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TD de biologie cellulaire

molcule htrodimre (compos de deux molcules diffrentes (protines):cdc2,p34 et cycline B) qui est important pour l'entre en phase M, je suis le MPF (M phase promoting factor). Cycline car expression cyclique car expression varie au cours du cycle.

G2

Cycline B

S M

G1

Le niveau 2nd de rgulation du cycle cellulaire c'est les cdk qui est cdk1= cdc2. Cdk (cycline dependent kinase). Cki (inhibiteur des cycline dependent kinase) ceci est le 3ime niveau de rgulation du cycle. Le modle cellulaire est l'ovocyte de xnope. Il est en prophase I est sous l'action de la progestrone , on fait tape de maturation, on arrive un ovocyte bloqu en mtaphase II. Au moment de la maturation, on voit une tache de maturation qui est appel white spoot. Masui prend du cytoplasme de la cellule mature et a mis dans cellule non mature celle-ci devient mature. Ceci est fait sans progestrone donc on a un ovocyte qui a un produit qui permet d'avoir la maturation de celui-ci. exprience 1 1) on met de la progestrone, on voit les whites spoot. Entre 0 et 4h, on voit que la vsicule germinale monte et on a un dbut de rupture de celle-ci. GVBD : germinal vesicle break down. On observe aussi la NEBD (nuclear envelop break down. 8h, on voit arrangement des chromosomes sur la plaque mtaphasique, et fuseau de division. 2) pour dterminer si une substance un effet identique la progestrone, on utilise comme exprience progestrone doit rentre dans la cellule, une hormone strode qui se retrouve au niveau du noyau. Pour faire rentr cette substance dans la cellule, on doit faire une micro-injection ou on fait une balnation (plonge cellule dans le milieu plein de progestrone).

3) Il ne se passe rien quand on a inject aprs 8h, dans l'ovocyte de xnope pas de rcepteurs nuclaires et sont suppos tre sur la membrane cytoplasmique. Le rcepteurs membrane cytoplasmique et pas nuclaire. Donc pour teste une autre substance, il me reste comme solution de la micro-injection ou balnation. Pour tester effet, prend ovocyte en prophase I et mettre en balnation ou mettre une micro-injection. Exprience 2 1) chromatographie spare et purification des protines. Les protines sont dtects la sortie de la colonne par spectrophotomtrie, on mesure les absorbances par les UV. On prend nos luats met dans cuvette et met dans spectrophotomtrie pour mesurer leur absorbance. Comment se fait l'lution ? L'lution se fait de faon que les protines de masse molculaires importantes sont lus en premier donc les plus petites en premire. On met une solution saline de type NaCl pour jouer sur la force ionique. Comment on a pu identifier les fractions positifs du MPF, on va pour cela micro-inject une partie des diffrentes fractions d'lutions dans des ovocytes en prophase I et on voit si effet positif si on observe la maturation de l'ovocyte. 2) SDS-PAGE, SDS est un dtergent et PAGE (polyacrylamide gel lectrophorse). On est en condition dnaturante. On aura alors chaque bande une protine. Dans les fractions positifs, on dtecte des protines au niveau de 30 cela correspond au moment de la maturation. On a donc la p34 qui apparat au moment de la maturation, on se pose la question. On observe qu'au niveau de 43, on a une protine aussi au moment de la maturation. 3) Une p32 a t amen sous quel forme est-elle? Il est port par l'ATP en position donc on aura du 32PATP. Autoradiographie : on a un film qui est attaqu par des particules et une fois sche, on observera des tches ces niveaux l. Donc on observe un substrat de la kinase qui est phosphoryl. On observe qu'une protine est phosphoryl aux alentours de 43kDa dans les fractions positifs. On a une kinase cdk1 et cdc2 qui marche de faon similaire. La cycline B est phosphoryl par une kinase qui est dans les fractions positifs du MPF. Les acides concerns srine, thronine et tyrosime exprience 3 : on ajoute des p34 cdc2 normales ou transformes par gnie gntique des extraits d'ovocytes bloqus en mtaphase II. On a fait un clonage, on met dans plasmide et produit la protine dans bactrie. On aura une protine radiomarqu car mthionine est le premier codon ajout dans la protines. On a une protine cdc2 normales ou transformes, on ralise sur p34 cdc2 des mutations d'un ou plusieurs acides amines qui ont une phosphorylisation importante. 1)On ralise chromatographie d'affinit sur une colonne de cycline B-spharose. Les protines les plus d'affinit avec la protine retenue dans la colonne sont lu le plus tard. On fait produire les protines p34 cdc2, 1 qui est normale et la 2 mutation sur tyrosine 15 et le 3 mutation sur thronine 161. on aura alors en 1, on attrape de la cdc2 et de mme lorsque l'on a une mutation sur tyrosine 15 et quand on mute de la thronine 161 on attrappe pas cdc2. Donc thronine 161 est importante pour l'interaction entre la cycline B et cdc2.

On peut dire la thronine 161 est impliqu dans l'interaction entre cycline B et cdc2. 2)On ralise immuno-prcipitation met anticorps sur bille pour pcher la protine qui nous intresse et on chercher savoir si on rcupre un partenaire ou pas. On cherche savoir si on rcupre la cycline B en utilisant cdc2. Dans le couloir 1 et 2, on rcupre la cycline B mais pour le couloir 3 on rcupre pas la cycline B donc confirmation que la thronine 161 est importante pour l'interaction entre cdc2 et cyclineB. Exprience 4 1) on fait un test H1 et kinase, on a H1 qui est la cible du MPF et celui-ci une fois active, il aura un mcanisme de kinase (phosphorylisation d'un autre substrat dtectable). En 1 pas de H1 active car on est en prophase I et le MPF est l mais pas active donc pas phosphorylisation de H1 donc on aura pas de H1 kinase active. En 2 on a en plus cdc25 qui est une phosphatase qui dphosphoryle enlve un P. activit de H1 kinase est active. Car le MPF est active car dphosphorylisation activatrice. L'activit de phase est faible car MPF est inactive. Dans le couloir deux augmentation de 30 fois, phosphatase dphosphorylisation activatrice. L'activit chute dans le couloir 3 car on a mis des anticorps anti phosphatase, ils ont reconnu la cdc25 soit empche son activit de dphosphorylisation donc plus de dphosphorylisation du MPF. 2) les tubes 1 et 2 sont fait sur des western bloot grce un anticorps monoclonal reconnaissant spcifiquement les tyrosines phosphoryle. Cdc25 dphosphoryle la ou les tyrosines ce qui permet de rendre le MPF active. Le MPF interaction de la cycline B et cdc2 faut une thronine et pour que sa soit active faut une dphosphorylisation via l'action de cdc25