AVANCES EN BIOTECNOLOGAS REPRODUCTIVAS EN YEGUAS Luis Losinno, MV, PhD Laboratorio de Reproduccin Equina, Ctedra de Produccin Equina, Departamento

de Produccin Animal, Facultad de Agronoma y Veterinaria, Universidad Nacional de Ro Cuarto, (5800) Ro Cuarto, Argentina; llosinno@gmail.com Las herramientas y/o procesos tecnolgicos que el hombre aplica de manera directa o indirecta a la reproduccin, en este caso animal, se conocen como Biotecnologas Reproductivas. Los reportes anecdticos de estas herramientas de manejo reproductivo en equinos son muy antiguos (s.XVI) pero el verdadero auge ocurre durante el siglo pasado con la expansin de la inseminacin artificial (IA) como la de mayor impacto sobre los sistemas productivos. Desde la segunda mitad del siglo XX la aplicacin masiva ha de estas tecnologas ha crecido exponencialmente en la industria equina mundial en especial la IA y la transferencia embrionaria (TE) (Squires, 2006). El objetivo de esta presentacin es realizar una breve descripcin conceptual de las ltimas biotecnologas reproductivas desarrolladas y sus aplicaciones potenciales en la clnica reproductiva y la produccin equina, considerando la inseminacin artificial; criopreservacin embrionaria; superovulacion; inyeccin intracitoplasmatica de espermatozoide (ICSI); transferencia intraoviductal de gametas (GIFT) y clonacin y excluyendo la transferencia embrionaria que ser tratada en un tpico aparte. Inseminacin Artificial (IA) Desde mediados de los aos 80 hasta el presente, el crecimiento de esta biotecnologa en los sistemas de produccin de caballos en el mundo en general y Argentina en particular ha sido exponencial dado que en este periodo la mayora de las asociaciones de criadores de caballos de razas puras ha aceptado y reglamentado la IA en sus diferentes variantes y otras biotecnologas, en especial la Transferencia Embrionaria dentro de sus estatutos. En la actualidad en el mundo hay muy pocas asociaciones que no acepten el uso de biotecnologas reproductivas, entre ellas una de las razas de mayor impacto econmico mundial en la cra de caballos como la Sangre Pura de Carrera. Una de las barreras para la inclusin de biotecnologas, aun las ms elementales y antiguas, dentro de los programas de reproduccin ha sido la desinformacin y el consecuente dogmatismo tanto de los profesionales involucrados como de las dirigencias de las razas. En los ltimos 10 aos debido entre otros factores al recambio generacional de profesionales y al mayor acceso a informacin tcnica y de divulgacin, al menos desde mi perspectiva de docente/investigador y formador de recursos humanos, esto ha cambiado radicalmente. Es verdad que la inclusin de estas herramientas debe estar inserta en un marco productivo que las haga econmicamente aplicables, algo que al menos en los ltimos aos y en especial en algunas razas deportivas como la de polo es particularmente importante. Dado que el objetivo de esta presentacin es la de focalizar solo en los avances, y no realizar una sustitucin de las recomendadas lecturas tcnicas, algunas de las cuales se mencionan en la bibliografa, son tres los que creo que son remarcables con respecto a la IA: 1) IA con semen refrigerado. La criopreservacion del semen diluido a 5C por periodos de hasta 24-48 hs en contenedores de diseo simple, econmicos, transportables, aun descartables, resistentes a malos tratos y a temperaturas externas elevadas junto a la difusin del uso de diferentes tipos de diluyentes de alta eficiencia, ha contribuido al crecimiento de este sistema que esencialmente disminuye los costos operativos al evitar 1

transportar animales valiosos, sin disminucin en los ndices de preez por ciclo si los procedimientos se realizan correctamente y los animales no tienen problemas de fertilidad aditivos. La implementacin en Argentina y otros pases de Amrica Latina ha encontrado una dificultad logstica referida a los sistemas de transporte pblicos y en algunos casos a la falta de entrenamiento idneo por parte de los veterinarios involucrados. Los problemas mas frecuentes en la utilizacin e implementacin de esta tecnologa estn relacionados con: Sementales cuyos espermatozoides tienen una baja tolerancia a las bajas temperaturas (y frecuentemente buenos ndices de preez por ciclo con semen fresco) y NO son testeados crticamente previo al programa de envos. Contaminacin de las muestras de semen por malas condiciones de higiene y falta de entrenamiento formal de los Veterinarios que realizan las maniobras. Envo de dosis marginales o sub-optimas en trminos de cantidad total de espermatozoides con motilidad progresiva. Fallas en la logstica de los envos (que demoren mas tiempo de lo esperado o tolerable, alterando las condiciones del semen) Envos a destiempo en relacin a la ovulacin de la yegua a inseminar. Contenedores inadecuados no testeados crticamente Diluyente seminal preparado en condiciones sub-ptimas, no controladas (pH, osmolaridad, antibiticos) y no testeado con el semen a enviar en particular. De cualquier manera es uno de los sistemas mas utilizados como complemento de la TE en Colombia y Brasil con resultados comparativos considerados desde aceptables a muy buenos. 2) IA con semen congelado. Los avances en la investigacin de nuevos criopreservadores como las amidas, diluyentes sin componentes de origen animal como la yema de huevo, leche, albmina, etc, diferentes curvas de descenso trmico, la evidencia que no hay un patrn standard de respuesta de los espermatozoides a la injuria trmica, inclusive variando dentro de cada padrillo en diferentes eyaculados, poca del ao, etc. y la presin del mercado y los criadores respecto a implementar protocolos eficientes y comercialmente aceptables, ha llevado a esta tcnica a ndices de preez comparables a los de semen refrigerado y en muchos casos a los de semen fresco. En razas deportivas, en especial de salto (pero extendindose rpidamente a las dems), el semen de la mayora de los padrillos importantes se comercializa congelado lo que permite preservar su gentica aun despus de muerto por tiempo indefinido y la difusin internacional de la misma en pequeos contenedores. En Argentina, hay registro de mas de 250 padrillos a los que se les ha congelado semen comercialmente y en la actualidad la demanda de este servicio ha crecido exponencialmente (Squires, 2006, Miragaya MH, 2007). Los problemas ms frecuentes se relacionan a: Falta de entrenamiento formal de los Veterinarios que realizan la tcnica, lo que repercute en la calidad y consistencia de las dosis congeladas Manejo del semen durante el proceso de congelacin (contaminacin, shock termino, shock osmtico) Manejo del semen post-descongelado (shock trmico) Momento de la inseminacin Dosis inseminante 3) IA con baja dosis. Descripta inicialmente para ser utilizada en padrillos con baja fertilidad y a travs de una histeroscopia, esta tcnica propone utilizar dosis inseminantes de hasta 1/10 de la recomendada para IA tradicional colocando el semen sobre la unin tero-tubarica (papila). El desarrollo de la tcnica y su traslado a sistemas de campo utilizando una pipeta de IA mas larga y flexible, guiada trasrectalmente permite depositar el semen sobre la papila disminuyendo la dosis 2

(tanto de semen fresco, refrigerado y congelado) y aumentar la eficiencia en trminos de dosis/eyaculado, bajando los costos con resultados en muchos casos superiores a las tcnicas convencionales. En mi opinin esta es una de las tcnicas de mayor impacto en trminos de usuarios que la adoptaron rpidamente y con ello mejoraron su performance de IA a un costo nfimo en relacin al beneficio. Vitrificacin de embriones La vitrificacin es un proceso fsico de criopreservacin donde una solucin lquida es transformada en un slido particular amorfo y estable, llamado vtreo, cuando se congela a bajas temperaturas (criognicas) utilizando altas concentraciones de crioprotectores. Como resultado, los fluidos intra y extracelulares se tornan ms viscosos a medida que el medio se enfra, evitando la unin de molculas de agua y consecuentemente la formacin de cristales de hielo. Para lograr esto, el enfriamiento debe ser muy rpido obteniendo un estado vtreo, de manera casi inmediata. Este estado tiene la distribucin inica y molecular de un lquido, por eso se evitan los efectos nocivos (mecnicos y qumicos) de los cristales de hielo que se forman durante la criopreservacin convencional. La tcnica de vitrificacin posee varias ventajas: es simple, puede realizarse en poco tiempo y no necesita equipos costosos. Sin embargo tambin presenta algunas desventajas: la alta concentracin de crioprotectores utilizados puede ser txica para las clulas. Un problema severo es la remocin de las altas concentraciones intracelulares del crioprotector luego del descongelamiento. Las exigencias de las competencias en los diferentes deportes hpicos dificultan que las yeguas gesten o permanezcan en un centro de TE durante su etapa reproductiva o deportiva. La criopreservacin permite el transporte de los embriones desde la yegua donante hacia la receptora sin necesidad de mantener la misma sincronizada, reduciendo los costos de mantenimiento y por otra parte posibilitando que completen su temporada deportiva. Una de las ventajas ms importantes de criopreservar embriones es que stos, a diferencia de las gametas, contienen el genoma completo de un nuevo individuo y esta listo para ser transferido a una madre sustituta. Adems de las ventajas mencionadas, la criopreservacin permite conservar material gentico de animales superiores, seleccionados por su desempeo atltico o por sus caractersticas raciales o productivas. A diferencia de los bovinos y otras especies domesticas, una de las limitaciones en los equinos es la dificultad, hasta el momento, de superovular yeguas consistentemente, por lo tanto la cantidad de embriones obtenidos por yegua por ciclo es comparativamente muy baja. Como resultado, los embriones disponibles para investigaciones en esta rea de la biotecnologa se encuentran muy acotados. De hecho es una de las especies de mamferos domsticos en la que menos se ha avanzado en este campo, donde solamente se reportan alrededor de 50 potrillos nacidos en el mundo producto de embriones criopreservados, a diferencia de decenas de miles de bovinos. Hasta principios de los `80 los resultados obtenidos con embriones equinos utilizando tcnicas de congelamiento estndar fueron desalentadores a diferencia de lo que ocurra con embriones de otras especies, en gran medida debido a que la presencia de cpsula en los blastocistos equinos dificulta la difusin de los crioprotectores intracelulares. El primer potrillo nacido de una preez lograda por medio de esta tcnica fue reportado por Yamamoto en 1982. Desde entonces varios intentos de congelar embriones equinos se han publicado con resultados variables y en general desalentadores en trminos de tasas de preez post-descongelacin. La primera preez con embriones vitrificados de ratones fue obtenida por Rall, (1987) y en vacas por Massip (1986). Recin en 1994, Hochi y col. publicaron por primera vez una preez a partir de un embrin equino vitrificado (Hochi et al., 1994). 3

El proceso de vitrificacin de embriones equinos es un proceso sencillo que se realiza en poco tiempo (3-4 minutos por embrin) y no requiere de equipamiento complejo. Una vez vitrificado el embrin este se puede mantener por tiempo indefinido dentro del termo de nitrgeno lquido. Para transferir el embrin vitrificado debemos contar con receptoras entre da 5 a 6 post ovulacin. Los resultados iniciales reportados en cuanto a preeces de embriones equinos fueron muy alentadores. Carnevale et al. (2004) y Eldridge-Panuska et al. (2005), reportaron tasas de preez significativamente altas en relacin a datos preliminares experimentales. En 2006, Carnevale reporto una tasa comparativa de preez post transferencia entre embriones refrigerados que son luego vitrificados y embriones nicamente vitrificados de 65% y 75% respectivamente (Carnevale, et al. 2006). Desafortunadamente, los resultados obtenidos por Investigadores y Veterinarios utilizando el mismo protocolo descrito en las publicaciones y los mismos kits comerciales, incluyendo a nuestro Laboratorio, no han logrado resultados que superen el 50% de los valores reportados, es decir, no superiores a 35% de preez (Allen, 2008, Samper, 2008, Losinno, 2008), por lo que en mi opinin, hasta el momento no hay un protocolo con resultados de estudios multicentricos, independientes, consistentes que demuestren resultados satisfactorios y repetibles como para poder recomendar su utilizacin en sistemas comerciales. Inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoide (ICSI) Esta tcnica de alta complejidad fue desarrollada como alternativa para el tratamiento de casos especficos de infertilidad masculina. En equinos, los resultados hasta el momento demuestran que es mas eficiente que la de FIV para la produccin in vitro de embriones y es ofrecida comercialmente desde el ao 2003 para el tratamiento de determinados casos de infertilidad de padrillos. La tcnica de ICSI consiste en seleccionar e inyectar un espermatozoide mediante un micromanipulador en el citoplasma de un ovocito en MII, es decir necesita de un ovocito maduro, que puede ser obtenido mediante puncin folicular (in vivo) o post mortem (ex vivo). Se puede utilizar semen fresco, refrigerado, congelado o liofilizado (desecado). El procesamiento del semen consiste en colocar los espermatozoides en un gradiente de percoll para disminuir el nmero de espermatozoides muertos, luego es centrifugado y colocado en un medio de alta densidad (PVP). Este medio permite disminuir la velocidad del movimiento de los espermatozoides, seleccionar uno, fijarlo mediante la aguja del micromanipulador y aspirarlo desde la cola. El siguiente paso consiste en inyectar el ovocito con el espermatozoide seleccionado. Luego el ovocito inyectado puede ser cultivado in vitro o transferido directamente al oviducto de una receptora previamente acondicionada. El primer reporte de un potrillo nacido por esta tcnica fue hecho por Squires y col (1996). Si bien hay pocos grupos trabajando en el desarrollo de la tcnica en aspectos especficos para las gametas y embriones equinos, esta ha tenido un gran impulso en los ltimos aos. Con el objetivo de trabajar sobre el desarrollo in vivo de embriones producidos in vitro, nuestro grupo ha realizado transferencias quirrgicas experimentales de cigotos obtenidos por ICSI a oviductos de yeguas, ovejas y conejas (Herrera, 2006). Debido a las dificultades en el cultivo embrionario equino in vitro, hasta el momento la tcnica de GIFT ha resultado mas eficiente en trminos de produccin de preeces, excepto en casos extremos de oligospermia u otras patologas espermticas que sean incompatibles con tcnicas de inseminacin artificial (Galli et al., 2007). Recientemente hemos reportado la produccin de embriones por ICSI utilizando espermatozoides de epiddimo criopreservados y espermatozoides desecados (Herrera et al., 2006; Alonso et al., 2007, Alonso et al, 2008) 4

Actualmente un grupo de trabajo lo ofrece comercialmente como servicio reproductivo en Argentina. Transferencia intraoviductal de gametas (GIFT) Consiste en transferir quirrgicamente al oviducto de una yegua receptora sincronizada e inseminada, uno o ms ovocitos de una donante. Los ovocitos pueden ser obtenidos mediante puncin folicular (in vivo) o post mortem (ex vivo) y madurados in vitro. Esta tcnica presenta menos dificultades tcnicas y mayores aplicaciones clnicas que las descriptas anteriormente dado que en resumen solo necesita que de la donante un ovocito viable y puede ser aplicada en casos de endometritis persistentes, fallas ovulatorias, desgarros cervicales, o en algunos casos de infertilidad idioptica. En ambos casos (ICSI y GIFT) es en general necesario realizar la aspiracin folicular guiada por ultrasonido (OPU). Actualmente los resultados de tasas de aspiracin en programas comerciales pueden ser en promedio de 50-70% /ciclo lo que claramente justifica su aplicacin comercial (Alonso et al, 2007). Los reportes de programas clnicos comerciales documentan resultados de 37 % de preez promedio y obtencin de preeces en el 70 % de las yeguas donantes con problemas de subfertilidad (Hinrichs, 2005). Tambin es ofrecido comercialmente en Argentina. Clonacin Es una tcnica que permite producir un individuo genticamente idntico a partir de una clula somtica (embrionaria, fetal o adulta). Se obtiene un individuo con la misma carga gentica que otro/s, pero sujeto a variaciones epigeneticas, ambientales y con el agregado del ADN mitocondrial del ovocito receptor, por lo que estrictamente un clon animal no es exactamente igual a otro (Hinrichs, 2006; Vajda, 2006). En junio del 2003 se reporto en la Universidad de Idaho EEUU el nacimiento del primer quido clonado del mundo, una mula llamada Idaho Gem (Woods 2003). Dos meses ms tarde se comunico el nacimiento de Prometea, el primer caballo clonado, en la Universidad de Cremona, Italia. (Galli 2003). Hasta el momento hay entre aproximadamente 21 clones equinos nacidos reportados. De acuerdo a los datos disponibles, hasta el momento solo un grupo en Argentina (Halitus/Bioteq SA) actualmente ofrece comercialmente el servicio de clonacin equina en Amrica Latina con un nacimiento y una preez en curso en 2008.. Los aspectos ms relevantes y actuales de la clonacin en equinos pueden consultarse en la excelente revisin de Hinrichs (2006). Conclusin La insercin de biotecnologas reproductivas en equinos es una realidad en cualquier sistema de produccin de caballos de mediana a alta complejidad, comenzando por la utilizacin masiva de la ultrasonografia reproductiva hasta la transferencia embrionaria. Las tcnicas de reproduccin asistida de mayor complejidad como ICSI GIFT y clonacin, de muy baja eficiencia y alto costo operativo, actualmente dirigidas a una elite de individuos de alto valor gentico, econmico o afectivo ofrecen hoy herramientas para solucionar problemas de infertilidad puntuales e indudablemente sus resultados mejoraran con el incremento de experimentos controlados trasladables a sistemas reales.

Biotecnologia Complejidad TE + GIFT ++ ICSI +++ Clonacion +++++++++

Costo X 2X 3X 100X

Eficiencia 35% 25% 15% 1-5%

Bibliografa 1. Alonso A, Miragaya MH, Losinno L, Herrera C. Intracytoplasmic sperm injection of equine oocytes using air-dried sperm or sperm stored in a high osmolarity medium. Reproduction, Fertility and Development 19(301), 2007. 2. Allen, WR. Comunicacion personal, 2008. 3. Caracciolo di Brienza V, Carnevale EM, Seidel GE Jr. Establishment of pregnancies after vitrification of equine embryos of various developmental stages. Reprod. Fertil Dev 16, 252 (2004). 4. Carnevale E. M., Eldridge-Panusca W.D., Caracciolo di Brienza V. How to Collect and Vitrify Equine Embryos for Direct Transfer. 50th Annual Convention of AAEP. Internet Publisher: (www.ivis.org), (2004). 5. Eldridge-Panuska W, Caracciolo di Brienza V, Seidel GE Jr. Development of equine embryos in vivo post vitrification and recovery rates of embryos 6.5 days after ovulation. Theriogenology 63,5,1308-1319 (2005). 6. Galli C, Colleoni S, Duchi R, Lagutina I, Lazzari G. Developmental competence of equine oocytes and ambryos obtained by in vitro procedures ranging from in vitro maturation and ICSI to embryo culture, cryopreservation and somatic cell nuclear transfer. Animal Reproduction Science 98:39-55, 2007 7. Galli C, Lagutina I, Crotti G et al. A cloned horse born to its dam twin. Nature 424:635, 2003. 8. Herrera C, Miragaya HM, Losinno L. Intracytoplasmic sperm injection for in vitro equine embryo production. Acta Scientiae Veterinaria 34(1) 245-249, 2006. 9. Herrera C., Miragaya H.M., Conde P., Hynes V., Losinno L., Quintans C., Pasqualini R.S. Intracytoplasmic injection of in vitro matured equine oocytes with frozen-thawed epididymal sperm. Anim. Reprod. Sci. 94:299-302, 2006. 10. Hinrichs K. A review of cloning in the horse. Proc Am Ass Equine Pract. 398-401, 2006 11. Hinrichs K. Update on equine ICSI and cloning. Theriogenology 64:535-541, 2005 12. Hochi S., Fujimoto T., Braun J., Oguri N. Pregnancies following transfer of equine embryos cryopreserved by vitrification. Theriogenology, 42, 48 488 (1994). 13. Losinno L, Alvarenga M. Critical factors on equine embryo transfer programs. Acta Scientiae Veterinaria,34(1), 39-49, 2006. 14. Samper, JC. Comunicacion personal, 2008. 15. Miragaya MH. Comunicacion personal, 2007. 16. Squires EL, McCue P. Superovulation in mares. Animal Reproduction Science 17. Squires EL. Integration of future biotechnologies into the equine industry. Animal Reproduction Science 89:187-198, 2005. 18. Stout TAE. Equine embryo transfer: review of developing potential. Equine Veterinary Journal 38(5)467-478, 2006 19. Woods GL, White KL, Vanderwall DK. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer. Science 301:1063, 2003. 6

20. Vajta G. Somatic cell nuclear transfer in its first and second decades: success, setbacks, paradoxes and perspectives. Reproductive Biomedicine On Line 15(5) 582-590, 2007 21. Campbell KHS; Fisher P; Chen WC; Choi I; Kelly RDW; Lee JH; Xhu J. Somatic cel nuclear transfer: Past, present and future perspectives. Theriogenology 68 (214-231), 2007.