Formulacin libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa.

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Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmtica. Carbohidratos duales (jarabe de maz y sacarosa) diseados para potenciar la absorcin de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad absortiva del intestino daado.
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1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 caloras, para ayudar a prevenir la deciencia en hierro. Niveles recomendados de vitaminas y minerales.
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Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de cidos grasos esenciales. Color blanco-leche, consistencia parecida a la de la leche, y aroma agradable.

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Ingredientes: (Pareve, (OU)) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maz, 2,6% de azcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 1,9% de aislado de protena de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato clcico, 0,11% de fosfato clcico tribsico, citrato potsico, fosfato potsico monobsico, cloruro potsico, mono- y diglicridos, lecitina de soja, carragenato, cido ascrbico, L-metionina, cloruro magnsico, fosfato potsico dibsico, cloruro sdico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboavina, hidrocloruro de piridoxina, cido flico, sulfato de manganeso, yoduro potsico, loquinona, biotina, selenito sdico, vitamina D3 y cianocobalamina. B. Frmula de soja Isomil DF para la diarrea

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Uso: como un alimento durante breve tiempo para la gestin diettica de la diarrea en bebs y nios que empiezan a andar. Caractersticas

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Primera frmula para bebs que contiene bra diettica aadida procedente de la bra de soja especcamente para la gestin de la diarrea.

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Se ha mostrado clnicamente que reduce la duracin de las deposiciones blandas, acuosas, durante la diarrea suave a grave en bebs. Nutricionalmente completa para cubrir las necesidades nutricionales del beb.
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El aislado de protena de soja con L-metionina aadida cumple o supera los requisitos del beb para todos los aminocidos esenciales. Formulacin libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa.
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Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmtica. Carbohidratos duales (jarabe de maz y sacarosa) diseados para potenciar la absorcin de carbohidratos y reducir el riesgo de exceder la capacidad absortiva del intestino daado.
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Cumple o supera los niveles de vitaminas y minerales recomendados por el Comit sobre Nutricin de la American Academy of Pediatrics y los requeridos por la Infant Formula Act. 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 caloras, para ayudar a prevenir la deciencia en hierro.
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Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de cidos grasos esenciales. Ingredientes: (Pareve, (OU)) 86% de agua, 4,8% de jarabe de maz, 2,5% de azcar (sacarosa), 2,1% de aceite de soja, 2,0% de aislado de protena de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,77% de bra de soja, 0,12% de citrato clcico, 0,11% de fosfato clcico tribsico, 0,10% de citrato potsico, cloruro potsico, fosfato potsico monobsico, mono- y diglicridos, lecitina de soja, carragenato, cloruro magnsico, cido ascrbico, L-metionina, fosfato potsico dibsico, cloruro sdico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboavina, hidrocloruro de piridoxina, cido flico, sulfato de manganeso, yoduro potsico, loquinona, biotina, selenito sdico, vitamina D3 y cianocobalamina. C. Frmula de soja libre de sacarosa Isomil SF con hierro
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Uso: como bebida para bebs, nios y adultos con alergia o sensibilidad a la leche de vaca, o una intolerancia a la sacarosa. Un alimento para pacientes con desrdenes para los que debera evitarse la lactosa y sacarosa. Caractersticas Aislado de protena de soja para evitar los sntomas de la alergia o sensibilidad a las protena de la leche de vaca.

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Formulacin libre de lactosa para evitar la diarrea asociada con la lactosa (la fuente de carbohidratos son los polmeros de glucosa Polycose). Libre de sacarosa para los pacientes que no pueden tolerar la sacarosa.
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Baja osmolalidad (240 mOsm/kg de agua) para reducir el riesgo de diarrea osmtica. 1,8 mg de hierro (como sulfato ferroso) por cada 100 caloras, para ayudar a prevenir la deciencia en hierro.
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Niveles recomendados de vitaminas y minerales. Aceites vegetales para proporcionar los niveles recomendados de cidos grasos esenciales. Color blanco-leche, consistencia parecida a la de la leche, y aroma agradable.

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Ingredientes: (Pareve, (OU)) 75% de agua, 11,8% de almidn de maz hidrolizado, 4,1% de aceite de soja, 4,1% de aislado de protena de soja, 2,8% de aceite de coco, 1,0% de almidn de maz modicado, 0,38% de fosfato clcico tribsico, 0,17% de citrato potsico, 0,13% de cloruro potsico, mono- y diglicridos, lecitina de soja, cido ascrbico, L-metionina, carbonato clcico, cloruro sdico, cloruro de colina, carragenato, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfatocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboavina, hidrocloruro de piridoxina, cido flico, sulfato de manganeso, yoduro potsico, loquinona, biotina, selenito sdico, vitamina D3 y cianocobalamina. D. Frmula de soja Isomil 20 con hierro, lista para tomar, 20 caloras/onza lquida

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Uso: cuando se desea una alimentacin con soja. Ingredientes: (Pareve, (OU)) 85% de agua, 4,9% de jarabe de maz, 2,6% de azcar (sacarosa), 2,1%de aceite de
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soja, 1,9% de aislado de protena de soja, 1,4% de aceite de coco, 0,15% de citrato clcico, 0,11% de fosfato clcico tribsico, citrato potsico, fosfato potsico monobsico, cloruro potsico, mono- y diglicridos, lecitina de soja, carragenato, cido ascrbico, L-metionina, cloruro magnsico, fosfato potsico dibsico, cloruro sdico, cloruro de colina, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, L-carnitina, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboavina, hidrocloruro de piridoxina, cido flico, sulfato de manganeso, yoduro potsico, loquinona, biotina, selenito sdico, vitamina D3 y cianocobalamina. E. Frmula para bebs Similac
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Uso: Cuando se necesita una frmula para bebs: si se ha tomado la decisin de interrumpir la lactancia materna antes de 1 ao de edad, si se necesita un suplemento para la lactancia materna, o como alimentacin rutinaria si no se ha adoptado la lactancia materna.
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Caractersticas Protena con la cualidad y cantidad apropiada para un buen crecimiento; desnaturalizada con calor, lo cual reduce el riesgo de prdida de sangre entrica asociada con la leche.

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Grasa procedente de una mezcla de aceites vegetales (doblemente homogeneizada), proporcionando el cido linolnico esencial que es fcilmente absorbido. Carbohidratos en forma de lactosa en proporcin similar a la de la leche humana.

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Carga de soluto renal baja para minimizar el estrs en los rganos en desarrollo. En formas de polvo, lquido concentrado y lista para tomar.

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Ingredientes: ((OU)-D) Agua, leche descremada, lactosa, aceite de soja, aceite de coco, mono- y diglicridos, lecitina de soja, cido ascrbico, carragenato, cloruro de colina, taurina, m-inositol, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato ferroso, pantotenato clcico, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, riboavina, hidrocloruro de piridoxina, cido flico, sulfato de manganeso, loquinona, biotina, selenito sdico, vitamina D3 y cianocobalamina. F. Frmula para bebs prematuros Similac NeoCare con hierro Uso: Para las especiales necesidades nutricionales de los bebs prematuros despus de su alta hospitalaria. Similac NeoCare es una frmula nutricionalmente completa desarrollada para proporcionar a los bebs prematuros con las caloras, protenas, vitaminas y minerales extras necesarios para promocionar la recuperacin del retraso en el crecimiento y apoyar su desarrollo. Caractersticas

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Reduce la necesidad de suplemento calrico y de vitaminas. Ms caloras (22 caloras/onza uida) que las frmulas para embarazos estndares (20 caloras/onza uida). Mezcla de grasas altamente absorbida, con triglicridos de cadena media (aceite MCT) para ayudar a cubrir las especiales necesidades digestivas de los bebs prematuros.

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Mayores niveles de protenas, vitaminas y minerales por 100 caloras para prolongar el apoyo nutricional iniciado en el hospital. Ms calcio y fsforo para una mineralizacin sea mejorada.

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Ingredientes: (OU)-D Slidos de jarabe de maz, leche descremada, concentrado de protena de soja, aceite de soja, aceite alto en oleico de alazor, aceite de coco fraccionado (triglicridos de cadena media), aceite de coco, citrato potsico, fosfato clcico tribsico, carbonato clcico, cido ascrbico, cloruro magnsico, cloruro potsico, cloruro sdico, taurina, sulfato ferroso, m-inositol, ascorbil palmitato, L-carnitina, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, tocoferoles mezclados, citrato sdico, pantotenato clcico, sulfato cprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, beta-caroteno, riboavina, hidrocloruro de piridoxina, cido flico, sulfato de manganeso, loquinona, biotina, selenito sdico, vitamina D3 y cianocobalamina. G. Vigorizante de la leche humana bajo en hierro Similac Natural Care, listo para tomar, 24 caloras/onza uida

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Uso: Diseado para ser mezclado con la leche humana o para ser tomado de forma alternativa con la leche humana, para bebs con bajo peso al nacer. Ingredientes: (OU)-D Agua, leche descremada, hidrolizado de almidn de maz, lactosa, aceite de coco fraccio33

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nado (triglicridos de cadena media), concentrado de protena de suero, aceite de soja, aceite de coco, fosfato clcico tribsico, citrato potsico, cloruro de magnesio, citrato sdico, cido ascrbico, carbonato clcico, mono- y diglicridos, lecitina de soja, carragenato, cloruro de colina, m-inositol, taurina, niacinamida, L-carnitina, acetato de alfatocoferil, sulfato de zinc, cloruro potsico, pantotenato clcico, sulfato ferroso, sulfato cprico, riboavina, vitamina A, palmitato, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, biotina, cido flico, sulfato de manganeso, loquinona, vitamina D3 , selenito sdico y cianocobalamina. Varios PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de esta invencin pueden sustituirse en y/o aadirse a las frmulas para bebs descritas ms arriba y a otras frmulas para bebs conocidas por los especialistas en la tcnica. II. Formulaciones nutricionales A. Ensure
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10

Uso: ENSURE es un alimento lquida bajo en residuos diseado principalmente como un suplemento nutricional oral a ser usado con o entre comidas o, en las cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE carece de lactosa y gluten, y es apropiado para su uso en dietas modicadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol. Aunque es principalmente un suplemento oral, puede ser alimentado por tubo.
20

Condiciones del paciente Para pacientes con dietas modicadas.

25

Para pacientes ancianos con riesgo de nutricin. Para pacientes con prdida de peso involuntaria. Para pacientes que se recuperan de una operacin o enfermedad.

30

Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos. Ingredientes

35

40

(OU)-D. Agua, azcar (sacarosa), maltodextrina (maz), caseinatos de calcio y sodio, aceite alto en oleico de alazor, aislado de protena de soja, aceite de soja, aceite de colza, citrato potsico, fosfato clcico tribsico, citrato sdico, cloruro magnsico, fosfato magnsico dibsico, aroma articial, cloruro sdico, lecitina de soja, cloruro de colina, cido ascrbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, goma Gellan, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato de manganeso, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboavina, cido flico, molibdato sdico, cloruro de cromo, yoduro potsico, selenato sdico. B. Ensure bars

45

Uso: Las ENSURE BARS son una nutricin completa y equilibrada para uso como suplemento entre o con las comidas. Proporcionan una alternativa deliciosa y rica en nutrientes a otros tentempis. Las barritas ENSURE BARS contienen < 1 g de lactosa/barrita, y el sabor Chocolate Fudge Brownie carece de gluten (El sabor a Honey Graham Crunch contiene gluten). Condiciones del paciente Para pacientes que necesitan caloras, protenas, vitaminas y minerales extras. Especialmente til para gente que no toman bastantes caloras y nutrientes.

50

55

Para gente que tiene la capacidad de mascar y tragar. No debe ser usada por nadie con alergia al cacahuete o cualquier otro tipo de alergia a las nueces.
60

Ingredientes Honey Graham Crunch - Jarabe de maz alto en fructosa, aislado de protena de soja, azcar moreno, miel, maltodextrina (maz), arroz crujiente (arroz molido, azcar [sacarosa], sal [cloruro sdico], y malta), salvado de avena, aceites de soja y de semillas de algodn parcialmente hidrogenados, glicerina, concentrado de protena del suero, polidextrosa, fructosa, caseinato clcico, polvo de coco, aromas articiales, aceite de colza, aceite alto en oleico de alazor, leche en polvo descremada, polvo de suero, lecitina de soja, y aceite de maz. Manufacturado en una instalacin que procesa nueces.
34

65

ES 2 258 816 T3
Vitaminas y minerales Fosfato clcico tribsico, fosfato potsico dibsico, xido de magnesio, sal (cloruro sdico), cloruro potsico, cido ascrbico, ortofosfato frrico, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, xido de zinc, pantotenato clcico, gluconato de cobre, sulfato de manganeso, riboavina, beta-caroteno, hidrocloruro de piridoxina, mononitrato de tiamina, cido flico, biotina, cloruro crmico, yoduro potsico, selenato de sodio, molibdato de sodio, loquinona, vitamina D3 , y cianocobalamina. Protena
10

Honey Graham Crunch - La fuente de protenas es una mezcla de aislado de protena de soja y protenas de la leche.
15

Aislado de protena de soja Protenas de la leche Grasas

74% 26%

20

Honey Graham Crunch - La fuente de grasas en una mezcla de aceites de soja y semillas de algodn parcialmente hidrogenados, de colza, alto en oleico de alazor, y de maz, y de lecitina de soja.
25

30

Aceites de soja y semillas de algodn parcialmente hidrogenados Aceite de colza Aceite alto en oleico de alazor Aceite de maz Lecitina de soja Carbohidratos

76% 8% 8% 4% 4%

35

Honey Graham Crunch - La fuente de carbohidratos es una combinacin de jarabe de maz alto en fructosa, azcar moreno, maltodextrina, miel, arroz crujiente, glicerina, polisacridos de soja, y salvado de avena. Jarabe de maz alto en fructosa Azcar moreno Maltodextrina Miel Arroz crujiente Glicerina Polisacridos de soja Salvado de avena C. Ensure High Protein Uso: ENSURE HIGH PROTEIN es un alimento lquido, concentrado, alto en protenas, diseado para gente que requieren caloras, protenas, vitaminas y minerales adicionales en sus dietas. Puede usarse como un suplemento nutricional oral con o entre comidas o, en las cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE HIGH PROTEIN carece de lactosa y gluten, y es apropiado para su uso por parte de gente recuperndose de ciruga general, o de fracturas de cadera, y por parte de pacientes con riesgo de padecer lceras por presin. Condiciones del paciente 24% 21% 12% 11% 9% 9% 7% 7%

40

45

50

55

60

Para pacientes que requieren caloras, protenas, vitaminas y minerales adicionales, tales como los pacientes que se recuperan de ciruga general, o de fracturas de cadera, pacientes con riesgo de padecer lceras por presin, y pacientes con dietas bajas en colesterol. Caractersticas

65

Bajo en grasas saturadas. Contiene 6 g de grasa total y < 5 mg de colesterol por servicio.
35

ES 2 258 816 T3
Sabor rico, cremoso. Excelente fuente de protenas, calcio y otras vitaminas y minerales esenciales.
5

Para dietas bajas en colesterol. Carece de lactosa, fcilmente digerible. Ingredientes

10

15

Vanilla Supreme: -(OU)-D. Agua, azcar (sacarosa), maltodextrina (maz), caseinatos de calcio y sodio, aceite alto en oleico de alazor, aislado de protena de soja, aceite de soja, aceite de colza, citrato potsico, fosfato clcico tribsico, citrato sdico, cloruro magnsico, fosfato magnsico dibsico, aroma articial, cloruro sdico, lecitina de soja, cloruro de colina, cido ascrbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, goma Gellan, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato de manganeso, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboavina, cido flico, molibdato sdico, cloruro de cromo, biotina, yoduro potsico, selenato sdico, loquinona, vitamina D3 , y cianocobalamina. Protenas

20

La fuente de protenas es una mezcla de dos protenas con elevado valor biolgico: la casena y la soja. Caseinatos sdico y clcico
25

85% 15%

Aislado de protena de soja

30

Grasas La fuente de grasas en una mezcla de tres aceites: alto en oleico de alazor, de colza, y de soja. Aceite alto en oleico de alazor Aceite de colza Aceite de soja 40% 30% 30%

35

40

El nivel de grasa en ENSURE HIGH PROTEIN cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE HIGH PROTEIN representan el 24% de las caloras totales, siendo el 2,6% de las grasas saturadas y procediendo el 7,9% de cidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las lneas maestras de la AHA, que 30% de las caloras totales procedan de la grasa, que <10% de las caloras procedan de cidos grasos saturados, y que 10% de las caloras totales procedan de cidos grasos poliinsaturados. Carbohidratos ENSURE HIGH PROTEIN contiene una combinacin de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores (Vanille Supreme, Chocolate Royal, Wild Cherry, y Banana), ms lotes de sabores VARIFLAVORS en pacana, cereza, fresa, limn y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente. Vainilla y otros sabores distintos del chocolate

45

50

55

Sacarosa Maltodextrina

60% 40%

60

Chocolate Sacarosa Maltodextrina 70% 30%

65

36

ES 2 258 816 T3
D. Ensure light Uso: ENSURE LIGHT es un alimento lquido bajo en grasas diseado para su uso como suplemento nutricional oral con o entre comidas. ENSURE LIGHT carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para su uso en dietas modicadas, incluyendo dietas bajas en colesterol. Condiciones del paciente
10

Para pacientes con peso normal o sobrepeso que necesitan una nutricin extra en un suplemento que contiene un 50% menos de grasa y un 20% menos de caloras que ENSURE. Para adultos sanos que no comen correctamente y necesitan nutricin extra. Caractersticas

15

Bajo en grasas saturadas. Contiene 3 g de grasa total por servicio y < 5 mg de colesterol.
20

Sabor rico, cremoso. Excelente fuente de calcio y otras vitaminas y minerales esenciales. Para dietas bajas en colesterol.

25

Carece de lactosa, fcilmente digerible. Ingredientes

30

35

Vanilla French: -(OU)-D. Agua, maltodextrina (maz), azcar (sacarosa), caseinato de calcio, aceite alto en oleico de alazor, aceite de colza, cloruro magnsico, citrato sdico, citrato potsico, fosfato potsico dibsico, fosfato magnsico dibsico, aromas naturales y articiales, fosfato clcico tribsico, gel de celulosa, cloruro de colina, lecitina de soja, carragenato, sal (cloruro sdico), cido ascrbico, goma de celulosa, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato clcico, sulfato cprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, palmitato de vitamina A, hidrocloruro de piridoxina, riboavina, cloruro de cromo, cido flico, molibdato sdico, yoduro potsico, selenato sdico, loquinona, vitamina D3 , y cianocobalamina. Protenas

40

La fuente de protenas es el caseinato clcico. Caseinato clcico 100%

45

Grasas La fuente de grasas en una mezcla de dos aceites: alto en oleico de alazor y de colza.

50

Aceite alto en oleico de alazor Aceite de colza

70% 30%

55

El nivel de grasa en ENSURE LIGHT cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 3 gramos de grasa en ENSURE LIGHT representan el 13,5% de las caloras totales, procediendo el 1,4% de las grasas de cidos grasos saturados y el 2,6% de cidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las lneas maestras de la AHA: 30% de las caloras totales proceden de la grasa, <10% de las caloras proceden de cidos grasos saturados, y 10% de las caloras totales proceden de cidos grasos poliinsaturados. Carbohidratos ENSURE LIGHT contiene una combinacin de maltodextrina y sacarosa. El sabor a chocolate contiene tambin jarabe de maz. La dulzura moderada y la variedad de sabores (French Vanilla, Chocolate Supreme, Strawberry Swirl), junto con lotes de sabores VARI-FLAVORS en pacana, cereza, fresa, limn y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.

60

65

37

ES 2 258 816 T3
Vainilla y otros sabores distintos del chocolate Sacarosa Maltodextrina 51% 49%

Chocolate
10

Sacarosa Jarabe de maz Maltodextrina

15

47,0% 26,5% 26,5%

Vitaminas y minerales Un servicio de 8 onzas uidas de ENSURE LIGHT proporciona al menos el 25% de las Dosis Diarias Recomendadas para 24 vitaminas y minerales claves. Cafena El sabor a chocolate contiene 2,1 mg de cafena/8 onzas uidas.
25

20

E. Ensure plus Uso: ENSURE PLUS es un alimento lquido alto en caloras y bajo en residuos, para uso cuando se necesitan caloras y nutrientes extras pero una concentracin normal de protenas. Est diseado principalmente como un suplemento nutricional oral a usar con o entre comidas, o, en cantidades apropiadas, como sustituto de las comidas. ENSURE PLUS carece de lactosa y de gluten. Aunque es principalmente un suplemento nutricional oral, puede suministrarse mediante tubo. Condiciones del paciente

30

35

Para pacientes que requieren caloras y nutrientes extras, pero una concentracin normal de protena, en un volumen limitado. Para pacientes que necesitan ganar o mantener un peso saludable.

40

Caractersticas Sabor rico, cremoso.

45

Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales. Ingredientes Vainilla: (OU)-D. Agua, jarabe de maz, maltodextrina (maz), aceite de maz, caseinatos clcico y sdico, azcar (sacarosa), aislado de protena de soja, cloruro magnsico, citrato potsico, fosfato clcico tribsico, lecitina de soja, aromas naturales y articiales, citrato sdico, cloruro potsico, cloruro de colina, cido ascrbico, carragenato, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato de manganeso, sulfato cprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboavina, palmitato de vitamina A, cido flico, biotina, cloruro de cromo, cido flico, molibdato sdico, yoduro potsico, selenato sdico, loquinona, cianocobalamina y vitamina D3 . Protenas La fuente de protenas es una mezcla de dos protenas de elevado valor biolgico: la casena y la soja.

50

55

60

Caseinatos sdico y clcico Aislado de protena de soja

65

84% 16%

38

ES 2 258 816 T3
Grasas La fuente de grasas es el aceite de maz.
5

Aceite de maz Carbohidratos

100%

10

ENSURE PLUS contiene una combinacin de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, fresa, caf, manteca de pacana, y yema), ms lotes de sabores VARI-FLAVORS en pacana, cereza, fresa, limn y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente. Sabores a vainilla, fresa, manteca de pacana, y caf Jarabe de maz Maltodextrina Sacarosa Sabores a chocolate y yema 39% 38% 23%

15

20

25

Jarabe de maz Maltodextrina Sacarosa Vitaminas y minerales

36% 34% 30%

30

Un servicio de 8 onzas uidas de ENSURE PLUS proporciona al menos el 15% de las Dosis Diarias Recomendadas para 25 vitaminas y minerales claves.
35

Cafena El sabor a chocolate contiene 3,1 mg de cafena/8 onzas uidas. El sabor a caf contiene una cantidad traza de cafena.
40

F. Ensure plus HN Uso: ENSURE PLUS HN es un alimento lquido nutricionalmente completo, alto en caloras y alto en nitrgeno, diseado para gente con necesidades ms elevadas de caloras y protenas o con tolerancia de volumen limitada. Puede usarse para suplemento oral o para apoyo nutricional total mediante tubo. ENSURE PLUS NH carece de lactosa y de gluten. Condiciones del paciente

45

50

Para pacientes con necesidades incrementadas de caloras y protenas, tales como despus de ciruga o una lesin. Para pacientes con una tolerancia de volumen limitada y saciedad temprana. Caractersticas

55

Para nutricional suplementaria o total. Para alimentacin oral o mediante tubo.

60

1,5 caloras/ml. Alto en nitrgeno. Calricamente denso.

65

39

ES 2 258 816 T3
Ingredientes Vainilla: (OU)-D. Agua, maltodextrina (maz), caseinatos clcico y sdico, aceite de maz, azcar (sacarosa), aislado de protena de soja, cloruro magnsico, citrato potsico, fosfato clcico tribsico, lecitina de soja, aromas naturales y articiales, citrato sdico, cloruro de colina, cido ascrbico, taurina, L-carnitina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato de manganeso, sulfato cprico, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboavina, palmitato de vitamina A, cido flico, biotina, cloruro de cromo, cido flico, molibdato sdico, yoduro potsico, selenito sdico, loquinona, cianocobalamina y vitamina D3 . G. Ensure powder Uso: ENSURE POWDER (reconstituido con agua) es un alimento lquido bajo en residuos diseado principalmente como un suplemento nutricional oral a usar con o entre comidas. ENSURE POWDER carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para uso en dietas modicadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol.
15

10

Condiciones del paciente Para pacientes con dietas modicadas.

20

Para pacientes ancianos con riesgo nutricional. Para pacientes que estn recuperndose de enfermedad/intervenciones quirrgicas. Para pacientes que necesitan una dieta baja en residuos.

25

Caractersticas Apropiado, fcil de mezclar.

30

Bajo en grasas saturadas. Contiene 9 g de grasa total y <5 mg de colesterol por servicio. Alto en vitaminas y minerales.

35

Para dietas bajas en colesterol. Carece de lactosa, fcilmente digerible.

40

45

Ingredientes: (OU)-D. Jarabe de maz, maltodextrina (maz), azcar (sacarosa), aceite de maz, caseinatos clcico y sdico, aislado de protena de soja, aroma articial, citrato potsico, cloruro magnsico, citrato sdico, fosfato clcico tribsico, cloruro potsico, lecitina de soja, cido ascrbico, cloruro de colina, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfatocoferil acetato, niacinamida, pantotenato clcico, sulfato de manganeso, cloruro hidrocloruro de tiamina, sulfato cprico, hidrocloruro de piridoxina, riboavina, palmitato de vitamina A, cido flico, biotina, molibdato sdico, cloruro de cromo, yoduro potsico, selenato sdico, loquinona, vitamina D3 y cianocobalamina. Protenas La fuente de protenas es una mezcla de dos protenas de elevado valor biolgico: la casena y la soja.

50

Caseinatos sdico y clcico Aislado de protena de soja

55

84% 16%

Grasas La fuente de grasas es el aceite de maz.

60

Aceite de maz Carbohidratos

100%

65

ENSURE POWDER contiene una combinacin de jarabe de maz, maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada de ENSURE POWDER, ms los lotes de sabores VARI-FLAVORS en pacana, cereza, fresa, limn y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente.
40

ES 2 258 816 T3
Vainilla Jarabe de maz Maltodextrina Sacarosa H. Ensure pudding
10

35% 35% 30%

Condiciones del paciente Para pacientes con dietas de consistencia modicada (por ejemplo, blandas, en forma de purs, o completamente lquidas).
15

Para pacientes con dicultades para tragar. Caractersticas

20

Rico y cremoso, buen sabor. Buena fuente de vitaminas y minerales esenciales. De forma conveniente no necesita refrigeracin. Carece de gluten.

25

Perl nutritivo cada 5 onzas: 250 Caloras, 10,9% de protenas, 34,9% de grasas totales, 54,2% de carbohidratos. Ingredientes
30

35

Vainilla: (OU)-D. Leche descremada, agua, azcar (sacarosa), aceite de soja parcialmente hidrogenado, almidn para alimentos modicado, sulfato magnsico, esteraoil lactilato sdico, fosfato sdico dibsico, aroma articial, cido ascrbico, sulfato de zinc, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, cloruro de colina, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato clcico, FD&C Amarillo #5, citrato potsico, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboavina, FD&C Amarillo #6, cido flico, biotina, loquinona, vitamina D3 y cianocobalamina. Protenas La fuente de protenas es la leche descremada.

40

Leche descremada Grasas La fuente de grasas es el aceite de soja hidrogenado. Aceite de soja hidrogenado Carbohidratos
55

100%

45

50

100%

ENSURE PUDDING contiene una combinacin de sacarosa y almidn alimentario modicado. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, dulce de azcar terciado con mantequilla, y tapioca) ayudan a prevenir la fatiga del sabor. El producto contiene 9,2 gramos de lactosa por servicio. Vainilla y otros sabores distintos del chocolate

60

Sacarosa Lactosa Almidn alimentario modicado

65

56% 27% 17%

41

ES 2 258 816 T3
Chocolate Sacarosa Lactosa Almidn alimentario modicado I. Ensure con bra
10

58% 26% 16%

15

Uso: ENSURE CON FIBRA es una alimento lquido que contiene bra, nutricionalmente completo, diseado para gente que puede beneciarse de bra y nutrientes incrementados en la dieta. ENSURE CON FIBRA es apropiado para personas que no requieren una dieta pobre en residuos. Puede alimentarse oralmente o mediante tubo, y puede usarse como un suplemento nutricional para una dieta regular, o, en cantidades apropiadas, como un sustituto de la comida. ENSURE CON FIBRA carece de lactosa y de gluten, y es apropiado para su uso en dietas modicadas, incluyendo las dietas bajas en colesterol. Condiciones del paciente

20

Para pacientes que pueden beneciarse de bras y nutrientes incrementados en la dieta. Caractersticas Nueva frmula avanzada baja en grasas saturadas, ms alta en vitaminas y minerales.

25

Contiene 6 g de grasa total y < 5 mg de colesterol por servicio. Sabor rico, cremoso.

30

Buena fuente de bra. Fuente excelente de vitaminas y minerales esenciales. Para dietas bajas en colesterol.

35

Carece de lactosa y gluten. Ingredientes

40

45

Vainilla: (OU)-D. Agua, maltodextrina (maz), azcar (sacarosa), caseinatos clcico y sdico, bra de avena, aceite alto en oleico de alazor, aceite de colza, aislado de protena de soja, aceite de maz, bra de soja, fosfato clcico tribsico, cloruro magnsico, citrato potsico, gel de celulosa, lecitina de soja, fosfato potsico dibsico, citrato sdico, aromas naturales y articiales, cloruro de colina, fosfato magnsico, cido ascrbico, goma de celulosa, cloruro potsico, carragenato, sulfato ferroso, alfa-tocoferil acetato, sulfato de zinc, niacinamida, sulfato de manganeso, pantotenato clcico, sulfato cprico, palmitato de vitamina A, cloruro hidrocloruro de tiamina, hidrocloruro de piridoxina, riboavina, cido flico, biotina, cloruro de cromo, biotina, molibdato sdico, yoduro potsico, selenato sdico, loquinona, vitamina D3 y cianocobalamina. Protena

50

La fuente de protenas es una mezcla de dos protenas de elevado valor biolgico: la casena y la soja. Caseinatos sdico y clcico Aislado de protena de soja Grasas
60

55

80% 20%

La fuente de grasas es una mezcla de tres aceites: alto en oleico de alazor, de colza, y de maz. Aceite alto en oleico de alazor Aceite de colza Aceite de maz 40% 40% 20%

65

42

ES 2 258 816 T3
El nivel de grasa en ENSURE CON FIBRA cumple las directrices de la American Heart Association (AHA). Los 6 gramos de grasa en ENSURE CON FIBRA representan el 22% de las caloras totales, procediendo el 2,01% de las grasas de cidos grasos saturados y el 6,7% de cidos grasos poliinsaturados. Estos valores se hallan dentro de las lneas maestras de la AHA, de que 30% de las caloras totales procedan de la grasa, <10% de las caloras procedan de cidos grasos saturados, y 10% de las caloras totales procedan de cidos grasos poliinsaturados. Carbohidratos
10

ENSURE CON FIBRA contiene una combinacin de maltodextrina y sacarosa. La dulzura moderada y la variedad de sabores (vainilla, chocolate, y manteca de pacana), ms los lotes de sabores VARI-FLAVORS en pacana, cereza, fresa, limn y naranja, ayudan a prevenir el cansancio del sabor y ayudan al cumplimiento del paciente. Vainilla y otros sabores distintos del chocolate

15

Maltodextrina Sacarosa Fibra de avena Fibra de soja

66% 25% 7% 2%

20

Chocolate
Maltodextrina Sacarosa Fibra de avena Fibra de soja 55% 36% 7% 2%

25

30

Fibra La mezcla de bras usada en ENSURE CON FIBRA consiste en bra de avena y polisacridos de soja. Esta mezcla resulta en aproximadamente 4 gramos de bra diettica total por lata de 8 onzas uidas. La proporcin de bra insoluble respecto la soluble es 95:5. Los varios suplementos nutricionales descritos ms arriba y conocidos por otros con formacin en la tcnica pueden sustituirse y/o suplementarse con los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de esta invencin.

35

40

J. Producto nutricional OxepaTM Oxepa es un producto nutricional enteral, calricamente denso, bajo en carbohidratos, diseado para la gestin diettica de pacientes con, o con riesgo de padecer ARDS. Tiene una combinacin nica de ingredientes, incluyendo una mezcla de aceites patentada que contiene cido eicosapentaenoico (EPA procedente del aceite de pescado), cido -linolnico (GLA procedente del aceite de borraja), y niveles elevados de antioxidantes. Distribucin calrica La densidad calrica es elevada, de 1,5 caloras/ml (355 caloras/8 onzas uidas), para minimizar el volumen requerido para cubrir las necesidades energticas. La distribucin de caloras en Oxepa se muestra en la Tabla 7. TABLA 7

45

50

55

Distribucin calrica de Oxepa por 8 onzas uidas

60

por litro 1500 93,7 105,5 62,5 785 43

% de caloras --55,2 28,1 16,7 ---

Caloras Grasas (g) Carbohidratos (g)

355 22,2 25 14,8 186

65

Protenas (g) Agua (g)

ES 2 258 816 T3
Grasas Oxepa contiene 22,2 g de grasa por servicio de 8 onzas uidas (93,7 g/l).
5

La fuente de grasas es una mezcla de aceites, con el 38,1% de aceites de colza, el 25% de triglicridos de cadena media (MCT), el 20% de aceite de borraja, el 20% de aceite de pescado, y el 3,2% de lecitina de soja. El perl tpico de cidos grasos de Oxepa se muestra en la Tabla 8. Oxepa proporciona una cantidad equilibrada de cidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados, y saturados, tal como se muestra en la Tabla 10. Los triglicridos de cadena media (MCT) --- 25% de la mezcla de grasas --- ayudan al vaciado gstrico porque son absorbidos por el tracto intestinal sin emulsin por parte de los cidos biliares.

10

15

Los varios cidos grasos componentes del producto nutricional OxepaTM pueden sustituirse y/o suplementarse con los PUFA que pueden obtenerse de acuerdo con los procedimientos de esta invencin. TABLA 8

20

Perl tpico de cidos grasos % del total de cidos grasos

25

g/8 onzas uidas* 0,04 3,1 2,33 1,18 0,38 0,39 5,16 3,44 0,73 1,02 1,08 0,12 0,48 1,52

g/l* 0,18 13,07 9,87 4,98 1,62 1,64 21,75 14,49 3,09 4,29 4,55 0,49 2,02 6,72

Caproico (6:0) Caprlico (8:0)

0,2 14,69 11,06 5,59 1,82 1,84 24,44 16,28 3,47 4,82 5,11 0,55 2,27 7,55

30

Cprico (10:0) Palmtico (16:0) Palmitoleico (16:1n-7)

35

Esterico (18:0) Oleico (18:1n-9)

40

Linoleico (18:2n-6) -linolnico (18:3n-3) -linolnico (18:3n-6)

45

Eicosapentaenoico (20:5n-3) n-3 Docosapentaenoico (22:5-n3)

50

Docosahexaenoico (22:6n-3) Otros

*Los cidos grasos igualan aproximadamente el 95% de las grasas totales.

55

TABLA 9 Perl de grasas de Oxepa % de las caloras proveniente de las grasas cidos grasos poliinsaturados
65

60

55,2 31,44 g/l 25,53 g/l

cidos grasos monoinsaturados

44

ES 2 258 816 T3
TABLA 9 (continuacin) Perl de grasas de Oxepa
5

cidos grasos saturados Proporcin n-6 respecto n-3

32,38 g/l 1,75:1 9,49 mg/8 onzas uidas 40,1 mg/l

10

Colesterol Carbohidratos

15

El contenido en carbohidratos es de 25,0 g por cada servicio de 8 onzas uidas (105,5 g/l). Las fuentes de carbohidratos son: 45% de maltodextrina (un carbohidrato completo) y 55% de sacarosa (un azcar sencillo), ambos de los cuales se digieren y absorben fcilmente.

20

El elevado contenido en grasas y bajo en carbohidratos de Oxepa est diseado para minimizar la produccin de dixido de carbono (CO2 ). Los niveles elevados de CO2 pueden complicar la ablactacin en pacientes dependientes del ventilador. Los niveles bajos de carbohidratos pueden ser tiles tambin para aquellos pacientes que han desarrollado hiperglicemia inducida por estrs. Oxepa carece de lactosa. Los carbohidrato dietticos, los aminocidos procedentes de protenas, y el grupo glicerol de las grasas pueden convertirse en glucosa en el cuerpo. A travs de este proceso, se satisfacen los requisitos de carbohidratos de los tejidos dependientes de glucosa (tales como el sistema nervioso central y los hemates). Sin embargo, una dieta carente de carbohidratos puede conducir a cetosis, catabolismo excesivo de las protenas de los tejidos, y prdida de uido y electrlitos. Estos efectos pueden prevenirse mediante la ingestin diaria de 50 a 100 g de carbohidratos digeribles, si la ingesta de caloras es la adecuada. En nivel de carbohidratos en Oxepa es tambin suciente para minimizar la gluconeognesis, si se satisfacen las necesidades energticas. Protenas Oxepa contiene 14,8 g de protena por cada servicio de 8 onzas uidas (62,5 g/l). La proporcin de caloras totales/nitrgeno (150:1) satisface las necesidades de los pacientes estresados.

25

30

35

40

Oxepa proporciona protena suciente para promover el anabolismo y el mantenimiento de una masa de cuerpo magro sin precipitar los problemas respiratorios. Las ingestas elevadas de protenas son una preocupacin en pacientes con insuciencia respiratoria. Aunque la protena tiene poco efecto en la produccin de CO2 , una dieta elevada en protenas incrementara el estmulo ventilatorio.
45

Las fuentes de protenas en Oxepa son: 86,8% de caseinato sdico y 13,2% de caseinato clcico. Tal como se demuestra en la Tabla 11, el perl de aminocidos del sistema de protenas en Oxepa satisface o supera el estndar para un conjunto de protenas de alta calidad establecido por la National Academy of Sciences.
50

Oxepa carece de gluten. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta solicitud son indicativas del nivel de capacitacin de aquellos especialistas en la tcnica a los que corresponde esta invencin.
55

Ahora que se ha descrito completamente la invencin, ser evidente para alguien con la formacin ordinaria en la tcnica que pueden hacrsele muchos cambios y modicaciones sin apartarse del mbito de las reivindicaciones anexas.
60

65

45

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REIVINDICACIONES 1. Polipptido puricado o aislado que es capaz de desaturar una molcula de cido graso en el carbono 6 12 a partir del extremo carboxilo de dicho cido graso, teniendo dicho polipptido una secuencia de aminocidos que tiene al menos un 60% de homologa con la secuencia de 457 aminocidos de la SEC. N ID. 2 o la secuencia de 399 aminocidos de la SEC. N ID. 4. 2. Polipptido segn la reivindicacin 1, que tiene una secuencia de aminocidos que tiene al menos un 80% de homologa con la secuencia de 457 aminocidos de la SEC. N ID. 2. 3. Polipptido segn la reivindicacin 1, que tiene una secuencia de aminocidos que tiene al menos un 80% de homologa con la secuencia de 399 aminocidos de la SEC. N ID. 4.
15

10

4. Polipptido segn la reivindicacin 1, que tiene una secuencia de aminocidos que tiene al menos un 90% de homologa con la secuencia de 457 aminocidos de la SEC. N ID. 2. 5. Polipptido segn la reivindicacin 1, que tiene una secuencia de aminocidos que tiene al menos un 90% de homologa con la secuencia de 399 aminocidos de la SEC. N ID. 4.

20

6. Polipptido segn la reivindicacin 1, 2 4, en donde dicho polipptido comprende un motivo de aminocidos seleccionado de entre el grupo consistente en los residuos 50-53, 39-43, 172-176, 204-213, y 390-402 de la SEC. N ID. 2. 7. Polipptido segn la reivindicacin 6, en donde dicho polipptido comprende los residuos 50-53, 39-43, 172176, 204-213, y 390-402 de la SEC. N ID. 2. 8. Polipptido segn una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 6 7 que comprende la SEC. N ID. 2.

25

30

9. cido nucleico aislado que codica un polipptido tal como se dene segn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 10. cido nucleico aislado segn la reivindicacin 9 que comprende la SEC. N ID. 1 o la SEC. N ID. 3.

35

11. Construccin de cido nucleico que comprende un cido nucleico tal como se dene en la reivindicacin 9 10 unido operativamente a un promotor. 12. Clula husped transformada con la construccin de la reivindicacin 11.

40

13. Clula husped segn la reivindicacin 12, la cual es una clula husped microbiana. 14. Clula husped segn la reivindicacin 13 que es una clula de levadura. 15. Procedimiento para la produccin del cido graso gamma-linolnico, cuyo procedimiento comprende:

45

hacer crecer un cultivo de clulas huspedes de las reivindicaciones 12, 13 14, cuyas clulas producen una delta-6 desaturasa en presencia de cido linoleico, en condiciones en las que dicho cido graso se convierte en cido gamma linolnico mediante la expresin del polipptido de dicha desaturasa; y
50

recuperar el cido graso cido gamma-linolnico del cultivo. 16. Procedimiento para la produccin del cido graso cido linoleico, cuyo procedimiento comprende:

55

hacer crecer un cultivo de clulas huspedes de las reivindicaciones 12, 13 14, cuyas clulas producen una delta-12 desaturasa, en presencia de cido oleico, en condiciones en las que dicho cido se convierte en cido linoleico mediante la expresin del polipptido de dicha desaturasa; y recuperar el cido graso cido linoleico del cultivo.

60

17. Procedimiento segn cualquiera de las reivindicaciones 15 16, el cual adems comprende la formulacin del cido graso en un producto seleccionado del grupo: una composicin farmacutica que comprende dicho aceite y un portador farmacuticamente aceptable;

65

una frmula nutricional; una frmula para bebs;

46

ES 2 258 816 T3
un suplemento diettico; un sustituto diettico;
5

un cosmtico; y un alimento para animales.

10

18. Procedimiento segn la reivindicacin 17, en donde dicha frmula para bebs, suplemento diettico, o sustituto diettico est en forma de un lquido o un slido. 19. Procedimiento segn la reivindicacin 17 18, en donde la frmula nutricional, la frmula para bebs, el suplemento diettico, o el sustituto diettico contienen al menos un macronutriente seleccionado del grupo consistente en: aceite de coco, aceite de soja, aceite de colza, mono- y diglicridos, glucosa, lactosa comestible, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche, protena de soja, y otros hidrolizados de protenas. 20. Procedimiento segn la reivindicacin 19, en donde dicha frmula nutricional, frmula para bebs, suplemento diettico, o sustituto diettico contiene al menos una vitamina seleccionada del grupo consistente en: vitaminas A, C, D, E y complejo B; y al menos un mineral seleccionado del grupo consistente en: calcio, magnesio, zinc, manganeso, sodio, potasio, fsforo, cobre, cloro, yodo, selenio y hierro. 21. Utilizacin de una clula husped microbiana de la reivindicacin 13, 14 15 para la produccin de un cido graso.

15

20

25

22. Utilizacin segn la reivindicacin 21 para la produccin de un producto que comprende dicho cido graso, seleccionndose dicho producto del grupo: una composicin farmacutica que comprende dicho aceite y un portador farmacuticamente aceptable;

30

una frmula nutricional; una frmula para bebs; un suplemento diettico;

35

un sustituto diettico; un cosmtico; y

40

un alimento para animales.

45

50

55

60

65

47

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LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIN GENERAL:
5

10

(i) SOLICITANTE: KNUTZON, DEBORAH MURKERJI, PRADIP HUANG, YUNG-SHENG THURMOND, JENNIFER CHAUDHARY, SUNITA LEONARD, AMANDA (ii) TTULO DE LA INVENCIN: PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA LA SNTESIS DE CIDOS GRASOS POLIINSATURADOS DE CADENA LARGA.

15

(iii) NMERO DE SECUENCIAS: 40 (iv) DIRECCIN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: LIMBACH AND LIMBACH LLP (B) DIRECCIN: 2001 FERRY BUILDING (C) CIUDAD: SAN FRANCISCO (D) ESTADO: CALIFORNIA (E) PAS: ESTADOS UNIDOS DE AMRICA

20

25

(F) (ZIP): 94111 (v) FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disquete

30

(B) ORDENADOR: Compatible con PC de IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Word de Microsoft

35

(vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE REGISTRO: (C) CLASIFICACIN: (viii) ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIN: (A) NOMBRE: WARD, MICHAEL R. (B) NMERO DE REGISTRO: 38.651 (C) NMERO DE REFERENCIA: CGAB-210 (ix) INFORMACIN PARA TELECOMUNICACIN: (A) TELFONO: (415) 433-4150

40

45

50

(B) TELEFAX: (415) 433-8716 (C) TELEX: N/D (2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 1:

55

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1617 pares de bases

60

(B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico

65

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 1:

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 2: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

60

(A) LONGITUD: 457 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante

65

(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: pptido

2

ES 2 258 816 T3
(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 2:

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 3: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1488 pares de bases

35

(B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: ADN (genmico) (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 3:

40

45

50

55

60

65

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 4:

50

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 399 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: pptido

55

60

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 4:

65

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 5:

40

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 355 aminocidos (B) TIPO: aminocido

45

(C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: pptido

50

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 5:

55

60

65

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 6: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

30

(A) LONGITUD: 104 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante

35

(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 6:

40

45

50

55

60

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 7:

65

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 252 aminocidos

9

ES 2 258 816 T3
(B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal
5

(ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 7:

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 8: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

10

ES 2 258 816 T3
(A) LONGITUD: 125 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante
5

(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 8:

10

15

20

25

30

35

40

45

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 9: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 131 aminocidos

50

(B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 9:

55

60

65

11

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 10:

35

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 87 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante

40

(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 10:

45

50

55

60

65

12

ES 2 258 816 T3
(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 11: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:
5

(A) LONGITUD: 143 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 11:
15

20

25

30

35

40

45

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 12: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

50

(A) LONGITUD: 35 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 12:

55

60

CCAAGCTTCT GCAGGAGCTC TTTTTTTTTT TTTTT (2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 13:

35

65

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases

13

ES 2 258 816 T3
(B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGA: lineal
5

(ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 13:

10

CUACUACUAC UAGGAGTCCT CTACGGTGTT TTG (2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 14

33

15

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla

20

(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 14

25

CAUCAUCAUC AUATGATGCT CAAGCTGAAA CTG (2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 15

30

33

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico
35

(C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico

40

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 15 TACCAACTCG AGAAAATGGC TGCTGCTCCC AGTGTGAGG 39

45

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 16 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares de bases

50

(B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGA: lineal

55

(ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 16

60

AACTGATCTA GATTACTGCG CCTTACCCAT CTTGGAGGC (2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 17: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

39

65

(A) LONGITUD: 39 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico

14

ES 2 258 816 T3
(C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGA: lineal
5

(ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 17: TACCAACTCG AGAAAATGGC ACCTCCCAAC ACTATCGAT 39

10

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 18: (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

15

(A) LONGITUD: 39 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGA: lineal

20

(ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 18:

25

AACTGATCTA GATTACTTCT TGAAAAAGAC CACGTCTCC (2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 19

39

30

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 746 cidos nucleicos (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: no relevante

35

(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 19

40

45

50

55

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 20 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

60

(A) LONGITUD: 227 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal

65

(ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 20

15

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 21 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 494 cidos nucleicos (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: no relevante (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 21

45

50

55

60

65

16

ES 2 258 816 T3
(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 22 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:
5

(A) LONGITUD: 87 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 22

15

20

25

30

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 23

35

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 520 cidos nucleicos (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: no relevante

40

(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: cido nucleico

45

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 23

50

55

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 24

60

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 153 aminocidos (B) TIPO: aminocido

65

(C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal

17

ES 2 258 816 T3
(ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 24
5

10

15

20

25

30

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 25 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

35

(A) LONGITUD: 420 cidos nucleicos (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: no relevante

40

(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: cido nucleico (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 25

45

50

55

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 26 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 125 aminocidos

60

(B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: no es relevante (D) TOPOLOGA: lineal

65

(ii) TIPO DE MOLCULA: pptido (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 26

18

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 27 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1219 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (Contig Editado 2692004) (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 27

30

35

40

45

50

55

60

65

19

ES 2 258 816 T3

10

15

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 28

20

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 655 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (Contig Editado 2153526)

25

30

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 28

35

40

45

50

55

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 29 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

60

(A) LONGITUD: 304 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal

65

(ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (Contig Editado 3506132) (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 29
20

ES 2 258 816 T3

10

15

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 30

20

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 918 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico

25

(C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (Contig Editado 3854933)

30

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 30

35

40

45

50

55

60

65

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 31

21

ES 2 258 816 T3
(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1686 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico
5

(C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (Contig Editado 2511785)

10

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 31

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

22

ES 2 258 816 T3
(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 32 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:
5

(A) LONGITUD: 1843 pares de bases (B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (Contig 2535) (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 32
15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

23

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 33 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2257 pares de bases

40

(B) TIPO: cido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal

45

(ii) TIPO DE MOLCULA: otro cido nucleico (Contig Editado 253538a) (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 33

50

55

60

65

24

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

25

ES 2 258 816 T3

10

15

20

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 34 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

25

(A) LONGITUD: 411 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal

30

(ii) TIPO DE MOLCULA: aminocidos (traduccin de Contig 2692004) (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 34
35

40

45

50

55

60

65

26

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 35

40

(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 218 aminocidos

45

(B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: aminocidos (traduccin de Contig 2153526)

50

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 35

55

60

65

27

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 36 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

45

(A) LONGITUD: 86 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal

50

(ii) TIPO DE MOLCULA: aminocidos (traduccin de Contig 3506132) (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 36
55

60

65

28

ES 2 258 816 T3
(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 37 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:
5

(A) LONGITUD: 306 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLCULA: aminocidos (traduccin de Contig 3854933) (xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 37
15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 38

29

ES 2 258 816 T3
(i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 565 aminocidos (B) TIPO: aminocido
5

(C) TIPO DE HEBRA: simple (D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: aminocidos (traduccin de Contig 2511785)

10

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 38

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

30

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 39 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 619 aminocidos

65

(B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: simple

31

ES 2 258 816 T3
(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: aminocidos (traduccin de Contig 2535)
5

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 39

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

32

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

(2) INFORMACIN PARA LA SEQ. N ID: 40 (i) CARACTERSTICAS DE LA SECUENCIA:

65

(A) LONGITUD: 757 aminocidos (B) TIPO: aminocido (C) TIPO DE HEBRA: simple
33

ES 2 258 816 T3
(D) TOPOLOGA: lineal (ii) TIPO DE MOLCULA: aminocidos (traduccin de Contig 253538a)
5

(xi) DESCRIPCIN DE LA SECUENCIA: SEQ. N ID: 40

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

34

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

35

ES 2 258 816 T3

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

36