Tcnicas de anlise de DNA e RNA

Fundamento e aplicao das tcnicas de anlise de DNA

Extraco, purificao, quantificao e deteco de cidos nucleicos Electroforese convencional em gel de agarose Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) Hibridao Southern, hibridao dot-blot e hibridao in situ Sequenciao de DNA Footprinting de DNA Retardao em gel Mutagnese de DNA

Extraco, purificao, quantificao e deteco de cidos nucleicos Extraco e purificao de cidos nucleicos Utilizao de Kits comerciais Quantificao de cidos nucleicos
Mtodo espectrofotomtrico (A concentrao de DNA medida pela absoro a 260 nm, sendo
uma absorvncia de 1,0 equivalente a 50 g/ml de DNA de cadeia dupla.) Mtodo baseado na fluorescncia do brometo de etdio (Comparao com a fluorescncia de amostras de DNA de concentrao conhecida.)

Deteco de cidos nucleicos

Colorao com brometo de etdio Colorao com nitrato de prata Mtodos de deteco no radioactivos na hibridao de cidos nucleicos Marcao das sondas in vitro com:
Corantes fluorescentes ou fluorforos (fluorescena e rodamina) Biotina ou digoxigenina (atravs de ligandos de afinidade avidina, estreptavidina ou anticorpo anti-digoxigenina - acoplados a uma enzima de sinalizao que converte os substratos em produtos corados ou quimioluminescentes) Enzimas (fosfatase alcalina AP ou peroxidase de rbano silvestre HRP)

Mtodos de deteco radioactivos na hibridao de cidos nucleicos Marcao das sondas in vitro com 32P
Marcao interna (Nick translation, Random primers, PCR) Marcao terminal 5ou 3

Electroforese em gel convencional (1)

Electroforese em gel convencional (2)

A tcnica de electroforese em gel permite a separao de fragmentos de DNA de dimenses diferentes A matriz de gel (ovais laranja) consiste em longas cadeias de polmeros, entrelaadas. A dimenso das cadeias interligadas, ou poros, depende da concentrao de agarose ou de acrilamida utilizada no gel.

Os poros nos gis de agarose so maiores do que nos gis de acrilamida. Os primeiros so utilizados para separar fragmentos grandes de DNA (500 pb a 20 kb) e os ltimos para separar fragmentos pequenos de DNA (1 nucletido a 2 kb).

Sob a aco da corrente elctrica que passa atravs do gel os fragmentos so separados, movendo-se para o plo positivo a uma taxa inversamente proporcional ao logaritmo da sua dimenso, formando bandas que so visualizadas por auto-radiografia (fragmentos radioactivos) ou pela adio de um corante fluorescente, como por exemplo o brometo de etdio.

Os gis de agarose so horizontais, mas os de acrilamida so verticais (preparados entre duas placas de vidro com um afastamento de alguns milmetros apenas) porque o oxignio do ar inibe a polimerizao da acrilamida.

Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (1)

A tcnica de electroforese em gel de campo pulsado PFGE utilizada para separar cromossomas diferentes, como por exemplo de Saccharomyces cerevisiae, cujas dimenses variam entre 220 000 a 2,5 milhes de pares de nucletidos, ou molculas de DNA com 107 pares de nucletidos. O DNA corado com brometo de etdio.

Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (2)

Definio das condies: N de fases; durao dos pulsos; durao de cada fase; amperagem. Exemplo: Fase 1; pulso 1 segundo; durao da fase 36 minutos; 180 mA Fase 2; pulso 2 segundos; durao da fase 36 minutos; 180 mA

Hibridao Southern e hibridao Northern (1)

As tcnicas de hibridao Southern e hibridao Northern permitem, respectivamente, a deteco de DNAs ou de RNAs especficos por hibridao com sondas apropriadas, de DNA e RNA. Neste exemplo, a sonda de DNA detectada pela sua radioactividade, mas as sondas tambm podem ser detectadas por mtodos no radioactivos.

Hibridao Southern e hibridao Northern (2)

Estas tcnicas envolvem as seguintes etapas:
(A) Misturas de molculas de RNA de cadeia simples (Hibridao Northern) ou de molculas de DNA de cadeia dupla obtidas por digesto com enzimas de restrio (Hibridao Southern) so separadas por electroforese com base na dimenso. (B) As molculas de RNA ou os fragmentos de DNA desnaturados por exposio do DNA a condies alcalinas desnaturantes, so transferidos para membranas de nitrocelulose ou de nylon. (C) A membrana, contendo os cidos nucleicos ligados, cuidadosamente removida do gel. (D) A membrana depois colocada num saco de plstico selado ou numa garrafa de hibridao, juntamente com a soluo de hibridao (uma soluo salina tamponada) e a sonda de DNA ou de RNA, radioactivamente marcada e na forma de cadeia simples, por um perodo de tempo prolongado em condies que favorecem a hibridao. (E) A membrana em seguida removida do saco ou da garrafa de hibridao e lavada vigorosamente, de modo que apenas as molculas de sonda que hibridaram com o RNA ou o DNA imobilizado na membrana permanecem ligadas. Aps auto-radiografia, o DNA ou o RNA que hibridou com a sonda marcada visualizado como uma banda.

Hibridao dot-blot

Estratgias de sequenciao shotgun do genoma humano

A sequenciao shotgun significa que o DNA genmico original aleatoriamente clivado em pequenos fragmentos.

Digesto parcial Clonagem em vectores BAC

Sonicao e reparao das extremidades dos fragmentos

Clonagem
Vector M13 ou Fagemdio

Estratgia da empresa pblica

Estratgia da empresa privada Celera

Sequenciao de insertos grandes

Pesquisa de regies codificantes numa sequncia de DNA (1)

Pesquisa de regies codificantes numa sequncia de DNA (2)

(A) Qualquer regio da sequncia de DNA, em princpio, codifica seis sequncias diferentes de aminocidos, porque as trs grelhas diferentes de leitura so utilizadas para interpretar a sequncia de nucletidos em cada cadeia. A sequncia de nucletidos sempre lida na direco 53 da cadeia e codifica um polipptido a partir da extremidade amnica (N) para a extremidade carboxlica (C). Na leitura de uma sequncia nucleotdica aleatria numa grelha particular encontrado, em mdia, um sinal de paragem da sntese proteica em 21 aminocidos (um em 63 nucletidos). Na sequncia de 48 pb, os codes stop esto representados a verde, e apenas a grelha de leitura 2 no tem codo stop. (B) Pesquisa na sequncia de DNA de 1700 pb de uma possvel sequncia codificante de uma protena. A informao est apresentada como em (A), com cada codo stop representado a verde. Todas as regies entre possveis codes de iniciao e terminao da sntese proteica esto representadas como barras vermelhas. Apenas a grelha de leitura 1 codifica realmente uma protena, de 475 aminocidos.

Aplicaes da sequenciao de genomas

Tcnica de footprinting de DNA (1)

Esta tcnica permite detectar interaces DNA-protena

Figure 8-54. 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

Tcnica de footprinting de DNA (2)

(A) A tcnica de footprinting de DNA requer uma molcula de DNA previamente marcada numa das extremidades. A protena representada na figura tem uma ligao forte com sete nucletidos da sequncia de DNA especfica, protegendo esses nucletidos do agente de clivagem, a enzima DNase I. Na reaco paralela de clivagem com DNase I realizada sem a protena de ligao a DNA, visualizado no gel de acrilamida desnaturante o conjunto completo de bandas (no est representado). Os resultados so analisados, em paralelo, com as quatro reaces de sequenciao pelo mtodo de Sanger do fragmento em estudo, o que permite determinar a sequncia de DNA reconhecida pela protena. A identificao dos nucletidos envolvidos na interaco com a proteina obtida por mutagnese in vitro. (B) O footprint foi realizado para determinar o local de ligao de uma protena humana que estimula a transcrio de genes eucariticos especficos. Estes resultados indicaram que o local de ligao se situa a cerca de 60 nucletidos a montante do local de incio da transcrio.

Retardao em gel (1)

Esta tcnica permite detectar interaces DNA-protena

Retardao em gel (2)

Este mtodo permite determinar, aps sequenciao, a sequncia de DNA reconhecida por uma protena reguladora de um gene. A identificao dos nucletidos envolvidos na interaco com a protena obtida por mutagnese in vitro. A protena relevante purificada e misturada com milhes de diferentes fragmentos curtos de DNA, cada um com uma sequncia diferente de nucletidos. Um conjunto destes fragmentos pode ser produzido programando um sintetizador de DNA, aparelho que sintetiza quimicamente DNA com a sequncia pretendida. Por exemplo, h 411, ou aproximadamente 42 milhes de sequncias possveis para um fragmento de DNA de 11 nucletidos. Os fragmentos de DNA de cadeia dupla que se ligam fortemente protena reguladora do gene so depois separados dos fragmentos de DNA que no se ligam por retardao em gel. Aps separao dos complexos protena-DNA do DNA livre, os fragmentos de DNA so removidos da protena, e so realizados vrios ciclos adicionais do mesmo processo de seleco. As sequncias de nucletidos dos fragmentos de DNA que permanecem atravs de mltiplos ciclos de seleco so determinadas, e uma sequncia consenso de DNA reconhecida pela protena pode ser obtida.

Retardao em gel (3)

Esta tcnica tem diferentes designaes: Electroforetic mobility shift assay (EMSA); Gelshift; Gel retardation; Bandshift assay.
Figure 7-29. 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

Retardao em gel (4)

O fundamento da tcnica de retardao em gel est esquematizado em (A).
Neste exemplo, o extracto proteico de uma linha celular produtora de anticorpo misturado com o fragmento de DNA radioactivo contendo cerca de 160 nucletidos da sequncia de DNA reguladora do gene que codifica a cadeia leve do anticorpo produzido pela linha celular. O efeito das protenas do extracto na mobilidade do fragmento de DNA analisado por electroforese em gel de poliacrilamida, seguida de auto-radiografia, comparando com a mobilidade do fragmento de DNA sem adio do extracto. Os fragmentos de DNA livres migram rapidamente para o fundo do gel, enquanto os fragmentos ligados a protenas so retardados; as seis bandas retardadas sugerem que o extracto contm seis protenas diferentes de ligao a sequncias especficas de DNA (C1 a C6), que se ligam a este fragmento. (Para simplificar, os fragmentos de DNA com mais de uma protena ligada foram omitidos da figura). Em (B), o extracto foi fraccionado por uma tcnica padro de cromatografia (em cima), e cada fraco foi misturada com o fragmento de DNA radioactivo, aplicada num poo do gel de poliacrilamida e analisada como em (A).

Purificao de protenas de ligao a DNA por cromatografia de afinidade (1)

Figure 7-30. 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

Purificao de protenas de ligao a DNA por cromatografia de afinidade (2)

Na etapa 1, as protenas de ligao a DNA so separadas das restantes protenas celulares numa coluna com diferentes sequncias de DNA. A fraca afinidade por DNA no especfico resulta de atraces inicas, sendo as protenas removidas por uma soluo com uma concentrao moderada de sal. Na etapa 2, a coluna contm apenas uma sequncia particular de DNA, e as protenas retidas devido a interaces no especficas so eludas por solues de concentrao moderada de sal, deixando na coluna as protenas (em geral uma) fortemente ligadas sequncia de DNA. Estas protenas so eludas da coluna por solues contendo uma concentrao muito elevada de sal. Um mtodo alternativo de purificao de uma protena de ligao a DNA consiste na triagem de uma biblioteca de cDNA com uma sonda de DNA que contm o local de ligao protena.

Mutagnese stio-especfica com primer mutagnico

Apesar da falta de complementaridade dos nucletidos internos, o emparelhamento do primer mutagnico possvel, sendo a segunda cadeia sintetizada pela polimerase de DNA, e as suas extremidades ligadas pela ligase de DNA. Os homodplices so identificados por hibridao molecular, utilizando o primer mutagnico como sonda oligonucleotdica alelo-especfica, ou por PCR alelo-especfico.

Mutagnese stio-dirigida por PCR

Deve ser utilizada uma polimerase termoestvel com capacidade de reviso de provas para minimizar eventuais erros.

O DNA molde, isolado de estirpes dam+, metilado e susceptvel digesto com DpnI, uma endonuclease especfica de DNA metilado e hemimetilado.

Fundamento e aplicao das tcnicas de anlise de RNA

Hibridao Northern Mapeamento de extremidades 5 e 3 do mRNA com nuclease S1 Mapeamento de extremidades 5 do mRNA por extenso do primer Microarrays de DNA

Hibridao Northern
A hibridao Northern permite:

Detectar a presena de mRNA especfico

Estimar a dimenso do mRNA, relativamente a RNAs marcadores

Estimar a quantidade relativa do mRNA (por comparao do sinal de hibridao com o de outros genes que so expressos em nveis conhecidos).

Para alm da hibridao Northern, as tcnicas de RT-PCR e hibridao in situ permitem analisar em que tecidos ou condies experimentais os genes se expressam.

Detectar a presena de transcritos diferentes de um gene especfico (splicing alternativo, promotores alternativos).

Mapeamento de extremidades 5 do mRNA

Tcnica de proteco da nuclease S1 Tcnica de extenso do primer

A extremidade 5 do mRNA corresponde ao local de incio da transcrio.

Anlise da expresso gnica com microarrays de DNA (1)

Perfect match Mismatch

Cada spot contm 106-109 cpias da mesma sequncia de cDNA de vrias centenas de pares de bases.

Cada gene est representado por 20 pares de oligonucletidos (PM e MM) diferentes de cadeia simples com 20-25 nt.

Anlise da expresso gnica com microarrays de DNA (2)

cDNA marcado

Transcritase reversa cDNA

cDNA marcado

Avidina conjugada com um fluorforo

Nvel de expresso X - elevado em 1 Y elevado em 2

Z idntico em 1 e 2

Anlise da expresso gnica com microarrays de DNA (3)

Os oligos MM contm uma nica base mismatch e servem para controlar a hibridao inespecfica. O controlo positivo o gene da actina, gene expresso constitutivamente. O controlo negativo includo nos microarrays de cDNA serve para normalizar o background ou hibridao no especfica. Para determinar o sinal de um gene particular, os sinais dos 20 oligos PM so somados e os sinais dos 20 oligos MM so subtrados do total. Em (C) um dos nucletidos est conjugado com um fluorforo. X representa genes hipotticos presentes em nveis elevados na amostra 1; Y nveis elevados na amostra 2; Z nveis idnticos nas amostras 1 e 2. Para este tipo de anlise da expresso baseada na hibridao multiplex muitas empresas comercializam (A), mas (B) comercializado como GeneChips apenas pela Companhia de Biotecnologia US Affymetrix Inc..